CN103097892A - 用于使用生物标志物进行伤口的诊断和治疗的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于确定伤口的愈合阶段的装置和方法。在一些方面，本发明提供了一种伤口诊断装置，该伤口诊断装置包括一个表面以及至少一种药剂，该药剂对于一个所希望的生物标志物是特异性的。在另一方面，本发明提供了用于确定伤口愈合的阶段的方法。仍在其他方面，本发明提供了使用所披露的装置来确定伤口愈合的阶段的方法。

Description

用于使用生物标志物进行伤口的诊断和治疗的装置和方法
发明背景
1.发明领域
本发明总体上涉及生物学领域。更具体地，它涉及用于使用生物标志物进行伤口的诊断和治疗的装置和方法。 
2.相关技术说明 
治疗来自不同来源（例如，静脉腿，糖尿病足或压迫性溃疡）的急性和慢性伤口的医院和家庭护理设置将很大地从允许医疗保健执业者对伤口是否正在愈合或该愈合是否延迟进行立即确定的诊断工具获益。当前，在市场上没有可获得的用于确定伤口愈合的阶段的快速、容易的诊断装置或方法。 
发明概述
本发明提供了用于确定伤口是否是在愈合的正常轨道内或者用于识别该伤口已经陷于其中的阶段的、而对患者没有引起进一步伤害的装置和方法。 
在一些方面，本发明提供了一种伤口诊断装置，该伤口诊断装置包括一个表面以及至少一种药剂，该药剂对于一个所希望的生物标志物是特异性的。在一些实施方案中，该装置包括一个固体表面，该固体表面具有对于一个第一生物标志物是特异性的至少一种第一剂以及对于一个第二生物标志物是特异性的至少一种第二剂。在一些实施方案中，该装置进一步包括至少一种第三剂，该第三剂对于一种第三生物标志物是特异性的。在一些实施方案中，该装置包括1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、7080、90、100、或更多种药剂，这些药剂对于1、2、 3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、7080、90、100、或更多种生物标志物是特异性的。 
该表面可以是所希望的药剂可以附着其上的任何表面，包括但不局限于一种伤口敷件或一个微阵列。在一些实施方案中，该表面是一种吸收性表面。在一些实施方案中，该吸收性表面包括滤纸或比色纸。在一些实施方案中，该装置是一种伤口敷件。该伤口敷件可以是任何适当类型的伤口敷件。在一些实施方案中，该伤口敷件包括一种聚氨酯膜敷件。在一些实施方案中，该表面是一个微阵列。 
该药剂可以是对于所希望的生物标志物是特异性的任何适当的药剂。在一些实施方案中，该药剂可以是适体、配体、抗体、或肽序列。在一些实施方案中，这些药剂可以是适体、配体、抗体、和/或肽序列以任何组合的一个组合。 
该药剂可以以任何适当的方式附着至该表面。在一些实施方案中，该装置是用结合至生物标志物的药剂来包覆或结合。在一些实施方案中，这些药剂可以化学地（离子地或共价地）或物理地结合至该伤口敷件。在一些实施方案中，这些药剂是通过化学接枝、聚合物结合剂、双功能化学结合（例如硅烷或普卢兰尼克（pluronic））、亲水或电化学的结合、或等离子涂层来结合。在其他实施方案中，该装置可以用药剂包覆。在一些实施方案中，这些药剂可以通过共价键连接至该固体表面。 
该生物标志物可以是任何分泌的生物标志物。在一些实施方案中，该生物标志物可以是髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（nElastase）、人中性粒细胞载脂蛋白（Lipolin）（HNL）、乳铁蛋白、溶菌酶、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）、人中性粒细胞弹性蛋白酶抗中性粒细胞胞质抗体（HNE ANCA’s）、MMP9、蛋白酶3、丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂进化枝B和D、活性氧（ROS）、或活性氮（RNS）、或它们的任何组合。在一些实施方案中，该生物标志物可以是碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）、成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）、成纤维细胞-特异性蛋白1（FSP1）、脯氨酸-4-羟化酶（5B5）、胰岛素生长因子-1（IGF-1）、四连接素、胶原α1、2、和3链、SERPINA1、或补体组分 或它们的任何组合。在其他实施方案中，该生物标志物可以是钙粒蛋白A/B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂A、S100钙结合蛋白、CD163、CD204、CD206、AM-3K、CSF-1R（集落刺激因子-1受体）、巨噬细胞的一种特异性标志物、EMR1（包含表皮生长因子模块的粘蛋白样受体1）、F4/80、前胶原、胶原、或纤连蛋白或它们的任何组合。可以单独或组合使用任何的这些生物标志物。 
在一些实施方案中，该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是FGF-2。在一些实施方案中，该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是FGF-10。在一些实施方案中，该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或中性粒细胞弹性蛋白酶，并且该第二生物标志物是CD204或CD206。在一些实施方案中，该第一生物标志物是前胶原或胶原，并且该第二生物标志物是纤连蛋白。 
在另一方面，本发明提供了一种确定伤口愈合的阶段的方法，该方法包括：a)检测在一个来自伤口的样品中的第一生物标志物的量和第二生物标志物的量；并且b)比较该第一生物标志物的量和该第二生物标志物的量，其中该第一生物标志物的量与该第二生物标志物的量之间的关系指示伤口愈合的阶段。 
通过在此披露的装置和方法分析的样品可以是来自任何所希望的来源。在一些实施方案中，该样品可以是来自伤口渗出物。在一些实施方案中，该样品是伤口流体。在一些实施方案中，该样品可以是从其他来源收集。例如，这些生物标志物可以是从粘附至敷件材料的（在将敷件从伤口除去时）亦或来自在伤口的清创术期间除去的非坏死组织的组织来提取。 
