CN101806804B - 用于免疫学方法检测急性心肌梗塞的试剂及测试条 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学诊断试剂,尤其涉及用于急性心肌梗塞早期诊断的快速检测试剂及测试条。本发明提供了一种双指标联合检测试剂,包含抗人心脏型脂肪酸结合蛋白H-FABP和抗人心肌肌钙蛋白cTnI的特异性抗体。本发明还提供了一种包含抗H-FABP和cTnI特异性抗体的胶体金标记免疫层析测试条,用于快速检测急性心肌梗塞。本发明的双指标联合检测试剂,即可对急性心肌梗塞患者早期诊断,又可防止对长期、症状轻微的慢性心梗病人的漏诊,比较好的解决了检测时间存在差异带来的影响。本发明的胶体金标记免疫层析测试条为急性心肌梗塞的早期诊断提供了快速、方便、价廉、实用的检测工具,可望用于各级医院,也可用于病人的自我监测。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断试剂,尤其涉及快速诊断急性心肌梗塞的诊断试剂及测试条。
背景技术
急性心肌梗塞AMI是内科常见的急危重症,已成为严重影响人类健康的疾病,其发病后1~6小时是溶栓治疗和介入手术治疗的黄金时间,而快速诊断发病6小时内的早期AMI是决定治疗的关键环节。按照世界卫生组织(WHO)推荐:典型的胸痛、心电图改变和心肌酶异常三项指标中有两项符合,即可诊断AMI。然而,在我国约25%的AMI病人无症状,约30%的病例无典型心绞痛表现;采用心电图诊断AMI的准确性平均约60%,诊断非Q波心肌梗死缺乏特异性,对不稳定心绞痛和小范围AMI难以鉴别,而具有确诊意义的病理性Q波常在发病6~8小时以后才出现,因而AMI早期心电图确诊率很低。
心肌损伤生化标志物的检测在急性心肌梗塞的诊断、监测、危险评估、预后和引导治疗等方面都起到了重要作用,目前常用的心肌损伤生化标志物有肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(Troponin I) 或肌钙蛋白T(cTnI或cTnT)、肌红蛋白(Myoglobin)等。例如,美国心脏病学会规定联合使用肌红蛋白(Myoglobin),CK-MB和肌钙蛋白I(Troponin I)三个标志物作为心肌梗塞检测的常规手段。但是,目前的心肌损伤生化标志物的在急性心肌梗塞早期诊断,尤其是发病6小时以内的早期诊断的敏感性和特异性方面仍有不足。
肌酸激酶同功酶(CK-MB):CK-MB在肌酸激酶的三个同工酶中,CK-MB对于诊断AMI具有高度敏感性,从19世纪80年代至1995年一直被认为是诊断AMI的“金标准”。然而,CK-MB存在于心肌和骨骼肌细胞中,影响诊断特异性。CK-MB在胸痛作之后5~6小时会升高2倍,12~24小时达到峰值。因此,不能作为早期标志物。
肌钙蛋白:肌钙蛋白(Cardiac troponins,cTn)是横纹肌收缩的主要蛋白,有三个亚单位:Tnc,TnI和TnT。cTn不能透过细胞膜进入血循环,故健康人血内不含或含极低量的cTnT和cTnI。当心肌缺血或缺氧发生变性坏死,细胞膜破损,cTnI和cTnT进入细胞间质。1989年首次报道检测cTnT,后来在1992年对cTnT的检测进一步描述。由于cTnT、cTnI对心肌细胞损伤有高度的敏感性和特异性,被人们认为是诊断AMI的“金标准”。但肌钙蛋白在AMI后的早期释放动力学与CK-MB相似,需要几个小时释放至血液中,才能进行检测,因此这两种肌钙蛋白不能作为早期标志物。
肌红蛋白(Myo):肌红蛋白是19世纪70年代以来用于诊断AMI的第一个非酶蛋白。它的分子量小,发病后1小时能快速释放到血液中,具有高敏感性和阴性预测值,对于早期筛选AMI非常有价值。 然而,肌红蛋白不仅大量存在于心肌细胞,还存在于骨骼肌细胞等多种组织中,故炎症、局部缺血、SLE、休克、皮肌炎等亦可引起MYO升高,其作为AMI的诊断指标特异性较低。
人们一直致力于研究新的用于AMI早期诊断的生化标志物,近年来,有研究者对心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)作为急性心肌梗塞的标志物进行了研究。H-FABP是一种低分子量的胞浆蛋白,分子量约15000Dt,是重要的细胞内脂肪酸载体蛋白。Van Nieuwen FA等在Circulation,1995,92:2848报告了FABP存在于心脏及某些骨骼肌中,但是在心肌中它的含量比骨骼肌中要高几倍,心肌缺氧时,在AMI早期就可查到FABP在血中升高。Tanaka T等在Clin Biochem,1991,24:195-201报道了10例AMI患者发病1.5~4小时内的早期标本中FABP都升高而CK-MB仍在正常范围。Tsuji R等在Int JCardiol,1993,41:209-217报道了在发病早期阶段(0~3小时)FABP和CK-MB的临床灵敏度分别为91.4%和20%,FABP显著高于CK-MB。