CN101541973A - 用于量化组织内的胶原的方法 - Google Patents

Abstract

为了成功地愈合创伤，新形成的皮肤必须通过胶原沉积产生抗张强度。在长肉芽的创伤床内的胶原测量结果可以预示创伤的成功愈合。现有的用于测量胶原的方法或者需要专门的设备，或者不允许辨别可能的干扰分子。此处描述的是准确的、特异性的且可靠的方法，该方法利用高压液相色谱技术来从组织中提取胶原并量化胶原。该方法足够灵敏到测量新近愈合的创伤内存在的少量胶原。

Description

用于量化组织内的胶原的方法

发明背景

本申请要求享有2006年9月21日提交的美国临时专利申请第60/846,250号的优先权的权益，该临时专利申请的全部内容在此专门以引用方式并入。

1.发明领域

本发明一般涉及测量组织内的胶原含量。更具体地说，本发明涉及利用HPLC技术来测量胶原含量。在具体的实施方案中，本发明涉及测量正在愈合的创伤内的胶原含量。

2.相关领域描述

胶原蛋白由主要由氨基酸的重复序列组成的多肽链形成，氨基酸主要包括羟基脯氨酸(Hyp)、甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)。胶原是人体内存在的最主要的蛋白质之一，其包括约80％-85％的正常(无创伤的)皮肤组织的真皮层内的细胞外基质(ECM)。有证据表明胶原的独特特性为正常皮肤组织提供了抗张强度(tensile strength)、完整性和结构。G.S.Schultz等人的Extracellular matrix：review of its roles in acute and chronic wounds(细胞外基质：其在急性和慢性创伤中的作用的综述)，World Wide Wounds，(August 2005)，在网址为worldwidewounds.com/2005/august/Schultz/Extrace-Matric-Acute-Chronic-Wounds.html的环球网上。因为产生抗张强度是成功愈合创伤的重要部分，而因为胶原是参与产生抗张强度的主要的蛋白质，所以准确的胶原测量结果可以预示创伤的成功愈合。

生物化学和分析化学中通常使用的各种分析方法可以适用于量化胶原，诸如分光光度测定法和气相色谱法。H.Inoue等人，J.of ChromatographyB，724：221-230(1999)。目前大多数可以利用的测量羟基脯氨酸的分光光度计比色法是对1950年的Neuman和Logan法或Stegemann法的改进，该方法可以是灵敏的且准确的，但也是麻烦的和有疑问的。H.Stegemann和K.Stalder，Clinica Chemical Acta，18：267-273(1967)；B.R.Switzer和G.K.Summer，Analytical Biochemistry 39：487-491(1971)。

另一种常用的分析方法是高压液相色谱法(HPLC)。通过在高压下，将其内添加了样品的液体泵送通过柱，而迫使样品通过专门填装的柱来操作HPLC。填装在柱内部的材料被称为固定相或吸附相，且通常是被精细研磨的粉末或凝胶。被称为流动相的液体通常是有机溶液和/或缓冲溶液。在色谱法中，样品内被分离供研究的物质通常被称为分析物。色谱的图像输出-色谱图显示了对应于分离的混合物的不同组分(诸如分析物)的不同的峰或图案。HPLC产生的数据允许分析员确定是否存在干扰或共流出峰，以及准确地确定这些峰出现的位置。虽然，可以分析由HPLC产生的峰以进行分离，但是不可能确定分光光度计的结果是否是由于污染化合物。

利用HPLC测量胶原的已知方法要求专门的设备，诸如荧光检测器或高度专业化的柱，这能够增大分析的成本和/或复杂度，从而可能阻止此过程。H.Inoue等人；J.of Chromatography B，757：369-373(2001)；D.A.Martinez等人，Diabetes Res.and Clinical Practice，591-9(2003)；F.A.Vázquez-Ortíz等人J.of Liquid Chromatography & Related Tech.，27，172771-2780(2004)。Inoue等人描述了利用HPLC将人体血清中的脯氨酰二肽、脯氨酸和羟基脯氨酸的水平确定为涉及胶原代谢类疾病的指标的方法。此方法要求串联的HPLC柱并以两个不同的发射波长进行监测。Martinez等人利用了使用Waters

柱的反相HPLC法来分析羟基脯氨酸，

柱是为分析氨基酸而专门填装的专用柱。通过量化羟基脯氨酸和羟基赖氨酰吡啶啉交联，Martinez等人得到了猪左心室内的胶原含量的指标，但是不能量化胶原含量。Vázquez-Ortíz等人描述了一种在诸如大腊肠的肉类产品中确定胶原浓度的方法。此方法涉及利用反相HPLC和荧光检测器(fluorichrom detector)来测量羟基脯氨酸的含量。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了一种测量组织内的总胶原的方法，其包括：(a)获得组织样品；(b)处理组织样品；(c)通过高压液相色谱法在处理过的组织样品中分离出甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸中的至少一种以获得分析物的峰面积；(d)确定组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸中的至少一种的浓度；以及(e)使组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸中的至少一种的浓度与组织内的总胶原量相关联。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种测量组织内的总胶原的方法，其包括：(a)获得组织样品；(b)处理组织样品；(c)通过高压液相色谱法在处理过的组织样品中分离出甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸以获得分析物的峰面积；(d)确定组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度；以及(e)使组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度与组织内的总胶原量相关联。