在一些实施方案中，该第一生物标志物已经从中性粒细胞分泌并且该第二生物标志物已经从成纤维细胞分泌。在一些实施方案中，如果该第一生物标志物的量大于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的发炎期。反之，如果该第一生物标志物的量小于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的增殖期。 
在一些实施方案中，该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是FGF-2。在一些实施方案中，如果MPO的量大于FGF-2的量至少两倍，则指示伤口愈合的发炎期。反之，如果MPO的量是或小于FGF-2的量的一半，则指示伤口愈合的增殖阶段。 
在一些实施方案中，该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。在一些实施方案中，该第一生物标志物已经从M1巨噬细胞分泌并且该第二生物标志物已经从M2巨噬细胞分泌。在一些实施方案中，从M1巨噬细胞分泌的第一生物标志物的一个更大的量与从M2巨噬细胞分泌的第二生物标志物的一个更小的量指示伤口愈合的发炎期。反之，从M1巨噬细胞分泌的第一生物标志物的一个更小的量与从M2巨噬细胞分泌的第二生物标志物的一个更大的量指示伤口愈合的增殖期。在一些实施方案中，该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP，并且该第二生物标志物是CD204或CD206。在一些实施方案中，如果CD204或CD206的量小于钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP的量两倍，则该伤口处于伤口愈合的发炎期。反之，如果CD204或CD206的量等于或大于钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP的量的两倍，则该伤口处于伤口愈合的增殖阶段。 
在一些实施方案中，该第一生物标志物是前胶原或胶原，并且该第二生物标志物是纤连蛋白。在一些实施方案中，如果前胶原或胶原的量大于纤连蛋白的量，则指示伤口愈合的发炎期。反之，如果前胶原或胶原的量小于纤连蛋白的量，则指示伤口愈合的增殖期。 
在一些方面，本发明提供了一种确定伤口愈合的阶段的方法，该方法包括：a)检测在一个来自伤口的样品中的第一生物标志物和第二生物标志物的量，包括使该样品与固体表面（该固体表面包括一个对于该第一生物标志物是特异性的第一剂以及一个对于该第二生物标志物是特异性的第二剂）接触；并且b)比较该第一生物标志物的量和该第二生物标志物的量，其中该第一生物标志物与该第二生物标志物的相对量指示伤口愈合的阶段。 
在实例部分中的这些实施方案应被理解为是可适用于本发明的所有方面的本发明的实施方案。 
在权利要求书中术语“或”的使用是用以表示“和/或”，除非明确指出仅仅是指替代项或这些替代项是互相排斥的，虽然本披露支持仅指替代项和“和/或”的定义。 
贯穿本申请，术语“约”被用于表示一个值包括了对于用来确定该值的装置或方法而言的误差的标准偏差。 
按照长期专利法，在权利要求书或说明书中结合词语“包括”使用时，词语“一个”和“一种”指一个或多个，除非特别地标注。 
如在此使用的术语“治疗有效的”是指为了达到一种疗效（例如其中接受治疗的病情的至少一种症状至少减轻了），在本发明的方法中采用的细胞和/或治疗用组合物（例如治疗用多核苷酸和/或治疗用多肽）的量值。 
本发明的其他目标、特征和优点将从以下详细说明中变得清楚。然而，应当理解，这种详细说明和这些具体实例虽然表明了本发明的具体实施方案，它们仅仅是通过解说的方式给出的，因为从这种详细说明中在本发明的精神和范围内的不同变化和修改对于本领域的那些普通技术人员而言将变得很清楚。 
附图简要说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在此用来进一步展示本发明的某些方面。通过结合在此展现的具体实施方案的详细说明来参见这些附图中的一幅或多幅，可以更好地理解本发明。 
图1用于慢性伤口的诊断检测装置的示意图。 
图2中性粒细胞-和成纤维细胞-特异性生物标志物的ELISA（酶联免疫吸附测定）分析。 
图3用于伤口的状态的快速检测的数字诊断装置的示意图。 
示意性实施方案的说明
披露的装置和方法提供了一种伤口状态的容易的、快速的、床边的诊断法。这通过提供伤口的愈合状态的信息来为临床医生提供关于“下一步做什么”的决策图表。 
在此披露了对于检测来自伤口流体的一种或多种生物标志物而不破坏在下面的受伤组织、对于准确地诊断一个伤口是否是在愈合的正常轨道内或者对于识别它已经捕获之处的阶段有用的而对患者没有引起进一步伤害的装置和方法。总体上，诊断测试呈现为(1)检测分泌的生物标志物以及(2)测量在样品中的这些标志物的比率。这些诊断测试将指示伤口是否停滞于发炎期或者已经进展进入伤口愈合的增殖期，而不破坏在下面的受伤组织。 
A.伤口愈合阶段 
伤口愈合过程分为三个阶段：(1)发炎，(2)增殖，以及(3)重塑。在愈合过程期间出现在伤口中的不同细胞的时间进程已经被广泛地表征。例如，在发炎期间，中性粒细胞是占优势的，然而在增殖期期间成纤维细胞是占优势的。作为对伤口的初始反应，身体增加炎症应答，其特征在于募集粒细胞，主要是中性粒细胞，以及来自单核巨噬细胞系的细胞到损伤部位。虽然中性粒细胞炎症被传统地认为是正常的急性应答，但中性粒细胞的持续存在通常与延迟的伤口愈合以及慢性停滞的伤口相关联。在伤口愈合的正常轨道中，典型地，在中性粒细胞已经通过活化巨噬细胞清除后，指示进入增殖期，其中发生上皮形成、血管发生以及临时基质形成。因此，成纤维细胞是在健康、愈合的伤口的增殖期期间发现的占优势的细胞类型。 
由这些以及其他的愈合期特异性细胞类型分泌的特异性生物标志物的检测将允许用于伤口愈合进展的准确测定，作为在受伤组织中 占优势细胞类型的间接而准确的表现。在此披露的方法中，可以检测由此类细胞类型分泌的独特标志物。在一些方面，本发明提供了一种包含并检测局部衍生的生物标志物的方法，可以用于即时护理诊断目的（图1）。 
通过在此披露的装置和方法分析的样品可以是来自任何所希望的来源。例如，该样品可以是从伤口渗出物收集。在一些实施方案中，可以通过将流体从注射器的抽吸物抽吸到伤口床中，并且将内容物转移入收集小瓶内来获得样品。可替代地，在“负压伤口疗法”、“减压疗法”、或“真空疗法”期间的伤口渗出物的收集可以用于生物标志物的检测。在一些实施方案中，在“负压伤口疗法”、“减压疗法”、或“真空疗法”期间，可以将吸附性滤纸放置在滴定出小量的伤口渗出物的单独的装置内。在其他实施方案中，可以在伤口敷件上直接收集伤口渗出物。在其他实施方案中，该样品可以是从其他来源收集。例如，这些生物标志物可以提取自粘附至敷件材料的（在将敷件从伤口除去时）的组织，亦或提取自在伤口的清创术期间除去的非坏死组织。该提取将可能必需一个浸泡（溶解）和/或一个浸泡和研磨步骤来释放生物标志物。 