Glatz等在Clin Chim Acta,1998,272:87报告了83例AMI患者不同标志物的诊断灵敏度分别为:FABP 78%,myoglobin 53%,CK-MB 57%;而且myoglobin和CK-MB活性增加的患者,99%也表现有FABP浓度增加。Suzuki等在Nippon Kyobu Geka Gakkai Zasshi,1996,44:760-764报告了FABP在心肌再灌注后60分钟内立即出现高峰,远在CK-MB和cTnT之前。此外,Glatz等在Clin Chim Acta,1998,272:87报告健康人血浆FABP水平为:(2.1±1.1)ug/L,上限(鉴别值)为5ug/L,FABP还可以用作判断围手术期心肌损伤的 指标。上述研究提示H-FABP作为AMI早期诊断的生化标志物具有一定的优越性,但是,如何与其他指标配合使用未见报道。
另外,在AMI检测方法上,目前国内常用的方法为酶联免疫法、化学发光法,该方法需要特定的仪器,成本高、操作较复杂、检测时间长,不适宜于AMI患者自检或初次就诊的基层医院和急诊室进行快速筛选诊断。
因此,本领域迫切需要更灵敏、更具特异性的AMI早期诊断标志物或标志组合,以及用于快速诊断AMI的产品。
发明内容
本发明的目的在于:将可用于急性心肌梗塞早期检测的生化标志物心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和肌钙蛋白I(cTnI)与成熟的胶体金免疫层析快速诊断技术结合起来,设计出一种快速诊断急性心肌梗塞检测试纸,用于AMI的早期筛选诊断,以解决各级医院,尤其是基层医院的急诊室缺乏快速、简便筛查早期AMI有效手段的难题。
本发明的第一方面,提供了一种用于检测急性心肌梗塞的免疫检测试剂,包括:
针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的单克隆抗体;和
针对人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的单克隆抗体。
在一个优选的方案中,针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的单克隆抗体选自7C8和2G4中的一种,其中7C8由保藏号为 CGMCC No.3428的小鼠杂交瘤细胞株产生,2G4由保藏号为CGMCCNo.3427的小鼠杂交瘤细胞株产生;针对人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的单克隆抗体选自3D2和2E5中的一种,其中3D2由保藏号为CGMCC No.3425的小鼠杂交瘤细胞株产生,2E5由保藏号为CGMCCNo.3426的小鼠杂交瘤细胞株产生。保藏单位为中国微生菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏日期为2009年11月9日。
在一个优选的方案中,上述用于检测急性心肌梗塞的免疫检测试剂,针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的单克隆抗体包括抗原表位不同的第一抗体和第二抗体;针对人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的单克隆抗体包括抗原表位不同的第一抗体和第二抗体。所述的针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的第一抗体选自7C8和2G4中的一种,第二抗体为另一种;所述的针对人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的第一抗体选自3D2和2E5中的一种,第二抗体为另一种。
在更优选的方案中,针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的第一抗体为非标记抗体,第二抗体为标记抗体;针对人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的第一抗体为非标记抗体,第二抗体为标记抗体。
所述的标记抗体的标记方法为本领域常用的方法,如辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记、胶体金标记。本发明优选胶体金标记。
本发明的第二方面,提供了一种用于快速检测早期急性心肌梗塞的免疫层析测试条,包括:
样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记抗体的金标 垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫;所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线,在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置两条相互分离的检测线;
