DE2607766A1 - Verfahren zur herstellung einer verbindung zwischen einem polyhydroxylpolymeren und einer primaere aminogruppen enthaltenden substanz - Google Patents
Verfahren zur herstellung einer verbindung zwischen einem polyhydroxylpolymeren und einer primaere aminogruppen enthaltenden substanzInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
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- C08F8/32—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups by reaction with amines
Description
BEHRINGWERKE AiCTIENGESELLSCHAPT, 355 Marburg(Lahn)
Aktenzeichen: Hoe 76/B OO7 - Ma 227
Datum: 2k, Februar 1976
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung zwischen einem
Polyhydroxylpolymeren und einer primäre Aminogruppen enthaltenden Substanz.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung
zwischen einem synthetischen, vicinale Hydrylgruppen enthaltenden Polymeren (im folgenden einfach als "das Polymere"
bezeichnet), insbesondere des Polyvinylenglykols mit einer primäre Aminogruppen enthaltenden Substanz, vorzugsweise
einem biologisch wirksamen Stoff, sowie die Verwendung der so erhaltenen trägergebundenen Substanz als spezifisches
Adsorbens und/oder als selektiver Reaktionskatalysator.
Zwar ist es bekannt, Proteine wie Enzyme, Antigene, Antikörper und Verbindungen, die mit biologisch aktiven Substanzen eine
Wechselwirkung einzugehen vermögen, an unlösliche polymere Substanzen zu binden, doch zeigen die dabei eingesetzten polymeren
Substanzen häufig selbst Wechselwirkungen mit den biologisch aktiven Stoffen. Eine derartige Wechselwirkung ist jedoch
unerwünscht. Es hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, immer wieder geeignete hinre&nhand inerte Polymere als Träger
für die biologisch wirksamen Stoffe zu finden.
709835/0337
Ma 227
In der Patentanmeldung P 24 21 78$. 8 ist Polyhydroxymethylen,
das auch unter der Bezeichnung Polyvinylenglykol bekannt ist, als Träger für biologisch aktive Substanzen beschrieben. Die
Verbindung zwischen dem biologisch wirksamen Stoff und dem Polyvinylenglykol wird gemäss dieser Patentanmeldung durch
Reaktion einerseits der Hydroxylgruppen des Polyvinylenglykols, andererseits bestimmter Gruppierungen der damit zu verbindenden
Substanzen herbeigeführt, wonach eine kovalente Verbindung
zwischen beiden entsteht. Vergleichbare Verfahren führen auch zu biologisch aktiven Verbindungen aus einem Copolymeren des
VinylenglykoIs mit einer biologisch aktiven Substanz entsprechend
einem älteren, noch nicht zum Stand der Technik gehörenden Vorschlag (Patentanmeldung P 25 52 510.4 - Hoe 75/,
B 0i4- Ma 233).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches Verfahren zur Herstellung einer Verbindung zwischen einer primäre
Aminogruppen enthaltenden Substanz und einem synthetischen, vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren, vorzugsweise
dem Polyvinylenglykol zu finden.
Die Aufgabe wurde eEfindungsgemäss gelöst durch Umsetzung
des genannten Polymeren mit einem mittelstarken bis starken Oxidationsmittel mit dem Ziel der Bildung von Aldehydgruppen
und einer darauffolgenden Umsetzung des Reaktionsproduktes mit einer primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindung.
Als Oxidationsmittel im Sinne der vorliegenden Erfindung sind solche zu verstehen, deren Fotentialbereich etwa zwischen +1,0
und +1,5 Volt liegt. Beispiele hierfür sind Verbindungen des
2— 2—
sechswertigen Chroms wie CrO^ oder Cr2O7 ; ferner das MnO2
öder das Cl„. Es können jedoch aich stärkere Oxidationsmittel
mit einem Potential y. +1,5 Volt wie MnOj, O3 oder Ρ£ verwendet
werden.
709835/0337
Ma 227
- ar -
Die Oxidation des Polymeren durch die genannten Oxidationsmittel ist selbstverständlich konzentration- und zeitabhängig.
Das ist bei der Wahl der Reaktionsbedingungen zu beachten· So werden die Oxidationsmittel allgemein in einem
Konzentrationsbereich von 0,01 bis 1,0 M eingesetzt. Bei starken Oxidationsmitteln, deren Potentialbereich *>+1,5 Volt
ist, vird das Oxidationsmittel bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 M angewandt. Oxidationsmittel mit
einem Potentialbereich von etwa +1,0 bis etwa +1,5 Volt werden hingegen vorzugsweise in einer Konzentration von 0,05
M bis 1,0 M eingesetzt.
