CN109561993B - 伤口状况的确定 - Google Patents

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Abstract

一种用于监测伤口状况的产品包括：(a)样品施加区；(b)所述样品施加区下游的反应区，包括蛋白酶敏感的聚合物；(c)有色颗粒；(d)所述样品施加区和反应区下游的观察区。所述样品施加区朝着所述观察区传输流体。存在于施加的伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将伤口流体与有色颗粒一起运送至观察区，从而在观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示。一种用于监测伤口状况的产品包括吸收伤口流体的基质。所述基质包括在所述基质上/内形成反应区的交联的且蛋白酶敏感的聚合物以及有色颗粒。所述聚合物和有色颗粒的布置使得由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致有色颗粒沿着/穿过基质运输，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。还提供了监测伤口状况的伴随产品、用途、套件和方法。

Description

伤口状况的确定
技术领域
本发明总体涉及用于确定伤口状况的产品和相关方法，所述伤口可以是慢性伤口。
背景技术
伤口可以定义为在例如由手术、打击、切割、化学品、热/冷、摩擦/剪切力、压力引起或由疾病(比如腿部溃疡或癌)引起的皮肤或下层组织/器官受损后，皮肤保护功能的破坏；在有或没有潜在结缔组织(即肌肉、骨骼、神经)的损失的情况下上皮的连续性丧失(Leaper和Harding,Wounds:Biology and Management,Oxford University Press(1998))。
伤口愈合包括恢复任何受损组织，包括形成新的结缔组织和上皮的再生(Copper,A review of different wound types and their principles of management in WoundHealing:A systematic approach to advanced wound healing and management,Cromwell Press,UK(2005))。
伤口可以分为急性或慢性。急性伤口包括由于需要协调完成各种细胞活动的顺序级联的重叠过程而发生愈合的伤口。相反，慢性伤口是伤口愈合的正常过程在伤口愈合阶段的一个或多个点被破坏的伤口。通常这可能导致慢性伤口陷入愈合的特定阶段，比如炎症或增殖。慢性伤口通常通过存在凸起的、过度增生的但非前进的伤口边缘来识别。富含炎症产物和促炎细胞因子的局部伤口环境可能包含由过量基质金属蛋白酶组成的不平衡酶环境，并且其抑制剂的减少导致细胞外基质的破坏(Menke等,Impaired wound healing,Clinical Dermatology(2007))。由此产生的深度炎症状态被认为是影响并延迟愈合的重要因素。此外，慢性伤口通常会受到伤口床中坏死或腐痂覆盖的组织积聚的阻碍。据报道，仅在美国，慢性伤口影响大约570万患者，并且每年花费约200亿美元(Branski等,A reviewof gene and stem cell therapy in cutaneous wound healing,Burns(2008))。常见的慢性伤口包括糖尿病性溃疡、血管性溃疡和压力性溃疡(Werdin等,Evidence-basedManagement Strategies for Treatment of Chronic Wounds,Eplasty(2009))。
已经提出伤口愈合的管理包括四个主要要素：伤口内和周围的组织及其状态；伤口内或周围存在任何炎症和/或感染；伤口内的水分平衡；以及伤口边缘的质量(Ayello等,TIME heals all wounds,Nursing(2004))。
目前，尝试解决这些主要要素中的一个或多个的伤口敷料有多种。选择合适的伤口敷料包括考虑伤口愈合的当前阶段、其特定的时间要求以及潜在的副作用。理想情况下，敷料应尽量减少疼痛，并易于使用。这些敷料必须在保护溃疡周围的组织和皮肤的同时防止摩擦和剪切。已经提出了在愈合过程的不同阶段的不同敷料的组合。例如，在清创阶段使用水凝胶敷料，在肉芽阶段使用泡沫敷料，并且在上皮形成阶段使用水胶体或低粘附敷料(aneau等,Consensus panel recommendations for chronic and acute wounddressings,Archives of Dermatology(2007))。
US 5,181,905涉及一种用于伤口的敷料，该敷料上或内部具有传达关于伤口状况的信息的指示剂。示例的实施例和优选指示剂包括可以在特定温度下改变色彩的温度敏感性液晶。
US 2004/0044299 A1涉及一种伤口敷料，该伤口敷料上或内部包括在细菌存在下改变色彩并且肉眼通过敷料的外表面可见的化学组合物。
GB 2340235 A涉及一种基于伤口渗出物中ATP的浓度监测伤口细菌污染的方法以及伴随装置和套件。
WO2012/074509涉及基于贴片的传感器，该传感器提供了确定伤口的一种或多种生理状况和/或愈合进展水平的一组特定被分析物参数。
发明概述
对伤口状况的监测目前限于由负责伤口敷料的常规更换的护理人员进行的初始评估，包括评估伤口的外观和/或气味和/或渗出物产生量中的一种或多种。这种评估可以使护理人员认为需要将患者转给临床医生或进一步分析伤口和/或伤口渗出物。
然而，这种评估不能在护理当场(point of care)分析渗出物的一种或多种成分以指示伤口的状况。
鉴于此，通过援引并入本文中的国际专利申请PCT/GB2016/050342涉及用于监测伤口状况的产品，该产品包括：
(i)吸收伤口渗出物的生物惰性基质；以及
(ii)基质上或中的一种或多种试剂，其用于测量伤口渗出物中包含的一种或多种标记物，
其中由伤口渗出物中包含的一种或多种标记物引起的一种或多种试剂的变化提供了伤口状况改变的视觉指示。
本发明涉及该技术的发展。第一发展涉及交联的且蛋白酶敏感的聚合物的使用，所述聚合物仅在存在(优选在预定阈值水平或高于预定阈值水平)(足够的)伤口渗出物中的蛋白酶活性时降解。第二发展涉及在基于侧向流的装置中使用蛋白酶敏感的聚合物用于非原位(ex situ)监测伤口状况。因此，本文描述的产品提供简单、易于使用且易于理解且成本低的手段来监测伤口的状况。
因此，在第一方面，本发明提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括吸收伤口流体的基质或基本上由或由所述基质组成，所述基质包括、基本上由或由以下组成：
a.在所述基质上/内形成反应区的交联的且蛋白酶敏感的聚合
物；以及
b.有色颗粒；
其中所述聚合物和有色颗粒的布置使得由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致有色颗粒沿着/穿过基质运输，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
本发明的核心是以下事实：交联的且蛋白酶敏感的聚合物和有色颗粒被(相对于彼此)布置成使得当基质与一定(足够)量的伤口流体接触并吸收一定(足够)量的伤口流体时，伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致(允许)有色颗粒沿着/穿过基质运输，以提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。通常，将有色颗粒的输送离开反应区。它可以朝向并进入本文定义和讨论的观察区观察区。此外，如本文进一步所述，聚合物的交联增强了聚合物对蛋白酶活性切割的抗性(与非交联形式相比)。因此，除非并且直到蛋白酶活性以足够的量存在以指示伤口状况的变化(其可以处于或高于蛋白酶活性的(预定)阈值水平)，有色颗粒保持固定于(位于)基质中。活性的阈值水平表示非愈合伤口。本领域已知急性伤口与慢性(非愈合)伤口中蛋白酶活性的平均和中值水平以及获得这些水平的方法(参见Trengove等，Wound Rep.Reg，1999，第7卷，第442-452页)。因此，可以导出适当的阈值水平用于一般和/或个性化使用。形成具有合适蛋白酶敏感性的反应区可以凭经验确定并调整，例如，基于产品应与伤口流体接触的时间(例如在伤口敷料下)。可以例如通过调节如本文所述的聚合物分子之间的交联度来控制蛋白酶敏感性。
伤口流体可以通过任何合适的方式沿着/穿过基质(在伤口流体中存在蛋白酶活性的情况下与有色颗粒一起)传输。通常，伤口流体通过毛细管作用沿着/穿过基质移动。
“伤口”可以定义为在例如由手术、打击、切割、化学品、热/冷、摩擦/剪切力、压力引起或由疾病(比如腿部溃疡或癌)引起的皮肤或下层组织/器官受损后，皮肤保护功能的破坏；在有或没有潜在结缔组织(即肌肉、骨骼、神经)的损失的情况下上皮连续性的丧失。
“伤口流体”也称为“伤口渗出物(exudate)”，其应理解为是指由于皮肤保护功能的破坏和上皮连续性丧失而暴露于外部环境的伤口的流体环境，其包括脓、血清、水和/或血液、基本上由或由脓、血清、水和/或血液组成，并且还包含以下、基本上由或由以下组成：脂质、多糖、蛋白质，特别是蛋白酶比如细胞外基质蛋白，包括胶原酶(更特别地，例如，明胶酶)和细胞碎片。
基质吸收伤口流体，从而使反应区暴露于伤口流体。在许多实施方式中，反应区形成在基质的上表面上，并且伤口流体通过下表面吸收。因此，在这样的实施方式中，基质允许伤口流体穿过至反应区。在一些实施方式中，基质的尺寸被确定为使得伤口流体使基质饱和。在一些实施方式中，基质可以是生物学惰性的，即，它不和与其接触的生物组织相互作用或引发响应。包含生物惰性基质的产品优选用于本文定义的产品的原位施加，其中将产品放置成与伤口接触预定的一段时间。通过具有生物惰性，受伤受试者的不利免疫反应的风险被最小化并且优选地完全被消除。应当理解，伤口的具体尺寸在每种情况下都是独特的，并且伤口敷料尺寸相应地进行适应，例如使用任意切割(cut to size)敷料。因此，在用于伤口中原位使用的其他实施方式中，基质具有适合于并且旨在便于产品在伤口敷料与伤口之间定位的尺寸。在某些实施方式中，基质的厚度×宽度×长度尺寸为至少2mm×10mm×10mm，但不大于7mm×40mm×40mm。在特定实施方式中，基质具有5mm×25mm×25mm的尺寸。在所有实施方式中，上表面和下表面不一定必须是正方形。例如，它们可以是矩形或圆形。在一些实施方式中，基质可以是圆柱形的。基质也可以以任意切割形式提供，条件是一旦切割每个基质则形成本发明的产品(即产生反应区和适当排列在基质中的有色颗粒)。对于原位施加，基质足够柔软和舒适，以最小化或避免在伤口引起显著的不适，特别是在已施加伤口敷料之后。伤口敷料的施加在基质上产生一定程度的压缩。因此，在另外的实施方式中，基质足够耐受压缩以允许基质保持适于吸收足够体积的伤口流体从而允许产品发挥作用的结构。在特定的实施方式中，基质能够吸收并保留足以用于进一步(下游和单独)分析渗出物的一定体积的伤口流体(渗出物)，如本文进一步描述的。例如，在某些实施方式中，基质具有吸收至少0.2ml体积(伤口流体)的能力。在另外的实施方式中，基质具有吸收0.2ml至10ml范围内的体积的能力。例如，体积至少为0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml或10ml。在一个具体实施方式中，基质具有吸收3ml体积的能力(包括2.5至3.4ml的范围)。
在某些实施方式中，基质由选自以下的一种或多种材料构成：
(i)聚氨酯；和/或
(ii)聚乙烯；和/或
(iii)纤维素纤维；和/或
(iv)多孔亲水塑料。
合适的多孔亲水塑料包括由Porex Limited销售的那些多孔亲水塑料。
在其他实施方式中，基质包含非织造材料，比如得自Anowo Ltd.的Orion非织造材料。在具体实施方式中，非织造材料具有4osy的重量。
当基质执行双重功能(即，提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示并且还保留足以进行进一步分析的渗出物体积)时，基质可以包括、基本上由或由第一和第二部分组成。因此，在整个公开内容中，对“基质”的指代包括对基质的第一和/或第二部分的指代。因此，基质可以包括、基本上由或由第一和第二层组成。这两个部分或层可以彼此连接，例如通过层压。每个部分具有如本文所述的基质的一个或多个或所有特征。
在一些实施方式中，第一部分包括、基本上由或由在其上/其中形成反应区的交联的且蛋白酶敏感的聚合物组成。第一部分能够吸收足够的伤口流体，以允许交联的且蛋白酶敏感的聚合物(在第一部分上或第一部分中)与伤口流体接触，并因此与其中可包含的蛋白酶活性接触。第一部分通常还包括、基本上由或由有色颗粒组成。通常，第一部分也是伤口流体中蛋白酶活性可视化的位点。
在一些实施方式中，第二部分能够以足以用于伤口流体的下游(和单独)分析的量吸收伤口流体，如本文进一步描述的。
因此，本发明提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
(i)吸收伤口流体的第一(生物惰性)基质，所述第一(生物惰性)基质包括、基本上由或由以下组成：
a.在所述基质上/内形成反应区的交联的且蛋白酶敏感的聚合物；以及
b.有色颗粒；
其中所述聚合物和有色颗粒的布置使得由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致有色颗粒沿着/穿过基质运输，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示；以及
(ii)第二(生物惰性)基质，所述第二(生物惰性)基质以足以用于所述伤口流体的下游(和单独)分析的量吸收伤口流体。
因此，基质可以被布置成使得第二部分与伤口直接接触，并且第一部分通过与第二部分的流体连通间接地吸收伤口流体。因此，第一部分可以堆叠在第二部分之上。由伤口敷料施加的压力可以保持这些部分在原位流体连接。在其他实施方式中，它们可以更永久地连接，例如通过层压连接。
在一些实施方式中，反应区可以被有效地夹在基质的第一和第二部分之间，任选地与有色颗粒一起(例如截留在反应区内)。如果在伤口流体中有足够的蛋白酶活性，则蛋白酶敏感的聚合物被降解，从而将有色颗粒释放到伤口流体中。当伤口流体进入第一部分时，在上表面上可见色彩。
在另外的实施方式中，不与第二部分接触的第一部分的表面包被有或以其他方式围绕有透明膜，以保护其免受物理损坏。由第二部分吸收的伤口流体仍然可以通过允许流体连通的连接表面进入第一部分。这种布置确保了基质的第一部分包括、基本上由或由其组成的交联的且蛋白酶敏感的聚合物暴露于伤口流体。如本文进一步所述，膜的透明性允许由于交联的且蛋白酶敏感的聚合物与伤口流体中的蛋白酶活性接触而产生的任何信号在护理当场被可视地检测。更一般地，基质的上表面可以包括这些特征，基本上由这些特征组成或由这些特征组成。
在一些实施方式中，基质的第一部分或层基本上比第二部分薄。在一些实施方式中，第一部分或层包括、基本上由或由膜组成。在一些实施方式中，第二部分包括吸收性泡沫材料，基本上由吸收性泡沫材料组成或由吸收性泡沫材料组成，比如聚氨酯泡沫。在基质包括、基本上由或由如本文所述的第一和第二部分组成的特定实施方式中，第一和第二部分可以由相同或不同的材料构成。在一些实施方式中，第二部分由聚氨酯构成，该聚氨酯可以是泡沫的形式。在特定的实施方式中，聚氨酯是非异氰酸酯基聚氨酯。在其他实施方式中，第一和/或第二部分可以包含非织造材料，比如得自Anowo Ltd.的Orion非织造材料。在具体实施方式中，非织造材料具有4osy的重量。
在特定的实施方式中，有色颗粒被截留在聚合物中。因此，在一些实施方式中，反应区包括、基本上由或由有色颗粒组成。在这样的实施方式中，除非样品中存在(足够的)蛋白酶活性，否则不释放有色颗粒。因此，暴露于含有不足的(包括没有)蛋白酶活性的伤口流体不导致从反应区释放有色颗粒(达到任何可感知的程度)。由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致沿着/穿过基质从聚合物释放有色颗粒，以提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
在一些实施方式中，在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割后有色颗粒沿着/穿过基质释放后提供的伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示包括、基本上由或由以下组成：有色颗粒从它们在基质上的初始沉积区域(即从反应区，与伤口流体接触之前所定义的)分散。因此，反应区中的着色强度降低或完全消失。强度的降低在视觉上是可感知的。在一些实施方式中，可以与产品一起提供色彩指南以提供合适的蛋白酶在伤口流体中有活性时预期的色彩变化/水平的参考。在一些实施方式中，这可以是标度，例如，无、低或高活性的简单标度，或数值标度。该标度可以提供有根据阅读结果的进一步动作的建议。替代性地，或者除了通过肉眼观察之外，可以使用分光光度计或本领域技术人员公知的适合于该目的的其他此类设备来检测和/或量化色彩强度的降低。因此，本发明的产品可以提供有合适的读取器，或者可以集成到能够执行某种程度的信号自动读取的装置中。在一些实施方式中，这可以是定量的或半定量的。
