CN110452872B - 一种制备中性粒细胞微囊泡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：将刺激剂加入至中性粒细胞培养液中，静置30～45min，紫外线辐射15～30min；加入叶酸，2～3h后离心收集中性粒细胞微囊泡；其中，离心前，始终保持溶液温度15～18℃；刺激剂为氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的混合物。本发明方法可快速刺激中性粒细胞产生大小均一的微囊泡，同时又能维持细胞的正常生长状态，防止对细胞的过度损伤。采用本发明方法，所得中性粒细胞微囊泡直径差值不超过200nm，大小均一，有完整的包膜。

Description

一种制备中性粒细胞微囊泡的方法
技术领域
本发明涉及一种制备中性粒细胞微囊泡的方法，属于生物技术领域。
背景技术
微囊泡(MV)是最早在血液系统被发现的一种细胞膜来源的囊泡结构，直径通常在100-1000nm之间(亦有学者认为其直径在20～1000nm之间)。研究发现多种细胞均可产生微囊泡，例如上皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞和肿瘤细胞等。中性粒细胞是机体抵御微生物的第一道屏障，在天然免疫系统中起着重要的作用，其释放的微囊泡含有与母细胞相似的蛋白和脂质成分，也可能含有母细胞胞浆的细胞器和其他遗传信息，因此，中性粒细胞微囊泡可能参与细胞之间的信息传递，参与炎症反应、免疫反应等。有研究显示，中性粒细胞在关节炎的治疗方面具有一定作用，除此之外，对于中性粒细胞微囊泡的研究相对较少，特别是对于微囊泡直径与其生物学功能之间的关系，尚未发现相关的研究报道。为了对微囊泡直径与其生物学功能之间的关系进行深入研究，研究者首先需要解决的问题是如何获得直径大小均一的中性粒细胞微囊泡。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种制备中性粒细胞微囊泡的方法。
本发明技术方案如下：
一种制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
S1：将刺激剂加入至中性粒细胞培养液中，静置30～45min，紫外线辐射15～30min；刺激剂的用量优选为0.5～1.0g/L中性粒细胞培养液。
S2：加入叶酸，2～3h后离心收集中性粒细胞微囊泡；
其中，离心前，始终保持溶液温度15～18℃；
所述刺激剂为氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的混合物。优选配比为1:(0.1～0.2):(20～28):(0.1～0.2)；
优选的，步骤S2中叶酸的加入量为33～38mg/L。
优选的，紫外线辐射能量为10～15mJ/cm2。
优选的，所述紫外线为UVB。
优选的，步骤S1所述中性粒细胞培养液中细胞浓度为105～107cell/mL。
优选的，步骤S2为：
加入33～38mg/L叶酸，2～3h后取细胞培养液，2000×g～3000×g、0～4℃离心3～5min，收集上清液，在上清液中加入绿原酸，6000×g～8000×g、0～4℃离心25～40min，弃上清液，得中性粒细胞微囊泡；绿原酸的加入量为12～20mg/L上清液。
优选的，所述中性粒细胞为小鼠骨髓中性粒细胞或小鼠外周血中性粒细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法能快速刺激中性粒细胞产生微囊泡，同时又能维持细胞的正常生长状态，防止对细胞的过度损伤。采用本发明方法，所得中性粒细胞微囊泡直径差值不超过200nm，大小均一，有完整的包膜，是研究微囊泡直径与其生物学功能之间关系的良好材料。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例中所述中性粒细胞培养液为将中性粒细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养所得。
实施例1
一种制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
S1：将刺激剂加入至中性粒细胞培养液(细胞浓度为105cell/mL)中，静置45min，UVB辐射(辐射能量为10mJ/cm2)30min；
S2：加入33mg/L叶酸(即每升溶液中加入33mg叶酸)，3h后取细胞培养液，2000×g、0℃离心3min，收集上清液，在上清液中加入绿原酸(每升上清液中加入12mg)，15min后，6000×g、0℃离心25min，弃上清液，得中性粒细胞微囊泡；
其中，离心前，始终保持溶液温度15～18℃；
刺激剂为氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的混合物(质量比为1:0.1:20:0.1)；
刺激剂的用量为0.5g/L中性粒细胞培养液。
所述中性粒细胞为小鼠骨髓中性粒细胞。
实施例2
一种制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
S1：将刺激剂加入至中性粒细胞培养液(细胞浓度为107cell/mL)中，静置30min，UVB辐射(辐射能量为15mJ/cm2)15min；
S2：加入38mg/L叶酸，2h后取细胞培养液，3000×g、4℃离心5min，收集上清液，在上清液中加入绿原酸(每升上清液中加入20mg)，10min后，8000×g、4℃离心40min，弃上清液，得中性粒细胞微囊泡；
其中，离心前，始终保持溶液温度15～18℃；
刺激剂为氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的混合物(氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的质量比为1:0.2:28:0.2)；
刺激剂的用量为1.0g/L中性粒细胞培养液；
所述中性粒细胞为小鼠骨髓中性粒细胞。
实施例3
实施例3与实施例1的区别是：
步骤S2为：
加入33mg/L叶酸，3h后取细胞培养液，6000×g、0℃离心25min，弃上清液，得中性粒细胞微囊泡。
实施例4
实施例4与实施例1的区别是：
所述紫外线为UVB，紫外线辐射能量为25mJ/cm2。
实施例5
实施例5与实施例1的区别是：
所述中性粒细胞为小鼠外周血中性粒细胞。
实施例6
实施例6与实施例1的区别是：
刺激剂为氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的混合物(氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的质量比为1:0.5:20:0.5)。
对比例1
一种制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：
S1：将刺激剂加入至中性粒细胞培养液(细胞浓度为105cell/mL)中，静置45min，UVB辐射(辐射能量为10mJ/cm2)50min；
S2：取细胞培养液，3000×g、4℃离心5min，收集上清液，在上清液中加入绿原酸(每升上清液中加入20mg)，30min后8000×g、4℃离心25min，弃上清液，得中性粒细胞微囊泡；
其中，离心前，始终保持溶液温度15～18℃；
刺激剂为氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的混合物(氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的质量比为1:0.1:20:0.2)；
刺激剂的用量为0.5g/L中性粒细胞培养液。
所述中性粒细胞为小鼠骨髓中性粒细胞。
对比例2
对比例2与实施例1的区别是：
原花青素替换为维生素C。
对比例3
对比例3与实施例1的区别是：
叶酸替换为绿原酸。
试验例1：
取实施例与对比例所得中性粒细胞微囊泡，PBS重悬，以2％磷钨酸溶液染色5min，用透射电镜观察中性粒细胞微囊泡形态。三次重复试验，结果见表1。
表1
Figure BDA0002186158920000041
Figure BDA0002186158920000051
结果显示：实施例所得样品，观察到大量膜性微囊结构，圆形或近圆形，其各微囊泡直径差值不超过200nm，大小均一，有完整的包膜。对比例样品，观察到大量膜性微囊结构，近圆形，各微囊泡直径差值超过200nm，大小不均一，有完整的包膜。
实施例5将小鼠骨髓中性粒细胞替换为小鼠外周血中性粒细胞，各微囊泡直径相对较大，为400～600nm，提示不同来源中性粒细胞所得微囊泡大小有所差异，但直径差值仍然不超过200nm，微囊泡大小均一。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (3)

