DE2603319A1 - Verfahren zur fixierung von proteinen an traegern - Google Patents

Verfahren zur fixierung von proteinen an traegern

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DE2603319A1 DE19762603319 DE2603319A DE2603319A1 DE 2603319 A1 DE2603319 A1 DE 2603319A1 DE 19762603319 DE19762603319 DE 19762603319 DE 2603319 A DE2603319 A DE 2603319A DE 2603319 A1 DE2603319 A1 DE 2603319A1
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Description

Patentanwälte
D'pl. Ing. H. V/ixkmann, Dip!. Phys. Dr. K, Fin-''a Dipl. Ing. F. Λ. Weickmann, Dipl. Chcm. B, \, HAX y 8 München 80, Wiihfciiaße Z?
BOEHRINGERMAIiNHEIMGMBH, 68 MANNHEIM 31, Sandhof er Str. --112-132
Verfahren zur Fixierung von Proteinen an Trägern
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Fixierung von Proteinen, insbesondere von biologisch aktiven Proteinen an flüssigen oder festen Trägermaterialien.
Die Fixierung bzw. Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen wie Enzymen, Hormonen, zur Teilnahme an Antigen-Antikörperreaktionen und Hapten-Antikörperreaktionen befähigten Substanzen, Gerinnungsfaktoren und dergleichen, insbesondere im Rahmen der präparativen und der analytischen Chemie, hat in den vergangenen Jahren große Bedeutung erlangt. Es v/urden bereits zahlreiche Fixierungsverfahren entwickelt. Trotzdem zeigt es sich, daß ständig neue Fixierungsprobleme auftauchen, die mit den bisher bekannten Methoden nicht befriedigend gelöst werden können. Hierauf ist es auch zurückzuführen, daß bisher trotz der ohne weiteres einsehbaren Vorteile der Fixierung von biologisch aktiven Proteinen an Trägermaterialien auf vielen Gebieten die Einführung der fixierten Proteine, in die Praxis nur zögernd erfolgte und sich der er- , wartete breite Durchbruch noch nicht realisierte.
Hinzu kommt weiter, daß die meisten Immobilisierungsmethoden nur für bestimmte Trägermaterialien brauchbar sind oder die Herstellung des Trägers durch Polymerisation aus wässriger Lösung in Gegenwart des bio-
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logisch aktiven Proteins ei fördern (Protein-Copolymerisation) , was eber.ialln die brauchbaren Trägermaterialien stark beschränkt.
Von besonderem Interesse als Trägermaterialien für immobilisierte aktive Proteine wären Substanzen, welche sekundäre Aminogruppen enthalten. Hierzu gehören einerseits verschiedene Polymerisate, die sich durch besonders günstige mechanische und chemische Eigenschaften auszeichnen, wie z. B. die Polyamide, Polyurethane und andererseits polypeptidartige Strukturen, wie Polyaminosäuren und dergleichen. Derartige Substanzen mit sekundären Aminogruppen weisen eine gewisse chemische Ähnlichkeit mit den Proteinstrukturen auf, insbesondere hinsichtlich ihrer Ladungsverteilung, so daß hier negative Auswirkungen auf die biologische Aktivität der daran immobilisierten Enzyme nicht zu erwarten sind oder gering bleiben, soweit keine sonstigen Gruppen darin vorhanden sind,welche besonders nachteilig auf die Aktivität von Proteinen einwirken.
Es ist bereits bekannt, daß Imidoester, die sich leicht aus sekundären Aminen erhalten lassen, spezifisch mit den Aminogruppen von Proteinen unter Bildung von Amidinostrukturen reagieren (vergl. z.B. Colowick-Kaplan "Methods in Enzymology", Band 25, Seite 646-648). Es ist auch bekannt, daß man Polyamide mit starken Alkylierungsmitteln in die Polyiminoester überführen kann (US-PS 3 340 210). Ein wesentlicher Nachteil derartiger Iminoester für die Proteinfixierung besteht jedoch darin, daß sie in den Lösungsmitteln löslich oder zumindest quellbar sind. Dies führt zu starker Klebrigkeif, ' die insbesondere das Arbeiten mit. Granulat, Folien, Schläuchen und ähnlichen Formkörpern wegen der auftretenden Verklebung stark erschwert oder gar unmöglich macht.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zu schaffen, welches die Fixierung von biologisch aktiven Proteinen unter Aktivitätserhalt an Substanzen, die mindestens zwei sekundäre Aminogruppen enthalten, ermöglicht und welches die oben erwähnten Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist.
