CN100567499C - 使用酶工程法生产辅酶q10的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是有关于一种使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，以辅酶Q0和十聚异戊二烯为原料、或者以辅酶Q1和茄尼醇为原料，其中，辅酶Q0、辅酶Q1、十聚异戊二烯进行磷酸化，茄尼醇进行溴化；在聚合酶的作用下，在40℃～60℃条件下，于反应器中进行辅酶Q10的合成反应，依次进行萃取，浓缩，结晶，干燥，得到成品。其中所述的聚合酶是通过以下步骤得到的：选择含有辅酶Q10的红假单胞光合菌，进行培养；破碎菌体细胞，用3%的盐水沉淀；分离沉淀物得到聚合酶。本发明的具有专一性，提高了反应效率，提高了产品质量。酶工程法生产的辅酶Q10，其侧链中不存在顺式结构的异戊二烯，产品的生物活性与微生物发酵法生产的产品相同，而生产成本大大降低。

Description

使用酶工程法生产辅酶Q10的方法

技术领域

本发明涉及一种生产辅酶Q10的方法，特别是涉及一种使用酶工程法生产辅酶Q10的方法。

背景技术

辅酶Q10又名泛醌10，是我国收录在药典中的一种非处方药物。辅酶Q10是一种脂溶性醌，在室温下呈橙黄色结晶物，其熔点是48℃，它无臭无味，其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链——聚异戊二烯基的聚合度为10而得名，是一种醌环类化合物。辅酶Q10的生理功能作用主要来自于醌基的氧化还原特性和类异戊二烯侧链的物理特性，其在人体内主要有两个作用，一是有明显的抗脂质过氧化作用；二是营养物质在线粒体内转化为能量的过程中起重要的作用。其醌环在氧化呼吸链中起传递电子和质子的作用，这种作用不仅是所有生命形式必不可少的，而且还是形成ATP的关键。它是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢激活剂，具有保护和恢复生物膜结构的完整性、稳定膜电位作用，是机体的非特异性免疫增强剂。目前临床应用于心脏病、肝炎等疾病的辅助治疗。

辅酶Q10的制备方法有三种：动植物组织提取法、微生物发酵法和化学合成法(包括半合成法，全合成法)。辅酶Q10广泛存在于动植物组织以及微生物菌体中，某些微生物菌体中辅酶Q10含量较高，动植物组织中含量低。动物组织提取法由于技术、成本和原料来源等问题现已基本被淘汰。

辅酶Q10化学合成法(包括半合成法，全合成法)合成条件苛刻，步骤繁多；另外，化学合成的辅酶Q10的异戊二烯侧链中有大量顺式结构，生物活性不好，且副产物含量多，提纯成本高。

利用微生物发酵生产辅酶Q10有几个基本优点：(1)发酵产物为天然品，生物活性好，易被人体吸收；(2)没有原材料的制约，可通过规模放大提高生产能力。但因其含量有限，效率较低，生产成本高而使工业化受到一定限制。

目前世界市场中微生物发酵法生产的辅酶Q10的产量最大。

从理论上讲，能够使用微生物发酵法生产的药物，都可以用酶工程的方法生产。因为发酵法中微生物在其内部合成(或分解)某种药物时，其合成(或分解)过程就是使用一种或多种特定的酶来完成的。

但是，使用酶工程法生产辅酶Q10国内外均未见到相关报道。

由此可见，上述现有的生产辅酶Q10的方法在方法上，显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。为了解决生产辅酶Q10的方法存在的问题，相关厂商莫不费尽心思来谋求解决之道，但长久以来一直未见适用的设计被发展完成，而一般方法又没有适切的途径能够解决上述问题。

有鉴于上述现有的生产辅酶Q10的方法存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，能够改进一般现有的生产辅酶Q10的方法，使其更具有实用性。经过不断的研究、设计，并经反复试作及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有的生产辅酶Q10的方法存在的缺陷，而提供一种新的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，所要解决的技术问题是使其在聚合酶的存在下，以辅酶Q0和十聚异戊二烯为原料、或者以辅酶Q1和茄尼醇为原料，合成为辅酶Q10，从而更加适于实用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其是在聚合酶的作用下，以辅酶Q0和十聚异戊二烯为原料、或者以辅酶Q1和茄尼醇为原料合成辅酶Q10，其包括以下步骤：1)将辅酶Q0或辅酶Q1进行磷酸化；2)将十聚异戊二烯磷酸化或茄尼醇进行溴化；3)制备聚合酶，所述聚合酶是通过以下步骤得到的：选择含有辅酶Q10的红假单胞光合菌，进行培养；破碎菌体细胞，用3％的盐水静置，取上清，加入硫酸铵溶液，水浴加热，离心；弃上清并加入硫酸缓冲液透析；加入100mL  琼脂糖凝胶4B(Sepharos4B)搅拌，用磷酸缓冲液分三次清洗；加氢氧化钠溶液调pH值后解离，过滤后的液体冻干，得聚合酶；4)在40℃～60℃的条件下，按照各合成物质的分子量的比例加入反应器皿中，并按照最后合成物重量的0.01％加入制备的聚合酶，搅拌10-30分钟；5)加入正己烷搅拌萃取；6)取正己烷层浓缩结晶；7)结晶物冷冻干燥得成品。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

