CN1704757A - 心梗快速诊断盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于早期快速诊断心肌梗塞的测试片和试剂盒。该测试片包括：a)加样区，b)与加样区侧邻的测试区；和c)吸收区。吸收区使得加至加样区的样品层析通过测试区。在所述测试区有包被抗体点样区(固定有包被的第二单克隆抗体)，且在测试片上设有金标抗体点样区(包含金标记的抗FABP的第一单克隆抗体)，所述的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体可同时结合于FABP。本发明的测试片和试剂盒可极其快速和很准确地诊断急性心肌梗塞。

Description

心梗快速诊断盒

技术领域

本发明涉及诊断技术领域，更具体地涉及一种用于诊断急性心肌梗塞(急性心梗)的试剂盒。

背景技术

心血管类疾病历来是人们健康的大敌。近年来，随着生活水平的提高及工作社会压力的不断加大，心血管疾病的发病率历年增加，心脏病已成为仅次于癌症的第二大死亡原因。在心脏病中尤其是心绞痛和心肌梗塞等缺血性心脏病的增加特别显著，大约占了因心脏病死亡的人数的4成。

对于急性心梗患者，抢救生命必须分秒必争。目前最主要的抢救措施是溶栓治疗，而溶栓治疗者的存活率取决于坏死面积的大小，患者越快得到治疗，存活的机率就越高。如果能在发病的4-6小时治疗，患者康复的机会很大，如果过了6小时，往往再抢救也来不及了。

早期治疗的成功关键取决于对急性心梗的早期快速诊断。目前临床上除根据临床症状、心电图分析外，还使用CK-MB、肌钙蛋白I和T、肌红蛋白这几个指标。这些手段各有优势，但也各有明显的缺限。部分病人的临床症状不典型，心电图变化不明显，单靠临床症状和心电图不能作出全面肯定的诊断。CK-MB阳性检出率太低；肌红蛋白虽可测出发病早期的病人，但不特异；肌钙蛋白I和T是目前临床上的金标准，以其高准确率见胜，但他们最大的缺点是只能在发病六小时以后测出，六小时之内基本无效，这就往往使病人失去了六小时之内最佳的治疗时间。

肌红蛋白(Mb)是另一种小分子(18KDa)蛋白质，其血浆动力学与FABP相似，可在心梗后2-3h出现于血中，也是急性心肌梗塞(AMI)早期检测的有用指标，但由于Mb在骨胳肌中含量较高，因而缺乏特异性，其含量升高不能区分是来源于骨骼肌还是心肌。心脏肌钙蛋白I和T(cTnI和cTnT)和肌酸激酶同工酶-MB(CK-MB)对心肌损伤有较好的特异性，但对AMI早期诊断不佳，因其在AMI发生后6-8h才使血中浓度升高。

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一组至少由6种不同相对分子质量组成的蛋白质(14,000～15,000道尔顿)，存在不同脏器中，心脏中的FABP和肝、小肠中的有明显区别。它被认为是重要的脂肪酸载体蛋白，不仅在脂酸酸代谢中起作用，而且在心脏中的能量代谢中也起重要作用。心肌缺氧时，H-FABP释放至细胞外，进入血液循环，使血中FABP含量升高。特别由于其分子量小和心肌中含量很高(0.46mg/g湿重)因而其特异性相对高，在急性心肌梗塞(AMI)早期在血中就可查到其升高。

美国专利申请20030100038公开了一种用抗心脏型和脑型脂肪酸结合蛋白(H-FABP，B-FABP)的单克隆抗体和多克隆抗体检测中风的方法。

CN02117447公开了一种检测急性心肌梗塞的试剂盒，其中用特异性抗H-FABP的单克隆抗体和多克隆抗体通过ELISA检测H-FABP，但其缺点是Elisa法涉及的步骤多，需几步孵浴及洗脱后再显色，所以一般需两小时才能读到结果，故在临床上特别是对急性心梗这样的急症实用意义不大。总之，急性心梗的早期诊断目前尚缺乏良好的手段，新的心梗早期指标确定和诊断试剂盒的开发很有必要。

发明内容

本发明的目的就是提供一种早期快速检测急性心肌梗塞的方法和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种检测心肌梗塞的测试片，该测试片含有以下结构：