在此披露的方法将通过细胞-特异性标志物分泌入伤口渗出液内来间接并准确地测量细胞的存在，而不是直接地测量细胞（会进一步损害患者的组织）。伤口渗出物通常提供了伤口的细胞外环境以及它的相对健康度的准确反映。这允许人们对伤口愈合的不同阶段之间进行区别。 
B.生物标志物 
在一些方面，在此披露的装置和方法利用生物标志物。生物标志物是一种可测量的生物物质、或标志，充当正常或异常的生物过程的特异性指示剂，通常对于医疗干预的药理学应答的评估是有用的。若干生物标志物可以形成用于在伤口中的中性粒细胞和成纤维细胞的检测的基础。中性粒细胞分泌因子以及成纤维细胞分泌因子的检测可以充当用于确定伤口愈合阶段的基于比率的诊断的开发的特异性生物标志物。 
任何分泌的生物标志物可以与本披露的方法和装置一起使用。在一些方面，生物标志物是中性粒细胞-或成纤维细胞-特异性的生 物标志物。在其他方面，生物标志物是从M1或M2巨噬细胞分泌的。本领域的普通技术人员可以认识到其他细胞-特异性分泌的生物标志物。 
这些分泌的生物标志物可以按任意所希望的组合，与所披露的方法和装置一起使用。例如，这些方法和装置可以使用1、2、3、4、5、10、15、20、或更多种生物标志物。在一些方面，该方法或装置可以结合一种或多种成纤维细胞分泌因子，使用一种或多种中性粒细胞分泌因子。在其他实施方案中，该方法或装置可以结合一种或多种从M1巨噬细胞分泌的因子，使用一种或多种从M1巨噬细胞分泌的因子。本领域的普通技术人员可以认识到生物标志物的其他所希望的组合。 
1.中性粒细胞分泌因子 
在一些方面，在此披露的装置和方法利用从中性粒细胞分泌的生物标志物。本领域普通技术人员会认识到多种分泌的中性粒细胞-特异性生物标志物。在一些实施方案中，该中性粒细胞分泌的生物标志物是髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（nElastase）、人中性粒细胞载脂蛋白（Lipolin）（HNL）、乳铁蛋白、溶菌酶、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）、人中性粒细胞弹性蛋白酶抗中性粒细胞胞质抗体（HNE ANCA’s）、MMP9、蛋白酶3、丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂进化枝B和D、活性氧（ROS）、或活性氮（RNS）。 
2.成纤维细胞分泌因子 
在一些方面，在此披露的装置和方法利用从成纤维细胞分泌的生物标志物。本领域普通技术人员会认识到多种分泌的成纤维细胞-特异性生物标志物。在一些实施方案中，该成纤维细胞-分泌的生物标志物是FGF-2、FGF-10、成纤维细胞-特异性蛋白1（FSP1）、脯氨酸-4-羟化酶（5B5）、胰岛素生长因子-1（IGF-1）、四连接素、胶原α1、2、和3链、SERPINAl、或补体组分。 
3.其他生物标志物 
在伤口愈合中，M1巨噬细胞引导一种炎症应答而M2巨噬细胞启动修复和血管发生。与M1巨噬细胞相比，M2巨噬细胞产生低量 的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及高量的其他可检测的标志物。因此，在M1巨噬细胞（产生促炎症反应细胞因子）与M2巨噬细胞（发挥衰减炎症应答并促进血管发生、组织重塑和修复的作用）之间的差别还指示伤口愈合的阶段。对M1或M2巨噬细胞是特异性的、有用的生物标志物的实例包括但不局限于：钙粒蛋白A/B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂A、S100钙结合蛋白（对M1是特异性的）以及CD163、CD204、CD206、AM-3K、CSF-1R（集落刺激因子-1受体）、巨噬细胞的一种特异性标志物、EMR1（包含表皮生长因子模块的粘蛋白样受体1）、或F4/80（对于M2是特异性的）。此外，前胶原或胶原对比纤连蛋白的水平的分析还指示伤口愈合的增殖期（胶原）亦或发炎期（纤连蛋白）。 
C.在生物标志物的量之间的关系 
在一些方面，所披露的方法和装置利用生物标志物的量或在所选择的生物标志物之间的比率来确定伤口愈合的阶段。在一些实施方案中，在中性粒细胞分泌因子与成纤维细胞分泌因子之间的比率将会被监测。在此类实施方案中，大于中性粒细胞分泌因子的量的成纤维细胞分泌因子的量指示伤口（样品从此处收集）正处于增殖期或正适当地愈合。在一些实施方案中，如果成纤维细胞分泌因子的量大于中性粒细胞分泌因子的2倍或更多，则该伤口处于增殖阶段。在一些实施方案中，中性粒细胞分泌因子与成纤维细胞分泌因子的比率是1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2.0、1:3、1:4、1:5、1:10，或更大或它们之间的任何可推出的比率。相比之下，大于成纤维细胞分泌因子的量的中性粒细胞分泌因子的量指示伤口（样品从此处收集）正处于发炎期或不是正在适当地愈合。在一些实施方案中，如果中性粒细胞分泌因子的量大于成纤维细胞分泌因子的2倍或更多，则该伤口处于发炎阶段。在其他实施方案中，成纤维细胞分泌因子与中性粒细胞分泌因子的比率是1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2.0、1:3、1:4、1:5、1:10，或更大或它们之间的任何可推出的比率。 
在一些实施方案中，在M1分泌因子与M2分泌因子之间的比率将会被监测。在此类实施方案中，大于M1分泌因子的量的M2分泌因子的量指示伤口（样品从此处收集）正处于增殖期或正适当地愈合。在一些实施方案中，如果M2分泌因子的量大于M1分泌因子的2倍或更多，则该伤口处于增殖阶段。在一些实施方案中，M1分泌因子与M2分泌因子的比率是1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2.0、1:3、1:4、1:5、1:10，或更大或它们之间的任何可推出的比率。相比之下，大于M2分泌因子的量的M1分泌因子的量指示伤口（样品从此处收集）正处于发炎期或不是正在适当地愈合。在一些实施方案中，如果M1分泌因子的量大于M2分泌因子的2倍或更多，则该伤口处于发炎阶段。在其他实施方案中，M2分泌因子与M1分泌因子的比率是1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2.0、1:3、1:4、1:5、1:10，或更大或它们之间的任何可推出的比率。 
