DE19645601C2

DE19645601C2 - Verfahren zur Herstellung von Boronsäureester-Derivaten

Info

Publication number: DE19645601C2
Application number: DE1996145601
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Gluesenkamp; Harald Kosegarten; Detlef Steinweg
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-11-06
Filing date: 1996-11-06
Publication date: 2001-09-27
Anticipated expiration: 2016-11-07
Also published as: DE19645601A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur schonenden Markierung von poly meren Trägern mit einer biospezifischen Verbindung, wie biochemischen Sonden, zur Herstellung von Boronsäureester-Derivaten der Formel Z-Y-BC,
mit C:

T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten OH-Gruppen, welcher Pflanzenzel len, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitte, Lektine oder Nukleinsäure- Derivate ist,
Y: 1,3-Phenylen oder Imino-3-Phenyl und
Z eine substituierte biospezifische Verbindung sind, die mindestens ein Vertreter der biologisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung und diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist, und die Verwendung derselben.

Unter Trägern wird auch im Sinne der Erfindung Träger oder Trägermaterialien wie po lymere Verbindungen z. B. verschiedene Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, leben de oder tote Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen verstanden. Unter Träger können auch die Monomere der polymeren Träger verstanden werden.

Unter biospezifischen Verbindungen oder Sonden werden im Sinne der Erfindung bio chemisch wirksame Verbindungen, pharmazeutisch wirksame Verbindungen, biologisch wirk same Verbindungen und/oder diagnostisch wirksame Verbindungen verstanden.

Insbesondere versteht man unter biochemisch wirksamen Verbindungen im Sinne der Er findung auch Proben oder Verbindungen zum qualitativen und quantitativen Nachweis, Anrei cherung, Isolierung, Reindarstellung oder Erkennen von Konzentrationen, Mengen etc. eines Stoffes, einer Komponente, insbesondere des biologischen Typs oder von Milieu in Organis men oder Teilen derselben wie in Gewebe, in Organen, Zellen, Zellkompartimenten, Zell-, Ge webeextrakten etc., z. B. Farbstoffe, physiologische Indikatoren, oder
ebenso pharmazeutisch wirksamen Verbindungen solche zur Behandlung von Krank heitszuständen, wie Antibiotika, Antimykotika, Enzyminhibitoren, Chelate, oder
biologisch wirksamen Verbindungen, welche enzymatisch katalysierte Reaktionen in bei spielsweise Zellen, Geweben, Organen, Organismen zu beeinflussen vermögen, wie Pestizide oder Herbizide, oder
diagnostisch wirksamen Verbindung, welche Zellen oder Zellkompartimente eines be stimmten Status wie entartete Zellen erkennen können bzw. an solche zu binden imstande sind, verstanden. Sonden können sein Farbstoffe, physiologische Indikatoren, Antibiotika, Antimy kotika, Enzyminhibitoren, Chelate, Lipide, Tracer, Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosac charide oder dergleichen bzw. die entsprechenden monomeren Bausteine.

Unter Boronsäure ist die ältere Bezeichnung für organische Derivate der Borsäure zu verstehen, entsprechendes gilt für die Bezeichnung Boronat.

Im Stand der Technik sind cyclische Borsäureester als Schutzgruppen in der organischen Synthesechemie bekannt. Das in DE 37 20 736 A1 offenbarte Verfahren ist auf ein solches zur Bestimmung von glykosylierten Proteinen gerichtet, welches auf die quantitative Bestimmung von an glykosylierten Proteinen gebundenen, z. B. fluorophoren, Arylborsäure-Derivaten be ruht. Das Verfahren eignet sich für die hinreichende schonende Kopplung von biospezifischen Verbindungen an polymeren Träger, ohne daß die biologische, biochemische oder pharmazeu tische Wirksamkeit der biospezifischen Verbindungen verloren geht. Zudem ist dieses Verfah ren jedoch aufgrund der hohen Kosten und des Zeitaufwandes von Nachteil.