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Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Aminogruppen bei Temperaturen zwischen -80 und 20° C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter überführung von sekundären Aminogruppen in Iminchloridgruppen der allgemeinen Formel I
R - C = N - R1
Cl
worin R und R, aliphatische, aromatische oder aliphatischaromatische Reste darstellen, und das so erhaltene Produkt
a) in wässrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt v/ird oder
b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung, gegebenenfalls in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel, umgesetzt wird und das dabei erhaltene Produkt mit Gruppen der allgemeinen Formel II
R - C = N - R1
NH - R2-X
worin R2 eine Alkylengruppe,eine ^1CJ -Dioxialkylengruppe oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomen und X eine primärt Aminogruppe oder eine zur Proteinbindung geeignete Funktion bedeutet, entweder zuerst mit einem bifunktionellen Proteinreagens und danach mit dem Protein oder direkt mit dem Protein zur Reaktion gebracht wird.
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Die erfindungsgemäße Iminchlorierungsreaktion wird vorzugsweise an flüssigen oder festen Polymeren vorgenommen, welche die sekundären Aminogruppen enthalten. Besonders bevorzugt werden hierunter wiederum die Polyamide wie Nylon und Perlon und ähnliche. Ein anderes Beispiel für sekundäre Aminogruppen enthaltendes Polymer ist Polyurethan. f
Die Erfindung ist jedoch nicht auf Polymere beschränkt sondern generell auf alle Verbindungen anwendbar, die als Träger für biologisch aktive Proteine in Betracht
kommen und eine Mehrzahl von sekundären Aminogruppen enthalten wie z. B. Peptide.
Bevorzugtes Chlorierungsmittel für die Herstellung des Iminchlorids ist PCIc Andere geeignete Chlorierungsmittel sind z.B. PCl3, SOCl2, COCl2, POCl3 und SO2Cl2. Die beiden letzteren sind zwar nicht so reaktionsfähig wie PCl5/ sie haben gegenüber letzterem jedoch den Vorteil, daß sie flüssig sind und daher ohne Lösungsmittel eingesetzt werden können. Bei der Umsetzung mit PCl5 ist dagegen ein Lösungsmittel erforderlich. Geeignet sind halogenierte Lösungsmittel wie Dichloräthan, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und ähnliche. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Herstellung des Iminchlorids mit PCI,- in Dichloräthan bei Temperaturen zwischen -38 und 0° C. Diese bevorzugten Bedingungen lassen sich leicht durch Zugabe von Trockeneis zur Dichloräthanlösung (oder der Lösung in einem anderen halogenierten Lösungsmittel) einstellen. Selbstverständlich sind aber auch andere Kühlungsmethoden geeignet.
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R und R.. sind aliphatische, aromatische oder aliphatischaromatische Reste, die weitere sekundäre und tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Sulfhydrylgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen oder Iminchloridgruppen enthalten können. Vorzugsweise bedeuten R und R. geradkettige, verzweigte oder/und cyclische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1 -12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylengruppen oder Alkylphenylgruppen bzw. Alkylenphenylengruppen mit bis zu 6 C-Atomen in der Alkylgruppe, die miteinander durch eine oder mehrere der vorstehend erwähnten Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgruppen verbunden sind, Peptidketten nus natürlichen und/oder synthetischen Aminosäuren oder dergleichen. Typische Beispiele für Verbindungen welche erfindungsgemäß über die Bildung von Tminchloridgruppen mit biologisch aktiven Proteinen gekoppelt v/erden können, sind 6-Polyamid, 6,6-Polyamid, 6,10-PoIyamid, 11-Polyamid, 12-Polyamid, Polycyclamide wie Poly (1,4-cyclohexylendimethylen-superamid), Polydodecanollactam, Wolle, Kasein, Naturseide, Polyarginin und ähnliche.
Unter den synthetischen Polymeren v/erden solche bevorzugt, in denen R und R1 Alkylen- und Cycloalkylengruppen mit 6-12 C-Atomen darstellen, welche durch Amidgruppen miteinander verbunden sind.
Das Iminchlorid kann erfindungsgemäß direkt in einem wässrigen Lösungsmittel mit dem biologisch aktiven Pro— · tein umgesetzt werden. Das biologisch aktive Protein wird dabei zweckmäßig in einem geeigneten wässrigen Puffer gelöst, mit dem festen Iminchlorid zusammengegeben und abreagieren gelassen. Eine derartige Arbeitsweise empfiehlt sich vor allem dann, wenn das Grundgerüst des Imins verzweigt ist, beispielsweise also bei Polyamiden, die Komponenten mit 3, 4 oder noch mehr Funktionen enthalten. Durch die dort auftretenden sterischen Verhältnisse wird die direkte Reaktion zwischen dem Iminchlorid und dem Protein begünstigt.
