DE2603319B2 - Verfahren zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägern - Google Patents
Verfahren zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an TrägernInfo
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Description
R-C=N-R1
Cl
worin R und Ri aliphatische, aromatische oder
aliphatischaromatische Reste darstellen, von denen wenigstens einer den Molekülteil zwischen dem dem
N-Atom einer ursprünglichen sekundären Aminogruppe benachbarten C-Atom und einer benachbarten
Iminchloridgruppe darstellt, und das so erhaltene Produkt
a) in wäßrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt wird oder
b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung,
gegebenenfalls in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel, umgesetzt wird, und das
dabei erhaltene Produkt mit Gruppen der jo allgemeinen Formel II
R-C=N-R1
NH-R2-X π
worin R2 eine Alkylengruppe, eine α,ω-Dioxyalkylengruppe
oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomen und X eine primäre Aminogruppe oder eine zur Proteinbindung
geeignete Funktion bedeutet, entweder zuerst mit einem bifunktionellen Proteinreagens
und danach mit dem Protein oder direkt mit dem Protein zur Reaktion gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- -ti
zeichnet, daß feste Polymere als Trägermaterialien verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Trägermaterial Polyamide verwendet werden. w
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein als Träger verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chlorierungsmittel PCI5, PCl3,
SOCI2, COCI2, POCI2 oder SO2CI2 verwendet wer- «
den.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß R und Ri sekundäre Aminogruppen, tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen,
Sulfhydrylgruppen, Carboxylgruppen, Hydro- mi xylgruppen und/oder Iminchloridgruppen enthalten.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß R und Ri geradkettige, verzweigte
oder/und cyclische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1 — 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. t,-,
Phenylengruppen oder Alkylphenylgruppen bzw. Alkylphenylengruppen mit bis zu 6 C-Atomen in der
Alkylgruppe darstellen, die miteinander durch eine oder mehrere sekundäre oder tertiäre Aminogruppen,
Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgruppen verbunden sind.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß X eine Acetalgruppe, Estergruppe, Nitrilgruppe oder Olefingruppe darstellt
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bifunktionelle Proteinreagens ein
Dialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetal, Bismaleinimid,
bifunktioneller Iminoester, Diepoxid oder/und Dicarbonsäuredichlorid, Diisocyanat
oder/und Diisothiocyanat ist
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Trägermaterial
verwendet wird, welches eine mit Polyamidflints, -fasern oder -flocken beflockte
Oberfläche aufweist
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Fixierung von Proteinen, insbesondere von biologisch aktiven Proteinen an flüssigen oder festen Trägermaterialien.
Die Fixierung bzw. Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen wie Enzymen, Hormonen, zur
Teilnahme an Antigen-Antikörperreaktionen und Hapten-Antikörperreaktionen befähigten Substanzen, Gerinnungsfaktoren
und dergleichen, insbesondere im Rahmen der präparativen und der analytischen Chemie,
hat in den vergangenen Jahren große Bedeutung erlangt Es wurden bereits zahlreiche Fixierungsverfahren
entwickelt Trotzdem zeigt es sich, daß ständig neue Fixierungsprobleme auftauchen, die mit den bisher
bekannten Methoden nicht befriedigend gelöst werden können. Hierauf ist es auch zurückzuführen, daß bisher
trotz der ohne weiteres einsehbaren Vorteile der Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägermaterialien
auf vielen Gebieten die Einführung der fixierten Proteine in die Praxis nur zögernd erfolgte und
sich der erwartete breite Durchbruch noch nicht realisierte.
Hinzu kommt weiter, daß die meisten Immobilisierungsmethoden nur für bestimmte Trägermaterialien
brauchbar sind oder die Herstellung des Trägers durch Polymerisation aus wäßriger Lösung in Gegenwart des
biologisch aktiven Proteins erfordern (Protein-Copolymerisation), was ebenfalls die brauchbaren Trägermaterialien
stark beschränkt.
Von besonderem Interesse als Trägermaterialien für immobilisierte aktive Proteine wären Substanzen,
welche sekundäre Aminogruppen enthalten. Hierzu gehören einerseits verschiedene Polymerisate, die sich
durch besonders günstige mechanische und chemische Eigenschaften auszeichnen, wie z. B. die Polyamide,
Polyurethane, und andererseits polypeptidartige Strukturen, wie Polyaminosäuren und dergleichen. Derartige
Substanzen mit sekundären Aminogruppen weisen eine gewisse chemische Ähnlichkeit mit den Proteinstrukturen
auf, insbesondere hinsichtlich ihrer Ladungsverteilung, so daß hier negative Auswirkungen auf die
biologische Aktivität der daran immobilisierten Enzyme nicht zu erwarten sind oder gering bleiben, soweit keine
sonstigen Gruppen darin vorhanden sind, welche besonders nachteilig auf die Aktivität von Proteinen
einwirken.