前述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其中所述的辅酶Q0或辅酶Q1进行磷酸化步骤是：在30℃的条件下，将辅酶Q0或者辅酶Q1溶解在磷酸缓冲液中，按照辅酶Q0重量的5％加入磷酸脂，搅拌30分钟。

前述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其中所述的十聚异戊二烯磷酸化的步骤是：在25℃的条件下，将聚十异戊二烯溶解在磷酸缓冲液中，按照聚十异戊二烯重量的0.01％加入三磷酸腺苷，搅拌120分钟。

前述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其中所述的茄尼醇的溴化步骤是：

在5℃的条件下，将茄尼醇溶解在乙醚中，按照茄尼醇重量的0.01％加入三氯化磷，搅拌150分钟。

前述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其中所述的磷酸化步骤中使用的磷酸缓冲液的pH值是7.4。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术方案可知，为了达到前述发明目的，本发明的主要技术内容如下：

本发明使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，包括如下步骤：

1)将辅酶Q0或辅酶Q1磷酸化；

2)十聚异戊二烯磷酸化或茄尼醇溴化；

3)制备聚合酶；

4)在40℃～60℃的条件下，按照各合成物质的分子量的比例加入反应器皿中，并按照最后合成物重量的0.01％加入制备的聚合酶，搅拌10-30分钟；

5)加入正己烷搅拌萃取；

6)取正己烷层浓缩结晶；

7)结晶物冷冻干燥得成品。

上述聚合酶的制备方法：选辅酶Q10含量高的光合菌或红极毛杆菌进行高密度培养，离心培养液，菌体细胞破碎，分离聚合酶，冷冻干燥后待用。

借由上述技术方案，使本发明使用酶工程法生产辅酶Q10的方法具有明显的技术进步性，本发明至少具有下列优点：

本发明方法通过聚合酶的对于合成物质的专一性，大大提高了合成效率，提高了产品质量。酶工程法生产的辅酶Q10，其侧链中不存在顺式结构的异戊二烯，产品的生物活性与微生物发酵法生产的产品相同，而生产成本大大降低。

综上所述，本发明特殊的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类制备方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，并产生了好用及实用的效果，且较现有的生产辅酶Q10的方法具有增进效果，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例详细说明如下。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法其具体实施方式、步骤、特征及其功效，详细说明如后。

聚合酶的制备例

用红假单胞光合菌制备聚合酶。

1)选种：显微镜下选红假单胞光合菌。菌体形态为短杆状或卵园形，宽为0.5-0.9微米，长1.2-2.0微米，无芽孢，无荚膜，单极鞭毛，可运动的健康菌种。

2)配制发酵液：5.5g磷酸二氢钠，1.5gDL苹果酸，2g乙酸钠，2g氢氧化钠，1g氯化铵，0.25g氯化镁，0.05g氯化钙，3.5g葡萄糖溶于1升蒸馏水，搅拌均匀，测定pH应于6.5至7.0之间。

3)取250mL的三角瓶10只，每只灭菌后注入100mL培养液，接种后密封。放置在32℃的光照培养箱中培养72小时，取出。

4)收集培养液，用每分钟6000转的离心机离心20分钟。离心后的菌体用超声波细菌破碎机破碎。加入3％的盐水200mL静置1小时。取上清，加入500mL的50％硫酸铵，40℃水浴1.5小时。用冷冻离心机在4℃、12000转条件下离心20分钟。弃上清，加入300mL硫酸缓冲液透析。加入100mLSepharos 4B搅拌，用200mL磷酸缓冲液分三次清洗。加2N氢氧化钠调pH值为8.5，解离。过滤后的液体用冷冻干燥机冻干，得80mg聚合酶。