Die Zeiten für die Einwirkdauer des Oxidationsmittels auf das Polymere richten sich ebenfalls nach dessen Stärke. Sie
liegen für relativ schwache Oxidationsmittel, wie es das System Dimethylsulfoxid/Eisessig darstellt, in der Grössenordnung
von 3-18 Stunden; für das System Dichromat/Schwefelsäure
in der Grössenordnung von 5-60 Minuten und für das
System Perjodat/Wasser 1-15 Minuten. Für andere Oxidationsmittel
gelten je nach deren Stärke sinngemässe Einwirkungsdauern.
In einem Vorversuch lassen sich die Bedingungen für das erforderliche
Maß der Oxidation ermitteln, welche sowohl einen zu weitgehenden oxidativen Abbau des Polymeren vermeiden, als auch
eine ausreichende Menge an umsetzbaren Aldehydgruppen freisetzen.
Da die infragekommenden Polymeren, beispielsweise das Polyvinyl
englykol , chemisch sehr stabile Verbindungen darstellen, ist das Dispersionsmittel, in dem die Umsetzung mit dem
Oxydationsmittel vorgenommen wird, nicht sehr kritisch. So haben sich beispielsweise Umsetzungen von Polyvinylenglykol
mit Perjodat in Wasser, mit Dichromat in etwa 0,1 normaler
Schwefelsäure und mit Dimethylsulfoxid in Eisessig besonders
bewährt.
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Ma 227
Es wurde festgestellt, daß die Einwirkung von Oxidationsmitteln auf synthetische, vicinale Hydroxylgruppen enthaltende Polymere
wie das Polyvinylenglykol zur Ausbildung von Aldehydgruppen ^ührt. Mit gängxgen Nachweisreakfcionen für die Aldehyd- bzw,
Carbony!gruppe kann z.B. die Bildung von Phenylhydrazon, Seinicarbazon
oder von Oxim gezeigt werden- Es ist demnach zweckmäßig, im Anschluß an die Oxidation des Polymeren
durch Überprüfung der Aldehydbildung mit Hilfe von z.B. Phenylhydrazon
in' Essigsäure oder einem zu einem Farbumschlag führenden
Carbonylindikator nachzuweisen, dass eine für die weitere
Umsetzung ausreichende Anzahl von Aldehydgruppen gebildet wurde.. Zudem wird die Konsistenz des Oxidationsproduktes mit dem
Ziel überprüft ι festzustllen, dass kein Abbau des Produktes
in einem unerwünschten Maße durch die Oxidation erfolgt ist. Dies geschieht z.B. durch vergleichende Trockengewichtsbestimmung
des Polymeren vor und nach der Einwirkung des Oxidationsmittels. Der Unterschied sollte zweckmässig nicht mehr als etwa
betragen.
Das Reaktionsprodukt der Oxidation kann mit primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindungen direkt umgesetzt werden. Bekanntlich
stellt die Mehrzahl der biologisch wirksamen Stoffe Proteine dar, welche primäre Aminogruppen-enthalten. Mit derartigen
Verbindungen ist eine direkte Umsetzung des oxidierten Polymeren durchführbar. Statt einer biologisch aktiven
Verbindung wie z.B. einem Enzym, Aktivator, Inhibitor, Antigen oder Antikörper, einem Plasmaprotein, einem Polypeptid, einem
Peptid oder einer Aminosäure können jedoch mit dem Oxidationsprodukt, des Polymeren auch solche Aminogruppen enthaltende
Verbindungen umgesetzt werden, welche mit biologisch wirksamen Stoffen zu reagieren vermögen. Häufig zeigen diese
Stoffe keine direkte biologische Wirksamkeit.- Sie werden jedoch
zumeist als deren Inhibitoren oder Antagoriisten. anzusehen sein ,
709835/0337
Ma
als Substrate für Enzyme oder auch als Antikörper gegen Antigene
oder Haptene. Neben Proteinen und Peptiden können allgemein alle organische et-Aminogruppen enthaltende Verbindungen mit
den oxidierten Polymeren direkt umgesetzt verden.
