DE3720736C2

DE3720736C2 -

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Publication number: DE3720736C2
Application number: DE19873720736
Authority: DE
Inventors: Erwin Dr. 8000 Muenchen De Schleicher
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-06-23
Filing date: 1987-06-23
Publication date: 1990-04-19
Also published as: DE3720736A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur Bestimmung von glycosylierten Proteinen.

Seit der Einführung des Insulins sind die akuten Komplika tionen, an denen die Diabetiker in der Vorinsulinaera star ben, seltener geworden. Bei den heutigen Therapiemöglich keiten wird die Lebenserwartung des Diabetikers vor allem durch die begleitenden Spätschäden bestimmt. Obwohl die Pathogenese der Spätschäden (Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie und Atherosklerose) nicht im einzelnen aufge klärt ist, zeigen epidemiologische Studien, daß schlechte Stoffwechseleinstellung frühzeitiger und vermehrt zu Spät komplikationen führt als gute Stoffwechselführung. Aus die sem Grunde ist es wichtig, einen Parameter zu haben, mit dessen Hilfe man den mittleren Blutzuckerspiegel von dia betischen Patienten beurteilen kann. Die meisten der be stehenden Methoden verwenden die direkte Glucosebestimmung im Blut oder im Urin. Allerdings schwankt der Blutzucker spiegel sehr stark im Tagesverlauf und hängt zudem u. a. von der Ernährung und der körperlichen Tätigkeit der dia betischen Patienten ab. Ebenso unterliegt die Harnglucose einer Reihe von Einflüssen, die unabhängig von der Stoff wechseleinstellung des Diabetikers sind.

Vor ca. 10 Jahren wurde entdeckt, daß Glucose an das Hämo globin im Blut in Abhängigkeit vom Blutglucosespiegel irre versibel gebunden wird. Die Bestimmung des entstehenden nichtenzymatisch glycosylierten Hämoglobins erlaubt nun eine Beurteilung des Blutzuckerspiegels der letzten drei Monate. Entsprechend dem Hämoglobin werden auch die anderen Serumproteine in Abhängigkeit vom Blutglucosespiegel nicht enzymatisch glycosyliert (zur Chemie vergleiche Schema 1). Albumin, mit einer Halbwertzeit von 20 Tagen macht den Hauptanteil an glycosylierten Plasmaproteinen aus. Die Bestimmung von glycosylierten Plasmaproteinen eignet sich deshalb zur Beurteilung der Stoffwechselführung über einen mittelfristigen Zeitraum von etwa 3 Wochen. Da mehrfach gezeigt wurde, daß zwischen glycosyliertem Albumin und gly cosyliertem Serumprotein eine sehr enge Beziehung besteht, kann die Isolierung des Albumins aus Serum unterbleiben.

Zur Bestimmung von glycosylierten Serumproteinen wurden mehrere Testprinzipien beschrieben:

1. Die Bestimmung mit Hilfe des durch schwachsaure Hydrolyse entstehenden Hydroxymethylfurfurals, das durch die Thio barbitursäureaktion gemessen wird, ist sehr störan fällig und zeitaufwendig (Dolhofer R. und Wieland O. H. Clin.Chim.Acta (1981) 112, 197-204) (DE-OS-33 23 837 A1).
2. Die Bestimmung mit Hilfe der Affinitätschromatographie an Borsäuregelen ist nur für das glycosylierte Hämoglobin quantitativ, nicht aber für die glycosylierten Serumpro teine (nur ein geringer Anteil des glycosylierten Al bumins wird retiniert) (Brownlee M. et al. Diabetes (1980) 29 1044-1047), (Gould et al. Ann.Clin.Biochem. (1984) 21, 16-21) (EP-A-64 551).
3. Bestimmung mit Hilfe eines Redoxindikators im alkalischen Milieu (Fruktosamin-Test) (Johnson et al. Clin.Chim.Acta (1982) 127, 87-95) (00 85 263 A1).
Diese einfache und billige Bestimmung erfaßt als Re duktionsmethode auch unspezifisch andere Serumbestand teile, deren Menge von Probe zu Probe variieren kann.
4. Bestimmung des durch stark saure Hydrolyse von Serumpro teinen entstehenden Furosins mittels Hochdruckflüssig chromatographie (HPLC) (Schleicher E. und Wieland O. H. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1981) 19, 81-87).
Für die Durchführung dieser präzisen und richtigen Methode ist man auf eine teure Hochdruckflüssigchromato graphie-Anlage angewiesen. Außerdem ist die Probenvorbe reitung zeitaufwendig.

Wie aus den vorhergehenden Ausführungen zu entnehmen ist, gibt es für die Bestimmung von nichtenzymatisch glycosyl ierten Proteinen nur eine Methode, die nicht durch inter ferierende, störende Faktoren beeinflußt wird. Allerdings ist diese Methode mit hohen Investitionen (HPLC-Anlage) verbunden und nicht einfach durchzuführen.

Es ist bekannt, daß substituierte Arylboronsäuren in wäßri ger alkalischer Lösung mit nichtenzymatisch glycosylierten Proteinen Boronsäureester bilden. Um die Menge des Boronsäu reesters zu bestimmen, wurde bisher Phenylboronsäure an einem Träger kovalent gebunden (Affinitätschromatographie). Nach spezifischer Bindung von nichtenzymatisch glycosylier ten Proteinen aus einem Gemisch wurde der Träger gewaschen und die gebundenen Proteine eluiert und quantifiziert. Diese Methode ist sehr teuer, zeitaufwendig und nicht automatisier bar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes, automatisierbares Verfahren sowie ein entsprechendes Mittel zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren bzw. das im Anspruch 8 gekenn zeichnete Mittel gelöst.