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Bei geradkettigen Polymeren hingegen erfolgt die Reaktion mit dem Protein zweckmäßig über eine Zwischenverbindung welche mindestens eine primäre Aminogruppe enthält (Spacer).
Die primäre Aminogruppe kann direkt mit einem Kohlenstoffatom verbunden sein oder als Hydrazidgruppe vorliegen, also an eine Säureamidogruppe gebunden vorliegen. Liegen zwei primäre Aminogruppen vor, so sollen die beiden Aminogruppen vorzugsweise durch eine Alkylen-#-£/ tCJ -Dioxialkylen- oder Dxcarbonsäureamidgruppe mit 2-8 C-Atomen voneinander'getrennt sein.
Wird anstelle eines Diamids ein" Monoamid verwendet, so enthält dieses noch eine weitere funktionelle Gruppe, vorzugsweise eine zur Herstellung einer Bindung mit einem Protein geeignete Gruppe. Diese zweite Gruppe der Zwischenverbindung, gleichgültig ob es sich um eine primäre Aminogruppe oder eine andere Gruppe handelt, kann wieder mit einem bifunktionellen Proteinreagens umgesetzt werden, ehe die endgültige Bindung des Proteins erfolgt. Derartige Verbindungen sind z.B. Dialdehyde wie Glutardialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetale, Bismaleinimide, bifunktionelle Iminoester wie Diäthylmalonimidat, Dimethyladipinimidat, Diepoxide, Dicarbonsäurechloride, insbesondere.-/^, ß-ungesättigte Dicarbonsäuredichloride, Diisocyanate, Diisothiocyanate und dergleichen. Sie enthalten zweckmäßig 2 bis 12 C-Atome, können jedoch auch längerkettig sein. " Ein solches zweites Zwischenglied kann entfallen, wenn die Iminchloridgruppe direkt mit einem heterobifunktionellen Reagens umgesetzt wird, dessen eine Funktion aus der primären Aminogruppe und die andere Funktion aus einer geschützten Funktion besteht, die in freier Form mit Proteinen reagieren kann, z. B. Acetal, sauer bzw. hydrogenolytisch bzw. schwach basisch verseifbare Ester, oder einer unreaktiven Vorstufe für eine solche Funktion wie z. B. Nitril für Iminoester, Olefine zu Epoxiden und andere.
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j NACHQERBOHTJ
Die Umsetzung des Iminchlorids rait der wenigstens eine Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Zwischenverbindung erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wenn die Zwischenverbindung (Spacer) nicht selbst flüssig ist, anderenfalls zweckmäßig in der Zwischenverbindung selbst als flüssige Phase. Auch eine Umsetzung in wässrigem Medium ist möglich, da die primäre Aminogruppe rascher mit dem Iminchlorid reagiert als die OH-Gruppe. Ist die primäre Aminogruppe an eine Säureamidgruppe gebunden, handelt es sich also um ein Hydrazid, so wird in Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid. Formamid und Dimethylformamid gearbeitet. Auch andere stark polare Lösungsmittel können in diesem Falle verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Immobilisierung bzw. die Fixierung biologisch aktiver Proteine an Trägermaterialien, die sich durch einen Gehalt von sekundären Aminogruppen im Molekül auszeichnen, in besonders schonender Weise und unter Erhalt der vorteilhaften
ι Eigenschaften, insbesondere der Oberflächeneigenschaften dieser Trägermaterialien. Das Verfahren eignet sich sowohl zur direkten Kupplung der Proteine an die intermediär gebildeten Iminchloridgruppen als auch zur Kupplung der Proteine über Zwischenverbindungen (Spacern), die es erlauben, das Protein in einem gewissen Abstand zum eigentlichen Trägermolekül zu halten.
