DE2607766B2 - Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Substanzen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Substanzen

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Description

Es ist bekannt, Proteine wie Enzyme, Antigene, Antikörper und Verbindungen, die mit biologisch aktiven Substanzen eine Wechselwirkung einzugehen ^ vermögen, an unlösliche polymere Substanzen zu binden, doch zeigen die dabei eingesetzten polymeren Substanzen häufig selbst Wechselwirkungen mit den biologisch aktiven Stoffen, indem sie an dem Trägerpolymeren unspezifisch adsorbiert werden. Eine derartige Wechselwirkung ist unerwünscht. Es hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, immer wieder geeignete hinreichend inerte Polymere als Träger für die biologisch wirksamen Stoffe zu finden.
In der DE-OS 24 21 789 ist Polyhydroxymethylen, das « auch unter der Bezeichnung Polyvinylenglykol bekannt ist, als Träger für biologisch aktive Substanzen beschrieben. Die Verbindung zwischen dem biologisch wirksamen Stoff und dem Polyvinylenglykol wird durch Reaktion einerseits der Hydroxylgruppen des Polyviny- «> Senglykols, andererseits bestimmter Gruppierungen der damit zu verbindenden Substanzen herbeigeführt, wonach eine kovalente Verbindung zwischen beiden entsteht. Vergleichbare Verfahren führen auch zu biologisch aktiven Verbindungen aus einem Copolyme- ""> ren des Vinylenglykols mit einer biologisch aktiven Substanz entsprechend einem älteren Vorschlag.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfacheres Verfahren zur Herstellung einer Verbindung zwischen einer primäre Aminogruppe enthaltenden biologisch wirksamen Substanz und einem synthetischen, vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren, vorzugsweise dem Polyvinylenglykol, zu finden.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Substanzen, bei dem Derivate synthetischer, vicinale Hydroxylgruppen enthaltender Polymerer entweder mit einer primäre Aminogruppen enthaltenden biologischen Substanz oder zunächst mit einer bifunktionellen, eine primäre Aminogruppe enthaltenden organischen Verbindung, wonach über die zweite funktionelle Gruppe die Umsetzung mit einer biologisch wirksamen Substanz durchgeführt wird, umgesetzt werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Derivat des synthetischen, vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren ein solches eingesetzt wird, das mit einem mittelstarken Oxidationsmittel, dessen Potentialbereich zwischen +1,0 und + 1,5V liegt, oder einem starken Oxidationsmittel mit einem Potentialbereich >1,5 bis zur Bildung von ausreichenden Mengen an Aldehydgruppen behandelt worden ist, und daß die gebildete Schiffsche Base gegebenenfalls durch Reduktion mit geeigneten Reduktionsmitteln stabilisiert wird.
Als mittelstarke Oxidationsmittel im Sinne der Erfindung sind solche zu verstehen, deren Potentialbereich zwischen +1,0 und +1,5VoIt liegt. Beispiele hierfür sind Verbindungen des sechswertigen Chroms wie CKV- oder Cr2O72~; ferner das MnO2 oder das CIj. Es können jedoch auch stärkere Oxidationsmittel mit einem Potential >+1,5 Volt wie MnO^ O3 oder F2 verwendet werden.
Die Oxidation des Polymeren durch die genannten Oxidationsmittel ist selbstverständlich konzentrations- und zeitabhängig. Das ist bei der Wahl der Reaktionsbedingungen zu beachten. So werden die Oxidationsmittel allgemein in einem Konzentrationsbereich von 0,01 bis 1,0 M eingesetzt. Bei starken Oxidationsmitteln, deren Potentialbereich > +1,5 Volt ist, wird das Oxidationsmittel bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 M angewandt. Oxidationsmittel mit einem Potentialbereich von +1,0 bis etwa + 1,5 Volt werden hingegen vorzugsweise in einer Konzentration von 0,05 M bis 1,0 Meingesetzt.
