CN104237538B - 一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条及其制备方法，包括主要溶液的配制，包括制备柠檬酸三钠溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3溶液、制备PBS溶液、制备牛血清白蛋白(BSA)溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液；胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕酮抗体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、胶体金试纸条的组装。本发明的试纸条稳定效果好，具有良好的稳定性，灵敏性和敏感性均较高，利于临床应用，利于指导临床的配种工作，能够有效地指导工作人员对疾病的诊断、治疗，提高受胎率。

Description

一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于生化领域，尤其涉及一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条及其制备方法。
背景技术
在实际生产中对奶牛妊娠检测普遍依靠直肠检查和B超检查，直肠检查的不确定性和B超仪器的价格高昂成为了临床应用的弊端。孕酮是一种甾体类激素，作为卵巢的指示剂，监测奶牛体内分泌孕酮含量的变化能够有效对妊娠情况和繁殖状况进行检测，是进行早孕检查和繁殖疾病监测的一种有效方法。
胶体金试纸条检测方法具有易学、快速、方便、成本低、无需任何仪器设备条件和所用试剂无毒害性等优点，适合在实际生产当中的各项要求。通过检测奶牛乳汁中孕酮的含量通过胶体金呈现出的颜色反应变化，很直观的判定出孕酮的浓度高低，判定出奶牛妊娠情况。国外在奶牛早孕检测方面已经有很多类似的产品，并得到了很好的应用。国内对奶牛孕酮检测的研究也有很多相关的产品如试剂盒、传感器和胶体金等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，旨在解决在实际生产中对奶牛妊娠检测普遍依靠直肠检查和B超检查，直肠检查具有不确定性和B超仪器的价格高昂的问题。
本发明是这样实现的，一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法的制备方法包括：
步骤一、主要溶液的配制，包括制备柠檬酸三钠溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3溶液、制备PBS溶液、制备BSA溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液；
步骤二、胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕酮抗体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、胶体金试纸条的组装。
进一步，所述的主要溶液的配制的具体方法如下：
制备柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠和100mL加超纯水，制备成浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，现用现配；
制备氯金酸溶液：称取1g氯金酸，和超纯水100mL，制备成氯金酸溶液，4℃保存；
制备K2CO3溶液：称取0.1gK2CO3溶于100mL超纯水，制成K2CO3溶液，现用现配；
制备PBS溶液：将8.09gNaCL、0.29gKH2PO4、0.29gKCL和2.99gNa2HPO4.2H2O混合，加蒸馏水至1000mL，将pH值调至7.4；
制备BSA溶液：称取5g的BSA加入100mL超纯水，充分溶解；
制备样品垫处理液：含1％(w/v)BSA，1％(w/v)PVP，0.5％Tween-20和0.02％(w/v)叠氮钠的Tris(0.05M pH＝5.5)；
制备金标复溶液：含20％(w/v)蔗糖，1％(w/v)BSA，1％(w/v)PVP和0.02％(w/v)叠氮钠的PBS(0.015M pH＝7.4)。
进一步，胶体金的制备的具体方法为：
应用柠檬酸三钠还原法[95]制备胶体金，操作步骤：将现配的1％氯金酸溶液1mL，稀释至100mL(终浓度为0.01％)，用微波炉加热至100℃后，迅速向其中加入1％柠檬酸溶液2mL，搅拌均匀，继续加热3min，直至溶液由灰黑色变成酒红色时取出，继续搅拌10min，冷却至室温，用去离子水或超纯水定容将所失水分补充至原体积，重复制备三到四次，用一次性滤膜(0.22μm)过滤后，4℃保存备用。
进一步，胶体金质量鉴定的具体方法为：
直观鉴定：肉眼观察胶体金的颜色变化，看有无浑浊、是否透明、有无折光性和有无凝胶；
电镜观察：观察胶体金颗粒大小、形态和密度；
可见光谱观察：在分光光度计OD400nm至OD700nm光谱范围内对胶体金溶液进行扫描，根据所得的数值判断胶体金颗粒的直径与最大吸收波长之间的关系，评价胶体金溶液的质量；
稳定性鉴定：将胶体金溶液放置于室温、4℃和37℃分别存放24h，观察其凝聚情况。
进一步，金标孕酮抗体复合物的制备与纯化的具体方法为：
单克隆抗体的除盐：标记前的单克隆抗体应彻底除盐，具体方法：将抗体溶液用PBS溶液(pH＝7.4)4℃透析过夜，4℃离心1h(15000rpm)，抽取上清去除沉淀，4℃保存备用；
