CN105424937B - 一种猴早期妊娠检测的孕酮胶体金免疫层析试纸条 - Google Patents

一种猴早期妊娠检测的孕酮胶体金免疫层析试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物免疫生化检测技术领域，具体涉及一种检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条。该试纸条包括PCV底板,吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、金标垫和样品垫；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在PCV底板上；其特征在于：金标垫上含有孕酮单克隆抗体；硝酸纤维素膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水滤纸，二者相互交叠组成，同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成；能检测猴早期妊娠的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2015170的杂交瘤细胞株分泌的。本发明的试纸条灵敏度高，操作简便，对提高猕猴、金丝猴等猴类的繁殖监测具有重要意义。

Description

一种猴早期妊娠检测的孕酮胶体金免疫层析试纸条
技术领域
本发明属于动物免疫化学检测技术领域，具体涉及一种猴早期妊娠检测的孕酮胶体金免疫层析试纸条。
背景技术
猴是一个总称，灵长目中很多动物被我们称之为猴，其大脑发达，是非人灵长类中最高等的类群，猴一般为单胎动物，极少数会达到两个或者三个。猕猴是猴类中最常见的一种，其代谢特点，生理机能及免疫代谢方面与人类极为相似，其繁殖季节一般为9月份至次年的4月份；金丝猴也属于季节性繁殖动物，有很明显的交配高峰，一般在9-12月份，生产一般在3-5月份。猕猴、金丝猴等猴类均为国家重点保护的野生动物，野外救治和人工繁育种群数量较大，对其开展保护和利用，意义重大。繁殖问题是猕猴、金丝猴等等野生动物迁地保护成败的关键问题之一。在繁殖监测技术方面，如今用于猴类妊娠检测的方法一般为子宫触摸、B超检测和试剂盒检测等，但是由于子宫触摸法和B超检测会对猴类造成较大的应激，容易造成流产和死亡；利用试剂盒检测，成本较高，耗时较长，并不是检测猴繁殖状态的最佳方法。
胶体金技术是在70年代初期由Faulk和Taylor创造的，该法经济节约，快速简便，无需任何仪器，对动物无毒害作用，目前已经广泛的用于人、牛、猪等的早期妊娠检测。尿液中的性激素及性激素代谢物的含量很好的反映了血液中性激素的变化，利用尿液中性激素及代谢产物的含量也能检测动物的生理状态。孕酮是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，是维持妊娠所必需。在怀孕期间，胎盘会大量分泌孕酮，经代谢从尿中排出。研究表明，金丝猴和猕猴在妊娠一个月时孕酮水平便大幅度增加，故而可以利用尿液中孕酮的含量变化来检测猴的早期妊娠。而且本发明在实施以前，曾试验用人医的现有的早期妊娠检测试纸对金丝猴和猕猴的早期妊娠进行检测，也曾试验过用现有的牛孕酮检测试纸条对金丝猴和猕猴的尿液进行了检测，但是并不能检测出金丝猴和猕猴是否早期妊娠的生理状态。
发明内容
本发明的目的在于研制一种能快速且无害的检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条，使工作人员能够快速准确地监测掌握猴的繁殖生理状态，加强对繁殖期猴的管理，从而提高猴的繁殖率。
本发明是基于制备得到一种能够检测孕酮的单克隆抗体(该单克隆抗体是由杂交瘤细胞LX20150930分泌的，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株LX20150930，于2015年9月30日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCC2015170，通过制备胶体金，标记纯化后的抗体，优化各项层析条件等完成了本发明。
本发明通过以下技术方案实现：