在某些实施方案中，组织来自创伤部位。在本发明的一个实施方案中，组织是长肉芽的(granulated)。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种评估或监测创伤愈合进展的方法，其包括：(a)从受治疗者的创伤部位获得组织样品；(b)处理组织样品；(c)通过高压液相色谱法在处理过的组织样品中分离出甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸中的至少一种以获得分析物的峰面积；(d)确定组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸中的至少一种的浓度；(e)使组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸中的至少一种的浓度与组织内的总胶原量相关联；以及(f)将创伤部位处的组织内的总胶原量与无创伤的组织内的胶原量进行比较以评估创伤愈合的进展。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种评估创伤愈合进展的方法，其包括：(a)从受治疗者的创伤部位获得组织样品；(b)处理组织样品；(c)通过高压液相色谱法在处理过的组织样品中分离出甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸以获得分析物的峰面积；(d)确定组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度；(e)使组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度与组织内的总胶原量相关联；以及(f)将创伤部位处的组织内的总胶原量与无创伤的组织内的胶原量进行比较以评估创伤愈合的进展。在某些实施方案中，重复至少一次本方法，且从同一个受治疗者的同一处创伤部位获得的组织样品用于每一次重复。在确定的时间段内，重复可以是重复至少一次。在某些实施方案中，时间段可以是每天、每周、每半个月、每月、每季度、每半年、每年、每两年、每三年、每四年或每五年。在某些实施方案中，可以每隔一天、每隔两天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每周、每隔一周、每隔两周、每隔三周、每隔四周或每隔五周重复此方法。其他实施方案包括将第一次重复时组织内的总胶原量与随后的一次或多次重复时组织内的总胶原量进行比较。将创伤部位处的组织内的总胶原量进行比较允许对创伤愈合的进展进行监测和/或评价。

可以从人类来源或诸如哺乳动物、两栖动物、爬行动物、鱼类和禽类的多种动物来源获得组织样品。一些非限制性的哺乳动物的示例包括小鼠、大鼠、猪、兔、狗、牛和人。可以通过多种方法，如切削、刮削、剥离、刮除(abrading)或切割的方法从来源去除组织。可以通过使用工具，如刀、解剖刀、剃刀或刀片帮助去除。

本发明可以适用于包含胶原的任何组织类型。胶原是支持大部分组织的细胞外基质的主要组分。此外，胶原可以存在于某些细胞的内部。胶原是诸如皮肤、筋膜、软骨、韧带和腱的软组织内的主要组分。胶原还存在于骨骼和牙齿中。在本发明的某些实施方案中，组织是皮肤。皮肤包括三个主要的层：最外层的表皮；具有高度密集的神经末梢和结缔组织的真皮；以及下皮层或皮下脂肪(脂肪)层。

人和动物体内存在许多不同类型的胶原。一些资料已经报道了多达28种的不同的已知类型。人体内存在的约80％-90％的胶原是I型(存在于皮肤、腱、骨骼、韧带、牙质和间质组织中)、II型(存在于软骨和玻璃体液中)和III型(存在于细胞培养物和胎儿组织中)的组合。本发明可以适用于胶原的任意类型或类型组合。

正如此处使用的，“处理过的组织样品”指已经被处理到适合于通过HPLC来分离其各组分的状态的组织样品。处理供分析用的，包括供HPLC分析用的组织的方法是本领域已知的。本发明的方法可以包括处理组织样品，使得在特定的实施方案中，处理包括下面的一种或多种：(a)从组织样品中去除脂肪；(b)使组织样品脱水；(c)将样品水解成氨基酸；和/或(d)对样品进行衍生化。所有这些处理都涉及本领域已知的且通常实施的过程。脂肪去除可以按照多种方式进行，包括物理和化学方式。在某些实施方案中，化学脱脂涉及用溶剂或洗涤剂清洗。这种溶剂的某些非限制性的示例包括乙醇、乙腈、己烷、戊烷和/或丙酮。脱水可以通过多种方法实现，诸如冷冻干燥(冻干法)、干燥、受控地施加热和/或施加真空。在具体的、非限制性的实施方案中，样品通过暴露于盐酸和热而水解，并在含4-二甲基氨基偶氮苯4′-磺酰氯的丙酮溶液中衍生化。