Auch die in der WO 95/020 46 beschriebene flüssige Zusammensetzung aus einem En zym und einem Enzymstabilisator, welcher ein Boronsäure-Derivat oder ein Borinsäure- Derivat ist, hilft dem Fachmann nicht weiter, da sich diese durch das Fehlen der an Trägern gekoppelten biospezifischen Verbindung auszeichnen und Hinweise in diesem Stand der Tech nik auf die Besonderheiten und Erfordernisse der schonenden Kopplung von biospezifischen Verbindungen an polymeren Trägern gänzlich fehlen.

Aufgabe der Erfindung soll es sein, Borsäureester-Derivate unter schonender Kopplungs reaktionen an biospezifische Verbindungen zu binden und diese an Träger zu koppeln, ohne daß die biologische, biochemische oder pharmazeutische Wirksamkeit der biospezifischen Ver bindungen verloren, zumindest aber nicht nennenswert beeinträchtigt wird.

Die Aufgabe wird gelöst durch den Hauptanspruch und den Nebenanspruch. Die Un teransprüche betreffen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterentwicklungen der Erfindung.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schonenden Markierung von polymeren Trägern mit einer biospezifischen Verbindung zur Herstellung von Boronsäureester-Derivaten der For mel Z-Y-BC,
mit C:

T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten OH-Gruppen, welcher Pflanzenzel len, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitte, Lektine oder Nukleinsäure- Derivate ist,
Y: 1,3-Phenylen oder Imino-3-Phenyl und
Z eine substituierte biospezifische Verbindung sind, die mindestens ein Vertreter der biologisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung und diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist, wobei
1 bis 20 mMol biospezifische Verbindung, welche mindestens ein Vertreter der biolo gisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung und diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist, mit 1 bis 20 mMol substituiertes Boronsäure-Derivat in 5 bis 40 ml polarem Lösungsmittel und einem Äquivalent Triethylamin 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird,
die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird und
anschließend mit dem polymeren Träger mit benachbarten Hydroxyl-Gruppen, welcher Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitte, Lektine oder Nu kleinsäure-Derivate ist, bei Raumtemperatur bei pH 6 bis 8 verestert wird.

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Verwendung der erfindungsgemäß herstellbaren Boronsäureester-Derivate als biologisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbin dung, pharmazeutisch wirksame Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung.

Ebenso können Boronsäure-Derivate der Formel (Z)_kY-B(OH)₂ herstellbar sein, wobei
Y: ein substituiertes oder unsubstituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2-Methyltrimethylen, oder
ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, ist, sowie
Z: eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung ist, an welcher vorzugsweise ein oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)₂ oder -O-B(OH)₂ oder

sind,
worin L gleich T oder Z, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH-Gruppen aufweist,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen sind, und
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.

Boronsäureester-Derivate der Formel [(Z)_kY-B]_mC können solche sein, wobei

T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs, vorzugsweise Propyliden oder 2-Methyltrimethylen, oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere ein Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen, und
E: -B(OH)₂ oder -O-B(OH)₂ oder

sind,
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierten oder unsubstituierten OH-Gruppen aufweist,
k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und
m eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist

Bei dem Verfahren zur schonenden Markierung von polymeren Trägern mit biospezifi schen Verbindungen ist es möglich, daß

a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure- Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel, wie Dimethyl formamid, und einer Base, wie Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
b) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung ein organi sches Lösungsmittel als Fällungsmittel, insbesondere Ether, zu dem Ansatz gegeben wird,
c) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur schonenden Markierung von polymeren Trä gern mit biospezifischen Verbindungen zur Herstellung von Boronsäureester-Derivaten ist es auch möglich, daß

a) die biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit einem substituierten Boronsäure- Derivat, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in einem polaren Lösungsmittel, wie Dimethyl formamid, und einer Base, vorzugsweise Triethylamin, 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
b) anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird,
c) die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird und
d) anschließend mit einem polymeren Träger mit benachbarten Hydroxyl-Gruppen bei Raumtemperatur bei pH 7 verestert wird. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate als biologisch wirksame Verbin dung, als biochemisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung gerichtet und auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen Boronsäureester-Derivate gerichtet als biologisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksa me Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung oder als diagnostisch wirksame Ver bindung.

In einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können 0.1 bis 40 mMol, vorzugsweise 1 bis 20 mMol, am bevorzugtesten 0.5 bis 5 mMol, biospezifische Ver bindung in einem Ansatz mit 0.1 bis 40 mMol, vorzugsweise 1 bis 20 mMol, am bevorzugte sten 0.5 bis 5 mMol, substituiertes Boronsäure-Derivat in 5 bis 40 ml polarem Lösungsmittel und 0.1 bis 10, bevorzugterweise 1 bis 5, Äquivalent Triethylamin 1 bis 5 Stunden lang inku biert werden.

Weiterhin ist es von Vorzug, wenn 1 mMol biospezifische Verbindung in einem Ansatz mit 1 mMol substituiertes Boronsäure-Derivat in 20 ml polarem Lösungsmittel und 1 Äquiva lent Triethylamin 5 Stunden lang inkubiert wird; hinzutretend kann als polares Lösungsmittel Dimethylformamid verwendet werden.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Boronsäure-Derivate können als Al kyliden bivalente Gruppen wie Ethyliden, Propyliden, Tetramethylen, 2-Methyltrimethylen oder 2,2-Dimethyltrimethylen sein. Diese können weiter substituiert sein. Als Arylen sind bivalente aromatische Gruppen wie 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,4-Phenylen, oder auch substituierte bivalent aromatische Gruppen wie 4-Methyl-1,3-Phenylen, 4-Amino-1,3- Phenylen.

Im Falle der substituierten Boronat-Gruppe, wenn E gleich

ist, steht L beispielsweise für einen polymeren Trägerrest oder für eine biospezifische Verbindung Z, wobei Sauerstoff an vicinalen Kohlen stoffatomen des Trägerrestes bzw. der biospezifischen Verbindung, nicht an geminalen, kova lent gebunden ist.

In einer Ausführungsform der Borsäure-Derivate der Formel Z-Y-B(OH)₂ kann
Y: für 1,3- Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl,
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung stehen; weiterhin kann die biospe zifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise Isothiocyanato-Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino-Gruppe ko valent gekoppelt sein.

Zudem ist es möglich bei den erfindungsgemäß herstellbaren Boronsäure-Derivate, daß die biospezifische Verbindung mindestens ein Vertreter der eine biologisch wirksame Verbindung, eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, eine biochemisch wirksame Verbindung und eine diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist. Die biologisch wirksamen Ver bindungen können Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide, die pharmazeutisch wirksamen Verbindungen ein Antibiotikum oder Antimykotikum sein. Der polymere Trägerrest kann Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen sein.

Die erfindungsgemäß herstellbaren Boronsäureester-Derivate der Formel (Z)_kY-BC können dadurch gekennzeichnet sein, daß

k eine ganze Zahl von 1 bis 5,
T: ein, vorzugsweise polymerer, Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder
ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen oder Benzylen,
Z eine substituierte oder unsubstituierte biospezifische Verbindung sind, an welcher vorzugsweise eine oder mehrere Reste der Formel (-D-E) gekoppelt sind, worin
D: ein substituiertes Alkyliden des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten Typs oder ein substituierter cyclischer Rest des gesättigten, heterocyclischen, alicyclischen oder aromatischen Typs, insbesondere Arylen, wie 1,3-Phenylen,
E: -B(OH)₂ oder -O-B(OH)₂ oder -O-B(OH)₂ oder