一种检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条,包含PCV底板,吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、金标垫和样品垫；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在PCV底板上，本发明的特征在于：所述的金标垫上含有孕酮单克隆抗体，硝酸纤维素膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水滤纸，二者相互交叠组成，同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成；
能检测猴早期妊娠的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2015170的杂交瘤细胞株LX20150930分泌的。
本发明猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条研制过程包括孕酮试纸条最佳条件的确定、试纸条的组装以及试纸条特异性、灵敏度、阳性率的鉴定。
本发明所用的制备猴早期妊娠检测试纸条的检测方法属于竞争法，结果判定当试纸条出现一条杠判定为妊娠，出现两条杠判定为未妊娠。
本发明方法简便，易操作，经济且省时。
进一步，检测猴早期妊娠的孕酮胶体金免疫层析试纸条包括PCV底板、样品垫、孕酮单克隆抗体金标垫，硝酸纤维素膜(NC膜)以及吸水滤纸，其中NC膜上设有一条检测线(即T线)和一条质控线(即C线)，在所述的NC膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水滤纸相互交叠组成，同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成。
将胶体金颗粒标记到孕酮单克隆抗体上成为本发明的金标抗体，使其能够捕获猴尿液中的孕酮激素；孕酮与OVA的偶联物包被与检测线(即T线)；羊抗小鼠IGg二抗包被与对照线。将孕酮胶体金试纸条的样品垫一端放入猴尿液中，尿液样品将沿着试纸条移动，当样品移动至孕酮单克隆抗体金标垫时，金标抗体会与样品中的孕酮优先结合成复合物。如果样品中的孕酮有足够的量，那么当样品移动至检测线时，金标抗体将不会再与检测线上的孕酮-OVA偶联物结合，故而金标抗体复合物不会在检测线上滞留，检测线不呈显红色，只有一条对照线显色；若样品中无孕酮或者孕酮含量不足以使金标抗体完全结合，则金标抗体便会与检测线 上的孕酮-OVA偶联物结合使检测线成红色，试纸条便会有两条线显色。
本发明的的能检测孕酮的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株LX20150930所分泌的，该杂交瘤细胞株LX20150930于2015年9月30日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2015170。
所述的孕酮包被原是购自上海药巢生物工程有限公司。
本发明的杂交瘤细胞株LX20150930可在制备检测孕酮的单克隆抗体中应用。
本发明的单克隆抗体可在制备检测猴早期妊娠的胶体金免疫层析试纸条中应用。
本发明的胶体金免疫层析试纸条可在猴早期妊娠检测中的应用。
申请人提供了一种检测猴早期妊娠的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶体金试纸条对尿液进行检测的步骤。
具体操作步骤如下：
1、利用上海药巢生物工程有限公司提供的孕酮免疫原免疫小鼠，经过细胞融合后获得保藏编号为CCTCC NO：C2015170的杂交瘤细胞株LX20150930；
2、复苏保藏编号为CCTCC NO：C2015170的杂交瘤细胞株LX20150930免疫小鼠得到腹水，并用辛酸硫酸铵法提纯的孕酮单克隆抗体；
3、利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；同时优化标记条件；得到孕酮胶体金免疫层析试纸条；
4、对孕酮胶体金免疫层析试纸条的各项性能进行测定。
本发明的突出效果建立了一种能够检测猴早期妊娠的胶体金免疫层析试纸条，并对其进行的测定，结果表明该试纸条灵敏度高、特异性强，可直接检测尿液，对猴无伤害。而早期尝试使用人的早期妊娠检测试纸及牛的孕酮检测试纸条对金丝猴和猕猴的尿液进行了检测，并不能检测出其生理状态。
更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。
附图说明
图1：本发明的孕酮胶体金免疫层析试纸条的结构及组装示意图。
图2：胶体金最佳pH值确定。
图3：本发明的孕酮胶体金免疫层析试纸条的成品及结果判定图。
图4：本发明的猴孕酮胶体金免疫层析试纸条对金丝猴样本初步检测结果图。