在特定实施方式中，基质包含视觉符号，该视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被有色颗粒掩盖，这些有色颗粒可以被截留在聚合物内。例如，可以通过使用任何合适的方式(例如不可擦除的墨水)将视觉符号印刷在基质上，其上是最初被沉积的有色颗粒(可以被截留在聚合物中)。一旦基质接触并吸收一定(足够)量的伤口流体，由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致沿着/穿过基质传输有色颗粒，从而显露视觉符号。
在另外的实施方式中，基质包括观察区。在暴露于伤口流体并且不存在蛋白酶活性之前，观察区不含有色颗粒。因此观察区与反应区分离。通常，分离在基质表面上至少是二维的。在暴露于伤口流体时，由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致沿着/穿过基质释放有色颗粒到观察区中。结果，由于有色颗粒运动到观察区，观察区看起来色彩变化和/或增强。因此，在观察区中提供了蛋白酶活性的视觉指示。在优选的实施方式中，肉眼可以看到色彩变化和/或增强。替代性地，或者除了通过肉眼观察之外，可以使用分光光度计或本领域技术人员公知的适合于该目的的其他此类设备来检测和/或量化色彩变化和/或增强。基质可以被布置成使得伤口流体流优选在从反应区到观察区的方向上。因此，例如，在一些实施方式中，基质可以包括从反应区向观察区引导流体流的通道。然而，这在所有实施方式中都不是必需的。在一些实施方式中，观察区可以简单地是基质的可见表面，该可见表面不是反应区和/或在没有(足够的)蛋白酶活性的情况下有色颗粒的位置。
在特定实施方式中，观察区包括、基本上由或由捕获分子组成以捕获有色颗粒。这可以帮助生成易于理解的信号。捕获分子可以被布置以产生可见线或可以允许对信号(以及因此蛋白酶活性)进行某种程度的量化的其他符号。捕获分子是能够结合有色颗粒的任何分子。这些可以包括、基本上由或由例如特异性结合有色颗粒的抗体或适体组成。在具体的实施方式中，捕获分子是与有色颗粒特异性结合的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆来源的。还可以使用保留特异性结合功能的片段和衍生抗体，包括但不限于Fab片段、ScFv、单域抗体、纳米抗体、重链抗体、适体等，并且这些包括在“抗体”的定义中。产生特异性抗体和适体的方法是本领域技术人员公知的。根据已知技术，抗体可以是人源的或非人源的(例如啮齿动物，比如大鼠或小鼠)和被人源化的等(Jones等,Nature(1986)May 29-Jun.4；321(6069):522-5；Roguska等,Protein Engineering,1996,9(10):895-904；和Studnicka等,Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3–D Structure.ProteinEngineering,1994,Vol.7,pg 805))。
在另外的实施方式中，基质包括与观察区的(下游)末端对齐的屏障。也就是说，观察区位于有色颗粒与屏障之间，并且屏障相对于观察区定位，使得在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割后有色颗粒沿着/穿过基质释放到观察区中后在观察区中累积有色颗粒。因此，屏障防止释放的有色颗粒行进超出观察区。例如，屏障可以包括、基本上由或由多孔材料组成，其中孔的尺寸允许流体和分子量低于临界值的分子通过屏障，但是孔的尺寸不足以使有色颗粒通过屏障。本领域技术人员能够根据所用的有色颗粒选择具有适当分子量临界值的合适材料。替代性地，对于包含多孔基质的实施方式，屏障可以包括基质本身的区域，其中该区域包含孔径小于有色颗粒直径的孔(同时仍允许流体通过)。例如，可以通过压碎或以其他方式压缩基质的该区域来产生这样的区域。压缩程度足以减小孔径，使其小于有色颗粒的直径。因此，有色颗粒不能通过压碎/压缩的区域(屏障)，并且因此在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割后有色颗粒沿着/穿过基质释放到观察区中后在观察区中累积有色颗粒。
根据本文所述的本发明的所有方面和实施方式，有色颗粒可以包括、基本上由或由有色微粒组成。通常，有色颗粒在伤口流体中是不溶的(即不溶解)。在特定实施方式中，有色颗粒可包括、基本上由或由活性炭颗粒和/或有色聚苯乙烯微粒组成(比如来自Polysciences公司(产品号15709)的
Figure GDA0003398057340000101
聚苯乙烯模糊染色微球(PolystyreneBlur Dyed Microsphere)(0.5微米直径，2.5％固体))。在优选的实施方式中，有色颗粒包括、基本上由或由彩色聚苯乙烯微粒组成。用于本发明的有色颗粒的其它非限制性实施方式包括铜酞菁四磺酸四钠盐、有色乳胶微粒、金颗粒和/或染料分子，比如酞菁蓝BN(也称为“单星蓝”(Monastal Blue)；CAS 147-14-8)。通常，有色颗粒是按照本文中所述的或者使用本领域技术人员已知的方法能够被检测到并且能够由水性流体沿着/穿过基质携带的任何有色颗粒。
根据本文所述的本发明的所有方面和实施方式，可以通过用有色颗粒干燥聚合物来实现在(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物内截留有色颗粒。结果，聚合物以及因此反应区具有截留的颗粒的颜色。有色颗粒保持被截留在聚合物中，直到并且除非由产品吸收的伤口流体中存在的蛋白酶活性使聚合物切割。在由伤口流体中存在的蛋白酶活性使聚合物切割之后，有色颗粒沿着/穿过基质传输，以提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。通常，这是从反应区到观察区。
有色颗粒的截留可以与使用可溶性染料(与蛋白酶敏感的聚合物相缔合)直接对比。缔合可以是直接缔合(例如共价缔合)或间接缔合(例如吸附)。有色颗粒的优点在于它们提供了改善的反应区着色。
鉴于前述内容，对于本领域技术人员显而易见的是，上述本发明的特定实施方式适合应用于基于非原位侧向流的形式。因此，本发明还提供：
一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由以下组成或由以下组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由交联的蛋白酶敏感的聚合物组成，其中有色颗粒被截留在所述聚合物中；以及任选地
c.在所述样品施加区和所述反应区下游的观察区；
其中所述样品施加区朝着所述反应区(和观察区，如果存在的话)传输流体，并且其中由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性(任选地在阈值水平以上)引起的聚合物切割导致有色颗粒沿着/穿过基质与所述伤口流体一起被运送，从而提供蛋白酶活性的视觉指示(如果存在，可以在观察区中观察到)。上述实施方式可以加以必要的变更适用于这种特定的侧向流方面，并且在此仅仅为了简洁不再重复。
在另外的实施方式中，根据所有前述方面和实施方式，交联的且蛋白酶敏感的聚合物(即反应区)形成屏障，在伤口流体中没有(任选地高于阈值水平的)蛋白酶活性的情况下，屏障防止伤口流体与有色颗粒接触。因此，除非在伤口流体中有足够的蛋白酶活性来破坏屏障，否则反应区可以形成伤口流体流动的屏障。在具体的实施方式中，有色颗粒不一定被截留在聚合物内，而是在由聚合物形成的屏障的下游，也就是说，屏障位于基质上的伤口流体的施加点与最初沉积有色颗粒的基质上的区域之间。在使用中，由伤口流体中存在的蛋白酶活性(任选地高于阈值水平)引起的聚合物切割破坏了屏障并导致有色颗粒沿着/穿过基质流动，以提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。在特定实施方式中，基质还包括观察区，该观察区在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下不包含有色颗粒。在暴露于伤口流体时，由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致沿着/穿过基质释放有色颗粒到观察区中。结果，由于有色颗粒运动进观察区，观察区看起来色彩变化和/或增强。因此，在观察区中提供了蛋白酶活性的视觉指示。
在优选的实施方式中，肉眼可以看到色彩变化和/或增强。替代性地，或者除了通过肉眼观察之外，可以使用分光光度计或本领域技术人员公知的适合于该目的的其他此类设备来检测和/或量化色彩变化和/或增强。因此，本发明的产品可以提供有合适的读取器，或者可以集成到能够执行某种程度的信号自动读取的装置中。在一些实施方式中，这可以是定量的或半定量的。
在特定实施方式中，观察区包括、基本上由或由捕获分子组成以捕获有色颗粒。这可以帮助生成易于理解的信号。捕获分子可以被布置以产生可见线或可以允许对信号(以及因此蛋白酶活性)进行某种程度的量化的其他符号。捕获分子是能够结合有色颗粒的任何分子。这些可以包括、基本上由或由例如特异性结合有色颗粒的抗体或适体组成。在具体的实施方式中，捕获分子是与有色颗粒特异性结合的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆来源的。还可以使用保留特异性结合功能的片段和衍生抗体，包括但不限于Fab片段、ScFv、单域抗体、纳米抗体、重链抗体、适体等，并且这些包括在“抗体”的定义中。产生特异性抗体和适体的方法是本领域技术人员公知的。根据已知技术，抗体可以是人源的或非人源的(例如啮齿动物，比如大鼠或小鼠)和被人源化的等(Jones等,Nature(1986)May 29-Jun.4；321(6069):522-5；Roguska等,Protein Engineering,1996,9(10):895-904；和Studnicka等,Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3–D Structure.ProteinEngineering,1994,Vol.7,pg 805))。
在另外的实施方式中，基质包含与观察区的(下游)末端对齐的第二屏障(即，除了由交联的蛋白酶敏感的聚合物形成的屏障之外)。也就是说，观察区位于有色颗粒与第二屏障之间，并且第二屏障相对于观察区定位，使得在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割后有色颗粒沿着/穿过基质释放到观察区中后在观察区中累积有色颗粒。因此，第二屏障防止释放的有色颗粒行进超出观察区。例如，屏障可以包括、基本上由或由多孔材料组成，其中孔的尺寸允许流体和分子量低于临界值的分子通过屏障，但是孔的尺寸不足以使有色颗粒通过屏障。本领域技术人员能够根据所用的有色颗粒选择具有适当分子量临界值的合适材料。替代性地，对于包含多孔基质的实施方式，第二屏障可以包括基质本身的区域，其中该区域包含孔径小于有色颗粒直径的孔(同时仍允许流体通过)。例如，可以通过压碎或以其他方式压缩基质的该区域来产生这样的区域。压缩程度足以减小孔径，使其小于有色颗粒的直径。因此，有色颗粒不能通过压碎/压缩的区域(第二屏障)，并且因此在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割后有色颗粒沿着/穿过基质释放到观察区中后在观察区中累积有色颗粒。
在特定实施方式中，基质包含视觉符号，该视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被有色颗粒掩盖。例如，可以通过使用任何合适的方式(例如不可擦除的墨水)将视觉符号印刷在基质上，其上是最初被沉积有色颗粒。一旦基质接触并吸收一定(足够)量的伤口流体，由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割破坏由聚合物形成的屏障，并且导致沿着/穿过基质传输有色颗粒，从而显露视觉符号。
因此，鉴于前述内容，对于本领域技术人员显而易见的是，以上描述的涉及由交联的蛋白酶敏感的聚合物形成的屏障的本发明的实施方式适合应用于基于非原位侧向流的形式。因此，在相关方面，本发明还提供了：
一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由以下组成或由以下组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由交联的蛋白酶敏感的聚合物组成；
c.包括、基本上由或由所述反应区下游的有色颗粒组成的区域；以及任选地
d.在所述样品施加区和所述反应区下游的观察区；
其中所述样品施加区朝着所述反应区以及包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域(以及观察区，如果存在)输送流体，并且其中所述反应区中的聚合物形成屏障，所述屏障防止伤口流体到达包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域(以及观察区，如果存在)。由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性(任选地在阈值水平以上)引起的聚合物切割破坏屏障，并且导致有色颗粒沿着/穿过基质与所述伤口流体一起被运送，从而提供蛋白酶活性的视觉指示(如果存在，可以在观察区中观察到)。上述关于由交联的蛋白酶敏感的聚合物形成的屏障的实施方式可以加以必要的变更适用于这种特定的侧向流方面，并且在此仅仅为了简洁不再重复。
根据本文所述的本发明的所有方面和实施方式，(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物包括、基本上由或由一种或多种蛋白酶的切割位点组成。优选地，蛋白酶敏感的聚合物包括、基本上由或由反映这样的蛋白酶的多种蛋白酶的切割位点组成：所述蛋白酶当过量存在时通常导致不正确的伤口愈合(如本文更详细讨论的)。因此，(任选地交联的)蛋白酶敏感的聚合物可以用于复制伤口的细胞外基质环境，特别是伤口边界。因此，反应区可以从伤口复制细胞外基质。因此，在一些实施方式中，聚合物可以被认为是分子“纤维”，在纤维之间形成任选的交联。(任选地交联的)蛋白酶敏感的聚合物可以形成水凝胶结构(例如明胶水凝胶)。在特定的实施方式中，聚合物包括、基本上由或由蛋白质/多肽组成。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，合成聚合物也可以是合适的，条件是它们包括、基本上由或由至少一种蛋白酶的一个或多个切割位点组成。在特定实施方式中，聚合物可以包括、基本上由或由天然存在的和非天然存在的单体单元二者组成。在具体的实施方式中，聚合物包括、基本上由或由任选交联的胶原组成。胶原可以形成胶原斑。在优选的实施方式中，胶原在用于本发明之前是完全、基本上或部分变性的。当通过胶原的部分水解发生这种情况时，称之为“明胶”，如本领域技术人员所熟知的。因此，在这些优选的实施方式中，聚合物包括、基本上由或由任选交联的明胶组成。在其他实施方式中，聚合物包括、基本上由或由任选交联的弹性蛋白组成。
根据本文所述的本发明的所有方面和实施方式，(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物对蛋白酶活性的敏感性可以通过多种(可组合的)方式直接和间接地进行调节。相关因素包括产品与伤口流体接触的时间长度(即由反应区暴露于伤口流体的时间长短决定)。例如，在一些实施方式中，包含(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物的反应区进一步包含一种或多种蛋白酶抑制剂。在具体的实施方式中，一种或多种蛋白酶抑制剂可以(直接(例如共价)或间接(例如通过吸附))与(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物缔合。存在于反应区中的一种或多种蛋白酶抑制剂分子抑制伤口流体中存在的特定蛋白酶，因此实际上降低了所存在的能够切割(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物的活性蛋白酶水平。例如，一种或多种蛋白酶抑制剂可以包括、基本上由或由Ilomastat(GM6001，Galardin)和/或来自Calbiochem的弹性蛋白酶抑制剂弹性蛋白酶抑制剂-V(2-(2-溴苯基)-5-氯-3,1-苯并恶嗪-4-酮)组成，Ilomastat是用于一系列MMP(尤其是MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-14等)的广谱基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，弹性蛋白酶抑制剂-V是苯并恶嗪酮化合物，其经由迈克尔加成-消除反应通过共价修饰活性位点丝氨酸而用作人白细胞弹性蛋白酶的有效抑制剂(IC50＝29.5nM)。调整(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物对蛋白酶活性的敏感性的另一种(间接)方法是在包含(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物的反应区中进一步包括一种或多种牺牲(sacrificial)蛋白/多肽。一种或多种牺牲蛋白/多肽可以例如包含、基本上由或由白蛋白和/或优化的(合成的)蛋白酶敏感的肽组成。一种或多种牺牲蛋白/多肽充当伤口流体中蛋白酶的替代(竞争性)底物，从而使蛋白酶活性转离(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物。对于其中蛋白酶敏感的聚合物交联的那些实施方式，调整聚合物对蛋白酶活性的敏感性的另一直接方法是通过增加或减少交联程度(如本文进一步描述的)。增加的交联将降低蛋白酶敏感性，因为增加的交联数量需要在有色颗粒能够通过伤口流体沿着/通过基质传输之前对蛋白酶敏感的聚合物进行更广泛的切割。反之亦然，基于相同的原理，减少的交联将增加蛋白酶敏感性。这些操纵(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物的蛋白酶活性敏感性的方法中的每一种可以适当地单独使用或组合使用(例如，取决于蛋白酶敏感的聚合物是否交联)。