sind,r
worin L gleich T oder Z ist, wobei Z benachbarte substituierte oder unsubstituierte OH-Gruppen aufweist.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäß herstellbaren Boronsäureester-Derivate können als Alkyliden bivalente Gruppen wie Ethyliden, Propyliden, Tetramethylen, 2-Methyltrimethylen oder 2,2-Dimethyltrimethylen sein. Diese können weiter substituiert sein. Als Arylen sind bivalente aromatische Gruppen wie 1,2-Phenylen, 1,3-Phenylen, 1,4-Phenylen, oder auch substituierte bivalent aromatische Gruppen wie 4-Methyl-1,3-Phenylen, 4-Ami no-1,3-Phenylen.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Borsäureester-Derivate können
Y für 1,3-Phenylen, 1-Imino-3-Phenyl und Z für eine substituierte biospezifische Verbindung stehen; weiterhin kann die biospezifische Verbindung über die Imino-Gruppierung an dem Phenyl-Rest in 3-Position oder über beispielsweise mittels Isothiocyanato-Gruppierung an die am Phenyl verbundene Imino-Gruppe kovalent gekoppelt sein. Im Falle der substituier ten Boronat-Gruppe, wenn C gleich

ist, steht T beispielsweise für einen polymeren Trägerrest, wobei Sauerstoff an vicinalen Kohlenstoffatomen des Trägerrestes, nicht an gemi nalen, kovalent gebunden ist.

Ebenso wenn E gleich

ist, steht L beispielsweise für einen polymeren Trägerrest T oder für eine biospezifische Verbindung Z, wobei Sauerstoff an vicinalen Kohlen stoffatomen des Trägerrestes bzw. der biospezifischen Verbindung, nicht an geminalen, kova lent gebunden ist.

Ebenso ist es möglich, daß

T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten substituierten und/oder unsubstituierten OH-Gruppen,
Y: 1,3-Phenylen und
Z eine substituierte biospezifische Verbindung sind.

Weiterhin kann in einer besonderen Ausführungsform die biospezifische Verbindung mindestens ein Vertreter der eine biologisch wirksame Verbindung, eine pharmazeutisch wirk same Verbindung, eine biochemisch wirksame Verbindung und eine diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe sein. Als biologisch wirksame Verbindungen eignen Enzy minhibitoren, Herbizide oder Pestizide, als pharmazeutisch wirksame Verbindungen ein Anti biotikum oder Antimykotikum und als polymere Trägerrest Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen. Vorzugsweise ist die biospezifi sche Verbindung mindestens ein Farbstoff, vorzugsweise substituiertes Fluorescein.

In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäß herstellbaren Boronsäuree ster-Derivate kann die biospezifische Verbindung mindestens ein Vertreter der biochemisch, wie ein Farbstoff, ein physiologischer Indikator, eine biologisch, diagnostisch und/oder phar mazeutisch wirksame Verbindung, Chelate, Lipide, Tracer, Oligopeptide, Oligonukleotide, Oligosaccharide oder dergleichen umfassenden Gruppe sein, wobei beispielsweise die biolo gisch, insbesondere Enzyminhibitoren, oder pharmazeutisch wirksame Verbindung, insbeson dere ein Antibiotikum, Antimykotikum, sein können. Hinzukommend kann der polymere Trä ger Pflanzenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitten oder dergleichen oder substituierte Lectine, Nukleinsäure-Derivate oder dergleichen sein. Jedoch kann der Trä ger auch ein Monomer des polymeren Trägers oder die biospezifische vicinale Hydroxyl- Gruppen aufweisende Verbindung sein.

Die chemischen Bindungen zwischen den Trägern und den Sonden sind cyclische Bor säureester mit einer überraschend hohen Stabilität unter physiologischen Bedingungen. Eine Voraussetzung für diese Verknüpfung kann sein, daß der polymere Träger benachbarte Hy droxyl-Gruppen (vicinale Diolgruppen) enthält und der Ligand mindestens eine Boronsäure- Gruppe mit einem organischen Rest, welcher z. B. aus der Acyclen, Aromaten, Alicyclen, wie Cycloalkane, Cycloalkene, Cycloalkine, und Heterocyclen wie 5- oder 6-Ringheterocyclen umfassenden Gruppe ausgewählt ist umfaßt. Vorzugsweise kann die substituierte Boronsäure- Gruppe als organischen Rest ein Alkyl des gesättigt-unverzweigten, gesättigt-verzweigten oder ungesättigten-unverzweigten oder ungesättigt-verzweigten Typs, ein cyclischer Rest des ge sättigten oder aromatischen Typs wie Phenylboronsäure-Gruppen sein.