其中所述的两条检测线由分别针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的特异性抗体组成;所述的胶体金标记抗体由抗原表位不同的分别针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的特异性抗体组成;所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白(SPG)或金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)组成。
在一个优选的方案中,针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的特异性抗体为抗原表位不同的单克隆抗体7C8和2G4,其中7C8由保藏号为CGMCC No.3428的小鼠杂交瘤细胞株产生,2G4由保藏号为CGMCC No.3427的小鼠杂交瘤细胞株产生;针对人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的特异性抗体为抗原表位不同的单克隆抗体3D2和2E5,其中3D2由保藏号为CGMCC No.3425的小鼠杂交瘤细胞株产生,2E5由保藏号为CGMCC No.3426的小鼠杂交瘤细胞株产生。
在更优选的方案中,所述的两条检测线,一条检测线由抗人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的单克隆抗体7C8组成,另一条检测线由抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体3D2组成;所述的胶体金标记抗体由抗原表位不同的抗心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的单克隆抗体2G4和抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体2E5组成;所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G 蛋白或或金黄色葡萄球菌A蛋白组成。
在更优选的方案中,所述检测线的特异性抗体终浓度为1~4mg/ml,按每ul喷涂成1cm长度喷涂到纤维素膜上形成检测线;所述金标垫是用胶体金标记抗体溶液充分浸泡玻璃纤维膜,再晾干形成金标垫;所述质控线的特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白终浓度分别为1~4mg/ml、0.25~1mg/ml、0.25~1mg/ml,按每ul喷涂成1cm长度喷涂到纤维素膜上形成质控线。
在最优选的方案中,所述检测线终浓度为2mg/ml;所述质控线的特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白终浓度分别为2mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml。
本发明所述的用于快速检测早期急性心肌梗塞的免疫层析测试条,其中支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜或混合膜;支持胶体金标记抗体的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜;所述样品垫可以是全血滤膜,所述的全血滤膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻璃纤维和纤维素的混合物,也可以在全血滤膜上设一覆盖膜,所述的覆盖膜为璃纤维或吸水纸;该样品垫适合于全血、血浆和血清样品;所述吸水垫由吸水材料制备,如吸水纸。
在一个优选的方案中,本发明的免疫层析测试条切成5mm宽度,其中纤维素膜长25mm,金标垫长5mm,全血滤膜长度18mm,覆盖在全血滤膜上的覆盖膜长度20mm,吸水垫长度20mm。
在一个优选的方案中,本发明所述的用于快速检测早期急性心肌 梗塞的免疫层析测试条还包括一个起支持作用的底板和保护作用的外壳;所述的外壳在相对于检测线、质控线的位置设有观察窗,相对于样品垫的位置设置有加样孔;所述的底板、外壳材质为塑料。
本发明的积极进步效果在于:
本发明的快速检测急性心肌梗塞免疫层析测试条,选用H-FABP和cTn I两个心肌损伤生化标志物作为检测指标,合理利用H-FABP在急性心肌梗塞患者外周血中出现早、窗口期短;cTnI出现较H-FABP迟、但窗口期长的特点,做到即可对急性心肌梗塞患者早期诊断,又可防止对长期、症状轻微慢性心梗病人的漏诊,在提高急性心肌梗塞早期检测的灵敏度与特异性的基础上,比较好的解决了检测时间存在差异带来的影响,为特异、灵敏的在不同时段对急性心肌梗塞作出诊断提供了有效手段。