加入样品的加样区；

与加样区侧邻的测试区；

吸收区，吸收区的位置与加样区相对而且吸收区相对测试片的其他区域而言具有吸收能力，从而使得加至加样区的样品层析通过测试区；

其中，在所述测试区有包被抗体点样区，所述包被抗体点样区包含固定化的抗FABP的第二单克隆抗体，

在测试片上设有金标抗体点样区，所述的金标抗体点样区位置是沿样品扩散方向的在包被抗体点样区的上游，并且所述的金标抗体点样区包含金标记的抗FABP的第一单克隆抗体，

并且所述的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体可同时结合于FABP。

在另一优选例中，所述的金标抗体点样区位于加样区。

在另一优选例中，所述的金标抗体点样区位于加样区和测试区之间，或者位于测试区中。

在另一优选例中，在检测区中还设有对照区。

在另一优选例中，所述的包被抗体点样区、金标抗体点样区或对照区为线状、点状、长方形或其他任何形状。

在另一优选例中，所述检测片还具有一基片，加样区、测试区和吸收区位于基片上，加样区、测试区和吸收区的厚度分别为0.05-5毫米(更佳地0.1-2毫米)，基片厚度为0.05-10毫米(更佳地0.1-2毫米)。

在另一优选例中，加样区为玻璃纤维膜并且在玻璃纤维膜上覆盖有滤血膜；检测区为硝酸纤维素膜；吸收区为吸水材料；基片为塑料片、玻璃片、金属片、陶瓷片、纸板(如涂有粘胶的纸板)。

在另一优选例中，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体结合于FABP的不同表位，并且与FABP的相对亲合力为1×10^-6-1×10^-12M，较佳地，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与FABP的相对亲合力为1×10^-7-1×10^-11M。更佳地，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与FABP的相对亲合力为1×10^-8-1×10^-11M。

在另一优选例中，所述包被抗体点样区中抗FABP的第二单克隆抗体的数量为0.01-50ug(更佳地为0.1-20ug，最佳地为0.2-10ug)；金标抗体点样区中抗FABP的第一单克隆抗体的数量为0.02-50ug(更佳地为0.1-20ug，最佳地为0.2-10ug)。

在本发明的第二方面，提供了所述测试片的用途，它被用于制备检测急性心肌梗塞的试剂盒。

在本发明的第三方面，提供了一种检测试剂盒，它含有本发明所述的测试片和说明书。

附图说明

图1显示了FABP表达质粒的酶切鉴定图(1％琼脂糖凝胶.)。其中各泳道如下：

泳道M：DNA标准物，GeneRuler^TM 1kb ladder，MBI Fermentas公司；

泳道1：pET32a/Fabp，用Nco I/BamH I切割；

泳道2：pET32a/Fabp，无切割。

图2显示了纯化后的FABP融合蛋白。其中各泳道如下：

泳道1：3ug纯化后的FABP；

泳道2：6ug/ml纯化后的FABP；

泳道3：9ug/ml纯化后的FABP；

泳道4：12ug纯化后的FABP；

泳道M：蛋白质标准物。

图3显示了Protein A纯化的抗FABP的单克隆抗体HF2和HF10。其中各泳道如下：

泳道1-3：单克隆抗体HF2；

泳道4-6：单克隆抗体HF10；

泳道M：蛋白质标准物。

图4显示了夹心ELISA测试中H-FABP的浓度曲线。其中，HF2为包被抗体，HF10为标记抗体。H-FABP标准液用阴性血清配制而成。

图5显示了本发明一种测试片的结构，其中箭头方向为样品流动方向。

图6显示了FABP金标快速诊断试剂盒对不同浓度FABP蛋白的检测结果。图片下方为检测样本中FABP的含量(ng/ml)。C处为质控线，T处为检测线。当血清中FABP浓度为2ng/ml(接近正常人平均值)时，结果呈阴性；6.5ng/ml(即正常人高限)时，在T处出现微弱条带；随着FABP浓度(10和20ng/ml)升高，T处红色加深。