Die Zeiten für die Einwirkdauer des Oxidationsmittels auf das Polymere richten sich ebenfalls nach dessen Stärke. Sie liegen für relativ schwache Oxidationsmittel, wie es das System Dimethylsulfoxid/Eisessig darstellt, in der Größenordnung von 3—18 Stunden; für das System Dichromat/Schwefelsäure in der Größenordnung von 5—60 Minuten und für das System Perjodat/Wasser 1 — 15 Minuten. Für andere Oxidationsmittel gelten je nach deren Stärke sinngemäße Einwirkungsdauern.
In einem Vorversuch lassen sich die Bedingungen für das erforderliche Maß der Oxidation ermitteln, welche sowohl einen zu weitgehenden oxidativen Abbau des Polymeren vermeiden, als auch eine ausreichende Menge an umsetzbaren Aldehydgruppen freisetzen.
Da die in Frage kommenden Polymeren, beispielsweise das Polyvinylenglykol, chemisch sehr stabile Verbindungen darstellen, ist das Dispersionsmittel, in dem die Umsetzung mit dem Oxidationsmittel vorgenommen wird, nicht sehr kritisch. So haben sich beispielsweise Umsetzungen von Polyvinylenglykol mit Perjodat in Wasser, mit Dichromai in etwa 0,1 normaler Schwefelsäure und mil Dimethylsulfoxid in Eisessig besonders
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bewährt.
Es wurde Festgestellt, daß die Einwirkung von Oxidationsmitteln auf synthetische, vicinale Hydroxylgruppen enthaltende Polymere wie das Polyvinylenglykol zur Ausbildung von Aldehydgruppen führt. Mit gängigen Nachweisreaktionen für die Aldehyd- bzw. Carbonylgruppe kann z. B. die Bildung von Phenylhydrazon, Semicarbazon oder von Oxim gezeigt werden. Es ist demnach zweckmäßig, im Anschluß an die Oxidation des Polymeren durch Überprüfung der iu Aldehydbildung mit Hilfe von z. B. Phenylhydrazin in Essigsäure oder einem zu einem Farbumschlag führenden Carbonylindikator nachzuweisen, daß eine für die weitere Umsetzung ausreichende Anzahl von Aldehydgruppen gebildet wurde. Zudem wird die Konsistenz des ι "> Oxidationsproduktes mit dem Ziel überprüft, festzustellen, daß kein Abbau des Produktes in einem unerwünschten Maße durch die Oxidation erfolgt ist. Dies geschieht z. B. durch vergleichende Trockengewichtsbestimmung des Polymeren vor und nach der Einwirkung des Oxidationsmittels. Der Unterschied sollte zweckmäßig nicht mehr als etwa 10% betragen.
Das Reaktionsprodukt der Oxidation kann mit primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindungen direkt umgesetzt werden. Bekanntlich stellt die Mehrzahl der biologisch wirksamen Stoffe Proteine dar, welche primäre Aminogruppen enthalten. Mit derartigen Verbindungen ist eine direkte Umsetzung des oxidierten Polymeren durchführbar. Statt einer biologisch aktiven Verbindung wie z. B. einem Enzym, M Aktivator, Inhibitor, Antigen oder Antikörper, einem Plasmaprotein, einem Polypeptid, einem Peptid oder einer Aminosäure können jedoch mit dem Oxidationsprodukt des Polymeren auch solche Aminogruppen enthaltende Verbindungen umgesetzt werden, welche mit biologisch wirksamen Stoffen zu reagieren vermögen. Häufig zeigen diese Stoffe keine direkte biologische Wirksamkeit. Sie werden jedoch zumeist als deren Inhibitoren oder Antagonisten anzusehen sein, als Substrate für Enzyme oder auch als Antikörper gegen Antigene oder Haptene. Neben Proteinen und Peptiden können allgemein alle organischen «-Aminogruppen enthaltende Verbindungen mit den oxidierten Polymeren direkt umgesetzt werden.