Es ist bereits bekannt, daß Imidoester, die sich leicht
aus sekundären Aminen erhalten lassen, spezifisch mit den Aminogruppen von Proteinen unter Bildung von
Amidinostrukturen reagieren (vgl. z.B. Colowick-Kaplan
»Methods in Enzymology«, Band 25, Seite 646 bis 646; DE-OS 24 37 870). Es ist auch bekannt, daß
man Polyamide mit starken Alkylierungsmitteln in die Polyiminoester überführen kann (US-PS 33 40 210). Ein
wesentlicher Nachteil derartiger Iminoester für die Proteinfixierung besteht jedoch darin, daß sie in den ι ο
Lösungsmitteln löslich oder zumindest quellbar sind. Dies führt zu starker Klebrigkeit, die insbesondere das
Arbeiten mit Granulat Folien, Schläuchen und ähnlichen Formkörpern wegen der auftretenden Verklebung
stark erschwert oder gar unmöglich macht Ferner lassen die Aktivitätsausbeuten aufgrund der extremen
Hydrolyseempfindlichkeit der Imidoester zu wünschen übrig.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schafffen, welches die Fixierung von
biologisch aktiven Proteinen unter Aktivitätserhalt an Substanzen, die mindestens zwei sekundäre Aminogruppen
enthalten, ermöglicht und weiches die obenerwähnten Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver
Proteine, welches dadurch gekennzeichnet ist daß eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Aminogruppen
bei Temperaturen zwischen —80 und 20° C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter Überführung
von sekundären Aminogruppen in Iminchloridgruppen der allgemeinen Formel I
R-C = N-R,
Cl
J5
worin R und Ri aliphatische, aromatische oder
aliphatischaromatische Reste darstellen, von denen wenigstens einer den Molekülteil zwischen dem dem w
N-Atom einer ursprünglichen sekundären Aminogruppe benachbarten C-Atom und einer benachbarten
Iminchloridgruppe darstellt, und das so erhaltene Produkt
a) in wäßrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt wird oder
b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung, gegebenenfalls
in einem wäßrigen oder organischen Lösungsmittel, umgesetzt wird und das dabei >o
erhaltene Produkt mit Gruppen der allgemeinen Formel II
R-C=N-R1
i
NH-R2-X
worin R2 eine Alkylerigruppe, eine α,ω-Dioxyalkylengruppe
oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomen und X eine primäre Aminogruppe m)
oder eine zur Proteinbindung geeignete Funktion bedeutet, entweder zuerst mit einem bifunktionellen
Proteinreagens und danach mit dem Protein oder direkt mit dem Protein zur Reaktion gebracht
wird. br>
Die erfindungsgemäße Iminchlorierungsreaktion
wird vorzugsweise an flüssigen oder festen Polymeren vorgenommen, welche die sekundären Aminogruppen
enthalten. Besonders bevorzugt werden hierunter wiederum die Polyamide wie Nylon und Perlon und
ähnliche. Ein anderes Beispiel für sekundäre Aminogruppen enthaltendes Polymer ist Polyurethan.
Die Erfindung ist jedoch nicht auf Polymere beschränkt sondern generell auf alle Verbindungen
anwendbar, die als Träger für biologisch aktive Proteine in Betracht kommen und eine Mehrzahl von sekundären
Aminogruppen enthalten wie z. B. Peptide.
Bevorzugtes Chlorierungsmittel für die Herstellung des Iminchlorids ist PCl5. Andere geeignete Chlorierungsmittel
sind z. B. PCI3, SOCl2, COCl2, POCl3 und
SO2Cl2. Die beiden letzteren sind zwar nicht so
reaktionsfähig wie PCl5, sie haben gegenüber letzterem
jedoch den Vorteil, daß sie flüssig sind und daher ohne Lösungsmittel eingesetzt werden können. Bei der
Umsetzung mit PCI5 ist dagegen ein Lösungsmittel erforderlich. Geeignet sind halogenierte Lösungsmittel
v/ie Dichloräthan, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff
und ähnliche. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Herstellung
des Iminchlorids mit PCl5 in Dichloräthan bei Temperaturen zwischen —38 und 0°C. Diese bevorzugten
Bedingungen lassen sich leicht durch Zugabe von Trockeneis zur Dichloräthanlösung (oder der Lösung in
einem anderen halogenierten Lösungsmittel) einstellen. Selbstverständlich sind aber auch andere Kühlungsmethoden
geeignet
R und Ri sind aliphatische aromatische oder
aliphatischaromatische Reste. Diese können weitere sekundäre und tertiäre Aminogruppen, Estergruppen,
Amidgruppen, Sulihydrylgruppen, Carboxylgruppen,
Hydroxylgruppen oder Iminchloridgruppen enthalten. Vorzugsweise bedeuten R und Ri geradkettige, verzweigte
oder/und cyclische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1 — 12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw.