具体实施方式

本发明人经过多年广泛而深入的研究，针对临床上对急性心梗早期诊断的需求，以脂肪酸结合蛋白(FABP)为靶点，利用两个识别脂肪酸结合蛋白不同表位(抗原决定簇)的、高特异性FABP单克隆抗体，用双抗体夹心法为原理制备了金标快速诊断测试片和试剂盒。在此基础上完成了本发明。

脂肪酸结合蛋白(FABP)是一种已知蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本领域已知的(见公知的GenBank数据库)。

生产FABP的方法也是已知的。例如，通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用FABP的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的FABP蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用编码人FABP蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

另一方面，制备抗FABP蛋白抗体的技术也是本领域中众所周知。优选用于本发明的抗体是对人FABP具有特异性的单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人FABP蛋白或其片段。较佳地，指那些能与人FABP蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人FABP蛋白的分子，也包括那些并不影响人FABP蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人FABP基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人FABP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人FABP蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。

单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的单克隆抗体抗体可以利用人FABP基因产物或片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人FABP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

特别优选的抗体是与FABP的相对亲合力为1×10^-6-1×10^-12M的抗体(即当抗体浓度为1×1^-6-1×10^-12M时，可以与1μg/ml FABP抗原有明显结合(OD_405nm大于0.5))。较佳地，与FABP的相对亲合力为1×10^-7-1×10^-11M。更佳地，与FABP的相对亲合力为1×10^-8-1×10^-11M，最佳地为1×10^-9-1×10^-11M。

参见图5，本发明的测试片包括：

可加入样品的加样区30(较佳地，加样区还包括覆盖在上方的滤血膜40)；

与加样区侧邻的测试区20；

吸收区50，吸收区50的位置与加样区30相对而且吸收区50相对测试片的其他区域而言具有吸收能力，从而使得加至加样区30的样品扩散通过测试区；

其中，在所述测试区有包被抗体点样区60，所述包被抗体点样区包含固定化的抗FABP的第二单克隆抗体，

在测试片上设有金标抗体点样区62，所述的金标抗体点样区位置是沿样品扩散方向的在包被抗体点样区的上游，并且所述的金标抗体点样区包含金标记的抗FABP的第一单克隆抗体。在图1所示的优选例中，金标抗体点样区62可位于加样区。当然，金标抗体点样区还位于加样区和测试区之间，或者位于测试区中。

图5中，80为血样，当血样滴在点样区上后，会被吸收区吸引向箭头方向扩散，先与金标抗体点样区62中金标记的抗FABP的第一单克隆抗体结合，形成“第一单克隆抗体-FABP”复合物。该复合物继续向吸收区扩散，进入测试区，然后与测试区中包被抗体点样区60中固定化的抗FABP的第二单克隆抗体，形成“第一单克隆抗体-FABP-第二单克隆抗体”复合物，并停留在包被抗体点样区，并显出检测结果(见图6)。此外，血样样品会继续向吸收区扩散，与对照区72中固定化的抗金标抗体的抗体(如羊抗鼠抗体)或FABP结合，作为测试条的质控对照。

由于本发明首次采用对FABP有高亲和力(相对亲合力为1×10^-6-1×10^-12M)，且识别不同表位的单克隆抗体，因此不仅灵敏度非常高，而且可以极其快速地检测出血液中FABP，将现有技术中需数小时才能获得检测结果缩短到数分钟(通常5分钟即能读到结果)，这对于救治急性心肌梗塞这种争分夺秒的疾病而言具有极其重大的意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

单克隆抗体的制备：

A.H-FABP基因的克隆和抗原的表达

以用常规方法抽提的人心脏细胞总RNA为起始模板，通过逆转录和PCR以获得H-FABP基因，方法如下：逆转录反应中以随机引物为引物，用SuperScript IIRNase H-反转录酶(购自Invitrogen公司)反转录得到cDNA，再用H-FABP特异引物(引物1和引物2)及platinum Taq DNA polymerase High Fidelity试剂盒(购自Invitrogen公司)扩增H-FABP基因。

引物1：5’-actgccatggatgtggacgctttcctgggcac-3’(SEQ ID NO：1)

引物2：5’-actgggatcctcatgcctctttctcgtaag-3’(SEQ ID NO：2)