类似的关系可以应用于生物标志物的任何组合，其中一种或多种生物标志物从对于伤口愈合的发炎阶段是特异性的细胞类型分泌，并且一种或多种生物标志物从对于伤口愈合的增殖阶段是特异性的细胞类型分泌。 
D.装置 
在一些实施方案中，本发明提供了对检测和/或可视化一种或多种来自伤口流体的生物标志物有用的装置。这些装置可以包括一个表面以及至少一种药剂，该药剂对于所希望的生物标志物是特异性的。该表面可以是所希望的药剂可以附着其上的任何表面，包括但不局限于一种伤口敷件或一个微阵列。 
在一些实施方案中，该装置可以是一种微流控装置，例如类似于一种妊娠测试。在其他实施方案中，该装置可以处于被设计用于“负压伤口疗法”、“减压疗法”、或“真空疗法”的装置的管材或管材连接件之中。在这种装置中，当具有过量中性粒细胞生物标志物或过量成纤维细胞标志物的渗出物存在时，该管材可以改变颜色。在其他实施方案 中，该装置可以处于罐或在转变颜色的罐的底部上的粘着剂的形式。仍在其他实施方案中，该装置可以是一种被编程为检测这些蛋白的水平并且数字显示最终读数的手持装置（图3）。 
对于生物标志物是特异性的药剂可以是任何可以特异性结合至所希望的生物标志物的药剂。实例包括但不局限于，适体、配体、抗体、肽序列或对于本领域的普通技术人员已知的其他结合剂。 
可替代地，在“负压伤口疗法”、“减压疗法”、或“真空疗法”期间的伤口渗出物的收集可以用于生物标志物的检测。在“负压伤口疗法”、“减压疗法”、或“真空疗法”期间，可以将与适体、配体、或抗体（图1）共价连接的吸附性滤纸放置在滴定出小量的伤口渗出物的单独的装置内。 
在一些实施方案中，该装置是用结合至生物标志物的药剂来包覆或结合。在一些实施方案中，这些药剂可以化学地（离子地或共价地）或物理地结合至该伤口敷件。在一些实施方案中，这些药剂是通过化学接枝、聚合物结合剂、双功能化学结合（例如硅烷或普卢兰尼克（pluronic））、亲水或电化学的结合、或等离子涂层来结合。在其他实施方案中，该装置可以用药剂包覆。 
1.伤口敷件 
在一些实施方案中，该装置可以是一种伤口敷件。该伤口敷件可以包含一种或多种对于所希望的生物标志物是特异性的药剂。在此使用的术语“伤口敷件”用来包括任何药学上可接受的伤口覆盖物或支撑基质。适合的伤口敷件材料的实例包括但不局限于，a)膜，包括具有半透性或半封闭性质的那些，例如聚氨酯共聚物、聚氨酯膜、丙烯酰胺、丙烯酸酯、石蜡、多糖、玻璃纸以及羊毛脂；b)水胶体，包括明胶、胶质的羧甲基纤维素蛋白组分以及复合多糖（包括阿拉伯胶、瓜尔胶以及梧桐胶），它们可以按软质泡沫的形式利用、配制在聚氨酯中或配制为粘合剂（例如聚异丁烯）；c)聚合物（例如琼脂、淀粉或丙二醇），它们典型地包含约80%至约90%的水并且常规地被配制为片、粉末、糊以及凝胶，连同交联聚合物（例如聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酰胺、丙二醇）一 起；d)泡沫，例如由亲水的开孔接触面与疏水的闭孔聚氨酯组成的多糖；e)浸渍剂，包括松网纱布（pine mesh gauze）、石蜡以及羊毛脂包覆的纱布、聚乙二醇包覆的纱布、针织粘胶纤维、人造丝、以及聚酯；以及f)纤维素样多糖，例如藻酸盐（包括藻酸钙），它们可以配制为非纺织的纤维复合材料或纺粘为纺织的复合材料。 
2.微阵列 
在一些实施方案中，该装置可以是一个微阵列。该微阵列可以使一种或多种对于所希望的生物标志物是特异性的药剂布置在其基质上。“阵列”是指一种由基质组成的装置，该基质典型地为一种固体支撑物，该固体支撑物具有一个表面，该表面被适配为接收并固定多个不同的蛋白、肽、和/或核酸种类（即捕获或检测试剂），可以用于确定在生物样品（例如伤口渗出物）中的其他分子（即，分析物或生物标志物）的存在和/或量。“微阵列”是指一种阵列，其中不同的检测试剂被布置在基质上。在一些实施方案中，这些药剂可以化学地（离子地或共价地）或物理地结合至该微阵列。 
E.检测方法 
生物标志物存在的检测可以用任何本领域普通技术人员已知的方式进行。在一些实施方案中，这些生物标志物的检测方法可以与所使用的装置类型有关。在一些实施方案中，可以进行若干生物标志物的同时检测，以提供伤口状态的更准确的测定。 
在一些实施方案中，生物标志物结合至该装置上的特异性药剂。在此类实施方案中，这些结合的生物标志物可以通过任何本领域的普通技术人员已知的适当方法来检测。在一些实施方案中，可以使用ELISA、免疫荧光测试、微阵列、发光测试、印迹、放射免疫测定、蛋白质印迹（Western blot）或斑点印迹法（dot blot）来检测分泌的生物标志物的存在。在一些实施方案中，分泌的生物标志物的存在可以使用比色检测方法来检测。这些方法可以导致与伤口愈合生物标志物的存在或不存在相关的直观的变色。在一些实施方案中，可以使用质谱法、傅立叶变 换红外光谱学（FTIR）、聚合酶链式反应（PCR）、实时定量PCR、或RNA印迹（Northern Blot）来检测分泌的生物标志物的存在。 
F.实例 
以下实例被包括以证明本发明的优选的实施方案。本领域的那些普通技术人员应当理解，在以下跟随的实例中披露的技术代表本发明人发现在本发明的实践中功能发挥良好的技术，并且因此可以被认为是构成了用于其实践的优选模式。然而，鉴于本披露，本领域的那些普通技术人员会理解的是，在所披露的具体实施方案中可以做出很多改变，并且仍获得相同或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。 
实例1-HL60和HDFa 
感兴趣的生物标志物的分泌水平是在相异的细胞类型的培养物中进行评价，以允许本领域的普通技术人员对于对每种细胞类型是独特的生物标志物进行评价，并且以确定这些独特的生物标志物的水平。所使用的这两种细胞类型是HL60（人前髓细胞白血病）细胞以及HDFa（成人真皮成纤维细胞）。使用1.2%的DMSO将HL60细胞诱导分化为中性粒细胞样细胞。在37°C在5%CO2中，将可比较的数目的细胞进行培养持续可比较的量的时间。使用传统的ELISA技术来评价条件培养基（包含来自每种细胞类型的分泌因子）的MPO、FGF2以及其他分析物的存在（表1）。ELISA，（酶联免疫吸附测定），是用于检测样品中抗原（典型地为蛋白）的存在的一种生物化学分析工具。简言之，在测试样品中的一种未知量的抗原特异性地或非特异性地附着至表面。然后将特异性抗体施用在该表面上使得它可以结合至测试抗原。该抗体典型地连接至一种酶，该酶将会在添加化学底物时被转化为可检测的信号（通常为颜色改变）。 
表1 
Figure BDA00002911875400141