确定胶体金最适蛋白标记量：通过Mey氏稳定性实验确定胶体金最适蛋白标记量，具体方法：取2mL离心管7个，分别编号，分别加入1mL胶体金溶液，由10μg/mL-60μg/mL加入逐级稀释后的孕酮抗体蛋白溶液，其中一管为空白对照，室温稳定5分钟后，分别向各管加入0.1mL的10％氯化钠溶液。将上述溶液摇匀后，静止2h，最后观察结果；
紫外分光光度计确定最适抗体标记量：将配置溶液静置4h，5000rpm离心1h，测定溶液在520nm下的吸光度值；OD值为垂直纵坐标，抗体蛋白用量为水平横坐标绘制曲线；
胶体金标记抗体最适pH值的测定：胶体金溶液对pH计电极有损害，本研究中关于胶体金溶液pH值的测定使用pH试纸，确定胶体金标记抗体的最适pH值；
胶体金标记抗体方法：称取胶体金溶液置于锥形瓶，称量100mL的0.1mol/LK2CO3或0.1mol/L的HCl溶液将胶体金溶液的pH值调整至8.6；加入48μg/mL孕酮单克隆抗体溶液48μL，逐滴加入，边加边搅拌，加完后再继续搅拌30min；再加入5％PEG2000溶液，最终浓度为1％，再搅拌30min；
金标抗体复合物纯化：采用离心纯化法纯化金标孕酮抗体，4℃条件下以2,000r/min低速离心1h，弃去沉淀；将上清液再次15000r/min高速离心1h，弃上清；之后4℃条件下18,000r/min离心1h，反复离心两次；最后将沉淀用金标抗体稀释液稀释为原体积的10％，置于4℃冰箱备用。
进一步，抗原包被液和金标稀释液的选择的具体方法为：
抗原包被稀释液选择：
A溶液：0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)；
B溶液：0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液(TBS)(pH＝7.4)；
C溶液：0.01mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)；
D溶液：0.01mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.0)；
E溶液：0.01mol/L的TBS(pH＝9.0)；
抗原分别用A、B、C、D和E五种不同配方的包被液将包被抗原P4-OVA分别稀释到每毫升内含有0.1mg、0.3mg、0.5mg和1mg的抗原。之后在NC膜上点样.室温自然干燥，滴加纯化后的金标抗体，水平放置5min后.用洗涤液充分冲洗，观察五种溶液的显色情况；
P4抗原包被条件的确定：
将包被抗原P4-OVA稀释到0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL和2mg/mL，分别在NC膜上点样，做为控制线(T线)，室温下自然干燥，将以上不同稀释倍数的金标抗体的金标垫和包被有不同浓度的竞争抗原的NC膜进行组合，阴性样品测试观察比较检测线(C线)和T线的显色情况，以此来确定竞争抗原的最佳包被浓度。
进一步，金标抗体稀释液选择和稀释度的选择的具体方法为：
金标抗体稀释液A：PBS0.01mol/L，pH＝7.4(含0.1％PEG20000、0.1％BSA)；2.5.2金标抗体稀释液B TBS0.01mol/L，pH＝8.0(含0.1％BSA、2％蔗糖和0.02％NaN3)；
金标抗体稀释液C PB0.01mol/L，pH＝7.4(含0.1％PEG2000、2％蔗糖和0.02％NaN3)；
将纯化后的金标抗体复合物经高速离心得到的浓缩金标抗体，用金标抗体稀释液A、B和C分别作2×、4×稀释后，吸附于NC膜上，干燥后组装成试纸条，观察胶体金显色情况和金水分离情况以比较其结果。
进一步，NC膜的选择和二抗包被浓度选择
用抗原包被液将二抗进行梯度稀释后，将其与几种不同浓度的抗原溶液，分别在NC膜上点样，阴性和阳性的结果均显色并清晰即；而可当对照线不显色时，视为失败。
进一步，NC膜封闭液和封闭时间的选择：
NC膜封闭液的选择：
封闭液A：0.01mol/L的PBST，pH＝7.4(含10％小牛血清)；
封闭液B：0.01mol/L的TBS，pH＝7.4(含3％BSA)；
封闭液C：0.01mol/L的PBS，pH＝7.4(含3％BSA)。
在NC膜上包被孕酮完全抗原和羊抗鼠二抗后，分别用封闭液A、B和C进行封闭，封闭时间为20min，室温自然干燥，之后滴加金标孕酮抗体复合物，再用PBST洗涤液充分冲洗后，观察NC膜层析情况及检测线的显色情况。
封闭时间的确定：
在NC膜上包被孕酮完全抗原后，封闭液封闭后分别在自然室温和37℃条件下孵育，时间分别为10min、30min和60min，观察检测线的显色情况。
进一步，样品垫的选择的具体方法为：
分别采用GF-06和GF-08两种样品垫组装试纸条后，滴加等量PBS溶液，比较在15s时间内溶液在样品垫上的吸收和扩散情况；
进一步，胶体金试纸条的组装的具体方法为：
步骤一、准备工作；将最佳包被浓度的竞争性孕酮抗原溶液和二抗溶液喷涂在NC膜上，分别做为T线和C线，经自然干燥，将最佳浓度的金标孕酮抗体喷涂到已经剪裁好的金标垫玻璃纤维膜上，4℃干燥备用；
步骤二、试纸条组装：试纸条由2cm的玻璃纤维膜、0.8cm的金标垫、2cm的吸水纸和2.5cm的硝酸纤维素膜组成。将上述物质依次包被于抗原带和二抗带等相应部位，4℃冰箱保存备用。
效果汇总
本发明的试纸条稳定效果较好，对特异性和敏感性均达到了85％以上，且在临床中数分钟即可读取结果，能够及时准确地检测奶牛的妊娠情况，能在4℃下保存2个月，具有良好的稳定性，灵敏性和敏感性均较高，利于临床应用，可以对处于黄体期的奶牛进行确诊，利于指导临床的配种工作，对患有持久黄体和黄体囊肿疾病奶牛的乳汁样品进行有效地检测，提高了临床对上述两种疾病的检测效率，能够有效地指导工作人员对此类疾病的诊断、治疗，也能够有效地指导配种，提高受胎率。