根据本文所述的本发明的所有方面和实施方式，在聚合物分子之间形成的交联可以是直接的或间接的。本发明的发明人已经发现，聚合物分子的交联有利地在水性条件下稳定聚合物分子，在没有(诊断相关的)蛋白酶活性的情况下防止聚合物逐渐分解，这在将在伤口保留相当长的一段时间(例如在伤口敷料下超过一天)的产品的情况下尤其相关。另外，如上所述，交联增强了聚合物对蛋白酶活性的切割的抗性，除非并且直到蛋白酶活性以足够的量存在以指示伤口状况的变化，该量可以处于或高于蛋白酶活性的(预定的)阈值水平。通常，首先用一个或多个可交联基团改性未改性的聚合物分子，然后在合适的交联条件下(如本文其他地方所述)处理改性的聚合物分子，从而得到交联的聚合物。合适的交联条件取决于所用的可交联基团。例如，合适的条件可以包括、基本上由或由任选地在存在合适的光引发剂的条件下使用紫外(UV)照射组成。通过控制聚合物与可交联基团的相对摩尔浓度和/或通过适当改变改性的反应条件，例如，改变可影响/改变单体单元(聚合物包括、基本上由或由这些单体单元组成)的电荷状态和/或聚合物的构象的反应的pH和/或温度，可以控制具有可交联基团的未改性聚合物分子的改性程度。改性程度可以通过本领域已知的合适方法定量，例如通过核磁共振光谱法。对于适用于原位检测伤口状况变化的产品的那些实施方式，优选具有可交联基团的聚合物的最大衍生化。
在优选的实施方式中，聚合物分子(通常是明胶、胶原和/或弹性蛋白)用甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐或其衍生物进行改性，然后甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐或其衍生物在本领域技术人员已知的合适条件下连接在一起。因此，对于这些实施方式，聚合物之间的交联包括、基本上由或由甲基丙烯酸酯或其衍生物组成。交联可以在本领域技术人员已知的任何合适的条件下实现，例如通过任选地在存在合适的光引发剂的条件下暴露于UV照射。
在其他实施方式中，聚合物分子(通常是明胶、胶原和/或弹性蛋白)用戊二醛或其衍生物进行改性，然后/在此期间戊二醛或其衍生物在本领域技术人员已知的合适条件下连接在一起。因此，对于这些实施方式，聚合物之间的交联源自戊二醛或其衍生物。交联可以在本领域技术人员已知的任何合适的条件下实现。
如本文所述，根据本发明的所有方面和实施方式，本发明中使用的聚合物是蛋白酶敏感的(即它们包含、基本上由或由至少一个蛋白酶切割位点组成)。在一些实施方式中，聚合物可以对一种特定的蛋白酶敏感。在其他更优选的实施方式中，聚合物可以对多种蛋白酶敏感(反映体内伤口愈合过程的那些蛋白酶)。如技术人员将理解的，这将取决于聚合物中存在的切割位点。每个切割位点可易受一种特异性蛋白酶或多种蛋白酶的切割。替代性地或另外，聚合物可以包含、基本上由或由不同蛋白酶可切割的两种或更多种不同切割位点组成。通常，切割位点包含、基本上由或由两个或更多个氨基酸部分的肽序列组成，其可以被能够在切割位点中的至少一个肽键处(在两个氨基酸部分之间)切断的一个或多个特异性蛋白酶识别。蛋白酶切割位点和互惠(reciprocal)蛋白酶在本领域中是熟知的。聚合物中的切割位点的数量应使得在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起聚合物的切割之后，聚合物被足够降解以导致有色颗粒沿着/穿过基质的转运，以提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。鉴于该要求，技术人员完全能够使用常规实验确定切割位点的足够数量。在具体的实施方式中，切割位点被丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和/或谷氨酸蛋白酶特异性识别并切割。在特定的实施方式中，切割位点被一种或多种基质金属蛋白酶(比如MMP2、MMP8和/或MMP9)特异性识别并切割。在优选的实施方式中，切割位点被胶原酶、明胶酶和/或弹性蛋白酶(比如中性粒细胞弹性蛋白酶，更特别是人中性粒细胞弹性蛋白酶)特异性识别并切割。在更另外的实施方式中，切割位点被蛋白酶组织蛋白酶(cathepsin)(比如组织蛋白酶G)特异性识别并切割。在更另外的实施方式中，切割位点被木瓜蛋白酶家族酶(比如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的葡萄球菌蛋白(staphopain))特异性识别并切割。有利地，蛋白酶敏感的聚合物可以被与伤口愈合相关的多种蛋白酶切割(可以称为“消化”)。多种蛋白酶可以选自上面列出的蛋白酶，直至所有这些蛋白酶。
在某些实施方式中，根据本文所述的本发明的所有方面和其他实施方式，仅当伤口流体中存在的蛋白酶活性处于或高于预定阈值水平时，蛋白酶敏感的聚合物才被切割(至任何显著程度)。在这些实施方式中，如果蛋白酶活性不存在或以低于阈值的水平存在，则由于缺乏(至任何显著程度)聚合物的切割，则可忽略不计的量的或没有有色颗粒沿着/通过基质传输，因此，没有提供蛋白酶活性的视觉指示。例如，蛋白酶活性的阈值水平可以是愈合伤口中预期的水平。例如，在愈合伤口中将预期一些胶原酶活性，但过量的活性可以表明伤口状况已经恶化。在具体的实施方式中，预定阈值水平可以在0.0001-0.1mg/mL的范围内。例如，可以是0.0001mg/mL、0.00015mg/mL、0.00031mg/mL、0.00062mg/mL、0.001mg/mL、0.00125mg/mL、0.0025mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.0125mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL或0.1mg/mL。阈值可适用于样品中可检测的总蛋白酶活性。在一种或多种蛋白酶包括、基本上由或由胶原酶/明胶酶、基质金属蛋白酶(比如MMP2、MMP8和/或MMP9)、中性粒细胞弹性蛋白酶(任选地人中性粒细胞弹性蛋白酶)和/或木瓜蛋白酶家族酶(比如金黄色葡萄球菌的葡萄球菌蛋白)组成的特定实施方式中，预定阈值水平可以是0.0001mg/mL、0.00015mg/mL、0.00031mg/mL、0.00062mg/mL、0.001mg/mL、0.00125mg/mL、0.0025mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.0125mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL或0.1mg/mL。在特定实施方式中，基质金属蛋白酶(比如MMP2、MMP8和/或MMP9)的活性的预定阈值水平为0.0007-0.025mg/mL的范围。在特定实施方式中，基质金属蛋白酶(比如MMP2、MMP8和/或MMP9)的活性预定阈值水平为或高于0.00076mg/mL。在其他实施方式中，基质金属蛋白酶(比如MMP2、MMP8和/或MMP9)的活性预定阈值水平为或高于0.0228mg/mL。阈值可适用于样品中可检测的总基质金属蛋白酶活性。在特定实施方式中，中性粒细胞弹性蛋白酶(任选地人中性粒细胞弹性蛋白酶)的活性预定阈值水平在0.0059-0.344mg/mL范围内。在具体的实施方式中，中性粒细胞弹性蛋白酶(任选地人中性粒细胞弹性蛋白酶)的预定阈值活性水平是或高于0.0995mg/mL。阈值可以适用于样品中可检测的总中性粒细胞弹性蛋白酶活性。在特定实施方式中，组织蛋白酶蛋白酶(比如组织蛋白酶G)的活性预定阈值水平在0.005-0.05mg/mL范围内。阈值可适用于样品中可检测的组织蛋白酶蛋白酶活性。
明胶(Gelatin)是用于本发明反应区的特别合适的材料，并提供伤口流体中生理学相关蛋白酶活性的指示。因此，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由吸收伤口流体的基质组成，所述基质包括、基本上由或由以下各项组成：
a.在所述基质上/内形成反应区的交联的明胶；以及
b.有色(优选聚苯乙烯)微粒；
其中所述交联包括、基本上由或由以下各项组成：(i)甲基丙烯酸酯或其衍生物，或(ii)戊二醛或其衍生物；并且
其中所述聚合物和有色颗粒的布置使得由所述伤口流体中存在的明胶酶活性引起的聚合物切割导致有色颗粒沿着/穿过基质运输，以提供所述伤口流体中明胶酶活性的视觉指示。上述所有特征和实施方式加以必要的变更与本产品相关，并且在此仅仅为了简洁不再重复。
类似地，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由交联的明胶分子组成，其中有色(优选聚苯乙烯)微粒被截留在所述明胶分子中；以及任选地
c.在所述样品施加区和所述反应区下游的观察区；
其中所述交联包括、基本上由或由以下各项组成：(i)甲基丙烯酸酯或其衍生物，或(ii)戊二醛或其衍生物；并且
所述样品施加区朝着所述反应区(和观察区，如果存在的话)传输流体，并且其中由所述伤口流体中存在的明胶酶活性(任选地高于阈值水平)引起的明胶分子切割导致有色(聚苯乙烯)颗粒沿着/穿过基质与所述伤口流体一起被运送，从而提供明胶酶活性的视觉指示(如果存在，可以在观察区中观察到)。上述所有特征和实施方式加以必要的变更与本产品相关，并且在此仅仅为了简洁不再重复。
类似地，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由交联的明胶分子组成；
c.包括、基本上由或由所述反应下游的有色(优选地聚苯乙烯)微粒组成的区域；以及任选地
d.在所述样品施加区和所述反应区下游的观察区；
其中所述交联包括、基本上由或由以下各项组成：(i)甲基丙烯酸酯或其衍生物，或(ii)戊二醛或其衍生物；并且
其中所述样品施加区朝着所述反应区以及包括、基本上由或由有色(聚苯乙烯)微粒组成的区域(以及观察区，如果存在)输送流体，并且其中所述反应区中的明胶分子形成屏障，所述屏障防止伤口流体到达包括、基本上由或由有色(聚苯乙烯)微粒组成的区域(以及观察区，如果存在)。由所述伤口流体中存在的明胶酶活性(任选地在阈值水平以上)引起的明胶分子切割破坏了屏障，并且导致有色聚苯乙烯微粒沿着/穿过基质与所述伤口流体一起被运送，从而提供明胶酶活性的视觉指示(如果存在，可以在观察区中观察到)。上述所有特征和实施方式加以必要的变更与本产品相关，并且在此仅仅为了简洁不再重复。
所有上述产品和实施方式可以进一步包括容纳基质的壳体。在提供壳体的情况下，所述壳体可以包括、基本上由或由一个或多个(任选地两个)观察窗组成，所述观察窗在基质上限定一个或多个观察区以观察有色颗粒。这些观察窗可以沿着壳体定位，使得在暴露于伤口流体之前并且在没有蛋白酶活性的情况下，有色颗粒在第一观察窗中可见但在第二观察窗中不可见。对于包括、基本上由或由一个或多个观察区组成的那些实施方式，可以对准一个或多个观察窗，使得观察区通过观察窗可见(并由观察窗限定)。替代性地，不包括、不是基本上由或不是由反应区和/或观察区组成的基质的部分可以被掩盖，使得最终用户看不到任何有色颗粒。这有助于简化要解释的信号。
更一般地，在相关方面，本发明还提供测试基质，所述测试基质包括、基本上由或由胶原和/或明胶聚合物组成，所述聚合物包含甲基丙烯酸酯交联或衍生自戊二醛的交联。在优选实施方式中，测试基质适用于测量优选在伤口流体中的蛋白酶活性。测试基质可以包括如本文关于本发明的其他方面所述的任何一个或多个附加特征。
类似地，本发明还提供甲基丙烯酸酯交联的明胶聚合物，用于测量伤口流体中的蛋白酶活性。
在另一方面，本发明公开了交联的且蛋白酶敏感的聚合物作为基底用于测量伤口流体中的蛋白酶活性的用途。在优选实施方式中，所用聚合物包括、基本上由或由胶原、明胶和/或弹性蛋白聚合物组成。明胶是最优选的。在另外的实施方式中，交联包括、基本上由或由甲基丙烯酸酯组成和/或衍生自戊二醛。
另一方面，本发明提供了一种监测(受试者的)伤口状况的方法，所述方法包括、基本上由或由以下各项组成：
a.将伤口流体的样品施加到如本文所定义的产品上；并且
b.检测由所述有色颗粒提供的蛋白酶活性的视觉指示。
在所述方法的特定实施方式中，在所述基质的区域中测量所述有色颗粒，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的定量。在相关的实施方式中，所述区域包括、基本上由或由如本文其他地方所定义的观察区组成。在一些实施方式中，所述方法中使用的产品包括、基本上由或由两个观察区组成，并且将一个区中的有色颗粒的损失与第二区中的有色颗粒的增加进行比较。例如，在暴露于伤口流体之前并且在没有蛋白酶活性的情况下，第一观察区可以包括、基本上由或由有色颗粒组成，而第二观察区不包括。在暴露于伤口流体时，由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致沿着/穿过基质释放有色颗粒。结果，有色颗粒在伤口流体的流动方向上从第一观察区沿着/穿过基质移动到第二观察区。在优选实施方式中，肉眼可以看到每个观察区中的色彩变化。替代性地或者除了通过肉眼观察之外，可以使用分光光度计或适合于该目的的其他此类设备来检测和/或量化色彩变化，这是本领域技术人员公知的。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括、基本上由或由向产品施加另外的液体以帮助伤口流体的流体流动组成。这可以被称为“追赶流体”(chase fluid)。另外的液体可以包括、基本上由或由缓冲液组成。缓冲液可以与伤口流体和/或该方法中采用的其他材料的性质相匹配。例如，可以使用“追赶流体”以便携带伤口流体通过测试条的孔。使用额外的液体可以改善释放的有色颗粒沿着/通过基质的传输。附加液体可以包括、基本上由或由表面活性剂组成，以防止有色颗粒不希望地粘附到基质上。
在本发明的另一个方面，每隔一段时间重复本文所述的方法，以便通过重复取样和分析伤口流体来促进伤口状况的纵向监测。所述间隔可以是每1/2、1、2、3、4、5或6天一次、每周一次或每月一次或其组合。随着时间的推移，与伤口状况有关的数据的累积更好地使临床医生能够理解伤口状况的进展和/或治疗功效。例如，如所描述的对伤口流体的纵向监测可以以比现有程序更快速和/或定量的方式向临床医生指示伤口的状况随时间变化而恶化并且因此本治疗无效。因此，临床医生可以更快速地选择替代治疗以促进伤口愈合。替代性地，数据可以向临床医生指示需要进一步测试伤口流体和/或伤口环境。
在另一个实施方式中，不存在过量的蛋白酶活性表明应继续任何现有的伤口治疗(即不应改变)。
另一方面，本发明提供了制备用于测量伤口流体中蛋白酶活性的基质的方法，所述方法包括、基本上由或由以下各项组成：
a.将含有甲基丙烯酸酯改性的聚合物的溶液施加到能够吸收伤口流体的基质中；并且
b.用UV光照射所述聚合物，从而使所述聚合物交联。
所述方法因此产生基质，所述基质包括、基本上由或由反应区组成。反应区通常覆盖基质的可见表面的离散部分，因此不会使基质饱和。
可以使用本领域已知的任何合适的技术/方案制备甲基丙烯酸酯改性的聚合物。例如，当聚合物包括、基本上由或由胺基团(比如蛋白质/多肽中的赖氨酸ε-胺基团)组成时，聚合物可以与甲基丙烯酸酐反应，甲基丙烯酸酐可以是(高)过量的。根据Be Hoon Lee等人的方法(RSC Adv.,2015,5,106094-106097)，该反应可以在大约50℃下在碳酸盐缓冲液中进行约3小时，以将pH保持在约pH7.0-9.0，必要时用甲基丙烯酸酐和氢氧化钠进行调节。该方法允许对蛋白质/多肽中的赖氨酸ε-胺基团进行高效改性，同时限制不需要的副反应。所产生的甲基丙烯酸酯改性的聚合物可以使用本领域已知的合适方法(比如切向流过滤或透析)进行纯化。
在特定实施方式中，步骤a)的溶液还包含有色颗粒，步骤b)导致有色颗粒被截留在交联聚合物中。
在另外的实施方式中，步骤a)的溶液进一步包括合适的光引发剂(在步骤(b)中暴露于UV辐射时开始/催化交联反应)。在特定实施方式中，步骤(a)的溶液中光引发剂、甲基丙烯酸酯改性的聚合物和有色颗粒的最终浓度在以下范围内：0.01-10％(w/v)光引发剂，0.01-50％(w/v)甲基丙烯酸酯改性的聚合物和0.01-40％(w/v)有色颗粒。在一些实施方式中，步骤(a)的溶液中光引发剂、甲基丙烯酸酯改性的聚合物和有色颗粒的最终浓度在以下范围内：0.1-1％(w/v)光引发剂，1-10％(w/v)甲基丙烯酸酯改性的聚合物和0.05-5％(w/v)有色颗粒。在优选实施方式中，步骤(a)的溶液中光引发剂、甲基丙烯酸酯改性的聚合物和有色颗粒的最终浓度为：0.45％光引发剂，8.1％甲基丙烯酸酯改性的聚合物和0.25％有色颗粒。