+++：在标准曲线范围内；---：在标准曲线范围以下 
FGF：成纤维细胞生长因子；MPO：髓过氧化物酶；MMP：基质金属蛋白酶；TNF：肿瘤坏死因子；TGF：转化生长因子；HL60：人前髓细胞白血病细胞系；HDFa：来自成人来源的人真皮成纤维细胞；HEKa：来自成人来源的人表皮角质化细胞；N/A：不可获得 
表2显示了在实验期间，在离散细胞培养介质中测量的分析物的浓度范围。例如，在HL-60条件培养基中，测量到了MPO的浓度在6.4ng/mL–16ng/mL之间。 
表2 
分析物 最低浓度 最高浓度
MPO 6.4ng/ml 16ng/ml
弹性蛋白酶 3125pg/ml 6250pg/ml
碱性FGF 10pg/ml 20pg/ml
TFG-β1 125pg/ml 250pg/ml
纤连蛋白 500ng/ml 5μg/ml
TNF-α-1 200pg/ml 6ng/ml
MMP 200ng/ml 13μg/ml
[0054] MPO仅在从诱导的HL60-中性粒细胞培养物所取的条件培养基中检测到，并且完全不存在于从培养的成纤维细胞获得的条件培养基中。这证明了MPO是用于中性粒细胞对比成纤维细胞的特异性检测的一种良好的候选生物标志物（图2）。 
还用0.5%的DMSO诱导HL60细胞以得到中性粒细胞样培养物。然后使用标准细胞培养条件，使诱导的HL60和HDFa细胞生长持续可比较的量的时间。对条件培养基中的中性粒细胞弹性蛋白酶（NElastase）、FGF-2、TGF-β1以及MPO的存在进行测试。 
FGF2仅在从成纤维细胞取的条件培养基中被检测到，并且这种生物标志物在很大程度上不存在于从培养的诱导的HL60细胞获得的条件培养基中，表示这种分泌的生物标志物适用于在伤口环境中将成纤维细胞从中性粒细胞区别开。由中性粒细胞和成纤维细胞两者分泌的对照蛋白—TGF-β1，被包括在这个分析中，并且如所期望的被发现于从两种细胞类型获得的条件培养基中（图2）。 
实例2-来自人伤口流体的MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶、FGF2以及TGFβ的定量 
为了补充以上所述的用HL60和HDF细胞系条件培养基的分析，其他分析包括：来自从不同类型伤口获得的人伤口流体的MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶、FGF2以及TGFβ（由外部销售商—Cureline公司提供）的定量。确切地，伤口渗出流体（1ml）是从具有下列类型伤口的同意的患者中收集：糖尿病足溃疡、灼伤、压迫性溃疡、静脉淤血性溃疡（venous stasis ulcers）、以及没有临床感染证据的急性创伤。用于这些分析的入选标准包括：具有签署的同意书的超过18岁的男性和女性。排除标准包括：激活的系统感染、免疫缺陷疾病、贫血（血细胞比容<26），和/或接收类固醇、免疫抑制的、或细胞毒性的药疗法。首先通过记录患者的人口统计信息（例如，受试者年龄、性别、种族、等），以及伤口信息（包括伤口持续时间、将来或以前的外科手术的日期、伤口的类型（急性或慢性）、以及以前的伤口治疗）来收集测试样品。 
测试样品如下制备：绘出受伤区域并测量深度以便计算伤口面积。基于伤口表面，将待添加的盐水的量进行计算并进行记录（例如，对于每4cm2的伤口表面积添加1cc盐水）。将半封闭的聚氨酯膜敷件（Tegaderm，3M公司，圣保罗，明尼苏达州，或者等效物）放置在伤口上，并且通过用附接至注射器的无菌21计量不锈钢针刺穿膜敷件、并且将内容物在转移入低温支持的聚丙烯管内之前，将内容物抽吸到在聚氨酯膜敷件与伤口床本身之间的伤口床内，来收集伤口流体。小心避免对在下面的伤口床组织的损害，仅对流体进行收集。将所收集的伤口流体的体积以及时间点进行记录，并且在将回收的伤口流体灌洗液倾析入低温支持的聚丙烯管内时，将这些管快速冷冻用于储存并且在干冰上进行运送用于分析。 
如上所述，通过ELISA对MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶、FGF2、以及TGFβ进行分析。将所发现的在每种伤口流体内的MPO:FGF2以及中性粒细胞弹性蛋白酶:FGF2之间的比率进行测定，并且用作对伤口的诊断。如果FGF2>MPO2倍或更大或者如果FGF2>中性粒细胞弹性蛋白酶2倍或更大，则伤口正适当地愈合。相对于MPO或中性粒细胞弹性蛋白酶低于2倍的FGF2的水平指示“受阻的”（“blocked”）或非愈合的伤口。 
根据本发明，在此披露并提出权利要求的所有组合物和/或方法都可以被制造并执行而无需进行过度的实验。虽然已经以一些实施方案的方式对本发明的组合物和方法进行了说明，本领域的普通技术人员应理解的是，可以对在此说明的这些组合物和方法以及方法的步骤或步骤顺序进行改变而不偏离本发明的构思、精神和范围。更确切地说，将清楚的是在化学和生理学上均相关的某些试剂可以替代在此说明的试剂，同时仍会得到相同或相似的结果。对于本领域普通技术人员而言，显然所有这种类似的替代和变更均应视为是在如所附的权利要求书中所述的本发明的精神、范围和构思以内。 

Claims (112)

1.一种伤口诊断装置，包括一种对第一生物标志物是特异性的第一剂以及一种对第二生物标志物是特异性的第二剂，其中该第一生物标志物是一种中性粒细胞分泌因子并且该第二生物标志物是一种成纤维细胞分泌因子，或者该第一和第二生物标志物是从M1或M2巨噬细胞分泌。
2.如权利要求1所述的装置，进一步被限定为包括用该第一和第二剂包覆的一个固体表面。
3.如权利要求1或2所述的装置，其中该固体表面是一种吸附性表面，该吸附性表面优选包括吸附性滤纸或比色纸，或是一个微阵列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的装置，其中该第一和第二剂通过共价键连接至该固体表面。
5.如权利要求1至4中任一项所述的装置，其中该装置是一种伤口敷件，优选一种聚氨酯膜敷件。
6.如权利要求1至5中任一项所述的装置，其中该第一和第二剂是适体、配体、抗体、或肽序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是髓过氧化物酶（MPO）并且该第二生物标志物是碱性成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）。
8.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶（nElastase）并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。