Da Zellen, wie z. B. Pflanzenzellen eine Vielzahl von polymeren Kohlenhydraten mit frei en, vicinalen Diolgruppen enthalten, ist eine gezielte Markierung mit Borsäurederivaten mög lich. Ein weiterer, neben der unerwartet hohen Stabilität der Bindung, hervorzuhebender Vor teil gegenüber gängigen Immobilisierungsmethoden ist die sehr schonende Kopplungschemie, die es überraschenderweise erlaubt, z. B. bei pH 7.0 und in physiologischen Puffersystemen Markierungen durchzuführen.

Cyclische Borsäureester sind als Schutzgruppen in der Organischen Synthesechemie be kannt (Th. W. Greene; P. G. M. Wuts: Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, John Wiley & Sons, 1991, S. 141ff). Völlig neu aber ist der Einsatz von Borsäure-Derivaten zur gezielten Immobilisierung von analytischen Sonden an z. B. Zellkompartimente. Die überra schenderweise sehr selektive Kopplungschemie eröffnet ein nicht vorhersehbares, außerordent lich breites Anwendungsspektrum. Das chemoselektive Reaktionsverhalten dieser Borsäure- Derivate erlaubt es, neuartige Verbindungen herzustellen, die z. B. für die kompartimentspezifi sche Markierung von Pflanzenzellwänden bedeutsam werden können. Es ist literaturbekannt, daß die Molekülgröße maßgeblich die Eindringtiefe in Geweben bestimmt. Darüberhinaus ist bekannt, daß viele Zellkompartimente von Membranen umgeben sind, die nur Moleküle bis zu einen bestimmten Molekulargewicht wie z. B. 10 kD passieren lassen. Maßgeschneiderte Son den mit unterschiedlichen Molekulargewichten machen so eine kompartimentspezifische Mar kierung möglich, die zum Studium von Membraneigenschaften, wie z. B. pH-Messung und/oder auch Messung von Ionenströmen, wie z. B. Fe²⁺/Fe³⁺-Transport geeignet sind. Außerdem ist es möglich, verschiedene analytische Sonden miteinander zu kombinieren, um verschiedenen Parameter wie z. B. pH-Wert und Fe³⁺-Konzentration gleichzeitig zu quantifizieren.

Abb. 1 zeigen beispielhaft das Reaktionsverhalten einer maßgeschneiderten Son de in

Fig. 1a) die substituierte biospezifische Verbindung hier Fluorescein-Boronsäure- Derivat (hier Addukt 1);
1b) das stabile Fluorescein-Boronsäureester-Derivat (hier Addukt 2).

Das Fluorescein-Boronsäure Addukt 1 (Abb. 1a) kann mit benachbarten Hy droxylgruppen von z. B. Zellwänden unter physiologischen Bedingungen zum stabilen cy clischen Boronsäureester-Derivat 2 (Abb. 1b) unter Wasserabspaltung regieren. Das so gebundene Fluorescein stellt eine analytische Sonde für die H⁺-Ionen Konzentration dar, da diese Verbindung eine pH-abhängige Fluoreszens aufweist.

Das nachfolgende Ausführungsbeispiel zeigt lediglich eine Ausgestaltung der Erfindung.