在一个实施方案中，确定组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度包括：(a)获得具有已知浓度的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的样品；(b)通过高压液相色谱法在样品中分离出甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸；(c)以图的x-轴表示甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的已知浓度，以图的y-轴表示分析物的峰面积来进行绘制以设计线性标准曲线；以及(d)计算处理过的组织样品中的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的每一个的浓度。甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的每一个的浓度可以利用公式计算：

其中b是y-轴截距，而m是线性标准曲线的斜率；以及(e)利用公式计算组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的每一个的浓度：

在另一个实施方案中，使组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度与组织内的总胶原量相关联，包括利用公式：

其中C是胶原内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的百分比之和。“C”值在本领域中已有报道，且可以随胶原类型变化。在非限制性的实施例中，“C”是0.55。

设计标准曲线的方法在本领域中是众所周知的且标准曲线可以通过手动设计或者借助仪器或计算机进行设计。用于计算机、计算器和其他仪器的曲线拟合软件程序可以用于设计标准曲线。

在本发明的一个实施方案中，高压液相色谱法是反相高压液相色谱法。在另一个实施方案中，高压液相色谱法是在C18柱上进行的，且在本发明的另一个实施方案，高压液相色谱法是在约1到约12的pH范围进行的。在高压液相色谱法的过程中，可以用，如光电二极管阵列检测器测量分析物(甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸)的洗脱(elution)。在一个实施方案中，以436纳米测量洗脱。在本发明的一个实施方案中，在高压液相色谱法的过程中，不用荧光检测器测量分析物(甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸)的洗脱。

在本发明的又一个实施方案中，高压液相色谱法具有约70％的25mM的磷酸钾、pH 11.0的缓冲液和约30％的乙腈的流动相。流动相可以包括50％、60％、70％、80％或90％的缓冲液。缓冲剂的非限制性的示例为磷酸钾、柠檬酸磷酸盐(citric phosphate)、Tris、HEPES、MES或MOPS。缓冲相可以包含10％、20％、30％、40％或50％的乙腈。

本发明的方法非常适合于检测低水平的胶原，诸如可能存在于创伤愈合的初期阶段内的胶原。在本发明的某些方面，该方法用于检测组织样品内以1.0μg/ml或更小的浓度存在的羟基脯氨酸。在本发明的一些方面，该方法用于检测组织样品内以小于0.9μg/ml、小于0.8μg/ml、小于0.7μg/ml、小于0.6μg/ml、小于0.5μg/ml、小于0.4μg/ml、小于0.3μg/ml或小于0.2μg/ml的浓度存在的羟基脯氨酸。在一些实施方案中，该方法用于检测组织样品内以0.12μg/ml到1.0μg/ml之间、0.12μg/ml到0.9μg/ml之间、0.12μg/ml到0.8μg/ml之间、0.12μg/ml到0.7μg/ml之间、0.12μg/ml到0.6μg/ml之间、0.12μg/ml到0.5μg/ml之间、0.12μg/ml到0.4μg/ml之间、0.12μg/ml到0.3μg/ml之间或0.12μg/ml到0.2μg/ml之间的浓度存在的羟基脯氨酸。在本发明的某些方面，该方法用于检测组织样品内以1.0μg/ml或更小的浓度存在的甘氨酸。在本发明的一些方面，该方法用于检测组织样品内以小于0.9μg/ml、小于0.8μg/ml、小于0.7μg/ml、小于0.6μg/ml、小于0.5μg/ml、小于0.4μg/ml、小于0.3μg/ml、小于0.2μg/ml或小于0.1μg/ml的浓度存在的甘氨酸。在一些实施方案中，该方法用于检测组织样品内以0.06μg/ml到1.0μg/ml之间、0.06μg/ml到0.9μg/ml之间、0.06μg/ml到0.8μg/ml之间、0.06μg/ml到0.7μg/ml之间、0.06μg/ml到0.6μg/ml之间、0.06μg/ml到0.5μg/ml之间、0.06μg/ml到0.4μg/ml之间、0.06μg/ml到0.3μg/ml之间、0.06μg/ml到0.2μg/ml之间或0.06μg/ml到0.1μg/ml之间的浓度存在的甘氨酸。在本发明的某些方面，该方法用于检测组织样品内以1.0μg/ml或更小的浓度存在的脯氨酸。在本发明的一些方面，该方法用于检测组织样品内以小于0.9μg/ml、小于0.8μg/ml、小于0.7μg/ml、小于0.6μg/ml、小于0.5μg/ml、小于0.4μg/ml、小于0.3μg/ml或小于0.2μg/ml的浓度存在的脯氨酸。在一些实施方案中，该方法用于检测组织样品内以0.12μg/ml到1.0μg/ml之间、0.12μg/ml到0.9μg/ml之间、0.12μg/ml到0.8μg/ml之间、0.12μg/ml到0.7μg/ml之间、0.12μg/ml到0.6μg/ml之间、0.12μg/ml到0.5μg/ml之间、0.12μg/ml到0.4μg/ml之间、0.12μg/ml到0.3μg/ml之间或0.12μg/ml到0.2μg/ml之间的浓度存在的脯氨酸。