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, eine Trägeroberfläche wie ein Gewebe, Fäden, Reagensgläser oder andere beliebige gewünschte Oberflächen mit einer Kleberschicht zu versehen und nach dem Verfahren der elektrischen Beflockung PoIyamidflints,-flocken u. dergl. aufzubringen. Die derartig Hergestellte große Oberfläche ergibt dann bei der Proteinfixierung, gemäß Erfindung, eine hohe spezifische Aktivität pro qcm des beflockten Trägers.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter: Beispiel 1 und 2:
Je 2 Meter Nylon-6-Schlauch, Innendurchmesser 1 mm, werden mit absolutem Methanol und anschließend mit absolutem Methylenchlorid gespült, um Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Dann wird der Schlauch auf -40°C vorgekühlt und mit einer -400C kalten 5 %-igen Lösung von PCl5 in CCl. gefüllt. Die exakte Einhaltung der Temperatur ist nicht kritisch, jedoch werden tiefe Temperaturen ab -20°C bevorzugt. Die PClr-Lösung wird
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nach 5 Std. abgesaugt und nüt trockenem CCl. wird überschüssiges Reagens ausgespült. Dann wird Äthylendiamin (bzw. eine 2 %-ige Lösung von Oxalsäure-dihydrazid in Dimethylsulfoxid) eingefüllt. Nach 2-stündigem Stehen mit Amin (bzw. Hydrazid-Lösung) wird der Schlauch über Nacht mit Wasser gespült. Dann wird der Schlauch mit absolutem Dioxan gespült, um Wasserreste zu entfernen, und eine Lösung von 50 mg Äthylenqrlykol-bis-propionsäure-bishydroxysucciminidester in 2,5 ml Dioxan + 0,5 ml N-A'thylmorpholin eingefüllt. Nach 30 Minuten wird die Lösung abgesaugt und mit 0,1 molarem Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, gespült. Dann wird eine Lösung von 2 mg Glucosedehydrogenase in 1 ml Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, eingefüllt und 3 Std. bei 4 C stehen gelassen. Danach wird mit 5 1 0,1 molarem Triäthanolamin-Puffer, pH 8,5, der einmolar an NaCl ist, gespült. Der Schlauch weist anschließend eine Aktivität von 1,5 U/m (Aminschlauch) bzw. 1,6 ü/m (Oxalsäurehydrazid-Schlauch) auf.
Beispiel 3
2 Meter Nylon-6-Schlauch werden wie in Beispiel 1 aktiviert. Bei der Enzymfixierung wird eine Lösung von 2 mg GOD in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,8, verwendet und wie in Beispiel 1 anschließend gespült. Wenn mit einer Durchf lußgeschv/indigkeit von 7 ml/min getestet wird, weist der Schlauch eine Aktivität von 1,5 U/m auf.
Beispiel 4 -
50 g Nylon-6-Granulat werden mit absolutem Methanol und" anschließend mit absolutem Methylenchlorid gespült, um Feuchtigkeitsspuren zu entfernen. Das auf -400C vorgekühlte Granulat wird mit einer -400C kalten 5 %-igen Lösung von PCl5 in CCl4 versetzt und gerührt. Nach 5 Std. Rühren bei -40°C wird abgesaugt und mit trockenem CCl4 überschüssiges Reagens ausgewaschen. Dann wird das Granulat mit einer 20 %-igen Lösung von Hexamethylendiamin in CH3OH
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-Ji-
"3
versetzt und nach 2 Std. abgesaugt. Anschließend wird das Granulat in eine Säule gefüllt und über Nacht mit Wasser gespült. Dann wird das Granulat 12 Min. mit einer 10 %-igen Glutardialdehyd-Lösung in 0,2 molarem Borat-Puffer, pH 8,5, gerührt. Anschließend wird abgesaugt und mit 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,8, gespült. 10 g des aktivierten Granulats werden dann mit einer Lösung von 80 mg GOD in 40 ml 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,8, versetzt und 3 Std. bei 4°C gerührt. Das Granulat wird anschließend in eine Säule gefüllt und mit 0,1 molarem Phosphat-Puffer, pH 7,8, der einmolar an NaCl ist, gewaschen. Das Granulat weist anschließend eine Aktivität von 240 U/g auf.
Beispiel 5:
2 m Nylonschlauch, Innendurchmesser 1 mm wurden auf -30°C gekühlt und mit einer -30°C kalten 10 %-igen Lösung von PCl5 in CCl. gefüllt. Nach 5 Std. wird mit trockenem Methylenchlorid gespült und sofort anschließend eine wässrige Lösung von Glucoseoxidase mit einer Konzentration von 5 mg GOD/ml 0,3 molarem TRA-Puffer, pH 8,0, eingefüllt. Nach 3 Std. bei 4°C wird der Schlauch mit einer 1 molaren Lösung von NaCl in 0,1 molarem Phosphat-Puffer, ph 7,0, gespült. Die Aktivität des so hergestellten GOD-Schlauches liegt bei 0,15 U/m, wenn mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 7 ml/min getestet wird.