Zur direkten Bestimmung der Boronsäureester in wäßriger alkalischer Lösung setzt man erfindungsgemäß fluorophore oder chromophore Arylboronsäuren ein. Als Chromophor eignen sich vor allem substituierte Phenylboronsäuren, die ein Absorptionsmaximum im langwelligen Bereich (500-600 nm) aufweisen, so daß die Eigenabsorption von Blutplasma oder -serum nicht interferiert. Fluorophorhaltige Arylboronsäuren wie die kommerziell erhältliche Dansylphenylboronsäure sind für die direkte Bestimmung der Boronsäureester im Blutserum oder -plasma nicht geeignet, da diese Körperflüssigkeiten variable, fluoreszenzlöschende Bestandteile enthalten. Aus diesem Grunde werden zur empfindlichen Bestimmung von Serum bestandteilen fluoreszeinmarkierte Substrate verwendet, da mit diesen Konzentrationsbestimmungen über die Änderung der Fluoreszenzpolarisation durchgeführt werden können. Die kommerziell erhältlichen Geräte verwenden das Fluoreszenz spektrum des Fluoreszeins, so daß die jeweiligen markierten Substrate für die Messung in diesen Geräten mit Fluoreszein markiert sein müssen.

Solche fluoro- oder chromophoren Arylboronsäuren können in an sich bekannter Weise erhalten werden.

Verschiedene Synthesewege sind anschließend beschrieben. Gibt man solche im langwelligen Bereich absorbierenden substituierte Arylboronsäuren im Überschuß zu wäßrigen alkalischen Proteinlösungen, so entstehen bei Raumtemperatur innerhalb von Minuten mit den Fruktosylamingruppen der Pro teine die Boronsäureester. Da die Esterbildung zur Absorp tionsabnahme des langwelligen UV-Maximums führt (Abb. 1), läßt sich die Menge der nichtenzymatisch glykosylierten Proteine über einen Standard, der genauso gemessen wurde, berechnen.

Bei sehr geringem Gehalt an Fruktosylamingruppen empfiehlt es sich die ungebundenen, überschüssigen Boronsäuren ab zutrennen z. B. durch Absorption an Aktivkohle oder andere bekannte Maßnahmen zur Trennung von nieder- und hochmoleku laren Substanzen wie Gelfiltration oder Filtration durch Nitrocellulosefilter. Die optische Dichte der verbleibenden Lösung ist der in dieser Lösung vorhandenen nichtenzymatisch glycosylierten Proteine proportional und kann ebenfalls über einen bekannten Standard berechnet werden. Die Darstellung und Kalibrierung eines nichtenzymatisch glykosylierten Pro teinstandards ist als Beispiel 10 beschrieben.

Vorteile des Meßverfahrens

Die einfache Handhabung erlaubt sowohl eine manuelle als auch eine automatisierte Testdurchführung. Da für die Aus führung außer einem UV-VIS Photometer oder einem Gerät zur Messung der Fluoreszenzpolarisation kein spezielles Gerät erforderlich ist, kann die Methode allgemein angewendet werden. Die auch bei Raumtemperatur rasche Boronsäureester bildung (meist innerhalb einer Minute abgelaufen) führt zu hohen Analysenzahlen pro Tag. Durch die Verwendung eines Standards, der

1. die Fruktosylaminbindung an Lysin enthält und
2. als Matrix eine Proteinstruktur enthält kann der Test absolut kalibriert werden.

Durch eine parallel ausgeführte Proteinbestimmung läßt sich der Meßwert auf die Proteinmenge beziehen.

Die erfindungsgemäßen Arylboronsäuren, die im voranstehend beschriebenen Verfahren eingesetzt werden können, lassen sich mittels verschiedener, prinzipiell bekannter Verfahren herstellen. So läßt sich z. B. durch Kupplung von 3-Diazo- Phenylboronsäure-chlorid mit substituierten aromatischen Phenolen oder Aminen als Kupplungskomponente eine Vielzahl von substituierten Phenylboronsäuren herstellen:

Zur Herstellung wird m-Amino-phenylboronsäure in stark salz saurer Lösung bei 0°C mit äquimolaren NaNO₂ diazotiert. Nach Beendigung der Reaktion wird das gelöste Diazoniumsalz lang sam zu einer alkalischen Lösung getropft, die eine äqu imolare Menge des aromatischen Phenols bzw. Amins enthält. Dabei soll die Temperatur zwischen 5 und 10°C und der pH-Wert über 10 z. B. 10 bis 12, gehalten werden.

Zur Isolierung wird aus saurer Lösung in eine organische Phase extrahiert und das Produkt chromatographisch gerei nigt. Entsprechend läßt sich durch Kupplung von substituier ten Aryldiazoniumsalzen mit m-Aminophenylboronsäure eine Vielfalt von unterschiedlich absorbierenden Boronsäurederi vaten darstellen:

Zur Darstellung wird das substituierte Diazoniumsalz in Gegenwart einer äquimolaren Menge vom m-Aminophenylboronsäu re in Wasser gelöst und bei ca. 20°C gerührt. In vielen Fällen erweist sich eine in situ Herstellung des Diazonium salzes als Vorteil. Die substituierte Arylboronsäure kann durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel gereinigt werden.