在另外的实施方式中，溶液在至少30℃的温度下施加。这有助于防止甲基丙烯酸酯改性的聚合物固化直至所需要的。在一些实施方式中，可以将增稠剂(比如羧甲基纤维素或明胶)添加到溶液中以增加其粘度，从而易于在UV照射之前将溶液操作到基质上。
在特定实施方式中，施加于基质的含有甲基丙烯酸酯改性的聚合物的溶液的体积为1-10μl、1-20μl、1-50μl、1-100μl或1-1000μl。在特定实施方式中，该体积是5μl。在其他实施方式中，该体积是1μl。
在特定实施方式中，任选地在光引发剂存在下，用UV光照射聚合物约15-30秒。在一些实施方式中，然后将交联聚合物在基质上/中干燥。这可以是(例如)通过空气干燥任选地1-5小时(优选3小时)。
在优选实施方式中，甲基丙烯酸酯改性的聚合物包括、基本上由或由胶原、明胶和/或弹性蛋白聚合物组成。
在另外的实施方式中，基质包括视觉符号，并且在步骤a)中，溶液被施加以覆盖视觉符号。可以通过使用任何合适的装置(例如不可擦除的墨水)将视觉符号印刷在基质上。
如技术人员将理解的，前述方法可以用于制备用于如本文所定义的产品的基质。
在另一方面，本发明提供了用于制备如本文所定义的产品的套件，所述套件包括、基本上由或由以下各项组成：
a.交联的且蛋白酶敏感的聚合物(优选明胶、胶原和/或弹性蛋白聚合物)；以及
b.有色颗粒。
在特定实施方式中，所述套件进一步包含如本文所述的基质。所述套件还可以包含容纳如本文所述的基质的壳体。在提供壳体的情况下，所述壳体可以包括、基本上由或由用于观察有色颗粒的一个或多个(任选地两个)观察窗组成。这些观察窗可以沿着壳体定位，使得在暴露于伤口流体之前并且在没有蛋白酶活性的情况下，有色颗粒在第一观察窗中可见但在第二观察窗中不可见。
虽然设想到本发明的产品的最有利的原位施加是作为与伤口敷料完全分开包装的分立产品，但也可以将本发明的产品整合到伤口敷料中。因此，本发明还提供了一种伤口敷料，所述伤口敷料整合了如本文所定义的本发明的产品。所述伤口敷料和产品可以以零件套件提供。因此，当将伤口敷料放置在伤口上时，伤口敷料整合了本发明的产品，如本文进一步详细描述的。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以设计或使用本文所述的产品以便吸收足够的伤口流体，从而能够在不必吸收的情况下提供关于伤口流体中的蛋白酶活性的视觉指示，或者能够吸收足够的伤口流体以供如本文所述的进一步下游处理。因此，在某些实施方式中，所述产品仅用作伤口内蛋白酶活性检测器。这些实施方式是有利的，因为它们非常易于操作和理解。
然而，本领域技术人员从本公开内容中还显而易见的是，本发明的用于原位施加的产品的许多实施方式的关键方面是吸收足够的伤口流体以使得能够在受试者的远程设置中进一步进行基于实验室的流体测试的能力。一旦从伤口移除，产品然后需要以使得流体保持在诊断上有用的方式被安全地递送到实验室。因此，本发明还提供了一种套件，所述套件包括、基本上由或由如本文所述的产品和(合适)用于安全容纳和运送产品的容器组成。在产品与伤口接触并且吸收伤口流体后，可以将产品从伤口取出并放入容器中以允许安全运输到实验室以进一步分析伤口流体，如本文进一步描述的。
在其中基质包括、基本上由或由如本文所述的第一和第二部分组成的产品的实施方式中，第一和第二部分可以作为本文所述的套件中的两个单独的部件提供。在特定实施方式中，这两个部件可以彼此连接，使得护理当场处的使用者可以将两个部件组装成单个单元以被放置成与伤口(流体)接触。伤口敷料可以将单个单元保持在位。在某些实施方式中，其中第二部分能够并且已经吸收了足以用于如本文进一步描述的伤口流体的下游分析的量的伤口流体，仅需要将该第二部分安全地递送至如本文所述的实验室。因此，第二部分可以从第一部分拆卸。替代性地，可以发送整个单元用于进一步测试。第一部分中的测试结果提供了有用的诊断信息，因此也可以有利地传输这些诊断信息。
在某些实施方式中，容纳容器的至少内表面以及通常包括外表面的所有表面都是生物惰性的。
在另外的实施方式中，基质与容纳容器的一个或多个内表面的接触不会可测量地改变流体或其组分(标记物)的状况。
容器应当是可密封的，以便安全运输，而不会有液体渗漏的风险。密封件可以是可逆的，或者可以需要在实验室中断开以便接近流体。该容器通常是可消耗的一次性物品。在一些实施方式中，它可以由塑料制成。然而，它可以在适当的灭菌(例如，在一些实施方式中，通过高压灭菌)后重复使用。
另一方面，本发明提供了一种监测受试者的伤口状况的方法，所述方法包括、基本上由或由以下各项组成：
(a)将如本文所述的本发明的产品放置成与伤口敷料下的伤口接触；
(b)使所述产品与所述伤口接触一段预定的时间；
(c)通过所述产品确定所述伤口中存在或不存在蛋白酶活性的视觉指示；
其中所述视觉指示的存在表明需要进一步分析所述伤口流体。
在其中基质包括、基本上由或由如本文所述的第一和第二部分组成的产品的实施方式中，第一和第二部分可以是单独的部件，彼此不连接并且独立地被放置成与伤口接触预定的时间量。在其他实施方式中，第一和第二部分可以作为单独的部件提供，这些部件可彼此连接并由使用者在护理当场组装成单个单元。然后将该单个单元放置成与伤口接触预定的时间量。因此，第二部分可以从第一部分拆卸。替代性地，可以发送整个单元用于进一步测试。第一部分中的测试结果提供了有用的诊断信息，因此也可以有利地传输这些诊断信息。在特定实施方式中，第一部分包括、基本上由或由本文所述的在基质的那部分上或中的交联的且蛋白酶敏感的聚合物组成。第一部分能够吸收足够的伤口流体，以使被包括在第一部分上或中的交联的且蛋白酶敏感的聚合物暴露于伤口流体，并因此与其中可能包含的蛋白酶活性接触。因此，该第一部分通过如本文所述的产品提供伤口中蛋白酶活性的视觉指示。第二部分能够以足以用于伤口流体的下游分析的量吸收伤口流体，如本文进一步描述的。
然而，在某些实施方式中，视觉指示与选自以下各项的一个或多个指示进行组合：
(i)所述伤口的气味
(ii)流体总量
(iii)所述伤口的外观
(iv)所述受试者的全身状况
以便确定是否需要进一步分析所述伤口流体。
产品的视觉指示的不存在可以被上面列出的一个或多个其他指示的存在来抵消，这些其他指示在共同评估时确定需要进一步分析伤口流体。可以由护理当场的护理人员(例如地区护士)或临床医生进行这种评估。
在另外的实施方式中，该方法进一步包括、基本上由或由以下各项组成：
(d)使所述产品与所述伤口脱离接触；
(e)取回所述产品吸收的液体；
(f)分析所述取回的液体以确定所述伤口的状况。
移除产品可以使用镊子或其他器械来防止人直接接触基质。
在具体实施方式中，其中所述产品包括、基本上由或由基质组成，所述基质包括、基本上由或由如本文所述的第一和第二部分组成，从已经吸收足以用于如本文进一步描述的伤口流体的下游分析的量的伤口流体的第二基质部分取回伤口流体。
在某些实施方式中，步骤(d)进一步包括、基本上由或由在执行步骤(e)之前将产品储存并运送到实验室组成。对于其中基质包括、基本上由或由如本文所述的第一和第二部分组成的产品的实施方式，在某些实施方式中，仅第二基质部分被储存并运送到实验室，因为正是这部分吸收了足以用于如本文进一步描述的伤口流体的下游分析的量的伤口流体。在其他实施方式中，第一和第二基质部分都被储存并运送到实验室，使得例如可以在实验室中评估第一基质部分中存在的一种或多种标记物的降解程度。因此，第二部分可以从第一部分拆卸。替代性地，可以发送整个单元用于进一步测试。第一部分中的测试结果提供了有用的诊断信息，因此也可以有利地传输这些诊断信息。产品的储存可以在如本文所述的容器中适用于在步骤(e)和(f)之前安全地容纳和运送。在某些实施方式中，容纳容器的内表面和外表面是生物惰性的。在另外的实施方式中，基质与容纳容器的内表面的接触不会可测量地改变流体或其组分的状况。
在另一个实施方式中，将含有从伤口移除的产品的容器被运输到实验室以对吸收的伤口流体进行进一步分析。
可以通过任何合适的方法取回流体。基质可以被挤压以释放流体或可以例如被离心。
对取回的流体进行分析包括、基本上由或由一个或多个测试组成以表征伤口的状况。这些测试可以促进治疗和其他临床干预的处理和选择。如本领域技术人员容易理解的，可以采用任何合适的测试。在某些实施方式中，对取回的流体进行分析包括、基本上由或由测量以下的一种或多种的水平和/或活性组成：
(i)N端血清1型前胶原(P1NP)
(ii)N-乙酰基-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸(acPGP)
(iii)中性粒细胞浸润的生物标记物
N端血清1型前胶原(P1NP)是胶原合成的指示分子。N-乙酰基-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸(acPGP)是由基质金属蛋白酶(特别是胶原酶)引起的胶原的溶蛋白性切割所产生的胶原的降解产物。因此，在另外实施方式中，P1NP和acPGP的水平用于确定治疗指数比率，其中：
(i)相等水平的P1NP和acPGP表明伤口的愈合和/或成功治疗，因为胶原合成和降解的速率大致平衡；
(ii)相对于P1NP，更高水平的acPGP表明炎症和/或伤口内感染风险增加，因为降解的胶原比合成的胶原多；
(iii)相对于acPGP，中等水平的P1NP表明强烈的愈合轨迹，因为合成的胶原比降解的胶原多；
(iv)相对于acPGP，显著更高水平的P1NP表明伤口中肉芽过度增生(hypergranulation)的风险增加，因为相对于胶原降解的速率，过量的胶原被合成。
“肉芽过度增生”应当理解为可以在伤口边缘上方延伸并且包括、基本上由或由新形成的胶原、弹性蛋白和毛细血管网络组成的肉芽组织的过度沉积。
在伤口愈合期间，浸润的中性粒细胞被吸收到伤口部位并参与组织降解和组织形成。因此，过度或减少的浸润性中性粒细胞活化或流入受损组织可能对下游细胞迁移、增殖、分化以及最终愈合反应的质量产生深远影响。特别地，钙网蛋白是由已知存在于血浆中并且在炎性条件下显著升高的中性粒细胞所产生的蛋白质。因此，在某些实施方式中，中性粒细胞浸润的生物标记物是钙网蛋白。
在另外实施方式中，对取回的流体进行分析进一步或替代性地包括、基本上由或由测量以下的一个或多个的水平组成：
(i)伤口流体中游离的赖氨酸和脯氨酸残基的羟基化；
(ii)血管生成生物标记物；和/或
(iii)血管分化生物标记物
在某些实施方式中，伤口流体中游离的赖氨酸和脯氨酸残基的低水平羟基化表明需要进行治疗以促进增加的血流量和氧气进入伤口。
在某些实施方式中，血管生成生物标记物包括、基本上由或由血管内皮生长因子组成。
在某些实施方式中，血管分化生物标记物包括、基本上由或由细胞间粘附分子组成。
在某些实施方式中，低水平的血管内皮生长因子和/或细胞间粘附分子表明用外部施加的血管内皮生长因子补充剂治疗伤口。
在另外实施方式中，对取回的流体进行分析进一步或替代性地包括、基本上由或由通过测量以下一种或多种的水平和/或活性来确定伤口的一氧化氮(NO)状态组成：
(i)诱生型一氧化氮合酶
(ii)羧甲基赖氨酸
(iii)精氨酸酶
如本领域所理解的，缺乏诱生型一氧化氮合酶会使生理稳态中通常需要的NO反应失效。类似地，羧甲基赖氨酸的积累表明伤口部位处于NO缺乏状态。还应理解，精氨酸酶在代谢途径中消耗精氨酸，该代谢途径不产生NO并且是NO合酶的竞争者。
低一氧化氮状态表明用一氧化氮疗法或精氨酸膳食补充剂治疗有伤口的受试者。
在另外实施方式中，对取回的流体进行分析进一步包括、基本上由或由测量一个或多个以下标记的水平组成：
(i)锁链素
(ii)基质金属蛋白酶(MMP8)
(iii)钙网蛋白
(iv)TIMP1
(v)TIMP2
(vi)A1AT
(vii)白介素-6
标记物水平是指伤口流体体中标记物的表达和/或活性和/或量和/或浓度的水平。表达水平可以与活性相关，并且因此可以用作活动的替代，反之亦然。
本领域技术人员熟悉多种技术和方法来确定P1NP、acPGP、赖氨酸和脯氨酸残基的羟基化、血管生成、血管内皮生长因子、血管分化、细胞间粘附分子、诱生型一氧化氮合酶、羧甲基赖氨酸、精氨酸酶、锁链素、MMP8、钙网蛋白、TIMP1、TIMP2、A1AT或白介素-6。
例如，可以根据任何合适的方法在蛋白质或mRNA水平上测量表达水平。蛋白质修饰(比如糖基化)也可能是相关的，并且可以通过任何合适的方法测量。许多这样的方法在本领域中是公知的，并且包括使用质谱法(例如MALDI-TOF质谱法)。
标记物(例如蛋白质)的表达水平和/或量和/或浓度可以依赖于结合试剂，比如特异性结合目标标记物(例如蛋白质)的抗体或适体。抗体可以是单克隆或多克隆来源的。还可以使用保留特异性结合功能的片段和衍生抗体，以包括但不限于Fab片段、ScFv、单域抗体、纳米抗体、重链抗体、适体等，并且这些片段和衍生抗体包括在“抗体”的定义中。这些抗体可用于本发明的方法。它们可以用于测量特定标记物(例如蛋白质，或在一些情况下，蛋白质的一种或多种特定亚型。技术人员能够很好地识别允许特定亚型彼此区分开的表位)的水平。
产生特异性抗体的方法是本领域技术人员已知的。根据已知技术，抗体可以是人源的或非人源的(例如啮齿动物，比如大鼠或小鼠)并且被人源化的等(Jones等,Nature(1986)May 29-Jun.4；321(6069):522-5；Roguska等,Protein Engineering,1996,9(10):895-904；和Studnicka等,Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving3–D Structure.Protein Engineering,1994,Vol.7,pg 805))。
在某些实施方式中，通过使用缀合到标记上的抗体或适体测定标记物的表达水平和/或量和/或浓度。标记是指允许直接或间接检测的组分。例如，标记可以是酶，任选过氧化物酶或荧光团。
标记是检测剂的示例。检测剂是指可用于帮助检测抗体-标记物(例如蛋白质)复合物的试剂。当抗体与酶缀合时，检测剂可以包括、基本上由或由化学组合物组成，使得酶催化化学反应以产生可检测的产物。由适当的酶催化的反应产物可以是，但不限于，荧光、发光的或放射性的，或者它们可以吸收或反射可见光或紫外光。适用于检测这种可检测标记的检测器的实例包括，但不限于，X射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计、光电探测器和密度计。在某些实施方式中，检测剂可以包括、基本上由或由二次抗体组成。然后使用与靶蛋白结合的未标记的一次抗体和与标记缀和的二次抗体确定表达水平，其中二次抗体结合一次抗体。
用于测定蛋白质水平和/或标记物的量和/或浓度的表达水平的其他技术包括例如Western印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、质谱法、ELISA等(参见Taylor&Francis公司出版的《免疫：实用指南》，编辑Brian Law，2005年版)。为了提高基于免疫反应性的测定方法的特异性和灵敏度，经常使用单克隆抗体，因为它们具有特异性的表位识别。多克隆抗体也已成功用于各种免疫测定，因为与单克隆抗体相比，它们对靶标的亲和力增加。在一些实施方式中，可以使用侧向流测定法检测蛋白质水平。
测量生物样品中的mRNA可以用作检测伤口流体中相应蛋白质水平的替代方法。因此，也可以通过检测适当的RNA来检测本文所述的任何相关标记物的表达水平。
因此，在具体的实施方式中，通过微阵列、northern印迹、测序(包括下一代测序，比如RNAseq)或核酸扩增来确定表达水平。核酸扩增包括PCR及其所有变体，比如实时和终点方法和qPCR。其他核酸扩增技术是本领域熟知的，并且包括比如NASBA、3SR和转录介导扩增(TMA)的方法。其他合适的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)、靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)、共有序列引物聚合酶链反应(美国专利号4,437,975)、任意引发的聚合酶链反应(WO 90/06995)、侵入技术、链置换技术、重组酶聚合酶扩增(RPA)、切口酶扩增反应(NEAR)和切口置换扩增(WO 2004/067726)。该清单并非穷举性的；可以使用任何核酸扩增技术，条件是合适的核酸产物被特异性扩增。合适的引物和/或探针的设计在本领域技术人员的能力范围内。各种引物设计工具可以免费使用以协助此过程，比如NCBIPrimer-BLAST工具。引物和/或探针的长度可以是至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25(或更多)个核苷酸。mRNA表达水平可以通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，随后用qPCR)测量。RT-PCR用于从mRNA产生cDNA。随着DNA扩增过程的进行，cDNA可用于qPCR测定以产生荧光。通过与标准曲线比较，qPCR可以产生绝对测量值，比如每个细胞的mRNA复制数。Northern印迹、微阵列、侵染检测(Invader assays)和结合毛细管电泳的RT-PCR均已用于测量样品中mRNA的表达水平。请参阅《基因表达谱：方法和协议》，Richard A.Shimkets，编辑，Humana出版社，2004年。