图5：本发明的孕酮胶体金免疫层析试纸条猕对猴重复样本初步检测结果图。
具体实施方式
实施例1 单克隆抗体的制备与纯化
1.杂交瘤细胞的制备：取免疫效果较好的小鼠的脾细胞进行细胞融合，融合前三天对小鼠进行加强免疫，用骨髓瘤细胞与脾细胞混合，经PEG-2000处理后置37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。之后根据细胞的生长情况，取细胞培养上清，利用ELISA方法筛选出分泌孕酮抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法克隆化，最终建立得到一株稳定的分泌且能够检测孕酮的单克隆抗体的杂交瘤细胞，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株LX20150930，于2015年9月30日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：C2015170。
2.孕酮单克隆抗体的制备与纯化：用RPMI 1640基础培养基(购自Hyclone公司)悬浮培养由保藏编号为CCTCC C2015170的杂交瘤细胞株LX20150930扩大培养的细胞，在接种前7天取Balb/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)4只，每只小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂进行预处理，待小鼠腹腔明显膨大时采集腹水，收集的腹水在5000r/min离心10min后，去掉表面油层，小心吸取上清，分装后置-20℃保存备用。对提取的腹水进行预处理：与等体积的巴比妥缓冲液(取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并定容至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过，即得)混合，加入适量的二氧化硅，室温搅拌30min，静置5分钟，3000r/min，离心10min，得澄清腹水。取预处理后的腹水加2倍体积的0.06mol/L的醋酸缓冲液(0.02mol/L的醋酸缓冲液稀释来的。0.02mol/L的醋酸缓冲液的制备：称取1.6406克无水乙酸钠，用水溶解后，用水稀释至约960ml，然后用冰乙酸调溶液pH值至5.0,再定容至1000ml)，用盐酸调节pH至4.5，充分搅拌下在30min钟内。每毫升(按原腹水体积计算)30ul的辛酸缓慢加入，4℃静置2h，取出，然后在4℃，15000r/min，离心30min，弃沉淀。用饱和硫酸铵(500g硫酸铵加入500ml的蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调pH至7.8)沉淀单抗，上清液经滤膜过滤，再加入1/10体积的0.1M磷酸缓冲液(准确称取10.86g Na2HPO4和6.08g NaH2PO4，加入双蒸水充分稀释后定容至1000mL)，用氢氧化钠调节pH至7.6，冰浴搅拌下加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL，于4℃静置后离心，沉淀用磷酸盐缓冲液(准确称取8g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa2HPO4,0.24g KH2PO4,加入双蒸水使之溶解，并定容至1000mL)重悬，透析。将透析完全的抗体于4℃，5000r/min离心30min，利用紫外吸收法测定蛋白质浓度。用SDS-PAGE电泳鉴定纯化后抗体的纯度，结果表明该单克隆抗体可用于标记胶体金。
实施例2 金标抗体相关溶液的制备
1、各种溶液的配制：
(1)柠檬酸三钠溶液的配制：准确称取0.5697g柠檬酸三钠，用超纯水溶解，并定容至50mL。4℃保存备用。
(2)氯金酸溶液的配制：取1g固体氯金酸用超纯水溶解，并定容至100mL。4℃保存备用。
(3)碳酸钾溶液的配制：0.01mol/L,准确称取1.38g K2CO3，用超纯水水溶解，并定容至100mL。4℃保存备用。
(4)磷酸盐缓冲液(PBS)的配制：准确称取1.00g牛血清白蛋白(BSA)溶于少量0.01MpH 7.2PB溶液中，用双蒸去离子水定容至100mL。
(5)10％牛血清白蛋白(BSA)溶液的配制：准确称取BSA 1.00g溶于10mL 0.02MpH7.2PB溶液中，用0.22μm的膜过滤，现配现用。