Eine andere Möglichkeit zur Darstellung von z. B. substitu ierten Phenylboronsäuren ist die Reaktion von m-Aminophenyl boronsäure mit Carbonylverbindungen (z. B. Isothiocyanaten):

Zur Synthese wird m-Aminophenylboronsäure in alkalischer Na₂CO₃-Lösung gelöst, eine äquimolare Menge Fluoreszeinderi vat zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt kann über präparative Dünnschichtchromatographie gereinigt werden.

Entsprechend der Bildung der nichtenzymatisch glycosylierten Proteine in vivo (Schema 1) lassen sich definiert glycosy lierte lysinhaltige Polyaminosäuren synthetischer oder na türlicher Herkunft (Proteine) darstellen, die zur Kali brierung geeignet sind. Dazu inkubiert man in wäßrigen Pufferlösungen (pH 5 bis 11, insbesondere 7 bis 9) die Polyaminosäu re mit D-Glucose bei ca. 37°C 1 bis 5 Tage. Die Reaktion läuft aber sogar bei eingefrorenen Proben, wenn auch sehr langsam ab und kann bis ca. 55°C durchgeführt werden. Sowohl pH- als auch Temperaturerhöhung beschleunigen die Reaktionsgeschwin digkeit. Zur Beendigung der Reaktion wird gegen den glei chen, aber glucosefreien Puffer dialysiert und die Menge an glycosylierter Polyaminosäure bestimmt.

Folgende Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind möglich:

1. Direkte Bestimmung der spezifisch gebundenen Arylboron säure ohne Trennung der überschüssigen freien Arylboron säure.
- a) Zugabe von z. B. substituierter Phenylboronsäure zu einer alkalischen Lösung von nichtenzymatisch glyco sylierten Proteinen führt zur Borsäureesterbildung, die mit einer Änderung des UV-VIS-Absorptionsspektrums der Phenylboronsäure begleitet ist. Da die Abnahme der Absorption im sichtbaren Bereich dem Glycosylierungs grad der Serumproteine proportional ist, läßt sich die Spektrumsänderung zur Bestimmung der glycosylierten Serumproteine direkt verwenden.
- b) Versetzt man z. B. fluoreszeinsubstituierte Phenylbo ronsäuren mit alkalischer Lösung von glycosylierten Serumproteinen, so führt die Borsäureesterbildung zu einer Änderung der Fluoreszenzpolarisation, deren Ausmaß vom Glycosylierungsgrad der Serumproteine ab hängig ist.
2. Bestimmung der spezifisch gebundenen Arylboronsäure mit Trennung der überschüssigen freien Arylboronsäure.
- a) Nach Boronsäureesterbildung im alkalischen Milieu wird die überschüssige freie Arylboronsäure schnell abge trennt (z. B. durch Aktivkohle). Die in wäßriger Lösung verbleibende, dem Glycosylierungsgrad der Se rumproteine proportionale, proteingebundene Arylboron säure kann photometrisch bestimmt werden. Selbstver ständlich kann auch umgekehrt die spezifisch gebundene Arylboronsäure z. B. durch Fällung abgetrennt und dann bestimmt werden.
- b) Für die halbquantitative Bestimmung eignet sich die Abtrennung der freien Arylboronsäuren durch eine proteinabsorbierende Filterschicht (z. B. Nitrocellu lose). Die dem Glycosylierunggrad des Proteins propor tionale, proteingebundene, farbige oder fluoreszieren de Arylboronsäure wird am Filter gebunden. Die Inten sität der Farbe oder der Fluoreszenz kann mit der von bekannten Standardproben verglichen werden. Entsprechend kann das Filter auch über eine wasserab sorbierende Schicht aufgezogen werden, so daß die freien Arylboronsäuren in die unter dem Filter liegen de Schicht wandern (Teststreifen).
3. Spezifische Blindwertbildung durch Arylboronsäureester. Zugabe von Borsäure oder substituierten Arylboronsäuren zu alkalischen Lösungen von nichtenzymatisch glycosy lierten Proteinen führt zur Borsäureesterbildung. Die so veresterten OH-Gruppen des Fruktosylaminrestes stehen nicht mehr zur Endiolbildung zur Verfügung und zeigen daher keine Reduktionseigenschaften mehr.

Zur Blindwertbildung eignet sich prinzipiell eine Reihe von Substanzen:

1. Borsäure bzw. Arylboronsäuren, die mit glycosylierten Proteinen Borsäureester bilden, aber in der Indikator reaktion nicht erfaßt werden.
- a) Reduktionstest (Testprinzip 3)
  Boronsäure bzw. Phenylboronsäure bilden mit nichtenzy matisch glycosylierten Proteinen im alkalischen Milieu Boronsäureester. Da nun keine Enolisierung des cis- Diols und damit keine Reduktion des Redoxindicators möglich ist, zeigen glycosylierte Proteine in Gegen wart von Bor- bzw. Phenylboronsäuren keine oder ernie drigte Reduktionseigenschaften. Die verbleibende Re duktionsaktivität, die unter diesen Meßbedingungen nachweisbar ist, ist unspezifischer Natur und kann vom Gesamtwert abgezogen werden. Die Differenz stellt ein Maß für die Glycosylierung dar.
- b) die als Blindwert verwendete Boronsäure absorbiert nicht im UV-Vis-Bereich, bei dem gemessen wird (z. B. 500 bis 600 nm). Ein ca. 100facher Überschuß dieser Boron säure verdrängt die chromophorhaltige Boronsäure spe zifisch aus der Bindung.
2. Zugabe eines Überschusses an cis-diolhaltigen Verbin dungen, die Arylboronsäuren binden, z. B. Fruktose, Sor bit, Diäthanolamin.