附图说明
图1是本发明实施例提供的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法的制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的胶体金溶液胶体金溶液的紫外波长曲线；
图3是本发明实施例提供的紫外分光光度计测定最佳蛋白浓度结果；
图4是本发明实施例提供的最佳标记pH值确定结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明实施例中，材料与主要溶液配制如下：
主要仪器设备：
96孔可拆酶标板购自Costar公司；超纯水制备装置购自美国LABCONCO公司；THE-82A恒温水浴锅购自荣华仪器设备厂；TECAN酶标仪购自美国SUNRISE公司；聚丙乙烯酶联反应板购自丹麦NUNC公司；旋涡混合器购自上海沪西分析仪器厂；透析袋DM25购自上海生工生物工程公司；紫外分光光度计购自上海精密科学仪器公司；HJ-3型磁力搅拌器购自江苏金坛国华仪器厂；微型空气压缩机和细菌滤器，购自浙江绍兴微型医疗设备有限公司；XHF-1内切式组织分散器购自宁波新芝生物科技股份公司；TGLL-18G高速冷冻离心机购自太仓市医疗器械公司；单道、多道移液器，购自美国Eppdorf公司。
主要试剂：
孕酮单克隆抗体和孕酮完全抗原均为实验室自制；TMB购自Sigma公司；四甲基联苯胺(TMB)、BSA购自Sigma公司；吐温-20(Tween-20)购自华美生物工程公司；标记二抗羊抗鼠IgG、卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)，Sigma公司；DMEM培养液购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司；考马斯亮蓝G-250(Coomassie Brilliant Blue G250)购自瑞士Fluka公司；无水乙醇、辛酸、无水乙酸钠、硫酸铵、甲醇、二氧化硅、石蜡、二氧化硅和PEG20000等均为国产分析纯或优级纯试剂；玻璃纤维素膜、PVC板、MAX线、吸水纸和硝酸纤维素膜等耗材，购自于上海捷宁生物科技有限公司。
本发明是这样实现的，一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法的制备方法包括：
S101：主要溶液的配制，包括制备柠檬酸三钠溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3溶液、制备PBS溶液、制备BSA溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液；
S102：胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕酮抗体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、胶体金试纸条的组装。
进一步，所述的主要溶液的配制的具体方法如下：
制备柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠和100mL加超纯水，制备成浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，现用现配；
制备氯金酸溶液：称取1g氯金酸，和超纯水100mL，制备成氯金酸溶液，4℃保存；
制备K2CO3溶液：称取0.1gK2CO3溶于100mL超纯水，制成K2CO3溶液，现用现配；
制备PBS溶液：将8.09gNaCL、0.29gKH2PO4、0.29gKCL和2.99gNa2HPO4.2H2O混合，加蒸馏水至1000mL，将pH值调至7.4；
制备BSA溶液：称取5g的BSA加入100mL超纯水，充分溶解；
制备样品垫处理液：含1％(w/v)BSA，1％(w/v)PVP，0.5％Tween-20和0.02％(w/v)叠氮钠的Tris(0.05M pH＝5.5)；
制备金标复溶液：含20％(w/v)蔗糖，1％(w/v)BSA，1％(w/v)PVP和0.02％(w/v)叠氮钠的PBS(0.015M pH＝7.4)。
进一步，胶体金的制备的具体方法为：
应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，操作步骤：将现配的1％氯金酸溶液1mL，稀释至100mL(终浓度为0.01％)，用微波炉加热至100℃后，迅速向其中加入1％柠檬酸溶液2mL，搅拌均匀，继续加热3min，直至溶液由灰黑色变成酒红色时取出，继续搅拌10min，冷却至室温，用去离子水或超纯水定容将所失水分补充至原体积，重复制备三到四次，用一次性滤膜(0.22μm)过滤后，4℃保存备用。
进一步，胶体金质量鉴定的具体方法为：
直观鉴定：肉眼观察胶体金的颜色变化，看有无浑浊、是否透明、有无折光性和有无凝胶；
电镜观察：观察胶体金颗粒大小、形态和密度；
可见光谱观察：在分光光度计OD400nm至OD700nm光谱范围内对胶体金溶液进行扫描，根据所得的数值判断胶体金颗粒的直径与最大吸收波长之间的关系，评价胶体金溶液的质量；
稳定性鉴定：将胶体金溶液放置于室温、4℃和37℃分别存放24h，观察其凝聚情况。
进一步，金标孕酮抗体复合物的制备与纯化的具体方法为：
单克隆抗体的除盐：标记前的单克隆抗体应彻底除盐，具体方法：将抗体溶液用PBS溶液(pH＝7.4)4℃透析过夜，4℃离心1h(15000rpm)，抽取上清去除沉淀，4℃保存备用；