实施例1

使用辅酶Q1和茄尼醇为原料，在聚合酶的作用下合成辅酶Q10。

1)辅酶Q1磷酸化。在30℃的条件下，将250g辅酶Q1溶解在1.5L磷酸缓冲液(pH＝7.4)中，按照辅酶Q1重量的5％加入12.5g磷酸脂，搅拌30分钟；

2)茄尼醇的溴化。在5℃的条件下，将631g茄尼醇溶解在3L乙醚中，按照茄尼醇重量的0.01％加入63mg三氯化磷，搅拌150分钟；

3)按照上述的聚合酶的制备例的方法，制备聚合酶待用；

4)在40℃-60℃的条件下，将制备好的辅酶Q1和茄尼醇加入反应器皿中，加入86mg制备的聚合酶，搅拌10-30分钟；

5)加入4.5L正己烷，在30℃条件下搅拌萃取60分钟。静止后取正己烷层。

6)正己烷液体在35℃、200Pa的真空度条件下浓缩。

7)浓缩物加入1.5L乙醇搅拌溶解，在4℃条件下逐步结晶。

8)结晶体在冷冻干燥机中干燥为865g成品。

经检测，产品中辅酶Q10含量大于98％，重金属小于20ppm，水分小于0.1％，符合中国药典关于辅酶Q10的标准。符合美国USP28标准。

实施例2

使用辅酶Q0和聚十异戊二烯为原料，在聚合酶的作用下合成辅酶Q10。

1)辅酶Q0磷酸化。在30℃的条件下，将172g辅酶Q0溶解在1.2L磷酸缓冲液中，按照辅酶Q0重量的5％加入8.6g磷酸脂，搅拌30分钟；

2)聚十异戊二烯的磷酸化。在25℃的条件下，将709g聚十异戊二烯溶解在3.3L磷酸缓冲液中，按照聚十异戊二烯重量的0.01％加入三磷酸腺苷，搅拌120分钟；

3)按照上述的聚合酶的制备例的方法，制备聚合酶待用；

4)在40℃-60℃的条件下，将制备好的辅酶Q0和聚十异戊二烯加入反应器皿中，加入86mg聚合酶，搅拌10-30分钟；

5)加入4.5L正己烷，在30℃条件下搅拌萃取60分钟。静止后取正己烷层。

6)正己烷液体在35℃、200Pa的真空度条件下浓缩。

7)浓缩物加入1.5L乙醇搅拌溶解，在4℃条件下逐步结晶。

8)结晶体在冷冻干燥机中干燥为860g成品。

经检测，产品中辅酶Q10含量大于98％，重金属小于20ppm，水分小于0.1％，符合中国药典关于辅酶Q10的标准。符合美国USP28标准。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1、一种使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其是在聚合酶的作用下，以辅酶Q0和十聚异戊二烯为原料、或者以辅酶Q1和茄尼醇为原料合成辅酶Q10，其特征在于其包括以下步骤：

1)将辅酶Q0或辅酶Q1进行磷酸化；

2)将十聚异戊二烯磷酸化或茄尼醇进行溴化；

3)制备聚合酶，所述聚合酶是通过以下步骤得到的：

选择含有辅酶Q10的红假单胞光合菌，进行培养；

破碎菌体细胞，用3％的盐水静置，取上清，加入硫酸铵溶液，水浴加热，离心；

弃上清并加入硫酸缓冲液透析；

加入100mL  琼脂糖凝胶4B搅拌，用磷酸缓冲液分三次清洗；

加氢氧化钠溶液调pH值后解离，过滤后的液体冻干，得聚合酶；

4)在40℃～60℃的条件下，按照各合成物质的分子量的比例加入反应器皿中，并按照最后合成物重量的0.01％加入制备的聚合酶，搅拌10-30分钟；

5)加入正己烷搅拌萃取；

6)取正己烷层浓缩结晶；

7)结晶物冷冻干燥得成品。

2、根据权利要求1所述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其特征在于其中所述的辅酶Q0或辅酶Q1进行磷酸化步骤是：

在30℃的条件下，将辅酶Q0或者辅酶Q1溶解在磷酸缓冲液中，按照辅酶重量的5％加入磷酸脂，搅拌30分钟。

3、根据权利要求1所述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其特征在于其中所述的十聚异戊二烯磷酸化的步骤是：

在25℃的条件下，将聚十异戊二烯溶解在磷酸缓冲液中，按照聚十异戊二烯重量的0.01％加入三磷酸腺苷，搅拌120分钟。

4、根据权利要求1所述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其特征在于其中所述的茄尼醇的溴化步骤是：

在5℃的条件下，将茄尼醇溶解在乙醚中，按照茄尼醇重量的0.01％加入三氯化磷，搅拌150分钟。

5、根据权利要求2或3所述的使用酶工程法生产辅酶Q10的方法，其特征在于其中所述的磷酸化步骤中使用的磷酸缓冲液的pH值是7.4。