Zur Standardisierung der beschriebenen Testverfahren kann humanes Serum Albumin (Behringwerke, Marburg, GFR) mit bekanntem Glycosylierungsgrad verwendet werden, aber auch z. B. Rinderserumalbumin und andere tierische Serumalbumine. Alternativ können lysinhaltige polymere Aminosäuren, die in vitro glycosyliert wurden, zur Standardisierung verwendet werden. Diese polymeren, in vitro glycosylierten Aminosäuren sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Bestimmung des Glycosylierungsgrades des Standards kann mittels der Furo sinmethode oder mit radioaktiv markierter Glucose erfolgen.

Als Untersuchungsmaterial sollte vorzugsweise Serum verwen det werden. Bei der Verwendung von Plasma muß eine Störung der verwendeten Antikoagulanz ausgeschlossen werden.

Sollen Gewebeproben gemessen werden, müssen diese chemisch oder enzymatisch in eine lösliche Form gebracht werden.

Hämolyse stört prinzipiell, da das Hämoglobin auch nicht enzymatisch glycosyliert ist und somit mitgemessen wird. Um einen alkalischen pH-Wert im Test zu haben, gibt man am besten Puffer zu. Als Puffer eignen sich z. B. Karbonat-, Glycin- und Tris Puffer im pH-Bereich 8 bis 11 - vorzugsweise zwischen pH=9 bis 9,5 - die die Borsäure oder die substituierte Phenylboronsäure bereits gelöst enthalten. Das so vorgefer tigte Reagenz kann direkt zur Probe gegeben werden. Da die Boronsäureesterbildung sehr schnell erfolgt, kann innerhalb von Minuten gemessen werden.

Bei allen Verfahrensvarianten kann evtl. zur Erhöhung der Löslichkeit der Arylboronsäure etwas Tensid, z. B. Tween, zugesetzt werden.

Theoretische Basis der Erfindung

Freie Aminogruppen von Proteinen bilden mit Carbonylverbin dungen eine Schiffsche Base, wobei das Gleichgewicht in wäßriger Lösung stark auf der linken Seite liegt. Enthält die Carbonylverbindung am C-2 eine OH-Gruppe wie z. B. Glucose oder Laktose, so kann sich die Schiffsche Base in ein Ketosylamin umlagern, wobei die als Amadoriumlagerung bekannte Reaktion im wesentlichen irreversibel ist.

Schema 1

Reaktion einer freien Aminogruppe eines Proteins mit Glucose

Unter physiologischen Bedingungen (i. e. pH=7,4) ist die Menge der proteingebundenen Glucose der mittleren Blutgluco sekonzentration proportional und damit für die Beurteilung der Einstellung von Diabetikern geeignet. Die Fruktosylamin gruppierung, ob frei oder proteingebunden, liegt in wäßri ger Lösung in pyranosider und furanosider Ringstruktur vor. In leicht alkalischem Milieu bilden diese aufgrund ihrer cis-diolständigen OH-Gruppen sehr schnell Borsäureester mit Borsäure oder substituierten Phenylboronsäuren.

Schema 2

Allgemeine Reaktionsgleichung der Boronsäureesterbildung

Im einzelnen läßt sich die klinische Bedeutung der Be stimmung von glycosylierten Serumproteinen (GSP) folgender maßen zusammenfassen:

1. Messung der GSP mit Hilfe von Borsäureestern stellt eine quantitative Bestimmung der nichtenzymatisch gebundenen Glucose von Serumproteinen dar, wobei das Albumin zu ca. 80% beiträgt; d. h., die Plasmahalbwertszeit entspricht etwa der des Albumins von ca. 20 Tagen.
2. GSP korreliert mit dem Nüchternblutzucker und mit glyco syliertem Hämoglobin. Der momentane Blutglucosespiegel beeinflußt den GSP-Wert zur Zeit der Probennahme nicht. So sind z. B. Ernährung, körperliche Aktivität und Zeitpunkt der Probennahme ohne Einfluß auf den GSP-Wert. Die GSP-Bestimmung stellt somit einen Index für die Stoffwechseleinstellung von Diabetikern dar.
3. Die GSP-Bestimmung ist als Screening-Test geeignet, um Personen mit manifesten Diabetes zu entdecken.
4. Je nach Durchführung des Tests ist eine Automatisierung möglich.
5. Die GSP-Bestimmung ist spezifisch für die Ketoaminform; die Aldiminform und freie Glucose beeinflussen das Ergeb nis nicht.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1: Änderung der UV-Vis Absorption von Azo 9 in Abhängigkeit vom Glycosylierungsgrad der Serumalbumins. Die Meßlösung in der Küvette enthält 13,4 µMol/l Azo 9 und 5,6 mg humanes Se rumalbumin, das in vitro unterschiedlich lange glycosyliert wurde (2-7), in 0,5 ml 50 mM Glycinpuffer pM=8,2 gelöst.
1=Lösung ohne Albumin
2-7=Lösung mit glycosysliertem Albumin (2,2-15,7 n/Mol Lys glu/mg)
8=Lösung ohne Albumin+Fruktoseüberschuß (<100fach)

Fig. 2: Strukturformeln der Diazoverbindungen Azo 1-5

Fig. 3: Strukturformeln der Diazoverbindungen Azo 6-9

Beispiel 1 Bestimmung von GSP ohne Trennung der freien substituierten Arylboronsäuren

0,1 ml Probe (ca. 3-7 mg Protein) wird zu 1 ml Reagenz gegeben. Das Reagenz enthält 20 µMol/l Azo 9, das in 0,1 M Glycinpuffer 0,1 M MgCl₂ pH=9,2 gelöst ist. Die Extinktions änderung wird im Bereich 540-600 nm z. B. bei 546 oder 578 nm abgelesen. Als Blindwert dient 0,1 ml einer NaBH₄ re duzierten Probe, die genauso gemessen wird.