1.一种制备中性粒细胞微囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将刺激剂加入至细胞浓度为105～107cell/mL的中性粒细胞培养液中，静置30～45min，紫外线辐射15～30min；紫外线辐射能量为10～15mJ/cm2；所述紫外线为UVB；
S2：加入叶酸，2～3h后离心收集中性粒细胞微囊泡；叶酸的加入量为33～38mg/L；
其中，离心前，始终保持溶液温度15～18℃；
所述刺激剂为氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的混合物；刺激剂中，氯化钙、叶酸、葡萄糖和原花青素的质量比为1:(0.1～0.2):(20～28):(0.1～0.2)；刺激剂的用量为0.5～1.0g/L中性粒细胞培养液。
2.根据权利要求1所述的制备中性粒细胞微囊泡的方法，其特征在于，步骤S2为：
加入33～38mg/L叶酸，2～3h后取细胞培养液，2000×g～3000×g、0～4℃离心3～5min，收集上清液，在上清液中加入绿原酸，6000×g～8000×g、0～4℃离心25～40min，弃上清液，得中性粒细胞微囊泡；绿原酸的加入量为12～20mg/L上清液。
3.根据权利要求1～2任一项所述的制备中性粒细胞微囊泡的方法，其特征在于，所述中性粒细胞为小鼠骨髓中性粒细胞或小鼠外周血中性粒细胞。
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