CN102298055B - 一种人血液h-fabp纳米金标检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血液H-FABP纳米金标检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫（1）、金标垫（2）、硝酸纤维素膜（3）和吸水纸（4）；在硝酸纤维素膜（3）上设有检测线抗体（5）和质控线抗体（6）；在金标垫（2）上设有金标抗体。本发明的人血液H-FABP纳米金标检测试纸条，使用中空的金纳米壳代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒，应用于人H-FABP检测，特异性高，结果易观察，灵敏度达到7ng/mL，15-30min内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性，操作简便，无需特殊仪器设备，可应用于急性心肌梗死和急性心肌损伤的早期诊断。

Description

一种人血液H-FABP纳米金标检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种人血液中心脏型脂肪酸结合蛋白(Heart-type Fatty Acid Binding Protein，H-FABP)纳米金标检测试纸条及制备方法。 

背景技术

H-FABP存在于心肌细胞胞浆内，含量丰富。心肌受损早期，心肌细胞膜完整性被破坏，H-FABP进入血液。H-FABP在心肌受损后1-2h即可在血液中检测到。由于H-FABP心肌特异性高于目前临床常用的肌红蛋白，因此H-FABP可成为一种重要的检测急性心肌组织损伤的早期特异性标志物。目前，生化标志物的检测已广泛应用于急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、急性心衰、心肌炎、心脏手术损伤评估、窒息新生儿心肌损伤等心肌损伤疾病的诊断、危险度分层和预后评判。美国每年因怀疑性冠状动脉综合征急诊就医病人达8000万，其中45％左右与心脏相关，15％诊断为急性冠脉综合征。我国急性冠状动脉综合征的发病率约50/10万，每年死于急性心肌梗死的人数超过100万。因此，H-FABP检测的应用具有重要的社会和经济效益。 

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种人血液H-FABP纳米金标检测试纸条，使其具有操作简便、灵敏度＜7ng/mL、结果稳定等优点。本发明的另一目的是提供上述检测试纸条的制备方法。 

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种人血液H-FABP纳米金标检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)；在硝酸纤维素膜(3)上设有检测线抗体(5)和质控线抗体(6)；在金标垫(2)上设有金标抗体。

所述的金标垫(2)为聚酯纤维膜制成的垫。 

所述的样品垫(1)为玻璃纤维膜制成的垫。 

所述的金标抗体为显色抗体，检测线抗体为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体。 

所述的金标抗体用40nm纳米金壳标记。 

一种制备人血液H-FABP纳米金标检测试纸条的方法，包括以下步骤： 

(1)采用“种子”生长法制备策略，以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备出单分散的银 纳米颗粒作为牺牲模板，通过置换反应获得胶体级、高分散的金纳米壳(40nm)。

(2)调节纳米金壳溶液pH8.0～8.5，加入显色抗体(1株抗人H-FABP单克隆抗体)与纳米金壳溶液反应，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗体溶液； 

(3)将聚酯纤维膜预处理后，烘干，用金标抗体溶液喷印；

(4)用捕捉抗体(1株抗人H-FABP单克隆抗体BT01)在已活化硝酸纤维膜上喷划检测线，真空干燥；然后用羊抗鼠IgG在已活化硝酸纤维膜上喷划质控线，真空干燥；

(5)按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，切割，装入塑料卡，包装；

其中，采用2株可互相形成夹心配对的抗人H-FABP抗体，其中1株作为捕捉抗体BT01，1株作为显色抗体BT02；用40nm纳米金壳标记显色抗体。

上述人血液H-FABP纳米金标检测试纸条在检测人血液中H-FABP的应用。 

有益效果：本发明的人血液H-FABP纳米金标检测试纸条，使用中空的金纳米壳代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人H-FABP检测，特异性高，由于中空金纳米壳所呈现的颜色(墨绿色)，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒(暗红色)产生更好的分辨光信号。而且由于中空金壳的重量轻于同样大小的实心纳米金颗粒(平均直径均为40nm)，其免疫层析的速度加快，有利于试纸的快速检测。结果易观察，灵敏度达到7ng/mL，15-30min内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性，操作简便，无需特殊仪器设备，可应用于急性心肌梗死和急性心肌损伤的早期诊断。 

附图说明

图1是试纸条的结构示意图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。 

实施例1 

(1)纳米金壳溶液的制备：

以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备单分散的银纳米颗粒作为“种子”：在70℃的水浴下将80mL去离子水加热至恒温，加入20mL 1％(wt)的柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，加入1.7mL 10mg/mL的AgNO₃溶液，剧烈搅拌下加入2mL 1％NaHB₄溶液，然后持续加热和搅拌1h，室温冷却后定容至100mL。