Der absolute Wert wird über einen bekannten Standard, der wie eine Probe gemessen wurde, berechnet.

Beispiel 2 Bestimmung von GSP mit Abtrennung der freien substituierten Arylboronsäuren

0,1 ml Probe (ca. 3-7 mg Protein) werden zu 0,5 ml Reagenz gegeben. Das Reagenz besteht aus einer frisch bereiteten Lösung von 0,1 mMol/l Azo 9 in 0,1 M Glycinpuffer 0,1 M MgCl₂ pH=9,2. Zur Blindwertermittlung wird 0,1 ml Probe zu 1 ml Blindwertreagenz gegeben, wobei das Blindwertreagenz aus der Reagentienlösung durch Zugabe von 25 mMol/l Ammoniumpen taborat erhalten wird. Nach 10 Minuten werden 0,5 ml Kohle- Dextransuspension zugegeben und 2 Minuten geschüttelt. Dann wird rasch zentrifugiert - 1 Minute bei ca. 10 000 g - und die Absorption des Überstandes bei 546 oder 578 nm bestimmt. Die Kalibrierung erfolgt mit Hilfe eines bekannten Stan dards, der genauso gemessen wurde.

Alle Arbeitsschritte können bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

Beispiel 3

Entsprechend der Vorschrift von Beispiel 2 kann der Test auch mit Azo 5 durchgeführt werden. Dabei enthält das Rea genz bzw. das Blindwertreagenz 0,1 mMol/l Azo 5 statt Azo 9. Die Absorption wird bei 546 nm abgelesen und wie oben be schrieben kalibriert.

Beispiel 4 Spezifische Blindwertbildung mit Borsäure und 3-Nitro-Phe nylboronsäure

0,1 ml Probe (ca. 3-7 mg Protein) wird bei 37°C zu 1 ml Carbonatpuffer (0,1 Mol/l; pH=10,3), der 0,25 mMol/l Nitro bluetetrazoliumsalz enthält, gegeben und die Absorption bei 530 nm nach 10 und 15 Minuten gemessen und der Extink tionsunterschied berechnet. Für die Blindwertermittlung wird genauso verfahren, nur enthält das Blindwertreagenz zusätz lich 0,15 Mol/l Natriumborat oder 30 mMol/l 3-Nitrophe nylboronsäure. Die Differenz von Haupt- und Blindwert wird mit der eines bekanntes Standards verglichen, der genauso gemessen wurde.
Berechnung:

Pipettierschema:

Beispiel 5 Halbquantitative Bestimmung des Glycosylierungsgrades von Proteinen

0,02 ml Probe (ca. 0,5-1,5 mg Protein) werden mit 0,1 ml Reagenz bei Raumtemperatur vermischt. Das Reagenz besteht aus einer Lösung von 0,02 mM fluoreszeinmarkierter Arylboron säure (Darstellung Beispiel 9) in 0,1 M Glycinpuffer 0,1 M MgCl₂ pH=9,2. Nach 5 Minuten wird die Probe durch ein Nitro cellulosefilter (Ø=3 cm) gesaugt und das Filter zwei Mal gewaschen. Dann werden die Filterplättchen unter UV-Licht mit zwei mitgeführten Standardproben verglichen. Je nach Fluoreszenzintensität kann die Probe der ersten Standard probe (entspricht Normalserum) oder der zweiten (entspricht Diabetikerserum) zugeordnet werden.

Beispiel 5a Quantitative Bestimmung des Glycosylierungsgrades von Proteinen

0,01 ml Probe (ca. 0,5-0,9 mg Protein) werden mit 2,0 ml Reagenz bei Raumtemperatur vermischt. Das Reagenz besteht aus einer Lösung von 20 nMol/l fluoreszeinmarkierter Phenylboron säure (Darstellung Beispiel 9) in 0,1 M Glycinpuffer 0,1 M MgCl₂ pH=9,2 oder in 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, 0,14 M NaCl pH=7,4. Nach 2 Minuten bestimmt man die Fluoreszenzpolari sation der Lösung (z. B. einem dazu geeigneten Photometer der Fa. Abbott, Chicago, USA).

Die Leerwertbildung ist möglich durch Zugabe eines ca. 100fachen Überschusses an einer nicht im UV-vis Bereich absorbierenden (also nicht fluoreszierenden) Boronsäure oder von Borsäure (siehe Beschreibung Seite 8 l.b.).