如上所述，本发明的方法非常适合于检测低水平的胶原，诸如可能存在于创伤愈合的初期阶段内的胶原。因此，在某些实施方案中，本发明提供了从创伤形成开始，在小于9天、小于8天、小于7天、小于6天、小于5天、小于4天、小于3天或小于2天的时间点时评估创伤愈合进展的方法。在某些方面，从创伤形成开始，在约2天到9天、2到8天、2到7天、2到6天、2到5天、2到4天、2到3天、3到9天、3到8天、3到7天、3到6天、3到5天或3到4天之间评估创伤愈合的进展。

本发明的方法也非常适合于检测宽动态范围内的胶原水平。此宽动态范围用于监测整个愈合过程中的创伤组织内的胶原水平。在某些方面，本发明提供了一种方法，该方法中，在0.06μg/ml到25μg/ml、0.12μg/ml到25μg/ml、0.75μg/ml到25μg/ml或0.75μg/ml到24μg/ml的范围内，检测组织样品中的羟基脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸的每一个的浓度。

设想此处描述的任何方法或组合物相对于此处描述的任何其他方法或组合物都可以被实施。

除非明确指出仅指可选择物或者可选择物是共同排除的，否则权利要求中使用的术语“或”用于意指“和/或”，尽管所公开的内容支持仅指可选择物以及“和/或”的定义。

在整个申请中，术语“约”用于表示值包括为确定值而采用的设备或方法的误差的标准差。

根据专利法长期以来的规定，在权利要求或说明书中，除非专门指出，否则当词汇“一个(a)”和“一个(an)”与词汇“包括”结合使用时，其表示一个或多个。

从下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优势将会变得明显。然而，应该理解，虽然详细描述和具体的实施例表示了本发明的具体实施方案，但是它们仅通过举例说明来给出，因为从此详细描述，本发明的主旨和范围内的各种变化和改动将会对于本领域技术人员变得明显。

附图简述

下面的附图形成了本发明说明书的一部分且被包括在说明书内以进一步证明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合此处提供的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1显示了羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的线性曲线，表示在场合(occasion)1注入羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的0.75μg/mL-24μg/mL的氨基酸标准混合物。每一种标准浓度的面积表示根据每一个氨基酸峰计算的值。列出了每一个氨基酸趋势线的相关系数且表明所有的氨基酸标准曲线在0.75μg/mL-24μg/mL之间是线性的。

图2显示正常的、完整的猪皮肤的典型皮肤色谱图。

图3显示了羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的掺加研究曲线(spikingstudy plot)。猪的正常、完整的皮肤组织样品被掺加80％、100％和120％的6.0μg/mL的氨基酸标准混合物(靶标准品)，重复两份。趋势线表示全部三个氨基酸的回收率(recovery)。结果太相似以致线重叠。每一个氨基酸的相关系数是0.995(羟基脯氨酸)、0.988(甘氨酸)和0.995(脯氨酸)。

发明详述

A.创伤愈合过程

当正常皮肤的完整性遭受破坏时，如因手术破坏时，成功地愈合急性创伤取决于依次经历的四个已知阶段。这些阶段是止血、发炎、增殖和重塑或化脓。在止血过程和初期的发炎阶段的过程中，释放血管收缩因子(vasoconstrictors)造成了毛细血管收缩，从而允许血小板和炎症细胞迁移到创伤床(wound bed)。在发炎阶段的过程中，中性白细胞被释放，这有助于稳定创伤。R.F.Diegelmann和M.C.Evens，Frontiers in Bioscience，9：283-289(2004)。在2到3天内，巨噬细胞进入创伤。这些巨噬细胞担负去除中性白细胞和受损基质的任务。A.J.Meszaros等人，J.of Immunology，165：435-441(2000)。接下来，创伤进入增殖阶段，且成纤维细胞和角化细胞迁移入创伤内。正是这些成纤维细胞产生了形成肉芽组织所需的胶原和其他细胞外基质蛋白质。肉芽组织通常是从创伤基底长成的遍布的(perfused)纤维结缔组织。在创伤愈合的过程中，胶原分子形成了胶原-纤维蛋白基质，其促进细胞迁移入创伤。