银纳米颗粒的“种子”生长：向80mL去离子水中加入2mL 1％柠檬酸钠溶液并加 热到沸腾状态，然后加入一定体积的银种子溶液，在剧烈搅拌过程中，加入1.7mL 10mg/mL的AgNO₃溶液，继续保持搅拌和加热30min，室温冷却后定容到100mL。 

以银纳米颗粒为牺牲模板，通过置换反应制备胶体级、高单分散的金纳米壳：取30mL银纳米颗粒溶液，在12500g下离心20min，倒出上清液，再以去离子水定容到100mL。将此100mL的银纳米颗粒溶液加热到沸腾状态，在剧烈搅拌下加入2mM HAuCl₄溶液2mL，反应液颜色逐渐由黄色转变为墨绿色，室温冷却。 

(2)显色抗体的金标记： 

用0.1M K₂CO₃调节纳米金壳溶液至pH8.2。于100mL纳米金壳溶液中逐滴加入显色抗体(鼠抗人H-FABP抗体BT02)3mg，搅拌5min，静置30min。再加入25mL 5％BSA+20mM Tris-HCl(pH8.2)，4℃封闭过夜，得反应液。反应液于4℃，4000g，离心30min，沉 淀用125mL 1％BSA+20mM Tris-HCl(pH8.2)重悬，重复离心两次，离心速度依次为3000g、2000g得沉淀。用1200μl重悬液(30％海藻糖，1％BSA，0.01％Tween-20，0.02％NaN₃，20mM Tris-HCl，pH8.2)悬浮沉淀，得金标抗体，金标抗体浓度优选0.8～1.3。

(3)金标垫制备及喷垫： 

膜处理液配制：0.25％Triton X-100，0.15mM NaCl，0.05M Tris(pH7.5)；聚酯纤维膜(S&S公司)在膜处理液中浸泡1h，真空干燥；以2μl/cm，将金标抗体喷印在金标垫上。

(4)检测线制备： 

取1株抗人H-FABP单克隆抗体BT01(可与鼠抗人H-FABP抗体BT02配对形成夹心)做检测线抗体，以缓冲液(10％海藻糖，6％甲醇)稀释为1mg/mL；用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为1ul/cm形成检测线，真空干燥。

(5)质控线制备： 

羊抗鼠IgG用缓冲液(10％海藻糖，6％甲醇)稀释为0.5mg/mL；用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为0.5ul/cm形成质控线，真空干燥。

(6)试纸条装配： 

将样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4按顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，如图1所示，在硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6；切割6cm宽度粘贴后的塑料板，装入检测卡；用带有干燥剂的热封锡箔袋包装，室温保存。

(7)检测： 

将样品100μl滴加入加样孔，15min时观察，判读试纸条检测结果的标准为：阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带；试纸条失 效，质控线处无显色条带。

实施例2 

将100μl配制的5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和40ng/mL H-FABP标准品样品滴加入样品孔，15min，观察结果，检测结果：40ng/mL的参考品5min内检测线出现墨绿色线；20ng/mL的参考品10min内检测线出现墨绿色线；10ng/mL的参考品15min内检测线出现墨绿色线；5ng/mL的参考品30min内检测线不出现墨绿色线。

参照标准样品检测的方法，对200例体检正常人血浆标本进行检测，其中198例30min内检测线不出现墨绿色线。可见，15-30min为有效结果，15min后有阳性，可认为阳性，达到30min还是阴性，判定为阴性。 

实施例3 

(1)人心肌H-FABP的纯化：

取人左心室肌在缓冲液中匀浆，多步骤离心后以(NH₄)₂SO₄进行盐析→离心→沉淀缓冲液重悬透析得蛋白粗提液→Sephadex G-75凝胶过滤→电泳确定主要蛋白条带的收集管号合并收集→Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析→聚乙二醇浓缩→缓冲液透析得人心脏型脂肪酸结合蛋白。纯化品以SIGMA公司人心脏型脂肪酸结合蛋白为对照标准品，以Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定相对分子质量15KD，纯度达90％以上，并经质谱确认。

(2)H-FABP单克隆抗体制备 

免疫动物：选8-12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠，以经典法纯化的120μL H-FABP(含蛋白质100μg)与120μL福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的H-FABP与等量福氏不完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内加强免疫，共3～4次。

采用间接ELISA法检测免疫小鼠尾静脉血抗体。 

细胞融合：选滴度较高的-Balb/C小鼠准备融合，融合前3d经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg H-FABP。 

取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(分子量：2000)分别置于37℃水浴中预温。准备盛37℃水的500mL烧杯1只。 

分别取骨髓瘤细胞2.4×10⁷/10mL，脾细胞1.8×10⁸/10mL加入灭菌50mL离心管中，混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。 

将两种细胞悬液充分混匀后，1000rpm离心10min，倒尽上清液，用手指弹击管底，使两种细胞混匀成糊状。 

将离心管置于37℃预温的盛水烧杯中，用吸管吸取0.8mL预温的50％PEG溶液，1min内加完，静置90s。 

立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液，使PEG稀释而停止作用。滴加方法是前30s加1mL；后30s加3mL；然后在3min内加完15mL。 