本发明的快速检测急性心肌梗塞免疫层析测试条,可将心脏型脂肪酸结合蛋白、心肌肌钙蛋白I用一份样品同时检测,不需任何仪器设备,用肉眼即可观察结果,检测全过程仅需数分钟,灵敏度与ELISA法相仿。
本发明的快速检测急性心肌梗塞免疫层析测试条具有单一试剂、一步操作、全部试剂可在室温长期保存的特点。
总体而言,本发明的快速检测急性心肌梗塞免疫层析测试条诊断急性心肌梗塞提供了快速、方便、价廉、实用的检测工具,可望在将来广泛应用于临床,尤其是基层医院、急诊室等,也可用于病人的自我监测,提高早期AMI诊断准确率,进而提高AMI的抢救成功率。
附图说明
图1为快速诊断急性心肌梗塞免疫层析试条的正面示意图。
图2为快速诊断急性心肌梗塞免疫层析试条的纵截面示意图。
图3为快速诊断急性心肌梗塞的试剂盒示意图。
其中:
1为样品垫(全血滤膜);2为金标垫;3为纤维素膜;4为吸水垫;5、6为检测线;7为质控线;8为背板;9为外壳;10为观察窗;11为加样孔。
具体实施方式
H-FABP和cTn I抗原:
本发明采用从GENBANK查阅的H-FABP和cTn I的DNA序列,并依据其DNA序列分别设计上下游引物,利用分子克隆的方法制备H-FABP和cTn I重组抗原。
作为检测靶标的H-FABP和cTn I抗原:急性心肌梗塞病人心肌缺氧坏死会释放H-FABP和cTn I进入血液中,使得病人血液中H-FABP和cTn I水平高于正常人。病人血液样品中包含的内源性H-FABP和cTn I作为待检抗原,可以与本发明诊断试剂中的特异性抗体反应。出现阈值之上的检测结果可以作为判断病人患有AMI的初步依据。
抗H-FABP和cTn I的单克隆抗体
单克隆抗体可用本领域技术人员已知的各种方法制备,例如,可利用杂交瘤技术来制备。本发明在采用H-FABP抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞按常规方法制备杂交瘤时,筛选到两株分泌特异性抗H-FABP的单克隆细胞株:
(1)7C8(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.3428,保藏日期为2009年11月09日),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG2a型;
(2)2G4(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.3427,保藏日期为2009年11月09日),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG1型。
本发明在采用cTn I抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞S/P20细胞按常规方法制备杂交瘤时,筛选到两株分泌特异性抗cTnI的单克隆细胞株:
(1)3D2(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.3425,保藏日期为2009年11月09日),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG1型;
(2)2E5(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.3426,保藏日期为2009年11月09日),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG2a型。
固定相抗体、流动相标记抗体的设置
可以将一株针对H-FABP抗原的特异性单克隆抗体标记于粒径在520~530nm之间的胶体金颗粒上,喷涂于玻璃纤维膜或聚脂膜上, 经干燥制成金标垫作为流动相抗体,将另一株抗原表位不同的抗H-FABP特异性单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜上作为固定相抗体(检测线),用以捕获已经与胶体金标记抗体结合的待检血样中的H-FABP抗原。同理,将一株针对cTn I抗原的特异性单克隆抗体标记于粒径在520~530nm之间的胶体金颗粒上,喷涂于玻璃纤维膜或聚脂膜上,经干燥制成金标垫作为流动相抗体,将另一株抗原表位不同的抗cTn I特异性单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜上作为固定相抗体(检测线),用以捕获已经与胶体金标记抗体结合的待检血样中的的cTn I抗原。在适当的反应体系中,当样品中H-FABP、cTn I抗原存在时,该抗原可以同时与固定相抗体、胶体金标记抗体结合,形成“三明治”形式的抗原抗体复合物,使得该抗原被固定到固定相抗体(检测线)位置,在检测线位置出现胶体金颗粒特有的色带,以显示待检抗原的存在。