在增殖阶段，成纤维细胞浸润是创伤愈合过程的关键所在。诸如血小板源性生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF-β)的特定细胞因子是成纤维细胞调节剂，其参与生成肉芽组织。而且，TGF-β积极地刺激成纤维细胞的增殖，成纤维细胞是创伤床内存在的量最大的细胞类型。在最后阶段的创伤重塑过程中，胶原沉积持续进行。在重塑两年之后，创伤的抗张强度将会达到正常皮肤组织约80％的最大值。C.T.Hess和R.S.Kirsner，Advances in Skin & Wound Care，16，5：246-257(2003)。

在某些情况下，在期望的时间内，未能在按顺序的、可预测的阶段内愈合创伤。这种创伤被认为是慢性的，且慢性创伤的患者可能因创伤未能愈合而具有另外的情感压力和身体压力。通常而言，如果某些因素造成发炎阶段或增殖阶段中断，那么就会发展成慢性创伤。中断的一般原因包括感染、组织缺氧、重复性外伤、存在残骸和/或坏死组织以及诸如糖尿病的某些疾病。罹患慢性创伤的患者被感染的风险更高，且经常报告巨大的疼痛。为了避免慢性创伤的并发症，应该评估和监测某些创伤。本发明提供了用于通过量化创伤组织中的胶原来评估和监测创伤的准确的、特异性的且可靠的方法。这些方法足够灵敏到测量新近愈合的创伤内存在的少量胶原。

B.胶原结构

胶原分子或“原胶原”亚基是长约300nm且直径1.5nm的棒。它们由三个多肽链形成，每一个多肽链是左手螺旋的，三个多肽链缠绕在一起形成右手卷曲螺旋。原胶原亚基将是自发自组装的，且在螺旋内或螺旋之间存在一定的共价交联。胶原原纤维是成束的胶原分子，而胶原纤维是成束的原纤维。胶原亚基链的氨基酸排列是明显不同的。普遍是模式Gly-X-Pro或Gly-X-Hyp，其中X可以是各种其他氨基酸残基中的任意一种，特别是经常出现排列Gly-Pro-Hyp。

本发明提供了一种通过分析胶原内存在的这三个量最大的氨基酸(羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸)来计算总胶原的方法。在一个实施方案中，首先根据它们各自的标准曲线来计算这三个氨基酸的浓度(μg/mL)，来计算总胶原。因此，每一个样品中的羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的浓度(μg/mg)可以用公式确定

其中基于线性曲线，b是y-轴截距，而m是斜率。接着，通过把样品重量、稀释因子和最终的样品体积(mL)考虑进来，计算每一个湿组织样品中每一种氨基酸的浓度(μg/mg)。

然后，可以通过取得羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的浓度(μg/mg)，并计算这三个值的和，然后除以特定类型的胶原的羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的乘上0.01后的已知百分数的和来计算总胶原。这在下面表示为“C”，其中C是表示成分数的胶原内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的百分组成的总和。因而，

C值可以在文献中获得，且报道值可以随胶原类型变化。例如，由T.M.Devin，Proteins I：Composition and Structure(蛋白质I：组成和结构)，见于：T.M.Devlin(编辑)Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations(与临床相关的生物化学的教科书)，John Wiley & Sons，Inc.，新泽西州，2006，第101页中报道的胶原的羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的已知百分数的总和是55％，且还报道了胶原包括约9.1％的羟基脯氨酸、33％的甘氨酸和13％的脯氨酸，共计总胶原的55％。

胶原必须从受治疗者取下的样品分离且通常在进行分析研究之前，进行化学准备。这种过程可以包括诸如冷冻、粉碎、冻干(脱水)、水解和衍生化的若干步骤。其他步骤可以包括非胶原分子的消化、过滤、沉淀、透析、稀释、溶剂化或反复清洗。本领域已知的胶原制备技术的示例可以见于美国专利第5,162,506、4,597,762和5,814,328号中。

C.高压液相色谱法

还有许多基于诸如正常的、反相、离子交换和生物亲和性的相材料的特定类型的HPLC。例如，反相HPLC由非极性的固定相和含水的、中等极性的流动相组成，且按照疏水性相互作用的原理进行操作，此相互作用源自极性洗脱液、相对非极性的分析物和非极性的固定相之间的排斥力。相比之下，离子交换色谱法依靠溶质离子与结合到固定相的带电部位之间的吸引。同种电荷的离子被排除。好多公司都制造可市售的HPLC仪器和配件，诸如Agilent Technologies、Hitachi和Waters Corporation。

HPLC仪器可以配备不同类型的检测器，如光电二极管阵列检测器。光电二极管阵列(PDA)是，如在集成电路芯片或多路复用器上排列在一起的多个独立的光电二极管元件的线性阵列。对光谱法(spectroscopy)来说，它被设置在分光计的成像平面上允许多种波长被同时检测。阵列检测器特别用于记录样品的紫外光-可见光全吸收光谱，所述样品被迅速通过样品流动池，如在HPLC检测器中的样品流动池。