9.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B并且该第二生物标志物是CD204。
10.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是TNF-α并且该第二生物标志物是CD204。
11.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是CD204。
12.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中中性粒细胞弹性蛋白酶和该第二生物标志物是CD204。
13.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B并且该第二生物标志物是CD206。
14.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是TNF-α并且该第二生物标志物是CD206。
15.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是CD206。
16.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是CD206。
17.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是前胶原并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
18.如权利要求1至6中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是胶原并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
19.如权利要求1至18中任一项所述的装置，其中该装置进一步包括至少一种第三剂，该第三剂对于一种第三生物标志物是特异性的。
20.一种确定伤口愈合的阶段的方法，包括：
检测在一个来自伤口的样品中的第一生物标志物的量和第二生物标志物的量；并且
b)比较该第一生物标志物的量和该第二生物标志物的量，
其中该第一生物标志物是一种中性粒细胞分泌因子，并且该第二生物标志物是一种成纤维细胞分泌因子，或者该第一和第二生物标志物是从M1或M2巨噬细胞分泌，并且该第一生物标志物的量对该第二生物标志物的量之间的关系指示伤口愈合的阶段。
21.如权利要求20所述的方法，其中该第一生物标志物已经从中性粒细胞分泌，并且该第二生物标志物已经从成纤维细胞分泌。
22.如权利要求20所述的方法，其中该第一生物标志物已经从M1巨噬细胞分泌，并且该第二生物标志物已经从M2巨噬细胞分泌。
23.如权利要求20或21任一项所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量大于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的发炎期，并且其中如果该第一生物标志物的量小于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的增殖期。
24.如权利要求20至23中任一项所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量大于该第二生物标志物的量至少两倍，则指示伤口愈合的发炎期，并且其中如果该第一生物标志物的量是或小于该第二生物标志物的量的一半，则指示伤口愈合的增殖阶段。
25.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物的一个更大的量与该第二生物标志物的一个更小的量指示伤口愈合的发炎期。
26.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物的一个更小的量与该第二生物标志物的一个更大的量指示伤口愈合的增殖期。
27.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是髓过氧化物酶（MPO）并且该第二生物标志物是碱性成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）。
28.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶（nElastase）并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。
29.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B并且该第二生物标志物是CD204。
30.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是TNF-α并且该第二生物标志物是CD204。
31.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是CD204。
32.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中，中性粒细胞弹性蛋白酶，并且该第二生物标志物是CD204。
33.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B并且该第二生物标志物是CD206。
34.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是TNF-α并且该第二生物标志物是CD206。
35.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是CD206。
36.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是CD206。
37.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是前胶原并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
38.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是胶原并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