RNA表达可以通过RNA与一组探针的杂交来确定。探针可以排列成阵列。微阵列平台包括由比如Affymetrix、Illumina和Agilent等公司制造的平台。还可以使用下一代测序技术(比如RNA-seq)来监测RNA表达。
类似地，可以在伤口流体中测量一种或多种标记物的活性(例如酶活性)。可以例如通过检测可以标记的底物的处理来测量酶活性。例如，该测定可以是荧光底物测定。可以使用合适的侧向流测定法检测酶活性。合适的测定形式的实例包括国际专利申请WO2009/024805、WO2009/063208、WO2007/128980、WO2007/096642、WO2007/096637、WO2013/156794和WO2013/156795中所述的测定法(每个专利申请的内容通过援引的方式并入本文中)。
在本发明的另一个方面，每隔一段时间重复本文所述的方法，以便通过重复取样和分析伤口流体来促进伤口状况的纵向监测。因此，例如，在除去如本文所述的产品(已经与伤口接触预定的一段时间并且已经吸收了伤口流体)之后并且在重新敷上伤口之前，将如本文所述的新的无菌产品放置成与新伤口敷料下面的伤口接触，并且对于现在与伤口接触的新产品重复该方法。所述间隔可以是每1/2、1、2、3、4、5或6天一次、每周一次或每月一次或其组合。所述间隔也可以是24小时、48小时、120小时或144小时一次或其任何组合。如本文所讨论的，如果提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示(即伤口状况的改变)，则可以仅将产品送到实验室进行进一步测试。尽管如此，通过每次重新敷上伤口时使用新产品，初始标记物测试是在定期重复的基础上进行的，相应的益处是每次都获得用于下游测试的样品。
即使在与伤口接触预定时间段(“预定接触时间”)之后产品没有视觉指示，也可以以这种方式对伤口流体进行纵向监测。例如，产品仍然可以与伤口脱离接触(并用新的无菌产品替换)，并且如果已经过了预定的时间段，如本文所述分析吸收的伤口流体，因为已经对来自伤口的流体进行了采样(“预定的采样时间”)。预定的采样时间可以是每1/2、1、2、3、4、5或6天一次、每周一次或每月一次或其组合。预定的采样时间也可以是每24小时、48小时、120小时或144小时一次或其任何组合。在优选实施方式中，预定的取样时间是在获取前一个样品后4周(在间隔期间没有来自产品的视觉指示)。因此，例如，每当伤口以3至4天间隔或约3至4天的间隔敷上时，可以更换产品。即使在中间期间没有产品显示出视觉指示，也可以每月一次将产品例行地送到实验室。
通过随着时间推移对伤口流体进行采样和分析，随着时间的推移，与伤口状况有关的数据的累积更好地使临床医生能够理解伤口状况的进展和/或治疗功效。例如，如所描述的对伤口流体的纵向监测可以以比现有程序更快速和/或定量的方式向临床医生指示伤口的状况随时间变化而恶化并且因此本治疗无效。因此，临床医生可以更快速地选择替代治疗以促进伤口愈合。替代性地，数据可以向临床医生指示需要进一步测试伤口流体和/或伤口环境。此外，累积的数据允许临床医生根据伤口状况随时间的变化程度和方向制定与伤口流体的进一步采样和由护理人员(例如地区护士或家庭成员)重新敷上伤口有关的访问时间表。
在另一个实施方式中，伤口流体中不存在过量的蛋白酶活性表明应继续现有的伤口治疗(即不应改变)。
在本发明的另一个相关方面，提供了一种产品，所述产品包括用于非原位监测伤口状况的(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物。该产品允许对伤口流体中的蛋白酶活性(任选地处于或高于(预定的)阈值水平)进行基于侧向流的检测。该产品可实现快速、灵敏、非原位的即时检测。因此，蛋白酶敏感的聚合物暴露于伤口流体通常较短时间。
因此，根据本发明的这方面，提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由(任选地交联的)蛋白酶敏感的聚合物组成；以及
c.包括、基本上由或由所述样品施加区下游的有色颗粒组成的区域；
d.观察区，所述观察区在所述样品施加区、所述反应区以及包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域下游；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体(并且其中存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将伤口流体与有色颗粒一起运送观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示)。在暴露于伤口流体并且不存在蛋白酶活性之前，观察区不含有色颗粒。因此，有利的是，在伤口流体中存在蛋白酶活性的情况下，有色颗粒被传输到观察区中为使用者提供了伤口流体中蛋白酶活性的积极指示。在优选的实施方式中，肉眼可以看到观察区中色彩变化和/或增强。替代性地或者除了通过肉眼观察之外，可以使用分光光度计或适合于该目的的其他此类设备来检测和/或量化色彩变化和/或增强，这是本领域技术人员公知的。
区域之间的伤口流体的传输可以通过任何合适的方式，例如通过毛细管作用。注意，在整个公开内容中，区域被定义为产品处于暴露于伤口流体之前的状态。因此，产品依赖于伤口流体经由反应区以及包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域从样品施加区到观察区的定向流。因此，该产品提供固体支撑物，样品施加区、反应区、包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域以及观察区被布置在该固体支撑物上。可以使用任何合适的固体支持物。例如，产品可以包括、基本上由或由测试条或毛细管流动装置作为固体支持物组成。固体支撑物可以包括、基本上由或由色谱介质组成。固体支持物可以由流体能够穿过的任何材料(比如流体通道或多孔膜)制成。在本发明的某些实施方式中，色谱介质包括、基本上由或由条带或膜(例如硝酸纤维素条带或膜)组成。在毛细管流动装置的情况下，样品施加区、反应区、有色颗粒区和观察区中的一个或多个位于通过毛细管通道连接的离散室中。在一些实施方式中，本发明的产品可以依赖于测试条和毛细管流动通道的组合。例如，样品施加区可以包括、基本上由或由吸收材料组成，并且伤口流体随后沿着吸收材料流到反应区。在反应区的下游，固体支持物可以限定窄的(与样品施加区和/或反应区相比)毛细管通道，以帮助有色颗粒在观察区中的浓缩。在一些实施方式中，产品包括、基本上由或由如本文所述的基质组成，样品施加区、反应区、包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域以及观察区被布置在该基质上。
在本发明的特定实施方式中，测试条或毛细管流动装置可以包括一个或多个凹陷的毛细管流动通道。例如，包括一个或多个凹陷毛细管流动通道的测试条或毛细管流动装置可以由两个(任选地塑料)部件形成，每个部件包括具有一个或多个凹陷区域/腔的面，两个部件连接在一起(例如通过超声波焊接或粘合剂)并且布置成使得每个面上的凹陷区域/腔形成一个或多个毛细管流动通道。替代性地，测试条或毛细管流动装置可以包括单个(任选地塑料)部件，该塑料部件包括具有一个或多个凹陷区域/腔的面。在所述一个或多个凹陷区域/腔上方铺设粘附层，该粘附层连接到包括一个或多个凹陷区域/腔的所述面，从而形成一个或多个毛细管流动通道。例如，该层可以是平箔或薄膜层。它可以通过任何适当的方式(例如通过粘合剂或通过超声波焊接)连接到包括一个或多个凹陷区域/腔的面上。
在特定的实施方式中，所述有色颗粒被包含在所述反应区内。因此，包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域被归入到反应区内(即它们是同一个整体“区域”)。
在另外的实施方式中，有色颗粒被截留在聚合物中。这可以通过用有色颗粒干燥聚合物来实现。结果，聚合物采用截留颗粒的着色。有色颗粒保持被截留在聚合物中，直到并且除非由伤口流体中存在的蛋白酶活性使聚合物切割。在将伤口流体添加到样品施加区之后，将伤口流体传输到反应区。由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致有色颗粒被释放到观察区，从而通过观察区提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
对于其中有色颗粒被截留在交联的蛋白酶敏感的聚合物中的那些实施方式，这可以通过用有色颗粒干燥聚合物来实现。结果，聚合物采用截留颗粒的着色。有色颗粒保持被截留在聚合物中，直到并且除非由伤口流体中存在的蛋白酶活性使聚合物切割。在由伤口流体中存在的蛋白酶活性使聚合物切割之后，有色颗粒沿着/穿过基质传输，以提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。如本文其他地方所述，在一些优选的实施方式中，交联剂是甲基丙烯酸酯或其衍生物。聚合物分子(通常是明胶、胶原和/或弹性蛋白)用甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐或其衍生物进行改性，然后甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐或其衍生物在本领域技术人员已知的合适条件下连接在一起。因此，对于这些实施方式，聚合物之间的交联包括、基本上由或由甲基丙烯酸酯或其衍生物组成。在其他实施方式中，戊二醛或其衍生物可用作交联剂。交联可以在本领域技术人员已知的任何合适的条件下实现。最优选包括、基本上由或由明胶组成的聚合物分子。
因此，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由被截留在(任选地交联的)蛋白酶敏感的聚合物内的有色颗粒组成；以及
c.在所述样品施加区和所述反应区下游的观察区；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体，并且其中存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将伤口流体与有色颗粒一起运送观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示。
在替代实施方式中，包括、基本上由有色颗粒组成的区域在反应区的下游，即它不同于反应区并位于反应区和观察区之间。
因此，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由(任选地交联的)蛋白酶敏感的聚合物组成；以及
c.包括、基本上由或由所述反应区下游的有色颗粒组成的区域；
d.观察区，所述观察区在所述样品施加区、所述反应区以及包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域下游；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体，并且其中存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将伤口流体与有色颗粒一起运送观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示。
在特定实施方式中，反应区和/或(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物包括、基本上由或由在其中形成防止(在不存在足够的其中包含的蛋白酶活性)伤口流体通过的屏障，更特别地防止的伤口流体到达反应区下游的区域(即，包括、基本上由或由有色颗粒和观察区组成的区域)的屏障。在暴露于伤口流体时，由所述伤口流体中存在的(足够的)蛋白酶活性(任选地在阈值水平以上)引起的聚合物切割破坏了屏障，并且导致有色颗粒被带到观察区，从而经由观察区提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。因此，对于包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域在反应区下游的那些实施方式，有色颗粒被防止与伤口流体接触，除非并且直到聚合物被伤口流体中存在的蛋白酶活性(任选地高于阈值水平)切割，并且屏障被破坏。
在一些实施方式中，产品包含视觉符号，该视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被有色颗粒掩盖。例如，可以通过使用任何合适的装置(例如不可擦除的墨水)将视觉符号印刷在基质上，在该装置上最初被沉积有色颗粒。在暴露于伤口流体后，通过伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致朝着观察区传输有色颗粒，从而显露视觉符号。
在另外的实施方式中，产品进一步包括与包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域(例如，在该区域上和/或由该区域限定)对齐的第二观察区，使得有色颗粒在暴露于伤口流体之前和不存在蛋白酶活性的情况下在第二观察区中可见。该附加观察区在本文中被称为“第二观察区”。对于这样的实施方式，可以掩盖产品的其余部分，使得仅观察区能够向用户提供清晰的视觉指示。
在另外的实施方式中，样品施加区、反应区以及包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域下游的观察区包括、基本上由或由捕获分子组成以捕获观察区中的有色颗粒。这可以帮助生成易于解释的信号。捕获分子可以被布置以产生可以允许对信号(以及因此蛋白酶活性)进行某种程度的量化的可见线或其他符号。捕获分子是能够结合有色颗粒的任何分子。这些可以包括、基本上由或由例如特异性结合有色颗粒的抗体或适体组成。在具体的实施方式中，捕获分子是与有色颗粒特异性结合的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆来源的。还可以使用保留特异性结合功能的片段和衍生抗体，以包括但不限于Fab片段、ScFv、单域抗体、纳米抗体、重链抗体、适体等，并且这些片段和衍生抗体包括在“抗体”的定义中。产生特异性抗体和适体的方法是本领域技术人员公知的。根据已知技术，抗体可以是人源的或非人源的(例如啮齿动物，比如大鼠或小鼠)并且被人源化的等(Jones等,Nature(1986)May 29-Jun.4；321(6069):522-5；Roguska等,Protein Engineering,1996,9(10):895-904；和Studnicka等,Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3–DStructure.Protein Engineering,1994,Vol.7,pg 805))。
在另外的实施方式中，产品包括位于观察区下游末端的屏障，该观察区位于样品施加区、反应区以及包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域下游。也就是说，观察区位于包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域与屏障之间，并且屏障相对于观察区定位，使得在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割之后，接着朝着观察区释放有色颗粒并释放到观察区中在观察区中累积有色颗粒。因此，屏障防止释放的有色颗粒行进超出观察区。例如，屏障可以包括、基本上由或由多孔材料组成，其中孔的尺寸允许流体和分子量低于临界值的分子通过屏障，但是孔的尺寸不足以使有色颗粒通过屏障。本领域技术人员能够根据所用的有色颗粒选择具有适当分子量临界值的合适材料。替代性地，对于其中固体支撑物包括、基本上由或由色谱介质(比如硝酸纤维素膜)或其他多孔膜组成的实施方式，屏障可以包括固体支撑物本身的区域，其中该区域包括孔径小于有色颗粒直径的孔(同时仍允许流体通过)。例如，可以通过压碎或以其他方式压缩基质的该区域来产生这样的区域。压缩程度足以减小孔径，使其小于有色颗粒的直径。因此，有色颗粒不能通过压碎/压缩的区域(屏障)，并且因此在由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割之后，接着朝着观察区并将有色颗粒释放到观察区中在观察区中累积有色颗粒。
在具体的实施方式中，(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物包括、基本上由或由胶原(任选地形成胶原斑)组成。在优选的实施方式中，胶原在用于本发明之前是完全、基本上或部分变性的。当通过胶原的部分水解发生这种情况时，称之为“明胶”，如本领域技术人员所熟知的。因此，在这些优选的实施方式中，聚合物包括、基本上由或由明胶组成。在一些实施方式中，聚合物包括、基本上由或由弹性蛋白组成。
在特定实施方式中，样品施加区和反应区至少部分重叠。因此，在一些实施方式中，可以将伤口流体直接添加到反应区中。这在其上游部分防止在没有蛋白酶活性的情况下通过产品的输送伤口流体。
因此，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由被截留在(任选交联的)明胶中的有色(优选聚苯乙烯)微粒组成；以及