2、氯金酸溶液的制备与纯化
将1ml氯金酸溶液加入到99ml的三蒸水中，加热至100℃，然后迅速向其中加入1ml1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热，当溶液变为酒红色时取下金溶液，再搅拌10分钟至溶液冷却，用超纯水将溶液定容至原体积，放4℃备用。
溶液质量鉴定：肉眼观察法，观察颜色是否有变化，是否有浑浊出现，是否有凝胶形成。
3、金标抗体溶液的制备
(1)最适孕酮抗体量的确定
用0.2mol/L的碳酸钾溶液将胶体金溶液调至pH值为8.2，取胶体金溶液1ml分别加入8个小试管中。将本发明制备的孕酮单克隆抗体逐级稀释后，取等体积单抗稀释液按顺序分别加入上述试管中，设一管不加抗体的对照管，具体设计如表1所示。放置10分钟后，在各试管中加入10％氯化钠溶液0.1ml，混匀后静置。观察各试管中胶体金溶液变化，未加抗体及加入量不足的溶液颜色由红色变蓝色，而加入抗体量达到或超过饱和量的溶液则保持不变。标记抗体量为在最低稳定胶体金溶液不变色的抗体量基础上再加20％抗体量。
表1胶体金标记孕酮单克隆抗体的最适稳定浓度的确定
(2)最适pH的确定
采用pH梯度法。取9个离心管各加入1ml胶体金溶液，各管依次调节pH(见表2)，在各管中加入最适抗体的量，混匀，室温静置15分钟。用紫外分光光度计测定521nm波长处的吸光值。
表2胶体金标记孕酮单克隆抗体的最适标记pH的确定
(3)金标抗体溶液的制备
1)调节pH：首先将氯金酸溶液放在磁力搅拌器上，调节温度和速率，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH，搅拌均匀，一般20ml的金溶液需加入200ul的碳酸钾溶液；
2)将孕酮单克隆抗体(简称单抗)用三蒸水稀释10倍，然后缓慢的加入到金溶液中，搅匀30min；
3)加入1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液搅拌5min；
4)再加入0.605ml的PEG-2000，搅拌30min；
(4)金标抗体复合物的纯化
1)将金标溶液分装到1.5mL离心管中，12000r/min离心30min，去上清。
2)加入硼酸至原始体积，4℃静置30min，4℃、12000r/min离心30min，去上清。
3)加入1mL硼酸，4℃、12000r/min离心30min，去上清。
4)加入1mL硼酸，4℃、4000r/min离心20min，浓缩溶液至1mL，4℃保存备用。
实施例3 孕酮胶体金免疫层析试纸条的制备
1.包被抗原稀释液及浓度的确定
(1)最佳稀释液的确定：
各种稀释液的配制：
a.0.01mol/L的TBS溶液，pH＝7.6
b.0.01mol/L的TBS溶液，pH＝9.0
c.0.01mol/L的PBS溶液，pH＝7.6
d.0.01mol/L的碳酸盐缓冲液溶液，pH＝9.0
e.双蒸水
将包被抗原(孕酮-OVA，购自上海药巢生物工程有限公司)用上述五种溶液分别稀释为0.2mg/ml、0.6mg/ml、1.0mg/ml、1.4mg/ml，然后用点膜仪将抗原包被于试纸条上，干燥后滴加金标抗体，观察结果，确定最佳稀释液。
(2)包被抗原浓度的确定
用最佳稀释液将抗原稀释为0.2mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml，将不同浓度的包被抗原点在试纸条上作为检测线，然后用其检测阴性样品，观察试纸条显色结果，从而确定最佳包被抗原的浓度。
2.硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
硝酸纤维素膜(NC膜)选用美国Millipore公司产品，规格25mm×100m；安装膜，调整机器，使膜在两铁板间松紧适度，膜眼应紧靠膜两边且松紧适度；确认要喷膜的检测线、质控线，将抗体分放在左右两边，用XYZ3000喷金喷膜机喷膜，检测线即T线上喷1.2ug/uL的孕酮包被原，质控线即C线上喷0.6ug/uL的羊抗鼠IGg；包被后的硝酸纤维素膜送入真空干燥箱，40分钟后取出，封入内装干燥剂的铝箔带，室温存放备用。
3.试纸条的制备
本发明的孕酮胶体金检测试纸条包含PCV底板,吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸、金标垫和样品垫；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在PCV底板上，金标垫上含有孕酮单克隆抗体，硝酸纤维素膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水滤纸，二者相互交叠组成；同时孕酮单克隆抗体金标垫又与样品垫交叠组成。