补加DMEM无血清培养液至40mL，1000rpm离心10min，倒尽上清液。 

在离心收集的细胞中加40mL含15％-20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管轻轻混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃，7％CO₂的培养箱中培养。 

杂交瘤细胞的克隆及筛选：细胞融合后HAT培养液中进行选择培养。 

采用间接ELISA检测培养孔上清特异性抗体。 

杂交瘤细胞的克隆化：选阳性最高孔采用有限稀释法亚克隆克隆筛选细胞株，阳性细胞株液氮冻存。 

(3)单克隆抗体的制备： 

在接种杂交瘤细胞前，Balb/c小鼠腹腔内注射0.5mL降植烷或液体石蜡，然后每只小鼠腹腔内注射5×10⁵～10⁶个杂交瘤细胞。接种杂交瘤细胞约7～10日后，小鼠腹部明显涨大，用75％乙醇消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支试管，将灭菌的注射针头刺入小鼠下腹部，让腹水滴入管内。间隔2～3d后，待腹水再积累后，同法再取腹水，共取2-3次，通常每只小鼠可收获腹水5～10mL，4℃保存。收集的腹水，1500rpm离心10min，吸取上清液，加入0.02％叠氮钠。间接ELISA法检测腹水抗体浓度，Protein A-Sepharose柱纯化。制得鼠抗人H-FABP抗体BT02。

抗人H-FABP单克隆抗体BT01的制备方法同鼠抗人H-FABP抗体BT02的制备方法。选取可以配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体BT01和鼠抗人H-FABP抗体BT02来使用即可。 

羊抗鼠IgG免疫动物：选取成年健康羊，以经典法纯化的小鼠IgG 2ml与2ml福氏完全佐剂充分混匀，注入羊静脉内，每隔2周2ml/只的小鼠IgG与等量福氏不完全佐剂充分混匀，注入羊静脉内加强免疫，共3～4次。收集羊血，间接ELISA法检测羊血抗体浓度，Protein A-Sepharose柱纯化。制得羊抗鼠IgG。 

Claims (3)

1.一种人血液H-FABP纳米金标检测试纸条，其特征在于：包括设在固定板上依次相连的样品垫（1）、金标垫（2）、硝酸纤维素膜（3）和吸水纸（4）；在硝酸纤维素膜（3）上设有检测线抗体（5）和质控线抗体（6）；在金标垫（2）上设有金标抗体，所述的金标垫（2）为聚酯纤维膜制成的垫，所述的样品垫（1）为玻璃纤维膜，所述的金标抗体为显色抗体，检测线抗体为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体，所述的金标抗体用40nm纳米金壳标记。

2.一种制备权利要求1所述的人血液H-FABP纳米金标检测试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用“种子”生长法，以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备出单分散的银纳米颗粒作为牺牲模板，通过置换反应获得胶体级、高分散的40nm金纳米壳；具体步骤如下：以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备单分散的银纳米颗粒作为“种子”：在70℃的水浴下将80mL去离子水加热至恒温，加入20mL重量百分比为1%的柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，加入1.7mL10mg/mL的AgNO₃溶液，剧烈搅拌下加入2mL1%NaHB₄溶液，然后持续加热和搅拌1h，室温冷却后定容至100mL；

银纳米颗粒的“种子”生长：向80mL去离子水中加入2mL1%柠檬酸三钠溶液并加热到沸腾状态，然后加入一定体积的银种子溶液，在剧烈搅拌过程中，加入1.7mL10mg/mL的AgNO₃溶液，继续保持搅拌和加热30min，室温冷却后定容到100mL；

以银纳米颗粒为牺牲模板，通过置换反应制备胶体级、高单分散的金纳米壳：取30mL银纳米颗粒溶液，在12500g下离心20min，倒出上清液，再以去离子水定容到100mL，将此100mL的银纳米颗粒溶液加热到沸腾状态，在剧烈搅拌下加入2mM HAuCl₄溶液2mL，反应液颜色逐渐由黄色转变为墨绿色，室温冷却；

（2）调节纳米金壳溶液pH8.0～8.5，加入显色抗体与纳米金壳溶液反应，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗体溶液；

（3）将聚酯纤维膜预处理后，烘干，用金标抗体溶液喷印；

（4）用捕捉抗体在已活化硝酸纤维膜上喷划检测线，真空干燥；然后用羊抗鼠IgG在已活化硝酸纤维膜上喷划质控线，真空干燥；

（5）按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，切割，装入塑料卡，包装；

其中，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相形成夹心配对的抗人H-FABP抗体。

3.权利要求1所述的人血液H-FABP纳米金标检测试纸条在检测人血液中H-FABP的应用。

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