用Ndel和BamHI酶切上述PCR产物和质粒pET32A(购自Novagen公司)，然后连接，获得质粒pET25b-FABP，转化常用的大肠杆菌DH5α，抽提质粒、经酶切鉴定得到正确构建的含表达质粒(见图1)。对插入片段进行DNA测序，证实了插入的H-FABP基因具有正确的核苷酸序列。

将上述制备的质粒pET32A-FABP转入常规的大肠杆菌BL21，转化子接种于10ml LB培养基中，37℃250rpm振荡培养12-15hr，1∶100稀释于预热的LB培养基继续振荡培养2.5hr，加IPTG至终浓度0.1mM后22℃诱导过夜，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，经Ni柱亲和层析和分子筛纯化得到FABP融合蛋白(在N端含有额外的TrxA-S-His6 Tag)。

结果如图2所示，纯化的H-FABP蛋白的分子量为29KD，与预测值相符。

B.抗体的制备：

用天然H-FABP蛋白(购自Life Diagnostics Inc.公司)或以上重组表达的H-FABP融合蛋白作为抗原，分别与弗氏完全和/或不完全佐剂混合后对小鼠进行三次以上免疫，每次50ug/鼠，收取血清，用ELISA法检测血清滴度。

结果发现所得抗血清与天然抗原(天然H-FABP)和重组表达的抗原均有1∶100000以上的效价，经最后一次尾静脉注射后，再经融合、筛选、亚克隆等传统步骤，制备出15株特异性抗H-FABP稳定单克隆抗体，亚型确定其中10株为IgG1，4株IgG2a，一株IgG3。选用其中配对最好的2株HF2和HF10，用于制备H-FABP心梗早期诊断试剂盒。

C.抗体的鉴定：

筛选得到的稳定单抗株HF2和HF10的鉴定试验如下

(1)单抗的纯化和定量：小鼠腹水经ProteinA亲和层析后得到纯的抗体，抗体的纯度用SDS-PAGE确定(见图3)，并用Biorad BCA法测定抗体浓度。

(2)相对亲和力的测定：用天然H-FABP(1ug/ml)包板，将纯化的抗体作梯度稀释，并用酶标抗鼠二抗(Sigma)作检测抗体，结果显示HF2和HF10的相对亲合力均达到10^-9M以上，分别为3×10^-10M和6×10^-10M。

实施例2

用ELISA法评估HF2和HF10在双抗体夹心法检测H-FABP中的作用

用于双抗体夹心法进行免疫检测的一对抗体必须识别抗原上不同的表位才能配对。在夹心ELISA法中，如包被抗体和标记抗体识别抗原上同一位点，则呈阴性结果；如包被抗体和标记抗体识别抗原上不同位点，则呈阳性结果。本实施例中，对HF10抗体用辣根过氧化酶进行标记，以HF2为包被抗体，以不同浓度的天然的H-FABP为夹心抗原，进行双抗体夹心法检测。

结果显示，HF2和HF10在夹心ELISA试验中配对良好，对H-FABP浓度的检测在2ng/ml-100ng/ml范围内呈线性(图4)。

实施例3

胶体金法检测H-FABP的方法和试剂盒

根据临床资料，H-FABP在正常人血清中的浓度高限为6.5ng/ml，一旦急性心梗发作，H-FABP的浓度马上升高，甚至可达几百到上千ng/ml。故将6.5ng/ml设为本试剂盒的临界值。

(a)胶体金颗粒的制备

(1)将HauCl₄先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。

(2)搅动下准确加入1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液1.0ml。

(3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。

(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。

用分光光度计扫描λmax来测量金颗粒的粒径及均匀度。结果表明，制备的胶体金的可见光区最高吸收峰在520nm，估测制备的胶体金颗粒的直径在35nm。吸收峰的峰形表明胶体金的均匀度较好。

(b)金标抗体的制备

(1)在电磁搅拌下，将1ml抗体溶液(HF2或HF10，浓度为1mg/ml)加入50ml胶体金溶液中，加入抗体时应逐滴加入，继续搅拌10分钟。

(2)在磁性搅拌下加入牛血清白蛋白(BSA)，冰箱过夜。以保持标记胶体金的稳定。

(3)标记好的金标抗体溶液在4℃，10000xg，离心10min。用PBS清洗三次，用相同溶液重悬标记好的金标抗体，在可见光区吸收峰在520nm处测得OD值。制备不同OD值的金标抗体(OD＝30，35，40)供金标抗体浓度的优化实验用。