Beispiel 6 Darstellung von 4′-Hydroxy-3′-carboxy-phenyl-diazophenyl-3- boronsäure (Azo 5)

20 mMol m-Amino-phenylboronsäure (Fa. Sigma, Taufkirchen GFR) werden in 55 ml 3 N HCl gelöst und die Lösung auf 0°C gekühlt. Langsam und unter Rühren werden 8 ml einer 2,5 M NaNO₂ Lösung zugetropft, wobei die Temperatur der Reaktions lösung unter 5°C bleiben sollte. Es wird soviel NaNO₂-Lösung zugegeben, bis Nitrit noch 5 Minuten in der Lösung nachweis bar ist. Überschüssige HNO₂ wird durch Zugabe von wenig Harnstoff beseitigt. Ein brauner Niederschlag wird abzentri fugiert.

Zu einer Lösung von 20 mMol Salicylsäure in 30 ml 2N NaOH läßt man langsam obige Lösung zufließen und die Temperatur wird zwischen 5 und 10°C gehalten. Der pH-Wert sollte nicht unter 10 sinken, sonst wird mit 2 N NaOH nachgestellt.

Nach Beendigung der Reaktion wird mit 6 N HCl auf pH=1-2 angesäuert und mit Diethylether extrahiert. Das nach Abzie hen des Lösungsmittels erhaltene Produkt wird in 0,1 M TRIS/HCl-Puffer pH 8,5 gelöst und auf eine DEAE-Cellulose- Säule (DE 52) (mit TRIS-Puffer pH 8,5 equilibriert) gegeben. Während der Elution mit demselben Puffer wird die zweite rote Bande gesammelt. Zur Gewinnung des reinen Farbstoffes wird erneut angesäuert, mit Ether extrahiert, die Ether- Phase über Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne eingeengt. Bei Chromatographie auf Kieselgel G 60 Dünnschicht-Platten mit dem Fließmittel n-Propanol : H₂O : NH₃ (25%)=30 : 10 : 10 erscheint die Substanz bei einem Rf-Wert von ca. 0,5. Ausbeute ca. 50%.

Nach der gleichen Arbeitsweise, jedoch mit 1-Amino-8-naph tol-3,6-disulfonsäure statt Salicylsäure wurde die entspre chende Naphtylverbindung erhalten.

Beispiel 7 Darstellung einer Bis-Diazophenylboronsäure (Azo 9)

0,1 mMol Diazo-4 Nitro-o-anisidin wird in wenig H₂O gelöst und langsam bei ca. 10°C zu einer Lösung von 0,1 mMol Sali cylsäure in 0,3 mMol NaOH gegeben. Der pH-Wert wird während der Reaktion geprüft und soll nicht kleiner als 10 werden. Man rührt das Reaktionsgemisch ca. 30 min bei 10°C (Lösung A).

0,1 mMol m-Amino-phenylboronsäure werden wie für Beispiel 6 beschrieben diazotiert.

Nach Zentrifugation wird die klare, gelb gefärbte Lösung langsam zu Lösung A gegeben (10°C), wobei durch Zugabe von 2 N NaOH die Mischung stets deutlich alkalisch (pH<10) gehalten wird.

Nach einer Reaktionszeit von 30 min wird angesäuert (pH 1-2) und der entstandene Niederschlag abzentrifugiert. Das Präzi pitat wird in wenig NaOH gelöst, verdünnt, mit etwas Na- acetat versetzt und mit Eisessig auf pH 4,5 gebracht, so daß sich noch kein Niederschlag bildet. Aus dieser schwachsauren Lösung wird der Farbstoff an Polyamid-6-Pulver adsorbiert. Man wäscht mit 0,1 M Acetat-Puffer pH 4,5 und mit wenig H₂O. Mit Methanol (100%) wird der gewün schte Farbstoff weitgehend spezifisch eluiert.

Eine weitere Reinigung kann durch Adsorptionschromatographie an Al₂O₃ basisch (Type WB-2) durchgeführt wer den:

Der in Diethylether gelöste Farbstoff wird auf eine Säule mit Al₂O₃ (equilibriert mit Ether) gegeben. Man wäscht zuerst mit Ether, dann mit Isopropanol. Das Titelprodukt wird mit Methanol eluiert. Die Synthese kann ebenso wie die Reinigung durch DC auf Cellulose-Platten mit n-Propanol: H₂O : NH₃ (25%)=30 : 10 : 10 als Fließmittel überprüft werden.

Rf-Wert=0,35.

Beispiel 8 Darstellung von 4′-Sulfonat-phenyl-diazophenyl-4-amino-2- boronsäure (Azo 2)

83,7 mg Sulfanilsäure und 50 mg m-Amino-phenylboronsäure werden in 420 µl H₂O suspendiert und unter Rühren tropfen weise NaNO2 Lösung (33,7 mg/420 µl H₂O) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach Ende der NaNO₂ Zugabe wird noch 1 Stunde gerührt. Dann wird 1 ml Ethanol zugegeben und die Reaktions lösung auf präparativen Dünnschicht-Platten (Kieselgel G 60) aufgetragen und in Ethanol: H₂O=60 : 40 entwickelt. Neben einer schnell wandernden gelben Bande erscheint bei Rf∼0,5 die weinrote Bande von Azo 2, die mit einer Mischung von Äthanol: H₂O=50 : 50 eluiert werden kann.

Beispiel 9 Darstellung von fluoreszeinmarkierter Phenylboronsäure

0,5 mMol Fluoresceinisothiocyanat p.A. werden in 50 ml 50 mM Na₂CO₃ pH=9 gelöst und zu 20 ml einer Lösung von 0,5 mMol m- Aminophenylboronsäure in 50 mM Na₂CO₃ pH=9 getropft und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Ansäuern auf pH=3 läßt sich das Produkt mit Ethylacetat extrahieren und auf präparativen Dünnschicht-Platten (Kieselgel G 60) reinigen. Fließmittel: Aceton : Ethylacetat-5 : 1

Rf=0,6.