39.如权利要求20至38中任一项所述的方法，进一步被限定为用如权利要求1至19中任一项所述的装置来实践。
40.一种伤口诊断装置，包括一个对第一生物标志物是特异性的第一剂，以及一个对第二生物标志物是特异性的第二剂，其中该第一生物标志物是一种中性粒细胞分泌因子并且该第二生物标志物是一种成纤维细胞分泌因子，或者该第一和第二生物标志物是从M1或M2巨噬细胞分泌。
41.如权利要求40所述的装置，进一步被限定为包括用该第一和第二剂包覆的一个固体表面。
42.如权利要求40所述的装置，其中该固体表面是一种吸附性表面。
43.如权利要求42所述的装置，其中该吸附性表面包括吸附性滤纸。
44.如权利要求42所述的装置，其中该吸附性表面包括比色纸。
45.如权利要求41所述的装置，其中该固体表面包括一个微阵列。
46.如权利要求41所述的装置，其中该第一和第二剂通过共价键连接至该固体表面。
47.如权利要求40所述的装置，其中该装置是一种伤口敷件。
48.如权利要求47所述的装置，其中该伤口敷件包括一种聚氨酯膜敷件。
49.如权利要求41所述的装置，其中该第一和第二剂是适体、配体、抗体、或肽序列。
50.如权利要求40所述的装置，其中该第一生物标志物是髓过氧化物酶（MPO）并且该第二生物标志物是碱性成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）。
51.如权利要求40所述的装置，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶（nElastase）并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。
52.如权利要求40所述的装置，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或中性粒细胞弹性蛋白酶，并且该第二生物标志物是CD204或CD206。
53.如权利要求40所述的装置，其中该第一生物标志物是前胶原或胶原，并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
54.如权利要求40所述的装置，其中该装置进一步包括至少一种第三剂，该第三剂对于一种第三生物标志物是特异性的。
55.一种确定伤口愈合的阶段的方法，包括：
a)检测在一个来自伤口的样品中的第一生物标志物的量和第二生物标志物的量；并且
b)比较该第一生物标志物的量和该第二生物标志物的量，
其中该第一生物标志物是一种中性粒细胞分泌因子，并且该第二生物标志物是一种成纤维细胞分泌因子，或者该第一和第二生物标志物是从M1或M2巨噬细胞分泌，并且该第一生物标志物的量对该第二生物标志物的量之间的关系指示伤口愈合的阶段。
56.如权利要求55所述的方法，其中该样品是伤口流体。
57.如权利要求55所述的方法，其中该第一生物标志物已经从中性粒细胞分泌并且该第二生物标志物已经从成纤维细胞分泌。
58.如权利要求55所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量大于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的发炎期。
59.如权利要求55所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量小于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的增殖期。
60.如权利要求55所述的方法，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是FGF-2。
61.如权利要求60所述的方法，其中如果MPO的量大于FGF-2的量至少两倍，则指示伤口愈合的发炎期。
62.如权利要求60所述的方法，其中如果MPO的量是或小于FGF-2的量的一半，则指示伤口愈合的增殖阶段。
63.如权利要求55所述的方法，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。
64.如权利要求55所述的方法，其中该第一生物标志物已经从M1巨噬细胞分泌并且该第二生物标志物已经从M2巨噬细胞分泌。
65.如权利要求64所述的方法，其中该第一生物标志物的一个更大的量与该第二生物标志物的一个更小的量指示伤口愈合的发炎期。
66.如权利要求64所述的方法，其中该第一生物标志物的一个更小的量与该第二生物标志物的一个更大的量指示伤口愈合的增殖期。
67.如权利要求55所述的方法，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP，并且该第二生物标志物是CD204或CD206。
68.如权利要求67所述的方法，其中如果CD204或CD206的量小于钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP的量两倍，则该伤口处于伤口愈合的发炎期。
69.如权利要求67所述的方法，其中如果CD204或CD206的量等于或大于钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP的量的两倍，则该伤口处于伤口愈合的增殖阶段。
70.如权利要求55所述的方法，其中该第一生物标志物是前胶原或胶原，并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
71.如权利要求70所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量大于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的发炎期。
72.如权利要求70所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量小于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的增殖期。
73.如权利要求55所述的方法，进一步被限定为用如权利要求40所述的装置来实践。
74.一种伤口诊断装置，包括一个表面，该表面具有一个对于第一生物标志物是特异性的第一剂以及一个对于第二生物标志物是特异性的第二剂。
75.如权利要求74所述的装置，其中该表面是用该第一和第二剂包覆的一个固体表面。
76.如权利要求74或75任一项所述的装置，其中该固体表面是一种吸附性表面。
77.如权利要求74至76中任一项所述的装置，其中该吸附性表面包括吸附性滤纸。