Phenylengruppen oder Alkylphenylgruppen bzw. Alkylenphenylengruppen
mit bis zu 6 C-Atomen in der Alkylgruppe, die miteinander durch eine oder mehrere
der vorstehend erwähnten Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgruppen verbunden
sind, Peptidketten aus natürlichen und/oder synthetischen Aminosäuren oder dergleichen. Typische Beispiele
für Verbindungen, welche erfindungsgemäß über die Bildung von Iminchloridgruppen mit biologisch
aktiven Proteinen gekoppelt werden können, sind 15-Polyamid, 6,6-Polyamid, 6,10-Polyamid, 11-PoIyamid,
I2-Polyamid, Polycyclamide wie Poly (1,4-cyclohexylendimethylen-superamid),
Polydodecanollactam, Wolle, Kasein, Naturseide, Polyarginin und ähnliche. Unter den
synthetischen Polymeren werde solche bevorzugt, in denen R und Ri Alkylen- und Cycloalkylengruppen mit
(i—12 C-Atomen darstellen, welche durch Amidgruppen miteinander verbunden sind.
Das Iminchlorid kann erfindungsgemäß direkt in einem wäßrigen Lösungsmittel mit dem biologisch
aktiven Protein umgesetzt werden. Das biologisch fiktive Protein wird dabei zweckmäßig in einem
geeigneten wäßrigen Puffer gelöst, mit dem festen Iminchlorid zusammengegeben und abreagieren gelassen.
Eine derartige Arbeitsweise empfiehlt sich vor allem dann, wenn das Grundgeriist des Imins verzweigt
ist, beispielsweise also bei Polyamiden, die Komponenten mit 3, 4 oder noch mehr Funktionen enthalten.
Durch die dort auftretenden sterischen Verhältnisse wird die direkte Reaktion zwischen dem Iminchlorid
und dem Protein begünstigt.
Bei geradkettigen Polymeren hingegen erfolgt die
Reaktion mit dem Protein zweckmäßig über eine Zwischenverbindung, welche mindestens eine primäre
Aminogruppe enthäft (Spacer),
Die primäre Aminognippe kann direkt mit einem Kohlenstoffatom verbunden sein oder als Hydrazid- -,
gruppe vorliegen, also an eine Säureamidogruppe gebunden vorliegen. Liegen zwei primäre Aminogruppen
vor, so sollen die beiden Aminogruppen vorzugsweise durch eine Alkylen-, α/ϋ-Dioxialkylen- oder
Dicarbonsäureamidgruppe mit 2—8 C-Atomen vonein- κι ander getrennt sein.
Wird anstelle eines Diamids ein Monoamid verwendet,
so enthält dieses noch eine weitere funktioneile Gruppe, vorzugsweise eine zur Herstellung einer
Bindung mit einem Protein geeignete Gruppe. Diese η zweite Gruppe der Zwischenverbindung, gleichgültig ob
es sich um eine primäre Aminogruppe oder eine andere Gruppe handelt, kann wieder mit einem bifunktionellen
Proteinreagens umgesetzt werden, ehe die endgültige Bindung des Proteins erfolgt Derartige Verbindungen :o
sind z. B. Dialdehyde wie Giutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester,
Diacetale, Bismaleinimide, bifunktionelle
Iminoestcr wie Diätfcyimalonimidat, Dimethyladipiniinidat,
Diepoxide, Dicarbonsäureihloride, insbesondere ix, ^-ungesättigte Dicarbonsäuredichloride, Diiso- y>
cyanate, Diisothiocyanate und dergleichen. Sie enthalten zweckmäßig 2 bis 12 C-Atome, können jedoch auch
längerkettig sein. Ein solches zweites Zwischenglied kann entfallen, wenn die Iminchloridgruppe direkt mit
einem heterobifunktionellen Reagens umgesetzt wird, so dessen eine Funktion aus der primären Aminogruppe
und die andere Funktion aus einer geschützten Funktion besteht, die in freier Form mit Proteinen reagieren kann,
z. B. Acetal, sauer bzw. hydrogenolytisch bzw. schwach basisch verseifbare Ester, oder einer unreaktiven r,
Vorstufe für eine solche Funktion wie z. B. Nitril für Iminoester, Olefine zu Epoxiden und andere.