Es ist selbstverständlich nicht erforderlich, daß der 4 biologisch wirksame Stoff ein Enzym, ein Aktivator, ein Inhibitor, ein Antigen, ein Antikörper, ein Plasmaprotein, eine Blutgruppensubstanz, ein Peptidhormon, ein Peptid oder eine Aminosäure ist, es kann auch ein natürlicher oder synthetischer Stoff sein, dessen w Wechselwirkung mit einer der genannten Substanzen bekanntgeworden ist und der demnach gemäß einer in Fachkreisen gängigen Ausdrucksweise als Effektor bezeichnet werden kann. Bekannte Effektoren sind z. B. Aminobenzamidin, Chlorbenzylamin und 4-Aminophe- >5 nyl-Quecksilber^IJ-acetat.
In den Fällen, in denen die mit dem Oxidationsprodukt des Polymeren umzusetzende biologisch wirksame Verbindung selbst keine primären Aminogruppen trägt, kann die Verbindung über eine Zwischenstufe durchge- «> führt werden, worin eine bifunktionelle, eine primäre Aminogruppe enthakende Verbindung mit dem Oxidationsprodukt zur Umsetzung kommt, wonach die zweite funktionell Gruppe mit einer Gruppierung des biologisch wirksamen Stoffes umgesetzt werden kann. <>'> Verbindungen dieser Art sind beispielsweise die als Spacer bezeichneten Verbindungen, weiche den Abstand der biologisch wirksamen Gruppierung vom Trägermolekül vergrößern. Dies kann z. B. durch Hexamethylendiamin erreicht werden, ferner mit diazotierbare Arylaminogruppen enthaltenden Vinylsulfonderivaten oder mit Schwefelsäureestern von jJ-Hydroxyäthylsulfonen. Beispielsweise kann nach einer Umsetzung des oxidierten Polymeren mit Glutathion und nachfolgender Umsetzung des Reaktionsproduktes z. B. mit 2,2'-Dipyridyl-disulfid und einer Verbindung mit freien Sulfhydrilgruppen eine Verknüpfung über eine Disulfidbrücke erreicht werden. Glutathion ist dabei der Spacer.
Über derartige Zwischenverbindungen ist es selbstverständlich möglich, das Oxidationsprodukt des Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren vor Umsetzung mit dem biologisch wirksamen Stoff, teilweise auch mit weiteren Polymeren umzusetzen. Bevorzugt werden Verknüpfungen der Oxidationsprodukte der Polymeren untereinander vorgenommen. Damit ist auch eine Beeinflussung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Trägers zu erreichen. Hierfür können beispielsweise bifunktionelle Verbindungen, die sowohl mit den Hydroxylgruppen des einen Polymeren als auch mit einer Gruppierung des zweiten Polymeren zu reagieren vermögen, verwendet worden sein. Auf die gleiche Weise können Polyhydroxyverbindungen zunächst untereinander verknüpft und die Oxidation im Anschluß daran vorgenommen worden sein. Dies hat Bedeutung bei wasserlöslichen Polyhydroxyverbindungen, die nach diesen Verfahren in eine wasserunlösliche Form überführt worden sein können. Geeignete übliche Verbindungen hierfür sind Diisocyanate wie Hexamethylendiisocyanat, Bisepoxide wie Hexamethylenbisepoxid oder Vorstufen von Bisepoxiden wie Dibrompropanol und Epichlorhydrin.
Bei der Umsetzung zwischen den Aldehydgruppen des oxidierten Polymeren und den primären Aminogruppen der Reaktionspartner entstehen Schiffsche Basen. Diese Verbindungen werden zweckmäßig durch Reduktion stabilisiert. Man verwendet dazu in bekannter Weise als Reduktionsmittel komplexe Borhydride wie Natriumborhydrid und Cyanborhydrid, komplexe Metallhydride wie Lithiumaluminiumhydrid sowie Raney-Nickel als Beispiel für einen Katalysator für die Hydrierung mit Wasserstoff.