Synthese- und Ausführungsbeispiele

1. Herstellung des Adduktes 1 (in Abb. 1a):
0.173 g (0.001 Mol) Aminobenzolboronsäure-Hydrochlorid (Fa. Aldrich) und 0.389 g (0.001 Mol) Fluoresceinisothiocyanat (= FITC) (Fa. Aldrich) werden in 20 ml Dimethylforma mid eingerührt und 1 Äquivalent Triethylamin hinzugefügt. Nach 5 h wird das Addukt 1 in Ether gefällt, mit Ether gewaschen und anschließend getrocknet. Ausbeute: 0.5 g (93%).
HPLC: Rt: = 27.5 min; 0.01 M Ammoniumformiat pH 5, Methanol; 100 bis 0% (30 min).
2. FITC-Markierung von Pflanzenzellen:
Herstellung des Adduktes 2 (Abb. 1b; FITC-Markierung von Pflanzenzellen): Aus gesuchte Wurzeln von 2 Wochen alten prekultivierten Weizenkeimen wurden auf Objektträger plaziert und anschließend sofort mit 2% Agarnährlösung (PBS = Phosphat gepufferte Koch salz-Lösung) bedeckt. Proben dieser Zellen wurden bei verschiedenen Temperaturen mit unter schiedlich konzentrierten Lösungen vom Addukt 1 (10-100 Mmolar in PBS) und als Kontrolle mit dem entsprechenden nicht derivatisiertem Fluorescein für 1 bis 12 h im dunkeln inkubiert. Danach wurden die Proben nach ausgiebigem Waschen mit einem konfokalen Lasermikroskop (Anregung 490 nm, Fluoreszens bei 600 nm) miteinander verglichen. Die Proben, die mit dem Addukt 1 inkubiert wurden, zeigten ein stabiles Fluoreszenssignal. Im Gegensatz dazu wiesen die Proben, die mit nicht markiertem FITC behandelt wurden keine stabile Fluoreszens auf.

Abb. 1 zeigt beispielhaft das Reaktionsverhalten einer maßgeschneiderten Sonde.

Claims

1. Verfahren zur schonenden Markierung von polymeren Trägern mit einer biospezifischen Verbindung zur Herstellung von Boronsäureester-Derivaten der Formel Z-Y-BC,
mit C:
T: ein polymerer Trägerrest mit benachbarten OH-Gruppen, welcher Pflanzenzel len, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitte, Lektine oder Nukleinsäu re-Derivate ist,
Y: 1,3-Phenylen oder Imino-3-Phenyl und
Z: eine substituierte biospezifische Verbindung sind, die mindestens ein Vertreter der biologisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung, bioche misch wirksame Verbindung und diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Grup pe ist, wobei
1 bis 20 mMol biospezifische Verbindung, welche mindestens ein Vertreter der biologisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung und diagnostisch wirksame Verbindung umfassenden Gruppe ist, mit 1 bis 20 mMol substituiertes Boronsäure-Derivat in 5 bis 40 ml polarem Lösungsmittel und einem Äquivalent Triethylamin 1 bis 5 Stunden lang inkubiert wird,
anschließend zur Fällung der substituierten biospezifischen Verbindung Ether zu dem Ansatz gegeben wird,
die gefällte substituierte biospezifische Verbindung getrocknet wird und
anschließend mit dem polymeren Träger mit benachbarten Hydroxyl-Gruppen, welcher Pflan zenzellen, Zellorganellen, Teile derselben, Gewebe, Gewebeschnitte, Lektine oder Nu kleinsäure-Derivate ist, bei Raumtemperatur bei pH 6 bis 8 verestert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als biochemisch wirksame Verbindung ein Farbstoff verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei als Farbstoff substituiertes Fluorescein verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei als biologisch wirksame Verbindung Enzyminhibitoren, Herbizide oder Pestizide verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei als pharmazeutisch wirksame Verbin dung ein Antibiotikum oder Antimykotikum verwendet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei als substituiertes Boronsäure-Derivat Aminobenzolboronsäure-Hydrochlorid verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei als substituiertes Fluorescein Fluo resceinisothiocyanat verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß 1 mMol bio spezifische Verbindung in einem Ansatz mit 1 mMol substituiertes Boronsäure-Derivat in 20 ml polarem Lösungsmittel und 1 Äquivalent Triethylamin 5 Stunden lang inkubiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als polares Lösungsmittel Dimethylformamid verwendet wird.

10. Verwendung der Boronsäureester-Derivate nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als biolo gisch wirksame Verbindung, biochemisch wirksame Verbindung, pharmazeutisch wirk same Verbindung oder als diagnostisch wirksame Verbindung.

11. Verwendung des Boronsäureester-Derivats nach Anspruch 9 als analytische Sonde bei kompartimentspezifischen Markierung von Pflanzenzellwänden für die H⁺- Ionenkonzentration an.