在本发明一个优选的方案中,固定相抗体为两株针对H-FABP、cTn I的特异性单克隆抗体,产生该抗体的细胞株保藏号分别为:CGMCC No.3428、CGMCC No.3425。用上述两株针对H-FABP、cTnI的特异性单克隆抗体包被硝酸纤维素膜,形成两条互相分离的检测线。流动相标记抗体为另外两株抗原表位不同的抗H-FABP、抗cTnI的特异性单克隆抗体,产生该抗体的细胞株保藏号保藏号分别为:CGMCC No.3427、CGMCC No.3426,该抗体用于标记粒径在520~530nm胶体金颗粒。
质控线
可以将与标记抗体特异性结合的二抗或其他蛋白固定在纤维素膜上作为质控线,例如链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白。本发明的胶体金标记抗体是小鼠杂交瘤细胞产生的单克隆抗体,相应的,质控线可采用羊/兔抗鼠IgG的多抗、链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白。无论待检样品中是否含有H-FABP、cTn I抗原,本发明的快速检测急性心肌梗塞免疫层析试条中质控线位置总能形成色带,该条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。
免疫层析试条
如图1、2所示,图1为快速诊断急性心肌梗塞的免疫层析试条的正面结构图,图2为快速诊断急性心肌梗塞的免疫层析试条的纵截面结构图。快速诊断急性心肌梗塞的免疫层析试条由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标垫2和样品垫(全血滤膜)1四部分粘贴在PVC底板8上组成;硝酸纤维素膜3上设有检测线5、6和质控线7。
检测过程与结果判断
测定时将待检全血样品150μL,血清或血浆样品100μL加在加样孔中,样品依次按样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4的方向移动,流经金标垫2时使金标垫2上的胶体金标记抗体复溶,并带动其向硝酸纤维素膜3、吸水垫4移动。胶体金标记抗体可与样品中的H-FABP、cTn I抗原结合,形成免疫复合物。此免疫复合物流至检测线5(本发明实施例为特异性结合H-FABP的单克隆抗体) 和检测线6(本发明实施例为特异性结合cTn I单克隆抗体)时,即被检测线5和检测线6的特异性固相抗体所捕获,在硝酸纤维素膜3上的检测线5和6位置显出胶体金颗粒特有的色带检测线条;此免疫复合物或者金标抗体本身流经质控线7时,即被质控线7的固相抗体(本发明实施例为兔抗鼠抗体)所捕获,在硝酸纤维素膜3上的质控线7位置显出胶体金颗粒特有色带质控线条。
检测线5的阳性阈值设定为被测样品中的心脏型脂肪酸结合蛋白抗原浓度大于或者等于10ng/ml,这是因为通过临床试验发现心脏型脂肪酸结合蛋白用于急性心肌梗塞早期筛选诊断时,其检测值以10ng/ml为最佳,当血液中的心脏型脂肪酸结合蛋白抗原浓度大于或等于10ng/ml时,检测结果为阳性,否则为阴性。检测线6的阳性阈值设定为被测样品中的心肌肌钙蛋白抗原浓度大于或者等于1.5ng/ml,这是因为通过临床试验发现心肌肌钙蛋白用于急性心肌梗塞筛选诊断时,其检测值以1.5ng/ml为最佳,当血液中的肌钙蛋白抗原浓度大于或等于1.5ng/ml时,检测结果为阳性,否则为阴性。
图3为快速诊断急性心肌梗塞的试剂盒示意图。其中,9为外壳;10为观察窗;11为加样孔。阳性标本既显示检测线,又显示质控线,如图3a;阴性标本没有检测线,仅显示质控线,如图3b。如果质控带不显色,不论检测线是否显色,均判为试条失效。
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法;所述百分含量如无特别说明均为质量 /体积百分含量或体积/体积百分含量。
实施例1.H-FABP、cTn I重组抗原的制备
H-FABP重组抗原的制备:
根据GENBANK公开的人H-FABP DNA序列,设计合成两条两端包含限制性内切酶位点的PCR引物,序列为
5′-AGCTGGATCCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC-3′;
5′-CTAGGAATTCTGCCTCTTTCTCATAAGTGCG-3′。
从心脏组织用RT-PCR方法扩增得到H-FABP cDNA序列,插入表达载体pET16b,经测序确认基因序列正确后,转入到E.coli BL/21(LysE)菌株,用IPTG诱导表达,表达的H-FABP利用Ni-Agarose亲和层析柱分离纯化,得到H-FABP重组抗原。具体操作按《分子克隆》及产品说明书教导的方法进行。