Verbindungen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Derivaten von synthetischen, vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren und biologisch aktiven Verbindungen mit primären Aminogruppen hergestellt werden, finden Verwendung als spezifische Adsorbenzien oder als selektive Reaktionskatalysatoren. Hierzu gehören insbesondere die Anwendung unlöslicher Enzyme zur Gewinnung von 6-Amino-Penicillansäure, für die Steroidumwandlungen, die Stärkeverzuckerung sowie die Invertzuckergewinriung, aber auch für die synthetische Herstellung z. B. von Polynukleotiden oder Trinukleotiden. Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet hierfür stellt sich in der Affinitätschromatographie dar. Dabei werden an die durch das erfindungsgemäße Verfahren wasserunlöslich gemachten Effektoren in spezifischen Affinitätsreaktiorien andere Substanzen gebunden, wonach diese in hoher Reinheit wieder eluiert werden können. Trägergebundene Enzyme bieten gegenüber gelösten Enzymen den Vorteil, daß sie bei Stoffumwandlungen in analytischen und präparativen Prozessen die Reaktionsprodukte nicht durch Enzyme verunreinigen.
Die Erfindung soll an nachstehend angeführten Beispielen näher erläutert werden.
Beispiele
1. Oxidative Aktivierung von Polyvinyleiiglykol (PVG)
Man suspendiert 1 g PVG in 50 ml einer 0,05-m Natrium-metaperjodat-Lösung und rührt 15 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wird die Suspension abgesaugt und mehrfach mit dest. Wasser gewaschen.
2. Direkte Verbindung von IgG (Immunglobulin G) an
den oxidativ nach 1. aktivierten Träger
Der aktivierte Träger wird in 59 ml 0,67-m Phosphatpuffer, pH 7,5, in dem ca. 40 mg IgG gelöst sind, suspendiert und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz bleibt bei 4° C über Nacht stehen.
Nach der Umsetzung wird die Suspension abzentrifugiert und mit 30 ml NaCl gewaschen. Auf diese Weise konnten ca. 18 mg IgG chemisch gebunden werden.
3. Verbindung von IgG über einen Spacer
2 g Hexamethylendiamin werden in 50 ml dest. Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit 2 n-HCl auf 8,7 eingestellt. In dieser Lösung wird 1 g aktiviertes PVG (siehe 1.) suspendiert und 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren reagieren lassen.
Das Produkt wird abgesaugt und mit dest. Wasser frei von überschüssigem Amin gewaschen.
Zur Stabilisierung der hydrolyseempfindlichen Schiffschen Base wird mit Natriumborhydrid reduziert. Hierzu suspendiert man das Produkt in 50 ml Methanol und tropft ca. 10 ml einer 10%igen Lösung von Natriumborhydrid in Methanol zu. Der Ansatz wird 15 Minuten unter Rückfluß gekocht, abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
Anschließend suspendiert man das Reaktäonsprodukt in 100 ml 0,5-m Natriumbicarbonat-Lösung pH 10 und gibt 2 g l-AminobenzoM-jJ-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester (Para-Baseester) zu. Der Ansatz reagiert 1 Stunde bei 50—60°C unter Rühren. Danach wird das Trägermaterial für biologisch aktive Stoffe abgesaugt und mit Aceton und Wasser gründlich gewaschen. Zur Diszotierung wird das Trägermaterial in 40 ml 0,1 n-HCl suspendiert, auf 0° — +50C abgekühlt und ca. 1 ml einer 0,1 n-NaNOrLösung zugetropft. Nach 30 Minuten Rühren wird abgesaugt und neutral gewaschen.
An dieser Stelle kann mit Hilfe von /J-Naphthol überprüft werden, ob sich das Trägermaterial für die Herstellung einer Verbindung mit einer biologisch aktiven Substanz eignet: Ein Teil von ca. 0,1 g des diazotierten Trägermaterials wird in 2 ml 0,1 n-NaOH-Lösung suspendiert und mit 0,1 g ^-Naphthol versetzt. Der Träger verfärbt sich augenblicklich orange. Eine intensive Färbung zeigt eine ausreichende Aktivierung und Eignung für die Umsetzung mit einer kupplungsfähigen Substanz an.