确定胶体金最适蛋白标记量：通过Mey氏稳定性实验确定胶体金最适蛋白标记量，具体方法：如表1，取2mL离心管7个，分别编号A-G，分别加入1mL胶体金溶液，由10μg/mL-60μg/mL加入逐级稀释后的孕酮抗体蛋白溶液，其中G管为空白对照，室温稳定5分钟后，分别向各管加入0.1mL的10％氯化钠溶液。将上述溶液摇匀后，静止2h，最后观察结果；
表1 最适标记蛋白浓度
紫外分光光度计确定最适抗体标记量：将配置溶液静置4h，5000rpm离心1h，测定溶液在520nm下的吸光度值；OD值为垂直纵坐标，抗体蛋白用量为水平横坐标绘制曲线；
胶体金标记抗体最适pH值的测定：胶体金溶液对pH计电极有损害，本研究中关于胶体金溶液pH值的测定使用pH试纸，确定胶体金标记抗体的最适pH值，结果如表2；
表2 胶体金标记抗体最适pH的测定
胶体金标记抗体方法：称取胶体金溶液置于锥形瓶，称量100mL的0.1mol/LK2CO3或0.1mol/L的HCl溶液将胶体金溶液的pH值调整至8.6；加入48μg/mL孕酮单克隆抗体溶液48μL，逐滴加入，边加边搅拌，加完后再继续搅拌30min；再加入5％PEG2000溶液，最终浓度为1％，再搅拌30min；
金标抗体复合物纯化：采用离心纯化法纯化金标孕酮抗体，4℃条件下以2,000r/min低速离心1h，弃去沉淀；将上清液再次15000r/min高速离心1h，弃上清；之后4℃条件下18,000r/min离心1h，反复离心两次；最后将沉淀用金标抗体稀释液稀释为原体积的10％，置于4℃冰箱备用。
进一步，抗原包被液和金标稀释液的选择的具体方法为：
抗原包被稀释液选择：
A溶液：0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)；
B溶液：0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液(TBS)(pH＝7.4)；
C溶液：0.01mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)；
D溶液：0.01mol/L的碳酸盐缓冲液(pH＝9.0)；
E溶液：0.01mol/L的TBS(pH＝9.0)；
抗原分别用A、B、C、D和E五种不同配方的包被液将包被抗原P4-OVA分别稀释到每毫升内含有0.1mg、0.3mg、0.5mg和1mg的抗原。之后在NC膜上点样.室温自然干燥，滴加纯化后的金标抗体，水平放置5min后.用洗涤液充分冲洗，观察五种溶液的显色情况；
P4抗原包被条件的确定：
将包被抗原P4-OVA稀释到0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL和2mg/mL，分别在NC膜上点样，做为控制线(T线)，室温下自然干燥，将以上不同稀释倍数的金标抗体的金标垫和包被有不同浓度的竞争抗原的NC膜进行组合，阴性样品测试观察比较检测线(C线)和T线的显色情况，以此来确定竞争抗原的最佳包被浓度。
进一步，金标抗体稀释液选择和稀释度的选择的具体方法为：
金标抗体稀释液A：PBS0.01mol/L，pH＝7.4(含0.1％PEG20000、0.1％BSA)；2.5.2金标抗体稀释液B TBS0.01mol/L，pH＝8.0(含0.1％BSA、2％蔗糖和0.02％NaN3)；
金标抗体稀释液C PB0.01mol/L，pH＝7.4(含0.1％PEG2000、2％蔗糖和0.02％NaN3)；
将纯化后的金标抗体复合物经高速离心得到的浓缩金标抗体，用金标抗体稀释液A、B和C分别作2×、4×稀释后，吸附于NC膜上，干燥后组装成试纸条，观察胶体金显色情况和金水分离情况以比较其结果。
进一步，NC膜的选择和二抗包被浓度选择
用抗原包被液将二抗进行梯度稀释后，将其与几种不同浓度的抗原溶液，分别在NC膜上点样，阴性和阳性的结果均显色并清晰即；而可当对照线不显色时，视为失败。
进一步，NC膜封闭液和封闭时间的选择：
NC膜封闭液的选择：
封闭液A：0.01mol/L的PBST，pH＝7.4(含10％小牛血清)；
封闭液B：0.01mol/L的TBS，pH＝7.4(含3％BSA)；
封闭液C：0.01mol/L的PBS，pH＝7.4(含3％BSA)。
在NC膜上包被孕酮完全抗原和羊抗鼠二抗后，分别用封闭液A、B和C进行封闭，封闭时间为20min，室温自然干燥，之后滴加金标孕酮抗体复合物，再用PBST洗涤液充分冲洗后，观察NC膜层析情况及检测线的显色情况。
封闭时间的确定：
在NC膜上包被孕酮完全抗原后，封闭液封闭后分别在自然室温和37℃条件下孵育，时间分别为10min、30min和60min，观察检测线的显色情况。
进一步，样品垫的选择的具体方法为：
分别采用GF-06和GF-08两种样品垫组装试纸条后，滴加等量PBS溶液，比较在15s时间内溶液在样品垫上的吸收和扩散情况；
进一步，胶体金试纸条的组装的具体方法为：
步骤一、准备工作；将最佳包被浓度的竞争性孕酮抗原溶液和二抗溶液喷涂在NC膜上，分别做为T线和C线，经自然干燥，将最佳浓度的金标孕酮抗体喷涂到已经剪裁好的金标垫玻璃纤维膜上，4℃干燥备用；
步骤二、试纸条组装：试纸条由2cm的玻璃纤维膜、0.8cm的金标垫、2cm的吸水纸和2.5cm的硝酸纤维素膜组成。将上述物质依次包被于抗原带和二抗带等相应部位，4℃冰箱保存备用。
实施例一
孕酮胶体金试纸条的各项性能测定
乳样样品测试：用不同批次的试纸条对通过直肠法确诊已妊娠的25头和25头未受孕奶牛乳汁样品进行检测。
