CN109576221B - 一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法 - Google Patents

一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。该方法首先体外将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，再刺激中心粒细胞产生微囊泡。本发明制备中性粒细胞微囊泡的方法突破了体内提取中性粒细胞的局限，为体外细胞制备，不涉及动物实验，保护了动物的生命，且制备方法简单易行，为进一步中性粒微囊泡的研究奠定了基础；本发明获得的中性粒微囊泡可进行后续的WB，流式细胞分析，动物实验等科学研究，为进一步研究中性粒细胞微囊泡的功能提供了便利，具有很好的应用前景。

Description

一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。
背景技术
中性粒细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分，也是最先到炎症区域发挥免疫防御作用的效应细胞之一。成熟血液中的中性粒细胞在体外寿命短，而且无法进行转染，这些特性使得对中性粒细胞功能机制的研究进程非常缓慢，因此，建立一种体外中性粒细胞模型，可以为中性粒细胞功能的分子机制研究奠定基础。
另外，微囊泡是指来源于原核和真核生物的细胞膜的微囊泡，含有核酸、蛋白质及小的代谢分子。微囊泡通过和靶点的细胞的相互作用发挥重要的生理和病理功能。微囊泡可做为疾病的生物标志物，中性粒细胞的微囊泡具备抗菌的作用。
因此，开发一种高效简易的制备中性粒细胞微囊泡的方法，将对中性粒微囊泡的功能研究发挥重要的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。该方法首先体外将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，之后刺激中心粒细胞产生微囊泡，制备的中性粒微囊泡可进行后续的WB、流式细胞分析、动物实验等科学研究，而且该方法为体外细胞制备，不涉及动物实验，保护了动物的生命，制备方法简单易行，应用前景好。
本发明的目的是提供一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。
本发明另一目的是提供由上述方法制备得到的中性粒细胞微囊泡。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，该方法首先将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，之后刺激中心粒细胞产生微囊泡，并对微囊泡进行浓缩及离心收集。
优选地，将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞所使用的诱导剂为二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜(DMSO)或视黄酸( RA)。
优选地，刺激中心粒细胞产生微囊泡所使用的试剂为丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）。
优选地，所述人类白血病细胞为人类白血病细胞HL-60。
更优选地，所述体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
S1. 体外诱导制备中性粒细胞：利用二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞；
S2. 制备微囊泡：利用丙二醇甲醚醋酸酯刺激中心粒细胞产生微囊泡；
S3. 微囊泡的分离：对微囊泡进行浓缩收集。
其中，优选地，步骤S1中所述二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸的浓度为0.4%～0.6%。
更优选地，步骤S1中所述二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸的浓度为0.5%。
优选地，步骤S1中人类白血病细胞在诱导之前先培养至对数生长期。
优选地，步骤S1中所述诱导时人类白血病细胞的初始细胞浓度为2×104 cells/mL～2×106 cells/mL。
更优选地，步骤S1中所述诱导时人类白血病细胞的初始细胞浓度为2×105cells/mL。
优选地，步骤S2中所述丙二醇甲醚醋酸酯的浓度为8 nM～12 nM。
更优选地，步骤S2中所述丙二醇甲醚醋酸酯的浓度为10 nM。
优选地，步骤S2中刺激之前中心粒细胞的浓度为106 cells/ml～108 cells/ml。
更优选地，步骤S2中刺激之前中心粒细胞的浓度为107 cells/ml。