78.如权利要求74至76中任一项所述的装置，其中该吸附性表面包括比色纸。
79.如权利要求74至76中任一项所述的装置，其中该装置是一种伤口敷件。
80.如权利要求79所述的装置，其中该伤口敷件包括一种聚氨酯膜敷件。
81.如权利要求75所述的装置，其中该固体表面包括一个微阵列。
82.如权利要求75所述的装置，其中该第一和第二剂通过共价键连接至该固体表面。
83.如权利要求74至82中任一项所述的装置，其中该第一和第二剂是适体、配体、抗体、或肽序列。
84.如权利要求74至83中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是FGF-2。
85.如权利要求74至83中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。
86.如权利要求74至83中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或中性粒细胞弹性蛋白酶，并且该第二生物标志物是CD204或CD206。
87.如权利要求74至83中任一项所述的装置，其中该第一生物标志物是前胶原或胶原并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
88.如权利要求74至87中任一项所述的装置，其中该装置进一步包括至少一种第三剂，该第三剂对于一种第三生物标志物是特异性的。
89.一种确定伤口愈合的阶段的方法，包括：
a)检测在一个来自伤口的样品中的第一生物标志物的量和第二生物标志物的量；并且
b)比较该第一生物标志物的量和该第二生物标志物的量，
其中该第一生物标志物对该第二生物标志物的相对量指示伤口愈合的阶段。
90.如权利要求89所述的方法，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是FGF-2。
91.如权利要求89所述的方法，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。
92.如权利要求89所述的方法，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或中性粒细胞弹性蛋白酶，并且该第二生物标志物是CD204或CD206。
93.如权利要求89所述的方法，其中该第一生物标志物是前胶原或胶原，并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
94.如权利要求89至93中任一项所述的方法，其中该装置进一步包括至少一种第三剂，该第三剂对于一种第三生物标志物是特异性的。
95.如权利要求89至94中任一项所述的方法，其中该样品是伤口流体。
96.如权利要求89至95中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物已经从中性粒细胞分泌并且该第二生物标志物已经从成纤维细胞分泌。
97.如权利要求89至96中任一项所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量大于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的发炎期。
98.如权利要求89至96中任一项所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量小于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的增殖期。
99.如权利要求89至96中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是MPO并且该第二生物标志物是FGF-2。
100.如权利要求99所述的方法，其中如果该MPO的量大于FGF-2的量至少两倍，则指示伤口愈合的发炎期。
101.如权利要求99所述的方法，其中如果MPO的量是或小于FGF-2的量的一半，则指示伤口愈合的增殖阶段。
102.如权利要求89至96中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该第二生物标志物是成纤维细胞生长因子-10（FGF-10）。
103.如权利要求89至102中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物已经从M1巨噬细胞分泌并且该第二生物标志物已经从M2巨噬细胞分泌。
104.如权利要求89至102中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物的一个更大的量与该第二生物标志物的一个更小的量指示伤口愈合的发炎期。
105.如权利要求89至102中任一项所述的方法，其中该第一生物标志物的一个更小的量与该第二生物标志物的一个更大的量指示伤口愈合的增殖期。
106.如权利要求103所述的方法，其中该第一生物标志物是钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP，并且该第二生物标志物是CD204或CD206。
107.如权利要求106所述的方法，其中如果CD204或CD206的量小于钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP的量两倍，则该伤口处于伤口愈合的发炎期。
108.如权利要求106所述的方法，其中如果CD204或CD206的量等于或大于钙粒蛋白A/B、TNF-α、MPO、或MMP的量的两倍，则该伤口处于伤口愈合的增殖阶段。
109.如权利要求89所述的方法，其中该第一生物标志物是前胶原或胶原，并且该第二生物标志物是纤连蛋白。
110.如权利要求109所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量大于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的发炎期。
111.如权利要求109所述的方法，其中如果该第一生物标志物的量小于该第二生物标志物的量，则指示伤口愈合的增殖期。
112.如权利要求89至111中任一项所述的方法，进一步被限定为用如权利要求74至88中任一项所述的装置来实践。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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