试纸条检测极限的测定：将不同浓度的孕酮标准溶液(浓度为1ng/mL、3ng/mL、5ng/mL、7ng/mL、9ng/mL、11ng/mL、13ng/mL、15ng/mL、17ng/mL)，用甲醇溶解。试纸条组装后，在试纸条上滴加50μL不同浓度的孕酮标准品溶液，室温静置5min后，用PBS做为阴性对照，观察检测结果。
特异性测试：将11-α-羟基孕酮、雌二醇、睾酮、促卵泡素、雌激素和雄烯二酮、皮质醇和皮质酮用PBS制备成100ng/mL的标准浓度溶液，利用试纸条检测上述激素与孕酮的交叉反应性。交叉反应性越低，说明试纸条的特异性越好。
重复性测试：从多批次的试纸条中随机抽取试纸条，每批次重复3次；分别用阴性样品和孕酮标准品进行重复性测试。
稳定性测试：用铝箔袋将成品试纸条密封，加入干燥剂后，分别放置于室温、4℃和37℃条件下进行稳定性测试。分别在放置10d、20d、30d和60d后用不同浓度的孕酮标准品稀释液进行测试。用PBS做阴性对照测试，观察试纸条的T线和C线的显色情况。
比较试验：采用临床直肠检查法、酶联免疫吸附试验检测法和胶体金试纸检测法对奶牛妊娠情况进行检测和比较。以直肠检测法的检测结果为参考标准，将试纸条法和ELISA法的检测结果与直肠检测法进行验证，以评价试纸条的检测性能。
结果与分析如下：
1.胶体金质量的鉴定结果
1.1 目测结果，胶体金溶液呈酒红色，无油状和球状漂浮物，没有出现颗粒状沉淀物。溶液清澈明亮，不浑浊，且折光性好。
1.2 紫外扫描光谱鉴定结果，如图2所示，胶体金溶液的紫外波长一般在400-700nm之间，紫外扫描的图谱显示多次制备的胶体金的最大吸收峰值为525nm。根据回归曲线方程Y＝0.4271X+514.56计算，胶体金颗粒直径约30nm。图中所示该图峰形对称，峰宽小，说明胶体金颗粒分布比较均匀。
2.金标孕酮单克隆抗体的鉴定结果
2.1 胶体金最适合标记蛋白浓度的确定胶体金形成稳定的胶体状是胶体金是外层带负电的疏水性颗粒与静电作用相互作用的结果，需要加入足够量的蛋白才能完全吸附胶体金。胶体的性质由盐离子效应而改变，当加入NaCl后会出现由红变蓝的聚沉现象，说明加入的抗体量达到或超过了稳定胶体金的最低标准量。通过表3所示，最适抗体蛋白量为48ug/mL。
表3 最适抗体浓度胶体金溶液的颜色结果
2.2 紫外分光光度计法结果
测定各管在波长在520nm处的吸光值(如图3所示)：4-3号管的吸光值逐渐增长，5、6号管的吸光值保持不变，说明胶体金内的抗体含量已经饱和。图中结果所示和目测法检测结果保持一致；因此本实验选择48ug/mL的浓度进行标记。
3.胶体金抗体标记pH值的确定
如图4所示，pH值在8-9之间的金标孕酮抗体吸光值较高，表明pH值为8-9之间时孕酮抗体和胶体金颗粒之间吸附性最佳。最后，选定最佳标记pH值为8.6。
4.抗原包被稀释的确定
如表4所示，包被液C在0.1mg/mL孕酮抗原稀释液的NC膜上已经有显色反应，而其他包被液0.1mg/mL稀释倍数中没有颜色变化，所以选择C液作为最佳包被稀释液。
表4 不同稀释倍数结果的比较
注：“+++”表示着色很深或着色很深但背景色也较深；“++”表示着色很深且与背景反差大；“+”表示着色淡或着色较深但有背景色；“-”表示没有着色，或与背景色没有反差。
5.NC膜的选择
如表5所示，NC膜Whatman Prima40层析速度适中且颜色清楚，在显色、层析速度和颜色方面的指标优于其他三种NC膜。本试验中选择Whatman Prima40做为本研究的NC膜。
表5 NC膜筛选结果
注：“+++”表示着色很深或着色很深但背景色也较深；“++”表示着色很深且与背景反差大；“+”表示着色淡或着色较深但有背景色；“-”表示没有着色，或与背景色没有反差。
6.样品垫选择结果
检测结果显示：GF-08样品垫用量少，层析速度快。为减少样品用量，本实验选择GF-08做为最佳样品垫。
7.包被抗原偶联物稀释液浓度确定结果
包被液A在稀释抗原到0.2mg/mL的NC膜上点样着色较深，而其他包被液在稀释抗原到0.2mg/mL后.颜色转变为单色或不显色。相对于其他包被液，包被液A可在一定程度上减少线的弥散性，故选择包被液A作为实际用包被稀释液。
8.NC膜上T线竞争抗原最佳包被浓度的确定
包被抗原P4-OVA的初始浓度为1.15mg/mL，划分为以下几个系列包被浓度：为每mL中含有0.576mg、0.288mg、0.144mg、0.072mg和0.036mg的抗原，分别喷涂在NC膜上作为T线，自然干燥后备用。将上述喷涂不同稀释倍数金标抗体的金标垫和包被有不同浓度的竞争抗原的NC膜进行组合为完整的试纸条。通过阴性样品测试观察，比较T线和C线显色情况，以此来筛选竞争抗原最佳包被浓度。确定最佳包被浓度后再用浓度分别为10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的孕酮标准样品的进行筛选金标抗体最佳稀释倍数。
9.胶体金试纸条的组装
按吸附区、检测区、质控区和吸附区顺序，将国产玻璃纤维纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维纸和吸水滤纸，依次粘在表面粘满双面胶的白色塑料底板上，在玻璃纤维膜一端(进样端)粘贴标有MAX线的塑料纸，最后用裁纸刀切成4mm宽的条带即可。
10.孕酮胶体金试纸条的各项性能测定
10.1 试纸条的敏感性和特异性检测采集25头经直检确定妊娠的奶牛乳汁样品经孕酮试纸条检测，有22头为阳性，即本试纸条敏感性(阳性检出率)为88％；25头经直检确定未妊娠的奶牛乳汁样品经孕酮试纸条检测，有24头为阴性，即即本试纸条特异性(阴性检出率)为96％。