cTn I重组抗原的制备:
根据GENBANK公开的人cTn I的DNA序列,设计合成两条两端包含限制性内切酶位点的PCR引物,序列为
5′-GACTGGATCCATGGCGGATGGGAGCAGCGAT-3′;
5′-ACTGGAATTCGCTCTCAAACTTTTTCTTGCG-3。
从心脏组织用RT-PCR方法扩增得到cTn I cDNA序列,插入表达载体pET22b,经测序确认基因序列正确后,转入到E.coli BL/21(LysE)菌株,用IPTG诱导表达,表达的H-FABP利用Ni-Agarose亲和层析柱分离纯化,得到H-FABP重组抗原。具体操作按《分子克 隆》及产品说明书教导的方法进行。
实施例2.H-FABP、cTn I单克隆抗体的制备
免疫 每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100μg上述纯化的重组蛋白+福氏完全佐剂的混悬液,以后每隔1月注射100μg纯化的重组蛋白+福氏不完全佐剂的混悬液1次,共3次,并于杀鼠取脾进行细胞融合的前3d经尾静脉直接注射抗原加强免疫1次。
杂交瘤细胞的产生与筛选SP2/0瘤细胞与免疫鼠脾细胞的融合及杂交瘤细胞的克隆按本实验室常规方法进行。以上述纯化的重组蛋白抗原包被酶标板,用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清进行检测筛选阳性孔,对阳性孔三次克隆化培养,选取稳定分泌特异抗以上重组蛋白抗原的杂交瘤细胞株,作为研发生产该试剂的杂交瘤细胞株。
单克隆抗体(McAb)免疫球蛋白亚类鉴定经浓缩的杂交瘤细胞培养上清液与羊抗鼠IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3在1%生理盐水琼脂板上进行免疫双扩散以鉴定McAb免疫球蛋白亚类。
腹水生产与腹水效价决定 每只BALB/c小鼠腹腔注射5×106杂交瘤细胞,1周后随时观察并取腹水。以纯化的重组蛋白包被酶标板,腹水进行倍比稀释,第1稀释度为1∶1000,用常规ELISA法确定腹水效价。
免疫印迹实验 取重组表达的H-FABP、cTn I抗原进行SDS-PAGE电泳,而后转移至硝酸纤维薄膜上。转移完毕后硝酸纤维 素膜用含5%脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭1小时,用PBS含0.5%TritonX-100(PBS-T)洗涤3次,按1∶20000稀释度加入单克隆抗体,4℃过夜,用PBS-T洗涤3次,加入用PBS稀释(1∶5000)的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体室温摇2小时,同法洗涤3次,再用PBS洗涤1次,用二氨基联苯胺(DAB)底物系统(DAB50mg,PBS100ml,30%H2O2 10μL)显色。
筛选到两株分泌特异性抗H-FABP的单克隆细胞株:
(1)7C8(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号为CGMCC No.3428,保藏日期为2009年11月09日,分类命名:抗-人心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)杂交瘤细胞株),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG2a型;
(2)2G4(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号为CGMCC No.3427,保藏日期为2009年11月09日,分类命名:抗-人心脏型脂肪酸结合蛋白(HFABP)杂交瘤细胞株),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG1型。
筛选到两株分泌特异性抗cTn I的单克隆细胞株:
(1)3D2(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号为CGMCC No.3425,保藏日期为2009年11月09日,分类命名:抗-人心肌肌钙蛋白I(cTnI)杂交瘤细胞株),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG1型;
(2)2E5(保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号为CGMCC No.3426,保藏日期为2009年11月09日,分类命名:抗-人心肌肌钙蛋白I(cTnI)杂交瘤细胞株),该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG2a型。
单克隆抗体的纯化