Die Hauptmenge des Diazoniumsalzes wird in 59 ml 0,67-m Fhosphatpuffer pH 7,5, in dem 200 mg IgG gelöst sind, suspendiert und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Kupplung wird das ο Reaktionsprodukt abzentrifugiert und mit 1-M NaCI-Lösung frei von überschüssigem Protein gewaschen.
Die quantitative Untersuchung ergab eine Aufnahme von ca. 160 mg IgG.
Wird statt IgG Albumin in den Ansatz der κι Diazoniumsalzlösung gebracht, werden etwa 120 mg Albumin pro Gramm PVG-Träger gebunden.
4. Quervernetzung von PVG mit Epichlorhydrin
ίο 3 g PVG werden in 250 ml 2 η-Natronlauge bei 70°-800C gelöst Man versetzt mit 0.6 g Epichlorhydrin, rührt 4 Stunden bei 70° —800C und über Nacht bei Raumtemperatur. Danach wird die Mischung unter schnellem Rühren in 21 Wasser gegossen und mit 2 n-HCl neutralisiert. Das Produkt wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen.
Die weiteren Umsetzungen können in der gleichen Weise wie für das PVG beschrieben durchgeführt werden.
5. Oxidative Aktivierung von PVG mit Kaliumdichromat/Schwefelsäure
2 g PVG werden in 100 ml dest. Wasser suspendiert
:<i und eine Lösung von 0,74 g Kaliumdichromat (0,05 m) und 7,5 ml 2 n-H2SO< in 50 ml dest. Wasser unter Rühren zugetropft. Es wird 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, das Reaktionsprodukt abzentrifugiert und mit dest. Wasser gewaschen. Die weitere Umsetzung mit
}j Hexamethylendiamin und l-Aminobenzol-4-^-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester sowie die Diazotierung und Kupplung von Protein erfolgt wie unter 3.
beschrieben.
Bei der quantitativen Untersuchung wurde eine Aufnahme von ca. 100 mg IgG pro Gramm PVG-Träger festgestellt.
6. Oxidative Aktivierung von PVG mit Dimethylsulfoxyd/Essigsäureanhydrid
j 2 g PVG werden in einer Mischung von 24 ml Dimethylsulfoxyd (DMSO) und 16 ml Eisessig suspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Danach wird der Ansatz mit 400 ml dest. Wasser versetzt, abgesaugt und mit Aceton und dest. Wasser ■>i) gewaschen.
Anschließend erfolgt die Einführung des Spacers und die Kupplung des Proteins wie unter 3. beschrieben.
Es wurde eine Aufnahme von 30 mg IgG pro Gramm der Trägersubstanz gemessen.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen biologisch aktiven Substanzen durch Umsetzung ~> von Derivaten synthetischer, vicinale Hydroxylgruppen enthaltender Polymerer entweder mit einer primäre Aminogruppen enthaltenden biologisch wirksamen Substanz
oder zunächst mit einer bifunktionellen, eine primäre Aminogruppe enthaltenden organischen Verbindung, wonach über die zweite funktionelle Gruppe die Umsetzung mit einer biologisch wirksamen Substanz durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Derivat des synthetischen, ii vicinale Hydroxylgruppen enthaltenden Polymeren ein solches eingesetzt wird, das mit einem mittelstarken Oxidationsmittel, dessen Potentialbereich zwischen + 1,0 und +1,5V liegt, oder einem starken Oxidationsmittel mit einem Potentialbereich >1,5 in bis zur Bildung von ausreichenden Mengen an Aldehydgruppen behandelt worden ist, und daß die gebildete Schiffsche Base gegebenenfalls durch Reduktion mit geeigneten Reduktionsmitteln stabilisiert wird. - j
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als vicinale Hydroxylgruppen enthaltendes Polymeres Polyvinylenglykol eingesetzt worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Jd zeichnet, daß als vicinale Hydroxylgruppen enthaltendes Polymeres ein mittels bifunktionellen Verbindungen vernetztes Polyvinylenglykol eingesetzt worden ist.
4. Verwendung einer mit einem Reduktionsmittel » behandelten Verbindung gemäß Anspruch 1 als spezifisches Adsorbens oder als selektiver Reaktionskatalysator.
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