c.在所述样品施加区和所述反应区下游的观察区；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体，并且其中存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的明胶切割导致将伤口流体与有色(聚苯乙烯)微粒一起运送观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示)。
本发明还提供了一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由(任选地交联的)明胶组成；
c.包括、基本上由或由所述反应区下游的有色(优选地聚苯乙烯)微粒组成的区域；
d.观察区，所述观察区在所述样品施加区、所述反应区以及包括、基本上由或由有色聚苯乙烯微粒组成的区域下游；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体，并且其中存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的明胶切割导致将伤口流体与有色(聚苯乙烯)微粒一起运送观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示)。
所有上述产品和实施方式可以进一步包括容纳产品的壳体。在提供壳体的情况下，所述壳体可以包括、基本上由或由用于观察有色颗粒的一个或多个(任选地两个)观察窗组成。这些观察窗可以沿着壳体定位，使得在暴露于伤口流体之前并且在没有蛋白酶活性的情况下，有色颗粒在第一观察窗中可见但在第二观察窗中不可见。观察窗用于定义产品的观察区。因此，对于包括一个或多个观察区的那些实施方式，可以对准一个或多个观察窗，使得观察区通过观察窗可见。
在一些实施方式中，在暴露于伤口流体之前，可以将蛋白酶敏感的聚合物、有色颗粒和任选的一种或多种交联剂混合在一起并作为混合物施加于反应区(其可以与如本文其他地方所述的样品施加区重叠)。仍然在暴露于伤口流体之前，可以将混合物干燥或固化(例如使用UV光)以促进交联形成(如果存在一种或多种交联剂)，和/或在反应区中固定(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物(有色颗粒被截留在其中)。该过程可以在护理当场进行。因此，本发明还提供了一个部件套件，所述部件套件包括：
(i)产品，所述产品包括如本文所定义的样品施加区、反应区(不存在(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物和有色颗粒)和观察区；
(ii)蛋白酶敏感的聚合物；
(iii)有色颗粒；以及
(iv)任选地一种或多种交联剂(优选甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐或其衍生物)。
在一些实施方式中，蛋白酶敏感的聚合物和有色颗粒作为预形成的混合物提供。
部件套件(kit of parts)的产品(参见上面的特征(i))可以进一步包括本文所述的一个或多个附加特征，比如壳体、第二观察区和/或屏障。这里仅仅为了简洁不再重复这些特征。
在替代的实施方式中，在暴露于伤口流体之前，可以将蛋白酶敏感的聚合物和任选的一种或多种交联剂混合在一起并作为混合物施加于反应区(其可以与如本文其他地方所述的样品施加区重叠)。将有色颗粒施加于位于反应区与观察区之间的不同区域。仍然在暴露于伤口流体之前，可以将混合物干燥或固化(例如使用UV光)以促进交联形成(如果存在一种或多种交联剂)，和/或在反应区中固定(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物。该过程可以在护理当场进行。因此，本发明还提供了一个部件套件，所述部件套件包括：
(i)产品，所述产品包括如本文所定义的样品施加区、反应区(不存在(任选交联的)蛋白酶敏感的聚合物和有色颗粒)、观察区以及位于所述反应区与所述观察区之间以接收所述有色颗粒的区域；
(ii)蛋白酶敏感的聚合物；
(iii)有色颗粒；以及
(iv)任选地一种或多种交联剂(优选甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酐或其衍生物)。
在一些实施方式中，蛋白酶敏感的聚合物和有色颗粒作为预形成的混合物提供。
部件套件的产品(参见上面的特征(i))可以进一步包括本文所述的一个或多个附加特征，比如壳体、第二观察区和/或屏障。这里仅仅为了简洁不再重复这些特征。
在特定实施方式中，基质包括、基本上由或由色谱介质组成。在一些实施方式中，基质包括、基本上由或由一个或多个毛细管流动通道(伤口流体可以沿着/穿过这些毛细管流动通道流动)组成。另外，可以蚀刻基质，使得一旦被施加到样品施加区(或如本文所述的类似物)，伤口流体随着它沿着/穿过基质行进而被浓缩。因此，有利地，减少了使用产品检测蛋白酶活性所需的伤口流体的量。
替代性地，不包括、不是基本上由或不是由反应区和/或观察区组成的产品的部分可以被掩盖，使得最终用户看不到任何有色颗粒。这有助于简化要解释的信号。
在相关方面，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的方法，所述方法包括、基本上由或由以下各项组成：
i.将伤口流体的样品施加到产品的样品施加区，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由(任选地交联的)蛋白酶敏感的聚合物组成；以及
c.在所述样品施加区下游的、包括、基本上由或有有色颗粒组成的区域；以及
d.观察区，所述观察区在所述样品施加区、所述反应区以及包括、基本上由或由有色颗粒组成的区域下游；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体(所述流体在暴露于伤口流体之前且在没有蛋白酶活性的情况下不含有色颗粒)，并且其中由存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将有色颗粒与伤口流体一起运送到所述观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示；并且
ii.检测由所述观察区中的有色颗粒提供的蛋白酶活性的视觉指示。
在一些实施方式中，有色颗粒可以在暴露于伤口流体之前被捕获在反应区中的蛋白酶敏感的聚合物内。因此，本发明还提供了一种用于监测伤口状况的方法，所述方法包括、基本上由或由以下各项组成：
i.将伤口流体的样品施加到产品的样品施加区，所述产品包括、基本上由或由以下各项组成：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括、基本上由或由被截留在(任选地交联的)蛋白酶敏感的聚合物内的有色颗粒组成；以及
c.在所述样品施加区和所述反应区下游的观察区；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体(所述流体在暴露于伤口流体之前且在没有蛋白酶活性的情况下不含有色颗粒)，并且其中由存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将有色颗粒与伤口流体一起运送到所述观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示；并且
ii.检测由所述观察区中的有色颗粒提供的蛋白酶活性的视觉指示。
这些方法中使用的产品可以包含一种或多种上述特征。这里仅仅为了简洁不再重复这些特征。
在所述方法的特定实施方式中，在所述观察区中测量所述有色颗粒提供了所述伤口流体中蛋白酶活性的定量。在一些实施方式中，该方法中使用的产品包括两个观察区(如本文其他地方所述)，将在包括、基本上由或由有色颗粒(不存在伤口流体和蛋白酶活性的情况下)组成的区域上方(即，与之垂直对齐)的第二观察区中的有色颗粒的损失与在包括、基本上由或由暴露于伤口流体和蛋白酶活性的有色颗粒组成的区域下游的观察区中的有色颗粒的增加进行比较和/或定量。在优选实施方式中，肉眼可以看到每个观察区中的色彩变化。替代性地或者除了通过肉眼观察之外，可以使用分光光度计或适合于该目的的其他此类设备来检测和/或量化色彩变化，这是本领域技术人员公知的。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括向产品施加另外的液体以帮助伤口流体的流体流动。这可以被称为“追赶流体”。另外的液体可以包括、基本上由或由缓冲液组成。缓冲液可以与伤口流体和/或该方法中采用的其他材料的性质相匹配。例如，可以使用“追赶流体”以便携带伤口流体通过测试条的孔。使用额外的液体可以改善释放的有色颗粒沿着/通过基质的传输。附加液体可以包括、基本上由或由表面活性剂组成，以防止有色颗粒不希望地粘附到基质上。
在本发明的另一个方面，每隔一段时间重复本文所述的方法，以便通过重复取样和分析伤口流体来促进伤口状况的纵向监测。所述间隔可以是每1、2、3、4、5或6天一次、每周一次或每月一次或其组合。随着时间的推移，与伤口状况有关的数据的累积更好地使临床医生能够理解伤口状况的进展和/或治疗功效。例如，如所描述的对伤口流体的纵向监测可以以比现有程序更快速和/或定量的方式向临床医生指示伤口的状况随时间变化而恶化并且因此本治疗无效。因此，临床医生可以更快速地选择替代治疗以促进伤口愈合。替代性地，数据可以向临床医生指示需要进一步测试伤口流体和/或伤口环境。
在另一个实施方式中，不存在过量的蛋白酶活性表明应继续任何现有的伤口治疗(即不应改变)。
在根据本发明所有方面的某些实施方式中，所述伤口是慢性伤口。“慢性伤口”应当理解为伤口愈合的正常过程在伤口愈合阶段中的一个或多个点处被破坏的伤口。例如，伤口停留在特定的愈合阶段(比如炎症或增殖)。慢性伤口的特征可以是凸起、过度增生、尚未前进的伤口边缘和/或局部伤口环境(富含炎症产物和促炎细胞因子)，该局部伤口环境包括、基本上由或由不平衡的酶环境组成，这种不平衡的酶环境由过量的基质金属蛋白酶组成，并且基质金属蛋白酶的抑制剂的减少导致细胞外基质的破坏。常见的慢性伤口包括糖尿病性溃疡、血管性溃疡和压力性溃疡。
在根据本发明所有方面的某些实施方式中，被获取伤口流体的受试者是动物。在特定的实施方式中，所述动物是人类。
在特定实施方式中，如本文所述的产品用于本文所述的方法中。
本发明的一些实施方式也可以由以下条款定义：
1.一种用于监测伤口状况的产品，所述产品包括吸收伤口流体的基质，所述基质包括：
a.在所述基质上/内形成反应区的交联的且蛋白酶敏感的聚合物；
b.有色颗粒；
其中所述聚合物和有色颗粒的布置使得由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致有色颗粒沿着/穿过基质运输，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
2.根据条款1所述的产品，其中所述有色颗粒被截留在所述聚合物内，并且由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致所述有色颗粒沿着/穿过所述基质释放，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
3.根据条款2所述的产品，其中所述视觉指示包括所述有色颗粒的分散。
4.根据条款2或3所述的产品，其中所述基质包括视觉符号，所述视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被截留在所述聚合物中的有色颗粒掩盖，并且其中所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示包括由于所述聚合物被切割并且所述有色颗粒被释放而显露所述视觉符号。
5.根据条款2至4中任一项所述的产品，其中所述基质包括观察区，所述观察区在暴露于所述伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下不包含有色颗粒，并且其中由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致所述有色颗粒沿着/穿过基质释放，从而在所述观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示。
6.根据条款5所述的产品，其中在所述观察区中可见的基质包括捕获分子以捕获有色颗粒。
7.根据条款5所述的产品，其中所述基质包括与所述观察区的(下游)末端对齐的屏障，使得有色颗粒在所述观察区中累积。
8.根据条款1至7中任一项所述的产品，其中所述有色颗粒包含聚苯乙烯微粒。
9.根据条款1至8中任一项所述的产品，其中所述交联的且蛋白酶敏感的聚合物形成屏障，所述屏障在所述伤口流体中不存在(任选地高于阈值水平的)蛋白酶活性的情况下防止所述伤口流体与有色颗粒接触，并且其中由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性(任选地高于阈值水平)引起的聚合物切割破坏所述屏障并导致所述有色颗粒沿着/穿过所述基质流动，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
10.根据条款9所述的产品，其中所述基质包括观察区，所述观察区在暴露于所述伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下不包含有色颗粒，并且其中由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割破坏所述屏障并导致所述有色颗粒沿着/穿过所述基质流动，以在所述观察区中蛋白酶活性的视觉指示。
11.根据条款10所述的产品，其中在所述观察区中可见的基质包括捕获分子以捕获有色颗粒。
12.根据条款10或11所述的产品，其中所述基质包括与所述观察区的(下游)末端对齐的屏障，使得有色颗粒在所述观察区中累积。
13.根据条款9至12中任一项所述的产品，其中所述基质包括视觉符号，所述视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被所述有色颗粒掩盖，并且其中所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示包括由于所述聚合物被切割、所述屏障被破坏并且所述有色颗粒沿着/穿过所述基质流动而显露所述视觉符号。
14.根据条款1至13中任一项所述的产品，其中所述聚合物包括胶原聚合物。
15.根据条款1至14中任一项所述的产品，其中所述聚合物包含明胶聚合物。
16.根据条款1至15中任一项所述的产品，其中所述聚合物包括弹性蛋白聚合物。
17.根据条款1至16中任一项所述的产品，其中所述交联包括甲基丙烯酸酯或其衍生物。
18.根据条款1至17中任一项所述的产品，其中所述交联衍生自戊二醛或其衍生物。
19.根据条款1至18中任一项所述的产品，其中所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和/或谷氨酸蛋白酶。
20.一种包括胶原和/或明胶聚合物的测试基质，所述聚合物包含甲基丙烯酸酯交联或衍生自戊二醛的交联。
21.用于测量伤口流体中的蛋白酶活性的甲基丙烯酸酯交联的明胶聚合物。
22.交联的且蛋白酶敏感的聚合物作为基底用于测量伤口流体中的蛋白酶活性的用途。
23.根据条款22所述的用途，其中所述聚合物包含胶原、明胶和/或弹性蛋白聚合物。
24.根据条款22或23所述的用途，其中所述交联包括甲基丙烯酸酯并且/或者衍生自戊二醛。
25.一种监测伤口状况的方法，其包括：
a.将伤口流体的样品施加于根据条款1至19中任一项所定义的产品
b.检测由所述有色颗粒提供的蛋白酶活性的视觉指示。
26.根据条款25所述的方法，其中在所述基质的区域中测量所述有色颗粒，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的定量。
27.根据条款26所述的方法，其中所述区域包括观察区。
28.根据条款26或27所述的方法，其中存在两个观察区，并且将一个观察区中有色颗粒的损失与第二观察区中有色颗粒的增加进行比较。
29.一种制备用于测量伤口流体中蛋白酶活性的基质的方法，所述方法包括：
a.将含有甲基丙烯酸酯改性的聚合物的溶液施加到能够吸收伤口流体的基质中；
b.用UV光照射所述聚合物，从而使所述聚合物交联。
30.根据条款29所述的方法，其中步骤a)的溶液还包含有色颗粒，并且步骤b)导致所述有色颗粒被截留在交联的聚合物中。
31.根据条款29或30所述的方法，其中所述溶液在至少30℃的温度下被施加。
32.根据条款29至31中任一项所述的方法，其中所述聚合物包括明胶、胶原和/或弹性蛋白聚合物。
33.根据条款29至31中任一项所述的方法，其中所述基质包括视觉符号，并且在步骤a)中，所述溶液被施加以覆盖所述视觉符号。
34.一种用于制备条款1至19中任一项所定义的产品的套件，其包括：
a.交联的且蛋白酶敏感的聚合物
b.有色颗粒。
35.根据条款32所述的套件，其进一步包括基质。
36.根据条款33所述的套件，其进一步包括容纳所述基质的壳体。
37.根据条款34所述的套件，其中所述壳体包括一个或多个，任选地两个观察窗用于观察所述有色颗粒。
38.一种用于监测伤口状况的产品，其包括：