将含H-FABP、cTn I单克隆抗体的小鼠腹水,先使用正辛酸-硫 酸铵沉淀法抽提,然后再用G蛋白层析柱(美国GenScript产品)按产品说明书纯化单克隆抗体。
实施例3.胶体金标记抗体溶液的制备
用以下方法制备H-FABP、cTn I特异性抗体标记的胶体金金标探针溶液和金标抗体垫:
用柠檬酸还原法制备胶体金:将质量百分比浓度为0.01%的HAuCl4(沪试牌购于上海国药集团化学试剂有限公司)水溶液煮沸,搅拌下加入2mL质量百分比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液,继续煮沸,直到液体呈深红色,得到胶体金溶液。
确定胶体金偶联抗体饱和度:用0.1M K2CO3溶液调节pH值至8.5,准备96孔酶标板,在孔中用0.05M硼酸缓冲液倍比稀释抗H-FABP、cTn I的特异性抗体,做一个稀释度梯度,分别加入相同体积胶体金混匀,再加入相同体积的10%NaCl溶液,混匀,观察液体颜色变化,颜色没有变化最低的抗体量就是最适浓度。结果确定保持稳定的抗体终浓度为20μg/mL。
抗H-FABP、cTn I特异性单克隆抗体的胶体金溶液及金标抗体垫的制备:
用0.1M K2CO3溶液调节pH值至8.5,每100mL胶体金溶液加入纯化的抗H-FABP单克隆抗体使终浓度为20μg/mL,4℃、150~200rpm搅拌4小时,再加入PEG20000使终浓度为0.05%,搅拌1小时,10000rpm离心30分钟,弃上清,用20mM硼酸缓冲液洗涤沉淀,并将其保存于20mL含5%蔗糖的20mM硼酸缓冲液中,得到抗H-FABP 单克隆抗体胶体金溶液。
同样方法制备抗cTn I单克隆抗体胶体金溶液。
将制备的两种胶体金溶液按照体积比1∶1的比例混合,用于浸泡玻璃纤维垫。浸泡的玻璃纤维垫在37℃下干燥5小时,得到金标抗体垫。
实施例4.快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条的制备
如图1所示,图中A为快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条的正面结构图,图中B为快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条的纵截面结构图。快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标抗体垫2和样品垫1四部分粘贴在PVC底板8上组成;硝酸纤维素膜3上设有检测带5、6和质控带7,该试纸的制备方法包括以下步骤:
NC膜的包被:两株特异性结合H-FABP、cTn I的单克隆抗体分别用10mM pH9.0的CBS缓冲液稀释到2mg/mL,用于包被两条检测带;兔抗鼠IgG由兰州生物制品研究免疫家兔、检测、纯化制备,用10mM pH9.0的CBS缓冲液稀释到2mg/mL,用于包被一条质控带。用XYZ-3050型喷点系统分别喷涂于300mm长、25mm宽的NC膜(购于MILLIPORE公司)上,形成互相分离的检测线。37℃下干燥2小时。
胶体金免疫层析试条的制备:用一块单面涂了不干胶的PVC底板,中间粘贴上处理好的NC膜;NC膜靠近质控线的一端紧密粘贴 吸水垫(购于MILLIPORE公司);NC膜靠近检测线的一端紧密粘贴金标抗体垫;金标抗体垫另一端紧密粘贴样品垫(全血滤膜;购于MILLIPORE公司);将组装成的试纸条用CM24000型切条系统切成5.0mm宽度,装入塑料外壳中,再将组装好的试纸条装入加干燥剂的包装袋中。
实施例5.快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条灵敏度的测试
按照实施例4的方法,调整质控线抗体、金标抗体浓度,制备快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条。
将基因工程表达的H-FABP与cTn I抗原经亲和层析法纯化、紫外分光法测定蛋白含量。
用含70mg/ml人血白蛋白的PB(0.15M,pH7.4)缓冲液定量稀释H-FABP纯化抗原4份(S1-S4),其中S1:H-FABP含量10ng/ml;S2:H-FABP含量20ng/ml;S3:H-FABP含量40ng/ml;S4:H-FABP含量80ng/ml。用于控制对H-FABP阳性样本的检出能力。
用含70mg/ml人血白蛋白的PB(0.15M,pH7.4)缓冲液定量稀释cTn I纯化抗原4份(S1′~S4′),其中S1′:cTn I含量1.5ng/ml;S2′:cTn I含量3.0ng/ml;S3′:cTn I含量6.0ng/ml;S4′:cTnI含量12.0ng/ml。用于控制对cTn I阳性样本的检出能力。
分别测试,结果如表1所示:
表1、灵敏度测试结果
实施例6.快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条的实验检测