Beispiel 10 Darstellung von definiert glycosylierten Proteinen bzw. Polyaminosäuren

400 mg humanes Serumalbumin werden in 10 ml Kaliumphosphat puffer (10 mM; pH=7,4), der 140 mMol/l NaCl enthält, gelöst und 20 mMol/l D-Glucose und 3 mMol/l NaN₃ zugegeben. Die Lösung wird bei 37°C 1-5 Tage inkubiert und anschließend gegen glucosefreien Inkubationspuffer mindestens 48 Stunden dialysiert. Der Standard wird anschließend mit der bekannten Furosinmethode kalibriert. Unter diesen Bedingungen werden 1,2 nMol Glucose je mg Albumin pro Tag eingebaut. Anstelle von humanem Serumalbumin lassen sich auch tierische Serumal bumine oder synthetische lysinhaltige Polymere wie Poly-D- Lysin, Poly (D-Glutamat, D-Lysin) 6 : 4 oder Poly (Glutamat, Lysin, Tyrosin) 6 : 3 : 1 vom Molekulargewichtsbereich 30-150 kD unter den beschriebenen Bedingungen glycosylieren und gemäß Schleicher E. und Wieland O. H. (J.Clin.Chem.Clin.Bio chem. 1981, 19, 81-87) analysieren.

Das Verfahren und die bevorzugte Verfahrensvarianten werden im folgenden zusammengefaßt, wobei der Ausdruck "färbende Borsäure" eine Arylboronsäure bedeutet, die im UV-Vis-Be reich ein Absorptionsmaximum hat oder fluoreszenzmarkiert ist und deren Fluoreszenzpolarisation sich bei der Bindung an die glycosylierten Proteine ändert.

Das Grundverfahren besteht in der Bestimmung der glycosylierten Proteine durch färbende Borsäuren. Dies kann auch auf Filterpapier erfolgen. Dies ergibt einen Hauptwert A1, der für bestimmte Reihenuntersuchungen oder Screening tests genügen kann.

Davon abgezogen wird der Blindwert A2, der an einer identischen Probe mit einer a) nichtfärbenden Borsäure oder an einer b) mit Boranat reduzierten Probe mit einer färben den Borsäure oder c) statt Borsäure bzw. Borsäurederivat mit einem Überschuß an cis-Diol bildender Verbindung gebildet wird.

Der Differenzwert A1 minus A2 ist die spezifische Absorption oder Fluoreszenz für die Glycosylierung.

Zur Absolutwertbildung wird die gleiche Arbeitsweise wie für A1 genannt mit einem Standard mit bekanntem Glucosegehalt durchgeführt, was den Wert ST1 ergibt.

Davon abgezogen wird der Wert ST2 der Standardprobe, die ebenso behandelt wird, wie oben für A2 beschrieben.

Der Differenzwert ST1 minus ST2 ist die Kalibrierung oder Standardisierung.

Der Wert ΔA : ΔST verhält sich wie die gesamte Menge an glycosyliertem Protein zum kalibrierten Standard, was einen Absolutwert ergibt (ΔA : ΔST=Gesamtmenge : Standard).

Durch Blindwertbildung, für welche Elementschutz begehrt wird, kann man auch beim unspezifischen Reduktionstest, der einen unspezifischen Hauptwert ergibt, durch Differenz bildung bei Durchführung des gleichen unspezifischen Re duktionstestes mit z. B. 3-Nitrophenylboronsäure zur Blind wertbildung und Differenzbildung einen spezifischen Wert erhalten.

Besonders interessant ist die Möglichkeit, die Bestimmung auf Filterpapier (Nitrocellulosefilter) durchzuführen, die man mit Standards vergleichen kann, um so schnell einen verhältnismäßig guten Überblick bei einem großen Patienten kollektiv zu erzielen.

Die Erfindung ermöglicht somit die Bestimmung von glycosyl iertem Protein mit substituierten Arylboronsäuren (im Über schuß) durch die Bestimmung des gebildeten Borsäure esters. Dabei kann der Anteil des gebundenen Borsäureesters gemessen werden. Die Trennung freier und gebundener Borsäureester kann z. B. erfolgen mit Kohle oder Filterpapierteststreifen oder direkt über die Änderung des UV-Vis-Spektrums oder die Änderung der Fluoreszenzpolarisa tion.