D.实施例

下面的实施例被包括在内以验证本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应该理解，下面的实施例中所公开的技术表示由发明人所发现的实施本发明时作用良好的技术，并因此可被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应该理解在所公开的具体实施方案内可以进行许多变化且仍能获得相同或类似的结果，而并不偏离本发明的主旨和范围。

1.样品收集和准备

在20头家猪(野猪(Sus scrofa))的背部上形成完整厚度的，直径5cm的切割创伤。在液氮中，在-80℃下将在创伤形成过程中取下的皮肤圆片(skin medallion)进行速冻(snap frozen)，直至用于胶原分析。这些圆片用作正常的、完整的皮肤样品。创伤用Duoderm^TM(水胶体敷料)进行敷裹且每周换3次敷料。在形成伤口后第9天，对动物实施安乐死然后取下肉芽组织圆片，并在-80℃下进行冷冻直至用于胶原分析。这些圆片用作初始愈合组织的样品。

在收集之后，用多样品生物粉碎机(Multi sample biopulverizer，Biospec)来粉碎冷冻的皮肤组织样品。接着，使样品冻干一整夜以除去任何过多的水。粉碎使皮肤组织碎裂并暴露更大的表面积，这有助于使组织脱脂。在冻干之后，按顺序地用70％的乙醇、100％的乙醇、100％的乙腈和100％的丙酮进行5次，15分钟的清洗使样品脱脂。然后，在室温下，干燥样品。干燥之后，通过添加6N盐酸，在110℃下，样品经过一整夜水解成氨基酸。冻干之后，在真空下，干燥样品一整夜以去除任何残余的盐酸，然后通过加水重建使样品达到约13mg/mL的最终浓度。

所有试样的结果是根据0.75μg/mL-24μg/mL范围的线性曲线。用1毫升的1.3mg/mL的4-二甲基氨基偶氮苯4′-磺酰氯的丙酮溶液衍生10μL含有约1.3×10^-1mg/mL的皮肤组织的样品。用pH 9.0的500μL的50mM的碳酸氢钠来稀释所衍生的样品以帮助中和样品溶液的pH。在70℃下，培育所衍生的样品10分钟到15分钟，然后冻干一整夜。在冻干之后，样品用2mL 70％的乙醇重建，并用Whatman 25mm GD/X PSU过滤膜过滤到HPLC瓶中。

2.HPLC分析和验证

用配备有2996光电二极管阵列检测器和用于数据处理的Empower软件的Waters

HPLC系统来分析所有经过滤的样品。为了确定总胶原，以436nm对羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸进行测量。此反相HPLC法利用了预处理的Phenomenex，Gemini^TM C18150×4.6mm和3微米粒度的柱。所有的样品在等度条件下运行，且预混合的和预过滤的流动相是70％，25mM的磷酸钾、pH 11.0的缓冲液和30％的乙腈。在室温下，每一次注射持续45分钟，且流速为0.5mL/分钟。羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的峰都在25.0分钟内被洗脱。在26分钟和45分钟之间的时间允许柱被冲洗并在下一次注射之前被平衡。

验证了HPLC法的线性、准确性、精确性、准确性/可重复性、检测限值和量化限值。通过检定由范围在0.75μg/mL到24μg/mL的已知浓度的羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸制备的5个标准样来确定线性。每一个标准样浓度被绘制，显示了面积对已知的标准样浓度，且计算每一个标准样浓度的相关系数。所使用的每一个线性具有大于0.996的相关系数。通过在同一天检定六个样品并确保平均回收率相对标准偏差(RSD)小于15％来确定准确性。在两个不同的场合，通过分析6.0μg/mL标准样的六次注射，改变每一场合的柱的批号并确保RSD小于3％来检定精确性。通过评价在三个不同的场合，由单独分析物制备的6个不同的样品制剂并确保每一场合的RSD小于15％且全部三个场合的平均RSD小于20％来测试准确性/可重复性(耐用性)。最后，通过检定稀释到最低的线性标准样浓度之下的连续稀释的标准样，来确定检测限值和量化限值。连续三次注射每一种稀释物，然后分析该色谱法对羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的检测限值/量化限值。计算了每一种连续稀释浓度的平均值和％RSD以及还计算并记录了每一种稀释物的峰信号对峰噪声的比。检测浓度的限值是具有3∶1的信噪比的浓度。量化限值是具有小于或等于15％的RSD的最低限值。

3.结果

完成验证以显示目前的方法是准确的、特异性的和可靠的。对此方法进行试验以验证羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的外标样(external standard)在0.75μg/mL-24μg/mL范围内是线性的(图1)。羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的线性相关系数(r²值)分别是0.999±0.001、0.999±0.002和0.999±0.001。发现此方法可以检测的羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的最低浓度是0.12μg/mL、0.06μg/mL和0.12μg/mL，在该水平上，使用3∶1的信噪比来计算这些值。此方法可以对每一个标准样进行量化的最低浓度是羟基脯氨酸0.24μg/mL、甘氨酸0.12μg/mL和脯氨酸0.24μg/mL。使用4∶1的平均峰信噪比和7.13的平均百分数的相对标准偏差(％RSD)来计算这些值。