(c)抗体浓度的优化实验

分别把OD值为20、30、40、50的金标抗体溶液取1ul喷在玻璃纤维膜上，把浓度为0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml抗体溶液取1ul喷在硝酸纤维素膜上，用正交法决定出0.4mg/ml符合检测灵敏度的抗体浓度为：金标抗体OD值为30，检测线上的抗体浓度为0.4mg/ml。

(d)试剂盒的制备

检测试剂盒的主要结构包括上样区，测试区和吸收区。上样区由全血滤膜和带有金标记抗体的玻璃纤维膜组成，测试区为硝酸纤维膜，上有检测线和质控线，吸收区由吸水滤纸组成(见图5)。三区按顺序装配在塑料底板上并经切割包装即完成。

(e)实验室检测结果

用不含H-FABP的血清为稀释液配成含不同浓度的H-FABP蛋白的标准溶液，用本金标试剂盒进行检测。

结果如图6所示，C处为质控线，T处为检测线。当血清中FABP浓度为2ng/ml(接近正常人平均值)时，结果呈阴性；6.5ng/ml(即正常人高限)时，在T处出现微弱条带；随着FABP浓度(10和20ng/ml)升高，T处红色加深。H-FABP含量越高，信号越强。

实施例4

临床初试结果

用实施例3制备的心肌梗塞试剂盒，对26例病人的126个血清(含发病后的不同时间点)和12个正常人的血样进行检测。

26个心梗病人的120个血样进行测试后，阳性符合率超过99％，仅一个病人的发病后1.5小时样品未见明显阳性，其它阳性标本全部符合。而其他现有试剂盒如CK-MB和肌钙蛋白I和T等在发病3小时前几乎不能测出。12个正常人的血样11个显示阴性，一个显示为极弱阳性。这些数据初步提示了FABP诊断盒在临床上的灵敏度和准确性。

此外，本发明试剂盒只需5分钟即能读到结果，这对于诊治急性心肌梗塞这种争分夺秒的疾病而言优势是显而易见的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种检测心肌梗塞的测试片，其特征在于，该测试片含有以下结构：

加入样品的加样区；

与加样区侧邻的测试区；

吸收区，吸收区的位置与加样区相对而且吸收区相对测试片的其他区域而言具有吸收能力，从而使得加至加样区的样品层析通过测试区；

其中，在所述测试区有包被抗体点样区，所述包被抗体点样区包含固定化的抗FABP的第二单克隆抗体，

在测试片上设有金标抗体点样区，所述的金标抗体点样区位置是沿样品扩散方向的在包被抗体点样区的上游，并且所述的金标抗体点样区包含金标记的抗FABP的第一单克隆抗体，

并且所述的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体可同时结合于FABP。

2.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述的金标抗体点样区位于加样区。

3.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述的金标抗体点样区位于加样区和测试区之间，或者位于测试区中。

4.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，在检测区中还设有对照区。

5.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述检测片还具有一基片，加样区、测试区和吸收区位于基片上，加样区、测试区和吸收区的厚度分别为0.05-5毫米，基片厚度为0.05-10毫米。

6.如权利要求5所述的测试片，其特征在于，加样区为玻璃纤维膜并且在玻璃纤维膜上覆盖有滤血膜；检测区为硝酸纤维素膜；吸收区为吸水材料；基片为塑料片、玻璃片、金属片、陶瓷片、或纸板。

7.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体结合于FABP的不同表位，并且与FABP的相对亲合力为1×10^-6-1×10^-12M。

8.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与FABP的相对亲合力为1×10^-7-1×10^-11M。更佳地，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与FABP的相对亲合力为1×10^-8-1×10^-11M。

9.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述包被抗体点样区中抗FABP的第二单克隆抗体的数量为0.01-50μg；金标抗体点样区中抗FABP的第一单克隆抗体的数量为0.02-50μg。

10.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的测试片和说明书。

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