Die Blindwertbildung kann erfolgen durch Überschuß an cis- Diol enthaltender Verbindung oder mit einer mit Boronat reduzierten Probe oder Umsetzung mit nicht färbenden Borsäu ren. Die Standardisierung ist möglich über natürliche oder lysinhaltige polymere Aminosäuren oder Peptide die definiert glycosyliert sind.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von glycosylierten Proteinen, die in biologischen Flüssigkeiten oder in aus biologischem Ma terial gewonnenen Flüssigkeiten enthalten sind, mittels Boronsäure esterbildung, dadurch gekennzeichnet, daß diese glycosylierten Proteine im alkalischen Milieu mit substituierten, hinreichend wasserlöslichen Arylboronsäuren, der allgemeinen Formel I worin
-A- die Gruppen -N=N- oder -NH-C(=S)-NH bedeutet, R¹, R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, H, Cl, F, NO₂, Methoxy, Ethoxy oder die hydrophilierende Gruppe OH, SO₃H, COOH, NH₂ oder eine niedere Alkylgruppe mit bis zu 4, insbesondere 2 C- Atomen bedeuten, wobei jedoch höchstens zwei der Reste R¹ bis R³, H, Cl, F, NO₂ oder Methoxy oder Ethoxy bedeuten können und bei niederen Alkylresten mindestens einer eine hydrophilierende Gruppe, wie oben definiert, enthält und dabei auch einer der Reste R¹ bis R³ eine bis dreifach mit R¹, R², R³ substituierte Diazo phenylgruppe sein kann und R⁴ NH₂ oder Wasserstoff bedeutet und B ein 1- bis 3fach mit OH, SO₃H, COOH, NH₂ sub stituierter ankondensierter Benzolring oder eine Gruppe, die I zu einem fluoreszierenden Molekül macht, sein kann, im Überschuß versetzt und die Arylboron säure mit den glycosylierten Proteinen zum entsprechenden cis-Diol-Ester umgesetzt werden und daß die Konzentration A1 der gebundenen Diol-Ester in an sich bekannter Weise ge messen wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Blindwertbestimmung eine zweite, identische Probe mit Borsäure oder einem nichtfärbenden oder im blauen UV nicht absorbieren den Borsäurederivat umgesetzt oder eine identische, jedoch mit Boranat reduzierte Probe nach dem Verfahren nach Anspruch 1 gemessen und durch die Differenzbildung ein Differenzmeßwert bestimmt und dieser Wert zu dem mit zwei Standardproben ST1 und ST2 in gleicher Weise erhaltenen Differenzwert in die Beziehung (A1-A2)/(ST1-ST2)=gesamte Menge an glycosylierten Proteinen kalibrierter Standard, gesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Endablesung vorhandene freie, überschüssige Phenyl boronsäurederivate abtrennt und dann die Endablesung vornimmt oder wahlweise die gebildeten cis-Diol-Ester aus der Reaktions mischung abtrennt und diese dann bestimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Differenz der Reduktionskraft zwischen Probenhaupt- und Probenblindwert A1 bzw. A2 mit den entsprechenden Werten ST1 und ST2 der Standardprobe gemessen wird und die Konzentration der cis-Diol-Ester in der Probe daraus berechnet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Differenz der Konzentration durch Zugabe eines Über schusses einer cis-Diol enthaltenden Verbindung, die Borsäure oder Arylboronsäure bindet, zur Blindwertprobe A2 und zur Standardblindwertprobe ST2 bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als cis-Diol enthaltene Verbindung Fruktose, Sorbit oder Diethanolamin verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Standardprobe glycosyliertes Serumalbumin humaner oder tierischer Herkunft oder in vitro glycosylierte polymere lysinhaltige Polyaminosäuren mit definiertem Glucosegehalt verwendet werden.

8. Mittel zur Bestimmung von glycosylierten Proteinen ent haltend substituierte Arylboronsäuren der allgemeinen Formel I worin-A- die Gruppen -N=N- oder -NH-C(=S)-NH bedeutet, R¹ R² und R³, die gleich oder verschieden sein können, H, Cl, F, NO₂, Methoxy, Ethoxy oder eine hydrophilierende Gruppe, OH, SO₃H, COOH, NH₂ oder eine niedere Alkyl gruppe mit bis zu 4, insbesondere 2 C-Atomen bedeuten, wobei jedoch höchstens zwei der Reste R¹ bis R³, H, Cl, F, NO₂ oder Methoxy oder Ethoxy bedeuten können und bei niederen Alkyl resten mindestens einer eine hydrophilierende Gruppe, wie oben definiert, enthält und dabei auch einer der Reste R¹ bis R³ eine bis dreifach mit R¹, R², R³ substituierte Diazophenylgruppe sein kann und R⁴ NH₂ oder Wasserstoff be deutet und B gegebenenfalls ein 1- bis 3fach mit OH, SO₃H, COOH, NH₂ substituierter ankondensierter Benzolring, oder eine Gruppe, die I zu einem fluoreszierenden Molekül macht, sein kann.

9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß neben einer dosierten Menge der Arylbroronsäure der allgemeinen Formel I gegebenenfalls in Lösung auf pH 8 bis 11 gepuffert, noch folgende Reagenzien vor handen sind,

- ein alkalischer Puffer von bekanntem pH-Wert im Bereich von 8 bis 11
- eine bekannte Menge eines Borats, dessen Borsäure ester bei der Bestimmung in der Indikatorreaktion nicht erfaßt wird, gegebenenfalls in Lösung gepuffert auf pH 8 bis 11
- Kohle-Dextransuspension
- eine bekannte Menge an Standardprotein mit bekanntem Glucosylierungsgehalt oder einer solchen Polyamino säure sowie gegebenenfalls
- Nitrobluetetrazoliumsalz, gegebenenfalls in verdünnter Lösung
- Natriumborhydrid und Fruktose, Sorbit und/oder Diethanolamin, wobei alle Substanzen allein in ge trennten Behältern oder getrennt, jedoch in einem einzigen Behälter vereinigt, vorliegen.

10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Arylboronsäure auf pH 9,2 gepuffert ist, das nicht bei der Indikatorreaktion erfaßte Borat Borsäure ein Alkaliborat oder Ammoniumborat oder -poly borat ist und der Puffer ein pH von 10 bis 10,5 auf weist, und daß zusätzlich 3-Nitrophenylboronsäuren in dosierter Menge und eine Anzahl Filterpapiere vorhanden sind.