Die Umsetzung des Iminchlorids mit der wenigstens eine Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Zwischenverbindung
erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wenn die Zwischenverbindung (Spacer) nicht
selbs. flüssig ist, anderenfalls zweckmäßig in der Zwischenverbindung selbst als flüssige Phase. Auch eine
Umsetzung in wäßrigem Medium :st möglich, da die primäre Aminogruppe rascher mit dem Iminchlorid a;
reagiert als die OH-Gruppe. Ist die primäre Aminogruppe
an eine Säureamidgruppe gebunden, handelt es sich also um ein Hydrazid, so wird in Lösungsmitteln wie
Dimethylsulfoxid, Formamid und Dimethylformamid gearbeitet. Auch andere stark polare Lösungsmittel ->o
können in diesem Falle verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Immobilisierung bzw. die Fixierung biologisch aktiver
Proteine an Trägermaterialien, die sich durch einen Gehalt von sekundären Aminogruppen im Molekül 5=
auszeichnen, in besonders schonender Weise und unter Erhalt der vorteilhaften Eigenschaften insbesondere der
Oberflächeneigenschaften dieser Trägermaterialien. Das Verfahren eignet sich sowohl zur direkten
Kupplung der Proteine an die intermediär gebildeten t,o Iminchloridgruppen als auch zur Kupplung der Proteine
über Zwischenverbindungen (Spacern), die es erlauben, das Protein in einem gewissen Abstand zum eigentlichen
Trägermolekül zu halten.
Eine weitere Ausführun§;sform der Erfindung besteht
darin, eine Trägeroberfläche wie ein Gewebe, Fäden, Reagensgläser oder andere beliebige gewünschte
Oberflächen mit einer Klebeschicht zu versehe!, und
nach dem Verfahren der elektrischen Beflockung Polyamidflints, -flocken u. dergl. aufzubringen. Die
derartig hergestellte große Oberfläche ergibt dann bei der Proteinfixierung, gemäß Erfindung, eine hohe
spezifische Aktivität pro qcm des beflockten Trägers.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:
Beispiel 1 und 2
Je 2 Meter Nylon-6-Schlauch, Innendurchmesser
1 mm werden mit absolutem Methanol und anschließend mit absolutem Methylenchlorid gespült, um
Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Dann wird der Schlauch auf -4O0C vorgekühlt und mit einer -WC
kalten 5%igen Lösung von PCl5 in CCU gefüllt Die exakte Einhaltung der Temperatur ist nicht kritisch,
jedoch werden tiefe Temperaturen ab -200C bevorzugt. Die PCIs-Lösung wird nach 5 Std. abgesaugt und
mit trockenem CCU wird überschüssiges Reagens ausgespült. Dann wird Äthylendiamin (bzw. eine 2%ige
Löfung von Oxalsäure-dihydrazid in Dimeihylsulfoxid)
eingefüllt. Nach 2stündiger- Steher/ mit Amin (bzw. Hydrazid-Lösung) wird der Sch'auch über Nacht mit
Wasser gespült Dann wird der Schlauch mit absolutem Dioxan gespült, um Wasserreste zu entfernen und eine
Lösung von 50 mg Äthylenglykol-bis-propionsäure-bis-
\ydroxysucciminidester in 2,5 ml Dioxan + 0,5 ml N-Äthylmorpholin eingefüllt Nach 30 Minuten wird die
Lösung abgesaugt und mit 0,1 molarem Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, gespült Dann wird eine Lösung von 2 mg
Glucosedehydrogenase in 1 m; Triäthanolamin-Puffer,
pH 8,5, eingefüllt und 3 Std. bei 4° C stehen gelassen.
Danach wird mit 5 1 0,1 molarem Triäthanolamin-Puffer,
pH 8,5, der einmolar an NaCl ist, gespült. Der Schlauch weist anschließend eine Aktivität von 1,5 U/m (Aminschlauch)
bzw. 1,6 U/m (Oxalsäurehydrazid-Schlauch) auf.
2 Meter Nylon-6-Schlauch werden v/k in Beispiel 1
aktiviert Bei der Enzymfixierung wird eine Lösung von
2 mg GOD in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,8, verwendet und wie in Beispiel 1 anschließend gespült Wenn mit
einer Durchflußgeschwindigkeit von 7 ml/min getestet wird, weist der Schlauch eine Aktivität von 1,5 U/m auf.