10.2 试纸条检测极限的确定经对胶体金试纸条多次重复试验，本实验所制作的试纸条结果基本一致。如表6所示：当孕酮标准品的浓度高于7ng/mL时，检测结果均为阳性(+)，而当孕酮标准品的浓度低于7ng/mL时，检测结果均为阴性(+)。因此，本试纸条的检测极限设定为7ng/mL。
表6 试纸条检测极限的测定
10.3 交叉反应性检测 本研究检测结果显示：检测制备的孕酮检测试纸条与17-α-羟基孕酮存在微弱的交叉反应，与雌二醇、睾酮、雌激素、皮质醇、皮质酮和雄烯二酮间无交叉反应，上述检测结果与阴性对照检测结果相同，说明本试纸条具有良好的特异性。
10.4 重复性测试 用阴性样品和孕酮标准样品对随机抽取的不同批次试纸条进行检测，结果显示：阴性和阳性样品的检测结果与先前检测一致，说明不同批次制备的试纸条有很好的重复性。
10.5 稳定性测试 结果显示：保存于37℃下两个月的试纸条在实验中层析速度变慢，控制线和检测线的显色结果较淡，而在4℃或室温条件下保存两个月的试纸条控制线和检测线无明显的变。因此，本试纸条的保存条件为室温下加入干燥剂后，密封保存即可。
实施例二、试验二胶体金试纸条的临床应用
在本实施例选取黑龙江东部的标准集约化牛场进行孕酮胶体金试纸条的临床应用，主要利用试纸条检测奶牛妊娠情况，并通过检测结果改进试纸条的各项性能，通过奶牛机体内孕酮含量与某些繁殖障碍疾病的关系。
材料与方法
1.1 主要仪器
离心机Anke TDL80-2B购自上海安亭科学仪器公司；超低温冰箱；T6型紫外可见分光光度计购自北京通用仪器有限公司；恒温箱购自上海跃进医疗器械一厂。
1.2 主要检测试剂
孕酮ELISA检测试剂盒购自卡迈舒上海生物科技有限公司。
1.3 试验动物分组与样品处理
1.3.1 试验一 选取基本情况相近的健康奶牛25头。分别采集配种15d、20d、25d和30d后且经直肠检测为妊娠奶的各5头奶牛乳汁样品10mL和血液样品10mL(1％肝素，100μL)，将血液样品离心10min(3500rpm)，抽取血浆后置于-80℃保存待检。应用ELISA检测试剂盒检测奶牛血液和乳汁样品中的孕酮浓度(ng/mL)，并应用酶标仪在450nm波长下测定样品的OD值。应用本研究制备的奶牛孕酮胶体金检测试纸条，对上述奶牛乳汁样品进行检测。
1.3.2 试验二分别采集处于配种期(0-2d)的奶牛乳汁样品10mL和血液样品10mL(1％肝素，100μL)，将血液样品离心10min(3500rpm)，抽取血浆后置于-80℃保存待检。应用ELISA检测试剂盒检测奶牛血液和乳汁样品中的孕酮浓度(ng/mL)，并应用酶标仪在450nm波长下测定样品的OD值。应用本研究制备的奶牛孕酮胶体金检测试纸条，对上述奶牛乳汁样品进行检测。之后，对上述奶牛进行跟踪调查，判定其后期发情或空怀等情况。
1.3.3 试验三分别采集患有黄体囊肿、卵巢静止和持久黄体的繁殖障碍性疾病的各5头奶牛的乳汁样品10mL和血液样品10mL(1％肝素，100μL)，将血液样品离心10min(3500rpm)，抽取血浆后置于-80℃保存待检。
1.4 主要检测项目和方法
1.4.1 繁殖障碍病种类及判断标准持久黄体：该病的重要标志是奶牛长期不发情。在临床中经直肠检查可发现卵巢上黄体囊泡与卵泡囊肿变化无差别，但囊肿壁变厚且柔软松弛，轻微压迫有痛感。病程中奶牛无发情表现，可以确诊为黄体囊肿。
卵巢静止：该病在临床直检中可以发现卵泡无发育，亦无黄体生成，卵巢处于静默状态，卵巢体积逐渐缩小，卵巢质地变硬且无活性。奶牛主要患病表现为产后不发情，卵巢萎缩等特征。
黄体囊肿：该病主要临床表现为奶牛产后长期不发情，子宫颈阴道干涩，少量分泌物附着于尾根，直肠检查可见单侧或者双侧卵巢明显呈现异常性膨大，且卵巢表面形成一个或多个腔体，触感波动强烈，挤压可觉液体充盈。
1.4.2 检测项目应用ELISA检测试剂盒检测奶牛血液和乳汁样品中的孕酮浓度(ng/mL)，并应用用酶标仪在450nm波长下测定样品的OD值。
应用本发明制备的奶牛孕酮胶体金检测试纸条，对上述奶牛乳汁样品进行检测。乳汁孕酮检测判定标准：试纸条左侧为控制线(C线)，右侧为测试线(T线)。当C线和T线同时显色时，检测结果为阴性(孕酮浓度低于7ng/mL)；仅C线显色时，检测结果为阳性(孕酮浓度超过7ng/mL)；仅T线显色时，检测结果无效。
1.5 数据处理
应用SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，实验数据均以平均数±标准差(MEAN±SD)表示，用Duncan氏检验法进行各组间差异的多重比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 妊娠奶牛血浆孕酮浓度与乳汁孕酮浓度变化
通过ELISA方法对配种后18-24d的奶牛血浆和乳汁样品孕酮浓度进行检测，结果如表7所示：在奶牛配种后18-24d内，妊娠奶牛血浆和乳汁中孕酮浓度随妊娠的时间增加而增加。其中，血浆孕酮含量与乳汁孕酮含量呈正相关。本实验制备的胶体金试纸条在确定的奶牛配种后20d检测结果为疑似，而在奶牛配种后22d检测结果呈阳性。
表7 妊娠奶牛血浆孕酮浓度与乳汁孕酮浓度
注：“ELISA-P”表示ELISA法检测血浆样品，“ELISA-M”表示ELISA法检测乳汁样品；“试纸条-M”表示试纸条检测血浆样品。
2.2 发情奶牛血浆与乳汁内孕酮含量变化
根据测定结果(表8)，确定配种期血浆孕酮浓度在75.48±0.5ng/mL，乳汁中孕酮浓度为7.23±0.15ng/mL，且试纸条检测为阳性(+)的奶牛，为黄体期输精，对其进行跟踪调查，上述奶牛或转发情或经两个月后直检确定为空怀。而经过试纸条检测为阴性的奶牛，经后期跟踪，显示为配种成功。
表8 配种期奶牛血浆P4和乳汁P4浓度
注：“ELISA-P”表示ELISA法检测血浆样品，“ELISA-M”表示ELISA法检测乳汁样品；“试纸条-M”表示试纸条检测血浆样品。