Es ist selbstverständlich nicht erforderlich, daß der biologisch
wirksame Stoff ein Enzym, ein Aktivator, ein Inhibitor, ein Antigen, ein Antikörper, ein Plasmaprotein, eine Blutgruppensubstanz,
ein Peptidhormon, ein Peptid oder eine Aminosäure ist, es kann auch ein natürlicher oder synthetischer
Stoff sein, dessen Wechselwirkung mit einerder genannten Substanzen
bekanntgeworden ist und der demnach gemäss einer in Fachkreisen gängigen Ausdrucksweise als Effektor bezeichnet
werden kann. Bekannte Effektoren sind z.B« Aminobenzamidin, Chlorbenzylamin und ^-Aminophenyl-Quecksilber-II-acetat.
In den Fällen, in denen die mit dem Oxxdationsprodukt des Polymeren umzusetzende biologisch wirksame Verbindung
selbst keine primären Aminogruppen trägt, kann die Verbindung über eine Zwischenstufe durchgeführt werden, worin eine bifunktionelle,
eine primäre Aminogruppe enthaltende Verbindung ·. Kit dein Oxidationsprodukt sur Umsetzung koiümt", wonach die zweite
furiktionelle Gruppe mit einer Gruppierung; des biologisch wirksamen
Stoffes umgesetzt werden kann. Verbindungen dieser Art sind beispielsweise die als Spacer bezeichneten Verbindungen,
welche den Abstand der biologisch wirksamen Gruppierung vom Trägermolekül vergrössern. Dies kann z.B. durch Hexamethylendiamin
erreicht werden, ferner mit diazotierbare Arylaminogruppen
enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder mit Schwefelsäureestern
von ß-Hydroxyäthylsulfonen. Beispielsweise kann
nach einer Umsetzung des oxidierten Polymeren mit Glutathion und nachfolgender Umsetzung des Reaktionsproduktes z.B. mit
2,2'-Dipyridyl-disulfidi und einer Verbindung mit freien
Sulfhydrilgruppen eine Verknüpfung über eine Disulfidbrücke erreicht werden. Glutathion ist dabei der Spacer.
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- S -
Ma 227
.Über derartige Zwischenverbindungen ist es selbstverständlich
möglich, das Oxidationsprodukt des Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren, nicht nur mit biologisch wirksamen Stoffen, sondern
auch mit -- , weiteren Polymeren umzusetzen. Bevorzugt werden Verknüpfungen der Oxidationsprodukte der Polymeren,
untereinander vorgenommen. Damit ist auch eine Beeinflussung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Trägers zu erreichen.
Hierfür werden beispielsweise biftiriktionelle Verbindungen,
die sowohl mit den Hydroxylgruppen des .einen Polymeren als > auch mit einer Gruppierung des zweiten Polymeren zu reagieren
vermögen, verwendet. Auf die gleiche Weise können Polyhydroxyl-
, . , zunächst . . .. ·, -.. Λ · j . ■ ··*
Verbindungen/untereinander verknüpft und die Oxidation im Anschluß
daran vorgenommen werden. Dies hat Bedeutung bei wasserlöslichen Polyhydroxy !verbindungen, die nach diesen Verfahren
in eine -wasserunlösliche Form überführt werden können. Geeignete Verbindungen hierfür sind Diisocyanate wie Hexamethylendiisocyanat,
Bisepoxide wie Hexamethylenbisepoxid oder Vorstufen von Bisepoxlden wie Dibrompropanol und EpI-chlorhydrin.
Bei der Umsetzung zwischen den Aldehydgruppen des oxidierten Po*ylymeren
und den primären Aminogruppen der Reaktionspartner entstehen Schiffsche Basen. Diese Verbindungen werden zweekmässig
durch Reduktion stabilisiert. Man verwendet dazu in bekannter Weise als Reduktionsmittel komplexe Borhydrid? wie Natriumborhydrid
und Cyanborhydrid, komplexe Metallhydride wie Lithiumaluminiumhydrid
sowie Raney-Nickel als Beispiel für einen Katalysator für die Hydrierung mit ¥asserstoff.
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- f - Ma 227
Gegenstand der Erfindung sind auch die Verbindungen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zwischen synthetischen, vicinale
Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren und Verbindungen mit'primären Aminogruppen, vorzugsweise biologisch aktiven
Stoffen, hergestellt werden, sowie die Verwendung der Verbindungen
als spezifische Adsorbenzien oder als selektive Reaktionskatalysatoren.
Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet hierfür stellt sich in der Affinitätschromatographie dar. Dabei werden an die
durch das erfindungsgemäße Verfahren wasserunlöslich gemachten Effektoren in.spezifischen Affinitätsreaktionen andere Substanzen
gebunden, wonach diese in hoher Reinheit wieder eluiert werden können. Trägergebundene Enzyme bieten gegenüber gelösten
Enzymen den Vorteil, daß sie bei Stoffumwandlungen in analytischen und präparativen Prozessen die Reaktionsprodukte nicht
durch Enzyme kontaminieren. .
.Die Erfindung soll an nachstehend angeführten Beispielen näher
erläutert werden. ■■ ·
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BEISPIELE . -«-. ' *** 227
1. Oxidative Aktivierung .von Polyyinylenglykol (PVG)
Man suspendiert 1 g *PVG in 50 ml einer 0,05 m Natrium-meta-'
periodafc—Lösung und rührt 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Danach wird die Suspension abgesaugt und mehrfach mit dest.
Wasser gewaschen. .. . -
2._Pi_rekte„Verbindung von., IgG^.än...den_joxidatiy nach 1. aktivier-
- ten Träger - - - - ■
Der aktivierte Trager wird in 59 ml 0,67 m Phosphatpuffer
pH 7,5,- in dem ca. 40 mg IgG gelöst sind, suspendiert und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz bleibt.
bei 4°C über Nacht stehen.. .
- Nach der Umsetzung wird die Suspension abzentrifugiert und
mit 30 ml NaCl gewaschen. Auf diese Weise konnten ca. 18 mg IgG chemisch gebunden werden. . . ■
3. Verbindung von IgG über einen Spacer
2 g Hexamethylendiamin werden in 50 ml dest. Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 2 η HCl auf 8,7 eingestellt.
In dieser Lösung wdLrd 1 g aktiviertes PVG (siehe 1.) suspendiert und 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren reagieren
lassen. . . -.
Das Produkt wird abgesaugt und mit dest. Wasser frei von überschüssigem Amin gewaschen.
Zur Stabilisierung der hydrolyseempfindlichen Schiff sehen
Base wird mit Natriumborhydrid reduziert. Hierzu suspendiert man das Produkt in 50 ml Methanol und tropft ca. 10 ml einer
lOjSigen Lösung von-Natriumborhydrid in Methanol zu. Der
Ansatz wird '15 Minuten unter Rückfluß gekocht, abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
■— *·
... ■. . ORIGINAL INSPECTED
7098 3Έ/033 7'
. - 9 - Ma
Anschließend suspendiert man das Reaktionsprodukt in lOO ml
O,5 nt Natriuiribicarbonat-Lösung pH 10 und gibt 2 g 1-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester
(Para-Baseester) zu. Der Ansatz reagiert 1 Stunde bei 5O-6O°C
unter Rühren. Danach wird das Trägermaterial für biologisch, aktive Stoffe abgesaugt und mit Aceton und Wasser gründlich
gewaschen. Zur Diazotierung wird das Trägermaterial in
ηΙΟ,Ιη HCl suspendiert, auf O°- +50C abgekühlt und ca.
1 ml einer Ο,Ι η NaNO2-Lösung zugetropft. Nach 30 Minuten
Ruhren wird abgesaugt und neutral gewaschen.
" An dieser Stelle kann mit Hilfe von ß-Naphthol überprüft
werden, ob sich das Trägermaterial für die Herstellung einer Verbindung mit einer biologisch aktiven Substanz eignet:
Ein Teil von ca. 0,1 g des diazotierten Trägermaterials wird in
2 ml 0,1 η NaOH-Lösung suspendiert und mit 0,1 g ß-Naphthol
versetzt. Der Träger verfärbt sich augenblicklich orange. Eine intensive Färbung zeigt eine ausreichende Aktivierung
und Eignung für die Umsetzung mit einer kupp lungs fähigen
Substanz an. - ■ '
Die'Hauptmenge des Diazoniumsalzes wird in 59 ml 0,67 m
Phosphatpuffer pH 7,5, in dem 200 mg IgG gelöst sind, suspendiert
und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Kupplung wird das Reaktionsprodukt abzentrifugiert und
mit 1 m NaCl-Lösung frei von überschüssigem Protein gev?aschen.
Die quantitative Untersuchung ergab eine Aufnahme von ca. 16Ο mg IgG.