准确性/可重复性试验是此方法量化的复杂部分且对无创伤的猪组织实施。通常的皮肤组织色谱图显示在图2中。羟基脯氨酸、甘氨酸和脯氨酸的保留时间分别是11.3、18.6和24.9分钟。在三个不同的场合，改变天数和/或分析物，来处理并分析六个单独的样品。接下来，计算每一场合的平均值和相对标准偏差。使用从所有三个场合得到的结果来计算总的平均值和总的相对标准偏差。一个场合的平均值是268.27μg/mg的总胶原，且具有5.20％的RSD。总的平均值(对所有场合来说)是240.82μg/mg的总胶原，且具有10.70％的总的相对标准偏差。每一场合的准确性/可重复性结果和总的平均值显示在表1中。结果表明本方法在分析皮肤组织样品内的胶原方面是准确的。

表1.每一场合的准确性/可重复性结果和总的平均值。表显示了在3个不同的场合，对正常、完整的猪皮肤的六次重复的总胶原测量结果。

掺加研究也包括在此方法的量化中以证实方法的准确性并显示此方法并不分析与正常、完整的皮肤组织基质的偏倚以及对所感兴趣的峰不存在干扰。一个完整皮肤的样品用在此研究中并掺加0％、80％、100％和120％的含有全部三种氨基酸混合物的6.0μg/mL浓度的标准样，重复两份。然后，用平均值和相对标准偏差来计算每一种浓度的百分比回收率。羟基脯氨酸的回收率是101.09％且具有5.93％的RSD。甘氨酸的回收率是100.50％且具有9.52的％RSD，脯氨酸的平均回收率是101.23％且具有5.89的％RSD。对每一种组分产生的曲线显示了实际的浓度对理论浓度之间的关系。计算每一条曲线的相关系数、y-轴截距和斜率。每一条曲线的相关系数是羟基脯氨酸0.995、甘氨酸0.988和脯氨酸0.995(图3)。相关系数接近1表明实际浓度等于理论浓度。此掺加研究的结果证实了从皮肤组织基质不会产生干扰峰。

为了确保该方法准确地测量新近愈合的创伤内存在的少量胶原，对来自猪的9天之久的创伤中的肉芽组织进行了分析，并将数据显示在表2中。所有的样品都落入标准曲线的线性部分内。因而，所有样品的总胶原浓度都是可计算的。猪的肉芽组织内存在的胶原的平均量是56.846μg/mg，而猪的正常、完整的皮肤内存在的胶原的平均量是240.823μg/mg。

表2.对20个猪的第9天的肉芽组织样品中的总胶原进行量化。

猪的肉芽组织样品  总胶原浓度(μg/mg)  平均胶原浓度(μg/mg)  ％RSD

         1          39.388

         2          58.405

         3          53.981

         4          51.483

         5          55.015

         6          61.028

         7          70.000

         8          46.490

         9          54.607

         10         63.396

         11         43.520

         12         54.444

         13         54.791

         14         53.539

         15         68.339

         16         55.649

         17         58.321

         18         57.327

         19         77.103

         20         60.093              56.846          15.36

4.讨论

由于羟基脯氨酸和衍生峰的洗脱时间接近，所以需要仔细优化此HPLC法。在此过程中，对许多不同的柱进行了试验，使用具有宽pH范围的Gemini C18柱获得了最佳的结果。根据USP规范验证此方法，USP规范见于联邦食品、药品和化妆品法的第501款，<1225>药典方法的验证，见于：(2004)美国药典27版/国家处方集22版，United States PharmacopeialConvention，Inc.，马里兰州，2004年，第2622-2625页。从线性研究得到的相关系数值(r²)显示所有的分析物检定在0.75μg/mL和24μg/mL之间是线性的。从掺加研究得到的回收率显示此方法是准确的且未发现混杂偏倚(confounding bias)。通过进行此研究的每一场合产生小于3％RSD的精确结果证明了方法的精确性。通过在三个不同的场合产生RSD≤15％和总的RSD≤20％显示了此方法的准确性/可重复性。

用于量化初期时间点的创伤内产生的少量胶原的方法必须是灵敏的。目前的方法使用正常的、完整的猪皮肤进行验证。一旦验证，该方法用于量化猪的肉芽组织内的胶原水平以确保此组织内的胶原量化将会落入为此方法提出的线性范围内。目前的方法被证明在至少0.75μg/mL和24μg/mL的范围内是灵敏的、准确的且精确的。此方法允许测量正常的猪皮肤(～241μg/mg的鲜重)和猪的、长肉芽的9天之久的创伤(～57μg/mg)内存在的胶原量。