2.3.繁殖障碍奶牛血浆孕酮和乳汁孕酮浓度变化
如表9所示，患有持久黄体和黄体囊肿疾病的奶牛血浆和乳汁中孕酮浓度较高，且试纸条检测为阳性，而患有卵巢静止的奶牛血浆和乳汁中孕酮含量较低，且试纸条检测为阴性。
表9 繁殖障碍奶牛血浆孕酮和乳汁孕酮浓度
注：“P”为血浆样品，“M”为乳汁；上角标小写字母不同者表示差异显著(P＜0.05)，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，相同或无字母表示差异不显著(P＞0.05)
以0.5mg/mL的PEG20000做稳定剂，结果显示胶体金溶液未出现沉淀现象，说明本发明的试纸条稳定效果较好。
胶体金试纸条对特异性和敏感性均达到了85％以上，且在临床中数分钟即可读取结果，能够及时准确地检测奶牛的妊娠情况。
所制作的试纸条能在4℃下保存2个月，说明本试纸条具有良好的稳定性。
本发明的孕酮胶体金免疫层析试纸条，各项条件基本达到检测要求，临床上能够在5min左右快速检测出结果。
用奶牛孕酮胶体金检测试纸条对配种后22d的奶牛即可进行妊娠诊断，且通过对试纸条性能检测，证明本试纸条灵敏性和敏感性均较高，利于临床应用。
通过本试纸条对处于配种的奶牛的乳汁样品进行检测，可以对处于黄体期的奶牛进行确诊，从而利于知道临床的配种工作。
利用本发明的试纸条对患有持久黄体和黄体囊肿疾病奶牛的乳汁样品进行有效地检测，提高了临床对上述两种疾病的检测效率，以能够有效地指导工作人员对此类疾病的诊断、治疗，也能够有效地指导配种，提高受胎率。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性的劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法的制作方法包括：
步骤一、主要溶液的配制，包括制备柠檬酸三钠溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3溶液、制备PBS溶液、制备BSA溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液；
步骤二、胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕酮抗体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、胶体金试纸条的组装；
金标孕酮抗体复合物的制备与纯化的具体方法为：
单克隆抗体的除盐：标记前的单克隆抗体应彻底除盐，具体方法：将抗体溶液用PBS溶液，pH＝7.4，4℃透析过夜，4℃离心1h，15000rpm，抽取上清去除沉淀，4℃保存备用；
确定胶体金最适蛋白标记量：通过Mey氏稳定性实验确定胶体金最适蛋白标记量，具体方法：取2mL离心管7个，分别编号，分别加入1mL胶体金溶液，由10μg/mL-60μg/mL加入逐级稀释后的孕酮抗体蛋白溶液，其中一管为空白对照，室温稳定5分钟后，分别向各管加入0.1mL的10％氯化钠溶液，将上述溶液摇匀后，静止2h，最后观察结果；
紫外分光光度计确定最适抗体标记量：将配置溶液静置4h，5000rpm离心1h，测定溶液在520nm下的吸光度值；OD值为垂直纵坐标，抗体蛋白用量为水平横坐标绘制曲线；
胶体金标记抗体最适pH值的测定：胶体金溶液对pH计电极有损害，使用pH试纸测定胶体金溶液的pH值，确定胶体金标记抗体的最适pH值；
胶体金标记抗体方法：称取胶体金溶液置于锥形瓶，称量100mL的0.1mol/LK2CO3或0.1mol/L的HCl溶液将胶体金溶液的pH值调整至8.6；加入48μg/mL孕酮单克隆抗体溶液48μL，逐滴加入，边加边搅拌，加完后再继续搅拌30min；再加入5％PEG2000溶液，最终浓度为1％，再搅拌30min；
金标抗体复合物纯化：采用离心纯化法纯化金标孕酮抗体，4℃条件下以2,000r/min低速离心1h，弃去沉淀；将上清液再次15000r/min高速离心1h，弃上清；之后4℃条件下18,000r/min离心1h，反复离心两次；最后将沉淀用金标抗体稀释液稀释为原体积的10％，置于4℃冰箱备用。
2.如权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的主要溶液的配制的具体方法如下：
制备柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠，加100mL超纯水，制备成浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，现用现配；
制备氯金酸溶液：称取1g氯金酸，加超纯水100mL，制备成氯金酸溶液，4℃保存；
制备K2CO3溶液：称取0.1gK2CO3溶于100mL超纯水，制成K2CO3溶液，现用现配；
制备PBS溶液：将8.09gNaCl、0.29gKH2PO4、0.29gKCl和2.99gNa2HPO4·2H2O混合，加蒸馏水至1000mL，将pH值调至7.4；
制备BSA溶液：称取5g的BSA加入100mL超纯水，充分溶解；
制备样品垫处理液：含1％(w/v)BSA，1％(w/v)PVP，0.5％Tween-20和0.02％(w/v)叠氮钠的Tris，0.05M pH＝5.5；
制备金标复溶液：含20％(w/v)蔗糖，1％(w/v)BSA，1％(w/v)PVP和0.02％(w/v)叠氮钠的PBS，0.015M pH＝7.4。
3.如权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，胶体金的制备的具体方法为：