应用本急性心肌梗塞早期快速检测试纸对临床收集的样品进行初步实验,结果显示,该试纸对于早期AMI检测的敏感性和特异性较高。其检测结果如下:早期急性心肌梗塞病人25例,阳性25例;稳定性心绞痛病人24例,弱阳性1例,余者均为阴性;不稳定性心绞痛病人20例,弱阳性2例,余者均为阴性;非心源性胸痛病人16例,阳性2例(2例为外伤病人)。
实施例7.快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试剂盒的稳定性考核
考核方法
用实施例1制备的快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试剂盒分别在室温(5~35℃不放冰箱,不开空调)下和37℃培养箱保存,进行老化试验。每隔2周抽样,按使用说明检测血样。
实验结果
用本发明的快速诊断急性心肌梗塞胶体金免疫层析试条进行稳 定性考核结果,室温下可以至少稳定18个月,37℃下老化试验至少稳定8个月,检测结果仍符合要求。
Claims (5)
1.一种用于快速检测早期急性心肌梗塞的免疫层析测试条,包括以下组分:
样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记抗体的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫;所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线,在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置两条相互分离的检测线;
其中:所述的两条检测线由分别针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的单克隆抗体7C8、3D2组成,所述检测线的特异性抗体终浓度为1~4mg/ml,按每ul喷涂成1cm长度喷涂到纤维素膜上形成检测线;所述的胶体金标记抗体由抗原表位不同的分别针对人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的单克隆抗体2G4、2E5组成,所述金标垫是用终浓度分别为50ug/ml的胶体金标记抗体混合溶液充分浸泡玻璃纤维膜;所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白(SPG)或金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)组成,终浓度分别为1~4mg/ml、0.25~1mg/ml、0.25~1mg/ml,按每ul喷涂成1cm长度喷涂到纤维素膜上形成质控线;
其中:7C8由保藏号为CGMCC No.3428的小鼠杂交瘤细胞株产生;2G4由保藏号为CGMCC No.3427的小鼠杂交瘤细胞株产生;3D2由保藏号为CGMCC No.3425的小鼠杂交瘤细胞株产生;2E5由保藏号为CGMCC No.3426的小鼠杂交瘤细胞株产生。
2.根据权利要求1所述的免疫层析测试条,其特征在于,所述检测线终浓度为2mg/ml;所述质控线的特异性结合胶体金标记抗体的二抗、链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白终浓度分别为2mg/ml、0.5mg/ml、0.5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的免疫层析测试条,其特征在于,所述支持检测线和质控线的纤维素膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜或混合膜;所属支持胶体金标记抗体的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜;所述样品垫是全血滤膜或全血滤膜上覆盖玻璃纤维或吸水纸的双层膜,其中全血滤膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻璃纤维和纤维素混合物;所述吸水垫为吸水纸。
4.根据权利要求3所述的免疫层析测试条,其特征在于,免疫层析测试条各部分宽度均为5mm,其中纤维素膜长25mm,金标垫长5mm,全血滤膜长度18mm,样品垫长度20mm,吸水垫长度20mm。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的免疫层析测试条,其特征在于,用于快速检测早期急性心肌梗塞的免疫层析测试条还包括一个起支持作用的底板和保护作用的外壳;所述的外壳在相对于检测线、质控线的位置设有观察窗,相对于样品垫的位置设置有加样孔;所述的底板、外壳材质为塑料。
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