4.结果判定
结果如图3所示。图3中阴阳性判断标准如下：
阴性(-)：T线显色，表示尿液中孕酮浓度低于试纸条的检测限。表示空怀(未受孕)。
阳性(+)：T线不显色，均表示猴尿液中孕酮高于试纸条的检测限。表示妊娠
无效：未出现C线，说明胶体金免疫试纸条失效。
实施例4 孕酮胶体金试纸条的特异性、灵敏度和阳性率的测定
1.本发明的胶体金试纸条灵敏度的测定
用甲醇将孕酮标准物稀释成不同的浓度梯度：3.125ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml。然后用本发明制备的试纸条进行检测，用TBS作为阴性对照，五分钟后观 察结果。
2.本发明的胶体金试纸条特异性检测
分别将雌酮、孕酮、睾酮、雌二醇、11a-羟基孕酮稀释成一定的浓度(25ng/mL)，用本发明制备的试纸条进行检测，五分钟后观察结果。
3.本发明的胶体金试纸条阳性率的检测
取100ul的金丝猴和猕猴尿液滴加到已组装好的胶体金试纸条上，五分钟后观察显色结果。
结果分析
1、氯金酸溶液的质量鉴定结果
本发明中氯金酸溶液的鉴定方法是直接进行肉眼观察：溶液呈酒红色、无浑浊出现、无肉眼可见的颗粒物悬浮物、清亮透明、无凝聚现象形成，说明制备出的胶体金溶液良好，符合试验要求。
2、胶体金制备过程中各最佳条件的确定结果
(1)最适抗体量的确定
结果显示，八个小试管1号管为对照，呈蓝色，而后2-8号管依次为浅蓝色、浅蓝色、浅红色、浅红色、浅红色、红色、红色。可以清晰的得出抗体量为3-7ug/ml的小试管(即编号为2-6号管)颜色均发生了改变，而8、9ug/ml(即编号为7-8号管)的小试管颜色为红色，且两者颜色接近几乎无变化，说明所得结果抗体量为7ug/ml，因此本发明确定最适标记抗体量为8ug/ml。
(2)最适pH的确定
从图2可以看出，该曲线的峰值在pH＝13处，即在520nm处，pH为13的溶液吸光值最大，得出最适pH值为13。
(3)最适包被液的确定
结果显示，由包被液b制成的试纸条显色较明显，而其他包被液所制试纸条显色不明显或者不显色，故而得出，本发明的最适包被液为b号管即0.01mol/L的TBS溶液，PH＝9.0。
(4)最适包被抗原量的确定
结果显示，在包被抗原的量为1.2ng/ml时显色结果较好。
3、孕酮胶体金试纸条的性能测定结果
(1)灵敏度测定结果
结果显示，孕酮标准液的浓度分别为3.125ng/ml、6.25ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml。其中3.125ng/ml、6.25ng/ml为两条杠，12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml为1条杠。说明该试纸条的灵敏度为12.5ng/ml。
(2)孕酮胶体金试纸条特异性检测
结果显示，检测样品分别为TBS、雌酮、孕酮、睾酮、雌二醇，孕酮为一条杠，TBS、雌酮、睾酮、雌二醇均为两条杠，即该试纸条与TBS、孕酮、睾酮、雌二醇无交叉反应出现，试纸条特异性良好。
(3)尿液样本测定
本实验对来自神农架的5只金丝猴的尿液样本和2只猕猴的尿液样本进行了初步测定，结果如下：
表3金丝猴样本测定结果
注：圆圆、神女、乔乔、娇娇、花花均为金丝猴名字。“－”显色较明显，表示阴性，“+”没有显色，表示阳性。
表4猕猴样本的重复测定结果
注：“－”显色较明显，表示阴性，“+”没有显色，表示阳性。由于采样基地猕猴样本较难采集故而初步检测仅采集了两只猕猴尿液。但本实施例对其进行了多次重复测定。
本发明在金丝猴妊娠期观察了各个金丝猴的生理状态，实际情况与本发明测定结果基本相符，并对猕猴进行了B超检测，检测结果与本发明相一致，说明本发明的试纸条具备良好的可行性。

Claims (1)

1.保藏号为CCTCC NO：C2015170的孕酮杂交瘤细胞LX20150930分泌的孕酮单克隆抗体制备的孕酮胶体金免疫层析试纸条在猴早期妊娠检测中的应用，其特征在于：金标垫上含有保藏号为CCTCC NO：C2015170的孕酮杂交瘤细胞LX20150930分泌的孕酮单克隆抗体；硝酸纤维素膜的两端分别是孕酮单克隆抗体金标垫和吸水垫，吸水垫与硝酸纤维素膜交叠，硝酸纤维素膜与孕酮单克隆抗体金标垫交叠，孕酮单克隆抗体金标垫与样品垫交叠。
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