应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，操作步骤：将现配的1％氯金酸溶液1mL，稀释至100mL，终浓度为0.01％，用微波炉加热至100℃后，迅速向其中加入1％柠檬酸溶液2mL，搅拌均匀，继续加热3min，直至溶液由灰黑色变成酒红色时取出，继续搅拌10min，冷却至室温，用去离子水或超纯水定容将所失水分补充至原体积，重复制备三到四次，用一次性滤膜过滤后，一次性滤膜为0.22μm，4℃保存备用。
4.如权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，胶体金质量鉴定的具体方法为：
直观鉴定：肉眼观察胶体金的颜色变化，看有无浑浊、是否透明、有无折光性和有无凝胶；
电镜观察：观察胶体金颗粒大小、形态和密度；
可见光谱观察：在分光光度计OD400nm至OD700nm光谱范围内对胶体金溶液进行扫描，根据所得的数值判断胶体金颗粒的直径与最大吸收波长之间的关系，评价胶体金溶液的质量；
稳定性鉴定：将胶体金溶液放置于室温、4℃和37℃分别存放24h，观察其凝聚情况。
5.如权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，抗原包被液的选择的具体方法为：
抗原包被液选择：
A溶液：0.01mol/L的PBS，pH＝7.4；
B溶液：0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液TBS，pH＝7.4；
C溶液：0.01mol/L的碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；
D溶液：0.01mol/L的碳酸盐缓冲液，pH＝9.0；
E溶液：0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，pH＝9.0；
分别用A、B、C、D和E五种不同配方的包被液将包被抗原P4-OVA分别稀释到每毫升内含有0.1mg、0.3mg、0.5mg和1mg的抗原；之后在NC膜上点样，室温自然干燥，滴加纯化后的金标抗体，水平放置5min后，用洗涤液充分冲洗，观察五种溶液的显色情况；
P4抗原包被条件的确定：
将包被抗原P4-OVA稀释到0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL和2mg/mL，分别在NC膜上点样，做为质控线，室温下自然干燥，将不同稀释倍数的金标抗体的金标垫和包被有不同浓度的包被抗原P4-OVA的NC膜进行组合，阴性样品测试观察比较质控线和检测线的显色情况，以此来确定竞争抗原的最佳包被浓度。
6.如权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，金标抗体稀释液选择和稀释度的选择的具体方法为：
金标抗体稀释液A：0.01mol/L PBS，pH＝7.4，含0.1％PEG20000、0.1％BSA；
金标抗体稀释液B：0.01mol/L TBS，pH＝8.0，含0.1％BSA、2％蔗糖和0.02％NaN3；
金标抗体稀释液C：PB0.01mol/L，pH＝7.4，含0.1％PEG2000、2％蔗糖和0.02％NaN3；
将纯化后的金标抗体复合物经高速离心得到的浓缩金标抗体，用金标抗体稀释液A、B和C分别作2×、4×稀释后，吸附于NC膜上，干燥后组装成试纸条，观察胶体金显色情况和金水分离情况以比较其结果。
7.如权利要求1所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，NC膜封闭液和封闭时间的选择：
NC膜封闭液的选择：
封闭液A：0.01mol/L的PBST，pH＝7.4，含10％小牛血清；
封闭液B：0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，pH＝7.4，含3％BSA；
封闭液C：0.01mol/L的PBS，pH＝7.4，含3％BSA；
在NC膜上包被孕酮完全抗原和羊抗鼠二抗后，分别用封闭液A、B和C进行封闭，封闭时间为20min，室温自然干燥，之后滴加金标孕酮抗体复合物，再用PBST洗涤液充分冲洗后，观察NC膜层析情况及检测线的显色情况；
封闭时间的确定：
在NC膜上包被孕酮完全抗原后，封闭液封闭后分别在自然室温和37℃条件下孵育，时间分别为10min、30min和60min，观察检测线的显色情况；
样品垫的选择的具体方法为：
分别采用GF-06和GF-08两种样品垫组装试纸条后，滴加等量PBS溶液，比较在15s时间内溶液在样品垫上的吸收和扩散情况；
胶体金试纸条的组装的具体方法为：
步骤一、准备工作；将最佳包被浓度的竞争性孕酮抗原溶液和二抗溶液喷涂在NC膜上，分别做为质控线和检测线，经自然干燥，将最佳浓度的金标孕酮抗体喷涂到已经剪裁好的金标垫玻璃纤维膜上，4℃干燥备用；
步骤二、试纸条组装：试纸条由2cm的玻璃纤维膜、0.8cm的金标垫、2cm的吸水纸和2.5cm的硝酸纤维素膜组成；将玻璃纤维膜、金标垫、吸水纸和硝酸纤维素膜依次包被于抗原带和二抗带相应部位，4℃冰箱保存备用。
8.一种如权利要求1-7任意一项所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法制备的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条。
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