优选地，步骤S3所述浓缩收集的方法为差速离心法。具体是将经过刺激中心粒细胞产生微囊泡的细胞液体经过离心得到富含微囊泡的上清，再将上清离心过滤浓缩，浓缩后富含微囊泡的溶液再离心去除上清，沉淀即微囊泡。其中第一步离心的条件为3000 g～5000 g，在0℃～10℃离心10～20 min（优选4000 g在4℃离心15 min），过滤浓缩的方法为通过Centriprep离心过滤管（10 kDa MW，Millipore）进行浓缩，第二步再离心的条件为150000 g～180000 g在0℃～10℃离心30～50 min（优选160000 g在4℃离心40 min）。
更进一步优选地，所述体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
（1）细胞准备：人类白血病细胞HL-60扩大培养至对数生长期；
（2）细胞诱导：利用浓度为0.4%～0.6%（优选0.5%）的二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸对对数生长期的细胞以起始2×104 cells/mL～2×106 cells/mL（优选2×105cells/mL）的浓度进行诱导，形成中性粒细胞；
（3）细胞诱导率的验证：诱导后的细胞在第六天，验证细胞诱导率（如用瑞氏染色法和流式细胞分析方法验证），进行下一步操作（优选地当诱导率大于80%时进行下一步操作）；
（4）刺激细胞产生微囊泡：利用浓度为8 nM～12 nM（优选10 nM）的丙二醇甲醚醋酸酯刺激细胞浓度为106 cells/ml～108 cells/ml（优选107 cells/mL）的中心粒细胞产生微囊泡；
（5）对微囊泡进行浓缩收集：步骤（4）的产物经过离心得到富含微囊泡的上清，再将上清离心过滤浓缩，浓缩后富含微囊泡的溶液再离心去除上清，沉淀即微囊泡。用0.9%氯化钠重悬，-80℃保存备用。
其中，优选地，步骤（1）中培养人类白血病细胞的培养基为RPMI-1640培养基。
更优选地，步骤（1）中培养人类白血病细胞的培养基中需加入25 mM HEPESGlutaMAX、10% FBS、100 units/ml的盘尼西林、100 ug/ml的链霉素、1%的丙酮酸盐。
更优选地，步骤（1）中培养人类白血病细胞的条件为37℃含有5% CO2的培养环境内扩大培养，细胞2～3天换液一次。
优选地，步骤（4）中使用RPMI 1640、25 mM HEPES GlutaMAX对中心粒细胞（诱导后的HL-60细胞）的浓度进行调整。
优选地，步骤（5）中的第一步离心的条件为3000g～5000 g在0℃～10℃离心10～20 min。
更优选地，步骤（5）中的第一步离心的条件为4000 g在4℃离心15 min。
优选地，步骤（5）中过滤浓缩的方法为通过Centriprep离心过滤管（10 kDa MW，Millipore）进行浓缩。
优选地，步骤（5）中的第二步再离心的条件为150000 g～180000 g在0℃～10℃离心30～50 min。
更优选地，步骤（5）中的第二步再离心的条件为160000 g在4℃离心40 min。
优选地，上述方法制备得到的中性粒细胞微囊泡也在本发明保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明记载的制备中性粒细胞微囊泡的方法突破了体内提取中性粒细胞的局限，为体外细胞制备，不涉及动物实验，保护了动物的生命，且制备方法简单易行，为进一步中性粒微囊泡的研究奠定了基础。
本发明获得的中性粒细胞微囊泡可进行后续的WB，流式细胞分析，动物实验等科学研究，为进一步研究中性粒细胞的微囊泡的功能提供了便利，应用前景好。
附图说明
图1为细胞的瑞氏染色图，其中A为HL-60未诱导的细胞瑞氏染色图，B为HL-60细胞诱导后的瑞氏染色图。
图2为流式细胞分析图，其中A为HL-60未诱导的细胞的流式细胞分析图，B为HL-60诱导后的细胞的流式细胞分析图。
图3为HL-60未诱导和HL-60细胞诱导后的中性粒得率柱状图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 体外制备中性粒细胞微囊泡
1、一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
（1）细胞准备：
人类白血病细胞HL-60在RPMI-1640培养基中培养，培养基中加入25 mM HEPESGlutaMAX、10% FBS、100 units/mL的盘尼西林、100 μg/mL的链霉素、1%的丙酮酸盐，放置在37℃含有5% CO2培养箱内扩大培养；取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，当细胞密度达到80%时对细胞进行换液，一般为2～3天进行换液；
（2）细胞诱导：
换液后的细胞培养至对数生长期，800 g离心5 min，用0.5%的二甲基甲酰胺对对数生长期的细胞以起始2×105/mL的浓度进行分化诱导；
（3）用瑞氏染色法和流式细胞分析方法验证诱导后的细胞诱导率：