Wird statt IgG Albumin in den Ansatz der Diazoniumsalzlosung gebracht, werden etwa 120 mg Albumin pro Gramm PVG-Träger
gebunden. ' ■-
4. Quervernetzung von PVG mit Epichlorhydrin
3 g^PVG werden in 250 ml 2 η Natronlauge bei 7O°-8O°C gelöst.
Man versetzt mit 0,6 g Epichlorhydr in, rührt 4 Stunden bei
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Ma 22?
7O°-8O°C und über Nacht bei Raumtemperatur. Danach wird die
Mischung unter schnellem Rühren in 2 1 Wasser gegossen und mit 2 η HCl neutralisiert. Das Produkt wird abgesaugt und
mit Wasser gewaschen.
Die weiteren Umsetzungen können in &r gleichen Weise wie
für das PVG beschrieben durchgeführt werden.
5. Oxidative Aktivierung von PVG mit Kaliumdichromat/Schwefel-'
.säure -
2 g PVG- werden in 100 ml dest. Wasser suspendiert und eine
Lösung von 0,74 g Kaliumdichromat (0,05 m) und 7,5 ml
2 η H SO. in 50 ml dest. Wasser unter Rühren zugetropft. Es
vird 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, das Reaktionsprodukt abzentrifugiert und mit dest. Wasser gewaschen.
- Die weitere Umsetzung mit Hexamethylendiamin und 1-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulforischwefelsäureester
sowie die Diazotierung und Kupplung von Protein erfolgt wie unter 3. beschrieben. .
Bei der quantitativen Untersuchung wurde eine Aufnahme von ca. 100 mg IgG pro Gramm PVG-Träger festgestellt.
S.
Oxidative Aktivierung von PVG mit Dimothylsülfoxyd/Essigsäureanhydrid
2 g PVG werden in einer Mischung von 24 ml Dime thy lsulf oxy d
(DMSO) und 16 ml Eisessig suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Danach wird der Ansatz mit 4OO ml dest. Wasser versetzt,
abgesaugt und mit Aceton und dest. Wasser gewaschen.
Anschließend erfolgt die Einführung des Spacers und die Kupplung des Proteins wie unter 3. beschrieben.
Es wurde eine Aufnahme von 30 mg IgG pro Gramm der Trägersubstanz gemessen.
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Claims (8)
- - Ha 227PATENTANSPRÜCHEi Verfahren zur Herstellung einer Verbindung zwischen einem synthetischen vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren ivnd einer primäre Aminogruppen enthaltenden Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymere mit einem mittelstarken t>is starken Oxidationsmittel bis zur Bildung von in einem Vorversuch als ausreichend ermittelten Menge an Aldehydgruppen behandelt und das Oxidationsprodukt sodann mit der primäre Aminogruppen enthaltenden Substanz umgesetzt wird. .
- 2. Verrohren, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die primäre Aminogruppen enthaltende Substanz ein biologisch wirksamer Stoff* ist oder ein Stoff, der mit einem biologisch wirksamen Stoff zu reagieren vermag.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymere Polyvinyl englykol ist.
- h. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-3, dadurch gekennzeichnet, dass der biologisch wirksame Stoff ein Enzym, Aktivator, Inhibitor, Antigen oder Antikörper, ein Plasmaprotein, eine Blutgruppensubstanz, ein Polypeptid, ein Peptid oder eine Aminosäure, ein natürlicher oder synthetisch hergestellter Effektor ist.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das Oxidati ons produkt zunächst mit einer bifunktionellen, eine primäre Aminogruppe enthaltende Verbindung umgesetzt vird, wonach über die zweite funktionelle Gruppe die Umsetzung mit einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 2 oder 4 erfolgt.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5» dadurch gekennzeichnet, dass das Polymere ein mittels bifunktioneilen Verbindungen verknüpftes Polyvinylenglykol ist.709835/0337" ~ Ma 227
- 7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahrensprodukt mit einem zur Reduktion der Schifffsehen Basen geeigneten Reduktionsmittel behandelt wird.
- 8. Eine Verbindung zwischen einem Polymeren und einem biologisch aktiven Stoff hergestellt nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1—7·9» Verwendung einer Verbindung gemäss Anspruch 7 als spezifisches Adsorbens oder als selektiver Reaktionskatalysator.709835/0337
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| DE2061009A1 (de) | Verfahren zur Fixierung von Polymeren |
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| Date | Code | Title | Description |
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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