Beispiel 6:
2 m Nylonschlauch werden wie in Beispiel 1 aktiviert. Als Spacer wird Bernsteinsäurehydrazid (0,3-proz.-Lösung.in Dimethylsulfoxid) und als bifunktionelles Proteinreagens Glutardialdehyd verwendet. Zur Fixierung wird eine Lösung von 2 mg Glycerokinase in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,8, verwendet und anschließend, wie in Beispiel 1, gespült. Wenn mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 7 ml/min getestet wird, weist der Schlauch eine Aktivität von 0,4 U/m auf.
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NACHGEREiCHT
Beispiel 7:
5 g Nylon-6-Granulat werden in 20 ml Tetrachlorkohlenstoff suspendiert. Dann wird bei Raumtemperatur 25 Minuten lang Phosgen durch die Suspension durchgeperlt, anschließend das Nylongranulat mit Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und das erhaltene Nylonpolyiminchlorid mit einer Lösung von 10 mg Glucoseoxidase in 10 ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 7,8, versetzt. Das Granulat weist nach Waschen, wie in Beispiel '4, eine Aktivität von 50 U/g auf.
Beispiel 8:
Mit Klebstoff versehene und anschließend mit Nylonflints beflockte Fäden werden, wie in Beispiel 1, mit Phosphorpentachlorid aktiviert. Als Spacer wird A'thylendiamin und als bifunktionelles Proteinreagens Glutardialdehyd verwendet. Zur Fixierung wird eine Lösung von 2 mg GOD in 1 ml Phosphat-Puffer, pH 7,8, verwendet und anschließend gespült. Ein cm des beflockten Fadens weist anschließend eine Aktivität von 0,73 U auf. Wird dasselbe verfahren ohne Verwendung eines Spacers durchgeführt und das aktive Polyiminchlorid-Derivat direkt zur Fixierung der GOD verwendet, so wird nach dem Waschen eine Aktivität von 0,35 U/cm des beflockten Fadens festgestellt.
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Claims (10)

  1. PATENT h !.SPRÜCHE
    Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung mit mindestens zwei sekundären Aminogruppen bei Temperaturen zwischen -80 und 20°C mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird unter Überführung von sekundären Aminogruppen in Iminchloridgruppen der allgemeinen Formel I
    R-C = N-R. I ι Cl
    worin R und R1 aliphatische, aromatische oder aliphatischaroraatische Reste darstellen, und das so erhaltene Produkt
    a) in wässrigem Lösungsmittel direkt mit einem biologisch aktiven Protein umgesetzt wird oder
    b) mit einer wenigstens eine primäre Aminogruppe enthaltenden bifunktionellen Verbindung, gegebenenfalls in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel, umgesetzt wird,und das dabei erhaltene Produkt mit Gruppen der allgemeinen Formel II
    R - C = N - R1 I '
    NII - R7-X .
    Worin R2 eine Alkylengruppe, eine^^J-Dioxialkylengruppe oder eine Dicarbonsäureamidgruppe mit 2 bis 8 C-Atomeh und X eine primäre Aminogruppe oder eine zur Proteinbindung" geeignete Funktion bedeutet entweder zuerst mit einem bifunktionellen Proteinreagens und danach mit dem Protein oder direkt mit dem Protein zur Reaktion gebracht wird.
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    ORIGINAL INSPECTED
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß feste Polymere als Trägermaterialien verwendet werden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial Polyamide verwendet werden.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein als Träger verwendet wird.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chlorierungsmittel PCl5, PCl3, SOCl2, COCl2, POCl2 oder SO2Cl2 verwendet werden.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    daß R und R1 sekundäre Aminogruppen, tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen, Sulfhydrylgruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen und/oder Iminchloridgruppen enthalten.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
    daß R und R1 geradkettige, verzweigte oder/und cyclische Alkylgruppen bzw. Alkylengruppen mit 1-12 C-Atomen, Phenylgruppen bzw. Phenylengruppen oder Alkylphenyl- , gruppen bzw. Alkylphenylengruppen mit bis zu 6 C-Atomen in der Alkylgruppe darstellen, die miteinander durch eine oder mehrere sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, Estergruppen, Amidgruppen oder Iminchloridgruppen verbunden sind.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine Acetalgruppe, Estergruppe, Nitrilgruppe oder
    Olefingruppe darstellt.
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  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bifunktionelle Proteinreagens ein Dialdehyd, Dihydroxysuccinimidester, Diacetal,^Bismaleinimid, bifunktioneller Iminoester, Diepoxid oder/und Dicarbonsäure, Dichlorid, Diisocyanat oder/und Diisothiocyanat ist.
  10. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Trägermaterial verwendet wird, welches eine mit Polyamidflints,-fasern oder flocken beflockte Oberfläche aufweist.
    ·2
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