50 g Nylon-6-Granulat werden mit absolutem Methanol
und anschließend mit absolutem Methylenchlorid gespült, um Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Das auf
-400C vorgekühlte Granulat wird mit einer -4O0C
kalten 5°/oigen Lösung von PCI5 in CCU versetzt und gerührt. Nach 5 Std. Rühren bei -4O0C wird abgesaugt
und mit trockenem CCU überschüssiges Reagens ausgewaschen. Dann wird das Granulat mit einer
20%igen Lesung von Hexamethylendiamin in CH3OH versetzt und nach 2 Std. abgesaugt. Anschließend wird
das Granulat in eine Säule gefüllt und über Nacht mit Wasser gespült. Dann wird das Granulat 12 Min. mit
einer 10%igen Glutardialdehyd-Lösung in 0,2molarem Borat-Puffer, pH 8,5, gerührt. Anschließend wird
abgesaugt und mit 0,1 molarem Phosphat Puffer, pH 7,8, gespült. 10 g des aktivierten Granulats werden dann mit
einer Lösung von 80 mg GOD in 40 ml O.lmolarcm Phosphat-Puffer, pH 7,8, versetzt und 3 Std. bei 40C
gerührt. Das Granulat wird anschließend in eine Säule gefüllt und mit 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,8, der
einmolar an NaCI ist, gewaschen. Das Granulat weist anschließend eine Aktivität von 240 U/g auf.
2 m Nylonschlauch, Innendurchmesser 1 mm wurden auf -3O0C gekühlt und mit einer -300C kalten
IO°/oigen Lösung von PCl5 in CCU gefüllt. Nach 5 Std.
wird mit trockenem Methylenchlorid gespült und sofort anschließend eine wäßrige Lösung von Glucoseoxidase
mit einer Konzentration von 5 mg GOD/ml 0,3molarem TRA Puffer, pH 8,0, eingefüllt. Nach 3 Std. bei 4°C wird
der Schlauch mit einer !molaren Lösung von NaCI in 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,0, gespült. Die
Aktivität des so hergestellten GOD-Schlauches liegt bei 0,15 U/m, wenn mit einer Durchflußgeschwindigkeit
von 7 ml/min getestet wird.
2 m Nylonschlauch werden wie in Beispiel I aktiviert. Als Spacer wird Bernsteinsaurehydrazid (U,j-proz.-Losung
in Dimethylsulfoxid) und als bifunktionelles Proteinreagens Glutardialdehyd verwendet. Zur Fixierung
wird eine Lösung von 2 mg Glycerokinase in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7, 8, verwendet und anschließend,
wie in Beispiel 1, gespült. Wenn mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 7 ml/min getestet wird, weist der
Schlauch eine Aktivität von 0,4 U/m auf.
5 g Nylon-6-Granulat werden in 20 ml Tetrachlorkohlenstoff
suspendiert. Dann wird bei Raumtemperatur 25 • Minuten lang Phosgen durch die Suspension durchgeperll,
anschließend das Nylongranulat mit Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und das erhaltene Nylonpolyminchlorid
mit einer Lösung von 10 mg Glucoseoxidase in 10 ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, versetzt. Das
in Granulat weist nach Waschen, wie in Beispiel 4, eine
Aktivität von 50 U/g auf.
Beispiel 8
(nachgereicht)
(nachgereicht)
Mit Klebstoff versehene und anschließend mit Nylonflints beflockte Fäden werden, wie in Beispiel 1,
mit Phosphorpentachlorid aktiviert. Als Spacer wird Äthylendiamin und als bifunktionelles Proteinreagens
ή Glutardialdehyd verwendet. Zur Fixierung wird eine
Losung von Ϊ mg GUD in I mi Phosphat-Puffer, pH 7,8,
verwendet und anschließend gespült. Ein cm des befleckten Fadens weist anschließend eine Aktivität von
0,73 U auf. Wird dasselbe Verfahren ohne Verwendung
.'■> eines Spacers durchgeführt und das aktive Polyiminchlorid-Derivat
direkt zur Fixierung der GOD verwendet, so wird nach dem Waschen eine Aktivität von 0,35
U/cm des beflockten Fadens festgestellt.
Claims (1)
1. Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine, dadurch gekennzeichnet,
daß eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Aminogruppen bei Temperaturen zwischen - 80
und 20° C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter Überführung von sekundären Aminogruppen
in Iminchloridgruppen der allgemeinen ι ο Formel I
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