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根据本发明的公开内容，可以制得和实施此处公开的并要求保护的所有的组合物和方法，而无需过度的试验。虽然已就优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是各种变化可以适用于此处描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤顺序而并不偏离本发明的概念、主旨和范围，这对本领域的技术人员来说是明显的。更具体地说，化学上和生理学上都相关的某些试剂可以替代此处描述的试剂，而同时仍获得了相同的或类似的结果，这将是明显的。对本领域的技术人员来说明显的所有这样类似的替代物和修改注定要落入本发明的由所附权利要求界定的主旨、范围和概念中。

参考文献

在一定程度上，下面的参考文献提供了示例性的过程或对此处提出的那些进行补充的其他细节，这些参考文献在此以引用方式并入。

G.S.Schultz等人的Extracellular matrix：review of its roles in acute andchronic wounds(细胞外基质：其在急性和慢性创伤中的作用的综述)，WorldWide Wounds，(August 2005)http://www.worldwidewounds.com2005/august/Schultz/Extrace-Matric-Acute-Chronic-Wounds.html.

Inoue等人，J.of Chromatography B，724：221-230(1999)。

H.Stegemann和K.Stalder，Clinica Chemical Acta，18：267-273(1967)；B.R.Switzer和G.K.Summer，Analytical Biochemistry39：487-491(1971)。

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C.T.Hess和R.S.Kirsner，Advances in Skin & Wound Care，16，5：246-257(2003)。

美国专利第5,162,506号

美国专利第4,597,762号

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联邦食品、药品和化妆品法的第501款，<1225>药典方法的验证，见于：(2004)美国药典27版/国家处方集22版，United States PharmacopeialConvention，Inc.，马里兰州，2004年，第2622-2625页。

T.M.Devin，Proteins I：Composition and Structure(蛋白质I：组成和结构)，见于：T.M.Devlin(编辑)Textbook of Biochemistry with ClinicalCorrelations(与临床相关的生物化学的教科书)，John Wiley & Sons，Inc.，新泽西州，2006，第101页。

Claims (17)

1.一种评估创伤愈合进展的方法，其包括：

(a)从受治疗者的创伤部位获得组织样品；

(b)处理所述组织样品；

(c)通过高压液相色谱法在处理过的组织样品中分离出甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸以获得分析物的峰面积；

(d)确定所述组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度；

(e)使所述组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度与所述组织内的总胶原量相关联；以及

(f)将所述创伤部位处的所述组织内的所述总胶原量与无创伤组织内的胶原量进行比较以评估创伤愈合的进展。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述组织是皮肤。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述组织是长肉芽的。

4.如权利要求1所述的方法，其中重复步骤(a)-(f)至少一次，且所述组织样品是从同一个受治疗者的同一处创伤部位获得的来用于每一次重复。

5.如权利要求4所述的方法，其中在约3天和约2年之间的时间段内，重复所述步骤(a)-(f)至少一次。

6.如权利要求4所述的方法，其还包括将第一次重复时所述组织内的总胶原量与随后的一次或多次重复时所述组织内的总胶原量进行比较。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述受治疗者是哺乳动物。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。

9.如权利要求1所述的方法，其中处理包括下述步骤：

(a)从所述组织样品去除脂肪；

(b)使所述组织样品脱水；

(c)将所述样品水解成氨基酸；以及

(d)对所述样品进行衍生化。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述高压液相色谱法是在C18柱上进行的。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述C18柱具有约1到约12的pH范围。

12.如权利要求1所述的方法，其中在所述高压液相色谱法的过程中，用光电二极管阵列检测器，以436nm测量甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的洗脱。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述高压液相色谱法是反相高压液相色谱法。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述高压液相色谱法具有的流动相是70％的25mM的磷酸钾，pH 11.0的缓冲液和30％的乙腈。

15.如权利要求1所述的方法，其中确定所述组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度包括：

(a)获得具有已知浓度的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的样品；

(b)通过高压液相色谱法在所述样品中分离出甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸；

(c)以图的x-轴表示甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的已知浓度，以图的y-轴表示分析物的峰面积来进行绘制以设计线性标准曲线；以及

(d)利用公式计算所述处理过的组织样品中的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的每一个的浓度：

其中b是y-轴截距，而m是线性标准曲线的斜率；以及

(e)利用公式计算所述组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的每一个的浓度：

16.如权利要求1所述的方法，其中使所述组织内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的浓度与所述组织内的总胶原量相关联，包括利用公式：

其中C是胶原内的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的除以100后的百分组成的和。

17.如权利要求16所述的方法，其中C等于0.55。

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