a.样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b.在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括蛋白酶敏感的聚合物；
c.所述样品施加区下游的包括有色颗粒的区域；
d.观察区，所述观察区在所述样品施加区、所述反应区以及包括有色颗粒的区域下游；
其中所述样品施加区朝着所述观察区传输流体，并且其中存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将伤口流体与有色颗粒一起运送至观察区，从而在第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示。
39.根据条款38所述的产品，其中所述有色颗粒被包含在所述反应区内。
40.根据条款38或39所述的产品，其中所述有色颗粒被截留在所述聚合物内，并且由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将所述有色颗粒释放到所述观察区，从而经由所述观察区提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
41.根据条款38所述的产品，其中包含有色颗粒的区域位于所述反应区的下游。
42.根据条款38至41中任一项所述的产品，其中所述反应区形成防止所述伤口流体到达所述观察区的屏障，并且其中由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性(任选地高于阈值水平)引起的聚合物切割破坏所述屏障并且导致所述有色颗粒被运送到所述观察区，从而经由所述观察区提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
43.根据条款38至42中任一项所述的产品，其中所述产品包括视觉符号，所述视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被所述有色颗粒掩盖，并且其中所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示包括显露所述视觉符号。
44.根据条款43所述的产品，所述产品限定了第二观察区，所述第二观察区位于在暴露于伤口流体之前且在不存在蛋白酶活性的情况下包含有色颗粒的区域的上方。
45.根据条款38至44中任一项所述的产品，其中所述观察区包括捕获分子以捕获所述观察区中的有色颗粒。
46.根据条款38至45中任一项所述的产品，所述产品包括在所述观察区的下游末端处的屏障，使得有色颗粒积聚在所述第一观察区中。
47.根据条款38至46中任一项所述的产品，其中所述聚合物包括胶原聚合物。
48.根据条款38至47中任一项所述的产品，其中所述聚合物包含明胶聚合物。
49.根据条款38至48中任一项所述的产品，其中所述聚合物包括弹性蛋白聚合物。
50.根据条款38至49中任一项所述的产品，其中所述样品施加区和所述反应区至少部分重叠。
51.一种监测伤口状况的方法，其包括：
a.将伤口流体的样品施加到根据条款38至50中任一项所定义的产品的样品施加区
b.检测由所述观察区中的有色颗粒提供的蛋白酶活性的视觉指示。
52.根据条款51所述的方法，其中测量的所述观察区中有色颗粒提供所述伤口流体中蛋白酶活性的定量。
53.根据条款51或52所述的方法，其中所述产品进一步包括第二观察区，并且将所述第二区中的有色颗粒的损失与所述第一区中的有色颗粒的增加进行比较。
附图说明
图1A是说明本发明一个实施方式的示意图，其中如本文所述的产品被放置成与伤口敷料下面的伤口接触。
图1B是说明在伤口流体吸收和由伤口流体中存在的蛋白酶活性引起交联的蛋白酶敏感的聚合物切割之后，如本文所述的产品产生视觉指示的示意图。
图2是说明如本文所述的产品的基于侧向流的实施方式的示意图。
图3是说明如本文所述的产品的另外的基于侧向流的实施方式的示意图。
图4示出了甲基丙烯酸酯改性之前未改性的明胶的NMR光谱。
图5示出了完全甲基丙烯酸酯改性的明胶(GELMA)的NMR光谱。
图6示出了根据本发明的示例性产品(优选地在伤口中原位使用)的俯视图(A)和分解侧视图(B)。
图7示出了使用中的本文所述的产品(时间＝0小时)。
图8示出了在24小时、48小时和72小时后存在和不存在木瓜蛋白酶时使用图7中所示产品的结果。
图9示出了使用中的本文所述的另外的产品(时间＝0小时)。
图10示出了在24小时和48小时后在存在和不存在基质金属蛋白酶9(MMP9)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的情况下使用图9中所示的产品的结果。
图11示出了在120小时和144小时后在存在和不存在基质金属蛋白酶9(MMP9)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的情况下使用图9中所示的产品的结果。
发明详述
现在将参考附图以并非限制而仅仅是为了帮助理解本发明的方式描述本发明。
图1A中示意性地示出了如本文所述的产品(1)。产品(1)包括、基本上由或由基质(2)(优选地对于原位施加是生物惰性的)组成，该基质可以吸收伤口流体和被截留在交联的且蛋白酶敏感的聚合物(3)内的有色颗粒，在这种情况下，有色聚苯乙烯微球(PSM)被截留在交联的明胶中、基质(2)上或基质中。被截留在交联的明胶(3)中的有色颗粒可以被干燥或缀合到基质(2)中(上)，并且在适当有色PSM的情况下，使基质的整个或大部分呈现黑色，从而形成测试单元或反应区。被截留在交联的明胶(3)中的有色颗粒用于测量伤口释放的流体中的蛋白酶(明胶酶)活性。伤口流体中存在的明胶酶(任选地处于或高于阈值浓度)使交联的明胶(3)降解。
当产品(1)被放置成与伤口敷料(6)下面的受试者(5)上的伤口(4)(可以是慢性伤口)接触时，基质(2)吸收伤口流体。如果伤口流体包含足够的明胶酶活性，则基质(2)上或中的交联的明胶(3)被降解成片段，特别是如果明胶酶活性以阈值水平或高于阈值水平存在。一旦被降解，PSM就不再被截留并且可以自由穿过/沿着基质分散。在这种情况下，如图1B所示，PSM穿过/沿着基质分散去除了在暴露于伤口流体之前由PSM引起的基质的反应区引起的黑色着色，并且显露印刷在产品上的视觉符号，比如十字(7)。视觉符号的显露表明伤口中存在异常的蛋白酶活性。
虽然十字(7)提供了阳性测试结果，因此是有利的，但它不是必需的。相反，着色的消散可以用作测试的结果而不显示另外的符号。
图2是说明如本文所述的产品的基于侧向流的实施方式的示意图。示出了样品施加区(21)，该样品施加区上被施加伤口流体(由直灰色箭头(22)表示)。在这种特定情况下，样品施加区是柔性芯，该柔性芯用作用于收集伤口流体(22)的拭子。芯(21)可与固体支持物(23)流体连通，在这种情况下，该固体支持物是多孔测试条，流体通过毛细作用在其中流动(类似于侧向流免疫测定的流动)。甲基丙烯酸酯交联的明胶(GELMA)(有色PSM被截留在其中)形成固体支撑物上的反应区(24)。伤口流体经由毛细管作用传送到反应区(24)。伤口流体中存在的蛋白酶活性切割GELMA并释放PSM。移动的流体的剪切应力夹带释放的PSM，并且这些随着流体一起被带入到观察区(25)中，从而提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
在替代实施方式中，明胶可以使用戊二醛或其衍生物代替甲基丙烯酸酯进行交联。在暴露于伤口流体之前，可以将明胶、有色PSM和戊二醛混合在一起并作为混合物施加以在固体支撑物上形成反应区(24)。仍然在暴露于伤口流体之前，可以将混合物干燥以促进交联形成并将戊二醛交联的明胶(有色PSM被截留在其中)固定到固体支撑物(23)上，从而形成反应区(24)。
在另外的实施方式中，包含至少固体支撑物(23)并且任选地还包括芯(21)的产品可以被容纳在外壳中，该外壳具有反应区(24)下游(在流体行进方向上)的观察窗。在这样的实施例中，观察窗限定观察区(25)。因此，可以在观察窗中观察到在伤口流体中由蛋白酶活性切割GELMA或戊二醛交联的明胶后释放的PSM。任选地，第二观察窗可以位于反应区(24)上方。因此，如果PSM由于伤口流体中存在的蛋白酶活性而被释放，则可以通过该额外的观察窗观察到色彩的损失。
在又另外的实施方式中，观察区(25)可以包括、基本上由或由能够特异性结合PSM的捕获分子。因此，释放的PSM被捕获在位并集中以帮助观察和潜在的定量。捕获分子可以包括、基本上由或由抗体组成，所述抗体特异性识别结合到PSM表面上的抗原，或者捕获分子可以包含、基本上由或由PSM可以与之结合的一些其他分子种类组成，包括带电分子以引起离子交换相互作用。
在另外的实施方式中，该装置可以与匹配的缓冲溶液源，比如pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(具有表面活性剂以防止PSM不希望地粘附到测试条)耦合以作为“追赶流体”，以便携带伤口流体穿过测试条的孔并最大化从基质中提取PSM(当蛋白水解开始时)并且将它们高效地运输到观察区(25)。
图3是说明如本文所述的产品的另外的基于侧向流的实施方式的示意图。
该产品包括、基本上由或由固体支持物(30)组成，该固体支撑物包括、基本上由或由以下各项组成：样品施加区，包括、基本上由或由吸收材料(31)、由蛋白酶敏感的聚合物分子(在这种情况下是明胶(32))形成的屏障(反应区)；包括、基本上由或由有色颗粒(34)组成的区域，有色颗粒在这种情况下是单星蓝染料分子(MBDM)；以及观察区(35)。任选地，产品还包括蚀刻(33)以引导并浓缩沿着/穿过基质的任何流体。
在操作中，伤口流体的样品被添加到样品施加区(31)并通过毛细管作用在大箭头指示的方向行进(图3中被示出为平行于产品示意图)，直到其到达明胶屏障(32)。在伤口流体中不存在蛋白酶活性时，明胶塞保持完整并防止伤口流体越过它。因此，MBDM保持干燥至基质并且不会朝向观察区传输并传输到观察区中。因此，观察区中没有提供蛋白酶活性的视觉指示。然而，在伤口流体中存在蛋白酶(明胶酶)活性时，明胶栓被切割，并且伤口流体现在可以经由毛细管作用朝着观察区行进并进入到观察区中。在这样做时，伤口流体携带MBDM进入观察区中，从而提供伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
在另外的实施方式中，固体支持物(30)可以容纳在具有观察窗的外壳中，该观察窗具有在包括、基本上由或由有色颗粒(34)组成的区域的下游(在流体行进的方向上)的观察窗，该观察窗包围并且可以限定观察区(35)。因此，在观察窗中可以观察到由伤口流体中的蛋白酶活性切割和破坏明胶屏障后释放的有色颗粒(例如MBDM)。任选地，第二观察窗可以位于该区域上方，该区域包括、基本上由或由有色颗粒(34)组成。因此，如果MBDM由于伤口流体中存在的蛋白酶活性而被释放，则可以通过该额外的观察窗观察到色彩的损失。
实验部分
实施例1：由明胶和甲基丙烯酸酯制备GELMA
通过用甲基丙烯酸酐封端使明胶改性，从而得到甲基丙烯酰胺封端的明胶，本文中称之为“GELMA”(一般方案如下所示)。
Figure GDA0003398057340000551
文献中有许多参考文献，这些参考文献使用各种不同的方法和条件来生产这种材料，但Bae Hoon Lee等人使用的方法(RSC adv.,2015,5,106094)被用于此目的，如下所述。
使用了在pH1-2(等电点pH7-9)下酸处理所获得的A型明胶。为了获得高效的取代(封端)，需要高过量的甲基丙烯酸酐。由于反应的副产物是甲基丙烯酸，反应的pH逐渐降低到低于等电点范围，从而导致封端减少。为了避免这种情况，Bae Hoon Lee等人使用了碳酸盐缓冲液将反应混合物保持在pH 7与9之间，并交替加入甲基丙烯酸酐和氢氧化钠用于pH控制。该方法允许以最少量的副反应(用甲基丙烯酸酯终止羟基)进行高效的封端。它还减少了所用试剂的量并使在纯化步骤中除去的无机盐的量最小化。通过切向流过滤(TFF)纯化反应产物，但也可以使用简单的透析。
具体方法
将A型明胶[175波罗姆](10g)和100ml碳酸盐缓冲液0.1M(100ml)[3.18g NaCO3、5.86g NaHCO3]在配有顶置式搅拌器、温度探针和pH计的圆底烧瓶中混合。将混合物加热至60℃以使固体溶解。然后将反应温度降至50℃并检查pH，并将pH调节至9.0。
向该溶液中滴加甲基丙烯酸(167μl)，使pH降至约8.5，搅拌反应混合物25分钟。此后，然后用20％NaOH溶液将pH调节回到pH9.0，并再搅拌5分钟。
进一步重复甲基丙烯酸循环和pH调节5次，直至在总共3小时的反应时间内加入总共1mL甲基丙烯酸。
最后，用50％乙酸将pH调节至7.4。将所得混合物通过0.2微米PTFE过滤膜过滤到切向流过滤贮存器中。然后使用跨膜压力为约15的3kD midi-Kros MPEs TFF膜通过对水(灌溉用水)进行渗滤来纯化混合物。对总共6L进行渗滤以获得渗透电导率<10μS。将得到的浅黄色溶液转移到佛罗伦萨烧瓶中并冷冻干燥2天。这样得到8.7g白色聚苯乙烯类材料，准备用于制备如本文所述的产品。
通过质子NMR测定产品中甲基丙烯酸酯取代度。在图4和5中示出了结果。注意图4中峰的消失或消耗(例如约3ppm处的赖氨酸亚甲基峰)和图5中新峰的出现(例如在4.8ppm、5.7ppm和5.9ppm处)表明在GELMA产品中掺入甲基丙烯酸酯基团。这些结果证实反应进展良好，峰的损失在约2.95-3.1ppm。
元素分析(CHN和Na)
元素 碳 氢 氮 钠
％实测值 45.88 6.42 16.21 0.71
这些数据表明仍然存在一些钠，但这并不造成问题。
讨论
该方法在2g中试规模进行了两次。通过透析(12-14KD截留)纯化了一种反应产物，另一种通过TFF(3KDa截留)纯化。两种材料同样适用于制造如本文所述的产品。由于TFF纯化的简便性和效率，决定使用该方法来纯化较大的10g批次。该方法可重复、简单且有效。
结论
用于产生甲基丙烯酸明胶(GELMA)的方法适合于此目的。如果需要，技术人员能够通过已知的方法和途径进一步优化制剂，比如使用自动化碱加入的恒定pH控制。通过已知的方法和程序可以容易地实现规模扩大用于商业应用。
实施例2：根据本发明的产品的制造
制造过程包括以下全部或部分操作，其细节可以根据用户需求和制造工厂的限制进行优化。
Figure GDA0003398057340000571
已发现可用作实用且易于制造的产品的特定的非限制性形式如下：
·一种吸收性医疗材料圆盘，由医用泡沫制成，深度为2.5mm，直径为15mm。
·在圆盘的顶侧的中心位置用永久墨水印刷有“+”符号。印刷的“+”尺寸为4毫米。
·“+”被有色试剂覆盖(因此隐藏在视野之外)，该有色试剂包括、基本上由或由交联的甲基丙烯酸酯改性明胶(GELMA)组成。
·该产品具有粘附在上表面上的弹性、薄的透明覆盖材料。优选的覆盖物是医用级聚氨酯。
·各个15mm圆盘作为单个单元包装，并被灭菌。
这种产品的示意图如图6所示。图6示出了产品的俯视图(A)。标记有永久性十字的圆盘被施加的有色试剂覆盖并遮盖，该着色试剂包括、基本上由或由交联的甲基丙烯酸酯改性的明胶(GELMA)组成。图6还示出了产品的分解侧视图(B)，该产品包括、基本上由或由以下各项组成：聚氨酯膜(61)；有色试剂，包括、基本上由或由交联的甲基丙烯酸酯改性的明胶(GELMA)(62)组成；以及吸收性基质(63)。
实施例3：制造-GELMA试剂和组件的湿沉积
产品所需的库存材料：
·吸收材料卷材
·聚氨酯卷材(已涂覆粘合剂)
·改性明胶(GELMA)
·染色的聚苯乙烯微粒
·永久性墨水
·防潮包装(可能是层压箔)
以下步骤构成了制造过程：
Figure GDA0003398057340000581
Figure GDA0003398057340000591
备注：
步骤4:
-有色试剂在储存和沉积过程中需要保持在高温下。这是为了防止试剂凝固。
-要沉积的体积非常小(每个圆盘5微升)。加热的改性明胶的粘度虽然高于水，但并不高。如果需要，可以通过添加增稠剂(例如羧甲基纤维素或仅更多未改性的明胶)来增加粘度。
-有色试剂不应当被吸收到吸收材料中，否则指示剂基质将不会均匀交联，并且将连累其形成的基质的深度。这对吸收材料的选择和/或预交联的GELMA试剂的性质有影响。
-有色试剂的沉积需要与印刷的“+”符号对齐。有色试剂可以是呈圆形的，只要它覆盖(遮盖)所有预先印制的“+”符号即可。因此对准很重要。
步骤5:
-UV灯用于将有色试剂固定在位。曝光时间为15-30秒，具体取决于灯泡的功率输出。到目前为止，已发现能够提供约300nm和约380nm UV灯的能量水平为1-100mW/cm2的灯是有效的。
步骤6:
在包装之前干燥固定的有色试剂。可以使用热空气通道来干燥有色的基质蛋白酶。可以考虑其他选项。
用于原位使用的示例性产品遇到困难并克服困难
遇到的困难：
1)改变干燥明胶的性质，使其更适用于基质长时间暴露于伤口流体的试验。正常状态(购买到的或衍生自胶原的)的明胶(变性胶原)可以被干燥以形成合适的基质结构，但它会逐渐被含有溶解蛋白质的水性流体溶解，比如在典型的伤口温度下的伤口流体，甚至在没有蛋白酶的情况下也是如此。另一方面，过度改性的明胶可能变得对蛋白酶切割具有过强的抗性。尽管未经改性的明胶可在某些条件下起作用，但交联型更坚固且能够在更长的时间段内起作用。
2)在制造过程中，沉积的明胶溶液必须非常快速地固定在位，使得它变得牢固地粘附在载体材料上，否则它将变成涂抹状或脱落。替代性地，不得不使用非常缓慢、不经济的处理。