诱导后的细胞用瑞氏染色法进行验证。诱导后的细胞在第六天，800 g离心5 min，去除上清，沉淀细胞用瑞氏染色法进行验证，即用少量PBS重悬沉淀细胞，然后取适量细胞制作细胞涂片，涂片后的细胞室温自然干燥，滴加瑞氏染液200 μL到涂片细胞上，孵育3～4min，滴加磷酸溶液8 mM KH2PO4，6 mM Na2HPO4（PH 4～8）200 μL到上述染液上，以洗耳球使得两液充分混合，孵育3～4 min，流水冲洗，冲洗时不能先倒掉染色液，可缓慢从玻片一端冲洗，以防有沉渣沉淀在标本上；室温干燥，用显微镜进行观察拍照；
诱导后的细胞用流式细胞分析方法进行验证。取大于2×105个诱导后的细胞到流式细胞分析用的管中，4℃，1000 rpm离心3 min，用抽吸器去除上清，用1 mL的磷酸溶液清洗细胞一次，重悬清洗后的细胞到100 μL的PBS中去，PBS中含有0.5%的BSA，并分别加入PEmouse l g G1和PE anti-human CD11b暗室冰上孵育30 min，在4℃，1000 rpm离心3 min，抽吸器去除上清，用1 mL PBS洗细胞两次，加入1 mL PBS重悬细胞，在FACS calibur流式细胞仪上进行分析；
（4）诱导后的HL-60细胞以RPMI 1640，25 mM HEPES GlutaMAX调整浓度为107cells/mL，以10 nM丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）刺激产生微囊泡；
（5）刺激细胞产生微囊泡的细胞通过4000 g在4℃离心15 min去除。收集离心后富含微囊泡的上清；
（6）富含微囊泡的上清通过Centriprep离心过滤管（10 kDa MW，Millipore）进行浓缩；
（7）浓缩后富含微囊泡的溶液160000 g在4℃离心40 min，去除上清，沉淀即微囊泡用0.9%氯化钠重悬-80℃保存备用。
2、实验结果
结果分别如图1～3所示。
图1为细胞的瑞氏染色图，其中A为HL-60未诱导的细胞瑞氏染色图，B为HL-60细胞诱导后的瑞氏染色图。结果表明，大部分HL-60细胞诱导成了中性粒细胞，表明该制备中性粒细胞的方法有效，为微囊泡的制备奠定了基础。
图2为流式细胞分析图，其中A为HL-60未诱导的细胞的流式细胞分析图，B为HL-60诱导后的细胞的流式细胞分析图。结果表明，诱导成的中性粒细胞占总细胞的80%以上，该所得中性粒细胞可用于微囊泡制备。
图3为HL-60未诱导和HL-60细胞诱导后的中性粒得率柱状图。结果表明，诱导成的中性粒细胞占总细胞的80%以上，该所得中性粒细胞可用于微囊泡的制备。
实施例2 体外制备中性粒细胞微囊泡
将实施例1步骤（2）中0.5%的二甲基甲酰胺改为0.4%二甲基亚砜，起始细胞浓度修改为2×106/mL；步骤（4）中丙二醇甲醚醋酸酯的浓度为8 nM，刺激之前中心粒细胞的浓度为108 cells/ml。
实施例3 体外制备中性粒细胞微囊泡
将实施例1步骤（2）中0.5%的二甲基甲酰胺改为0.6%的视黄酸，起始细胞浓度修改为2×104/mL；步骤（4）中丙二醇甲醚醋酸酯的浓度为12 nM，刺激之前中心粒细胞的浓度为106 cells/ml。
另外经过试验验证，利用上述制备的中性粒细胞微囊泡进行WB分析，结果表明该微囊泡具备中性粒细胞的标志蛋白lactofeerin乳铁蛋白和髓过氧化物酶MPO。从而证明该微囊泡可进行下一步的科学实验研究。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，其特征在于，将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，刺激中心粒细胞产生微囊泡，刺激中心粒细胞产生微囊泡所使用的试剂为丙二醇甲醚醋酸酯；
其中，将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞所使用的诱导剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸；
所述人类白血病细胞为人类白血病细胞HL-60；
具体包括以下步骤：
S1.体外诱导制备中性粒细胞：利用二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞；
S2.制备微囊泡：利用丙二醇甲醚醋酸酯刺激中心粒细胞产生微囊泡；
S3.微囊泡的分离：对微囊泡进行浓缩收集。
步骤S1中所述二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸的浓度为0.4％～0.6％。
步骤S2中所述丙二醇甲醚醋酸酯的浓度为8nM～12nM。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中所述诱导时人类白血病细胞的初始细胞浓度为2×104cells/mL～2×106cells/mL。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中刺激之前中心粒细胞的浓度为106cells/ml～108cells/ml。
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