3)染料改性的明胶在沉积在合适的载体表面上时可能不会形成足够强的色彩，其深度足够薄以允许被临床相关水平的蛋白酶破坏。
4)本申请所期望的操作简单性不允许复杂的过程，比如免疫测定或需要不止一个操作步骤的其他过程。
5)因为该装置必须与伤口物理接触，所以不能使用未被批准用于伤口或在伤口中没有使用历史的反应性成分。
6)计划用于该装置的一些操作方面要求它可以在敷料下原位留在伤口表面上至少一天并且可能持续几天。
Figure GDA0003398057340000601
Figure GDA0003398057340000611
该产品可以具有高非常薄的结构形式，这种结构形式具有很少或没有流体收集能力。它可以作为内置于非织造载体中的原位测试单元呈现，其可以通过伤口流体简单地“润湿”。它可以在这种模式下落在伤口表面上，如果需要不同的时间长度，它可以简单地作为一种低成本、极易使用的蛋白酶活性指示行使功能。在其最简单的实施方式中，它甚至可以在没有载体的情况下使用，仅呈现为彩色的交联的明胶膜片，尽管这不太容易处理和观察。替代性地，指示基质可以是尺寸为15mm×2.5mm的复合单元的一部分，其中存在透明盖、非织造载体层和泡沫样品收集层。
实施例4：基于甲基丙烯酸酯交联的明胶证明本发明的产品的使用
使用的材料
GELMA:改性明胶与甲基丙烯酸酐。(源自Sigma-Aldrich(产品号276685)的甲基丙烯酸酐。源自Sigma Aldrich，Porcine Type A，300波罗姆的明胶(产品编号G2500))。
光引发剂“Daracure”，2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮，源自SigmaAldrich(产品号410896)
Figure GDA0003398057340000621
聚苯乙烯模糊染色微球(0.5微米直径，2.5％固体)，源自Polysciences公司(产品编号15709)
聚氨酯薄膜，源自Coveris Advanced Coatings(英国雷克瑟姆)，(Inspire 2331)
聚氨酯泡沫，源自泡沫Freudenberg，以前是Polymer Health Technologies；(英国Ebbw Vale)，(免费样品)
方法
通过将2.5mg的Daracure粉末添加到500μl1x浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来制备0.5％w/v光引发剂(PI)溶液。将混合物加热至60℃，同时定期涡旋混合直至所有固体溶解。在光引发剂完全溶解后，向溶液中加入50mg GELMA粉末，将其轻轻混合以使GELMA溶解。在该溶解过程中，通过周期性涡旋混合将GelMA/PI/PBS溶液的温度降至40℃。将溶液的温度保持在40℃以防止GELMA固化成凝胶。最后以9份GELMA/PI/PBS与1份微粒原液的比例加入蓝色聚苯乙烯微球。将溶液充分混合以确保均匀的溶液。混合物中的最终浓度为：0.45％光引发剂、8.1％GELMA和0.25％微粒。
取5μl等份的GELMA/微球/光引发剂混合物，并以每10×10mm平方薄膜一个5μl斑点的比率集中沉积在30μm透明聚氨酯薄膜(Coveris高级涂层，Inspire 2331)的粘合剂表面上。轻轻搅拌每一滴以将蓝色混合物滴分散到4-5mm直径的蓝色圆圈中。然后将聚氨酯(PU)薄膜正方形置于广谱UV灯(Dr.Honle，德国；功率c.100mW/cm2)下15秒以引发交联并聚合GELMA。最后，将PU正方形上的聚合斑点在环境温度下风干3小时。
在斑点干燥后，通过暴露的粘合剂将每个PU正方形(具有其自己的单个蓝色指示斑点)固定到类似尺寸的PU泡沫(5mm厚)上，以产生一组复合正方形。因此，每个正方形由一层PU泡沫组成，顶部被一片薄透明PU薄膜覆盖，该薄膜通过粘合剂层保持在位，在两层之间保持干燥的蓝色交联GELMA斑点。蓝色GELMA斑点被定位成使得其最上表面与粘合剂接触，并且其下表面与PU泡沫直接接触。通过使用永久性记号笔，在每个复合正方形的最上表面(在透明PU薄膜层的上表面上)绘制4mm(高度和宽度)蓝色十字，使得十字位于蓝色GELMA斑点上方，使得所绘制的十字的任何部分都不延伸超出蓝色指示剂的外边缘。通过这种布置，蓝色十字被其下方的强烈蓝色的斑点视觉遮挡。当这个完成后，正方形就可以用作蛋白酶活性的指标。
为了测试组装指示剂的响应性，制备了三种测试溶液，每种测试溶液基于具有以下组成的标准木瓜蛋白酶活化缓冲液：-去离子水中的4.22mM L-半胱氨酸HCL、3.6mMEDTA、0.2M NaCl，pH7。测试溶液1含有0.1mg/ml木瓜蛋白酶(大约1000单位/g)，试验溶液2含有0.001mg/ml木瓜蛋白酶，试验溶液3含有0mg/ml木瓜蛋白酶。将两个制备的指示剂正方形被放置在含有溶液1的培养皿中，使得吸收剂PU泡沫变得被溶液饱和。在这种情况下，溶液与蓝色斑点直接接触。两个正方形类似地被放置在溶液2中，并另外两个被放入溶液3中。正方形在它们被放置成与测试溶液接触之前(即在干燥状态下)被拍摄，并且当最初用测试溶液润湿时被再次拍摄，并且在第一次接触测试溶液后在37℃下24小时、48小时和72小时后再次拍摄。
结果
在图7和8中显示了在实验的预定时间点的蓝色GELMA斑点的状态。在干燥状态和用任何测试溶液首先润湿(即时间＝0小时)时，可以看出蓝色GELMA斑点是完全完整的(图7)。在这种情况下，蓝色十字没有暴露在任何正方形上。在随后的每个时间点，在存在两种浓度的木瓜蛋白酶的情况下观察到GELMA几乎完全消化(图8)。这可以通过演示的变化来看出，其中蓝色斑点变为蓝色十字。这是因为GELMA的明胶组分已经被活性蛋白酶消化，继而释放出截留和固定的微球。然后，有色微球分散，均匀地散布在整个泡沫中，以显示PU顶部的不可擦除的十字。相反，暴露于具有零木瓜蛋白酶(阴性对照)的溶液的蓝色GELMA斑点在整个时间过程中保持完整，没有观察到结构完整性丧失的迹象(图7和8)。在这些正方形中，留下蓝色圆形斑点，并且未显露在PU膜顶部标记的蓝色十字。
结论
从这些结果可以清楚地看出，当暴露于没有蛋白酶活性的水性溶液时，与蓝色聚苯乙烯微球混合的交联GELMA保持完整。当将蛋白酶活性被引入到样品溶液中时，GELMA很容易被木瓜蛋白酶(作为代表性蛋白酶)分解，因此释放蓝色微球使其分散在整个下面的泡沫层中。这种状态变化指示蛋白酶活性，可以观察到简单的色彩扩散或显露叠加的永久色彩匹配的十字(或其他符号)。
如实施例5所示，在中性粒细胞弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶9中也观察到了这一结果，预计它们都存在于感染或发炎的伤口流体中。
实施例5：基于甲基丙烯酸酯交联的明胶证明本发明的产品的使用
使用的材料
GelMA:改性明胶与甲基丙烯酸酐。(源自Sigma-Aldrich(产品号276685)的甲基丙烯酸酐。源自Sigma Aldrich，Porcine Type A，175波罗姆的明胶(产品编号G2625))。
光引发剂“Daracure”，2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮，源自SigmaAldrich(产品号410896)
Figure GDA0003398057340000641
聚苯乙烯模糊染色微球(0.5微米直径，2.5％固体)，源自Polysciences公司(产品编号15709)
来自Anowo公司的Orion非织造物(4osy重量)
方法
通过将2.5mg的Daracure粉末添加到500μl1x浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中来制备0.5％w/v光引发剂(PI)溶液。将混合物加热至60℃，同时定期涡旋混合直至所有固体溶解。在光引发剂完全溶解后，向溶液中加入50mg GELMA粉末，将其轻轻混合以使GELMA溶解。在该溶解过程中，通过周期性涡旋混合将GELMA/PI/PBS溶液的温度降至40℃。将溶液的温度保持在40℃以防止GELMA固化成凝胶。最后以9份GELMA/PI/PBS与1份微粒原液的比例加入蓝色聚苯乙烯微球。将溶液充分混合以确保均匀的溶液。混合物中的最终浓度为：0.45％光引发剂、8.1％GELMA和0.25％微粒。
取1μl等份的GELMA/微球/光引发剂混合物并将其中心沉积在Orion非织造材料的5×5mm正方形上。进行了一系列重复沉积。将该滴剂扩散到Orion垫中，然后置于广谱UV灯(Dr.Honle，德国；功率c.100mW/cm2)下15秒以引发交联并聚合GELMA。最后，将Orion正方形上的聚合斑点在环境温度下风干3小时。
为了测试组装指标的响应性，制备了一系列测试溶液。将基质金属蛋白酶9(MMP9)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)酶稀释到活化缓冲液中，其组分如下：去离子水中50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液、10mM氯化钙二水合物、100mM氯化钠、50μM氯化锌、0.025％w/wBrij 35、0.05％叠氮化钠。将每种酶在活化缓冲液中稀释，得到以下酶浓度：0微克/毫升、0.15微克/毫升、0.31微克/毫升、0.62微克/毫升、1.25微克/毫升、2.5微克/毫升、5微克/毫升和10微克/毫升。将每种酶稀释液的两种制备的指示剂正方形置于培养皿中，提供8×2形式的一系列材料正方形。对于每个配对，每平方加入25μL相关酶稀释液。正方形在它们被放置成与测试溶液接触之前(即在干燥状态下)被拍摄，并且当最初用测试溶液润湿时被再次拍摄，并且在第一次接触测试溶液后在37℃下24小时、48小时、120小时和144小时后再次拍摄。
结果
在图9至11中显示了实验的结果。在干燥状态和用任何测试溶液首先润湿(即时间＝0小时)时，可以看出蓝色GELMA斑点是完全完整的(图9)。在随后的每个时间点，在存在MMP9和HNE两者的情况下观察到GELMA的消化(图10和11)。这通过整个Orion非织造材料上的色彩分散(和衰减)来表示。这是因为GELMA的明胶组分已经被活性蛋白酶消化，继而释放出截留和固定的微球。然后，有色微球分散，均匀地散布在整个Orion非织造材料中。相反，暴露于不含MMP9或HNE(0μg/ml；阴性对照)的溶液的蓝色GELMA斑点在整个时间过程中保持完整，没有观察到结构完整性丧失的迹象(图9至11)。因此，结果证明当GELMA暴露于活性MMP9和HNE蛋白酶活性时可见的色彩衰减/损失。在24小时时，较高浓度的两种酶消化了GELMA并失去有色斑点(存在于时间点＝0hr)，其中有色微球分散在整个Orion非织造材料中。随着孵育时间的增加，较低浓度的活性酶能够切割GELMA并释放有色微球，从而导致色彩衰减/损失(图10和11)。这个时间过程清楚地表明GELMA可被MMP9和HNE酶消化。在整个测试过程中零酶对照斑点保持完整，证实交联的GELMA在延长的孵育期(144小时)内不会在37℃扩散或溶解。
结论
从这些结果清楚地看出，当暴露于没有蛋白酶活性的水性溶液时，与蓝色聚苯乙烯微球混合的交联GELMA保持完整。当存在活性蛋白酶活性时，GELMA很容易被MMP9和HNE(伤口中的代表性生物学相关酶)分解，因此释放蓝色微球，从而允许它们分散在整个下面的吸收层中。这种状态变化指示蛋白酶活性，并且可以观察到简单的色彩分散，或者在一些实施方式中，随后显露叠加初始色斑上或在初始色斑下面的符号(例如十字)。
本发明不限于本文所述的具体实施方式的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。此外，本文描述的本发明的所有方面和实施方式被认为是广泛适用的并且可与任何和所有其他一致的实施方式组合，包括适当地从本发明的其他方面(包括单独地)获得的那些实施方式。本文引用了各种出版物，这些出版物的公开内容通过援引全部并入。

Claims (21)

1.一种用于监测伤口状况的产品，其包括：
a. 样品施加区，伤口流体被添加到所述样品施加区；
b. 在所述样品施加区下游的反应区，所述反应区包括蛋白酶敏感的聚合物；
c. 所述样品施加区下游的包括有色颗粒的区域；
d. 第一观察区，所述观察区在所述样品施加区、所述反应区以及包括有色颗粒的区域下游；
其中所述样品施加区朝着所述第一观察区传输流体，并且其中存在于伤口流体中的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致将伤口流体与有色颗粒一起运送到所述第一观察区，从而在所述第一观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示，其中
所述反应区形成防止伤口流体到达所述第一观察区的屏障，并且其中由所述伤口流体中存在的任选地高于阈值水平的蛋白酶活性引起的聚合物切割破坏所述屏障并且导致所述有色颗粒被运送到所述第一观察区，从而经由所述第一观察区提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
2.根据权利要求1所述的产品，其中所述聚合物是交联的。
3.根据权利要求1或2所述的产品，其中包括有色颗粒的所述区域在所述反应区的下游。
4.根据权利要求1所述的产品，其中所述产品包括视觉符号，所述视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被所述有色颗粒掩盖，并且其中所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示包括显露所述视觉符号。
5.根据权利要求4所述的产品，所述产品限定了第二观察区，所述第二观察区位于在暴露于伤口流体之前且不存在蛋白酶活性的情况下包括有色颗粒的所述区域上方。
6.根据权利要求1所述的产品，其中所述第一观察区包括捕获分子以捕获所述第一观察区中的有色颗粒。
7.根据权利要求6所述的产品，其中所述捕获分子包含与所述有色颗粒特异性结合的抗体。
8.根据权利要求1所述的产品，其包括在所述第一观察区的下游末端处的屏障，使得有色颗粒累积在所述第一观察区中。
9.根据权利要求1所述的产品，其中所述样品施加区和所述反应区至少部分重叠。
10.一种用于监测伤口状况的产品，其包括吸收伤口流体的基质，所述基质包括：
a. 在所述基质上/内形成反应区的交联的且蛋白酶敏感的聚合物；
b. 有色颗粒；
其中所述聚合物和有色颗粒的布置使得由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致有色颗粒沿着/穿过所述基质运输，以提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示；
其中所述基质包括观察区，所述观察区在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下不包含有色颗粒，并且其中由所述伤口流体中存在的蛋白酶活性引起的聚合物切割导致所述有色颗粒沿着/穿过所述基质释放，从而在所述观察区中提供蛋白酶活性的视觉指示，其中
所述交联的且蛋白酶敏感的聚合物形成屏障，所述屏障在所述伤口流体中不存在任选地高于阈值水平的蛋白酶活性的情况下防止所述伤口流体与有色颗粒接触，并且其中由所述伤口流体中存在的任选地高于阈值水平的蛋白酶活性引起的聚合物切割破坏所述屏障，并导致所述有色颗粒沿着/穿过所述基质流动，以在所述观察区中提供所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示。
11.根据权利要求10所述的产品，其中所述视觉指示包括所述有色颗粒的分散。
12.根据权利要求10或11所述的产品，其中所述基质包括视觉符号，所述视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被截留在聚合物中的所述有色颗粒掩盖，并且其中所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示包括由于所述聚合物的切割和有色颗粒的释放显露所述视觉符号。
13.根据权利要求10所述的产品，其中在所述观察区中可见的基质包括捕获分子以捕获有色颗粒。
14.根据权利要求10所述的产品，其中所述基质包括与所述观察区的末端对齐的屏障，使得有色颗粒在所述观察区中累积。
15.根据权利要求1或10所述的产品，其中所述有色颗粒包括聚苯乙烯微粒。
16.根据权利要求10所述的产品，其中所述基质包括视觉符号，所述视觉符号在暴露于伤口流体之前并且在不存在蛋白酶活性的情况下被所述有色颗粒掩盖，并且其中所述伤口流体中蛋白酶活性的视觉指示包括由于所述聚合物被切割、所述屏障被破坏并且所述有色颗粒沿着/穿过所述基质流动而显露所述视觉符号。
17.根据权利要求1或10所述的产品，其中所述聚合物包括胶原聚合物。
18.根据权利要求1或10所述的产品，其中所述聚合物包括明胶聚合物。
19.根据权利要求2或10所述的产品，其中所述交联包括甲基丙烯酸酯或其衍生物。
20.根据权利要求2或10所述的产品，其中所述交联衍生自戊二醛或其衍生物。
21.根据权利要求1或10所述的产品，其中所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和/或谷氨酸蛋白酶。
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