DE2758507B2 - Stabilisierte biochemische Präparate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Stabilisierte biochemische Präparate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

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Description

An Festkörper gekoppelte biochemische Materialien sind seit einiger Zeit bekannt Diese Fixierung an Festkörper hat mehrere Vorteile. So lassen sich z.B. Enzyme durch Fixierung stabilisieren und behalten dadurch ihre Aktivität über größere Zeiträume, während sie diese in Lösung in relativ kurzer Zeit verlieren. Außerdem bleiben sie gegenüber größeren pH- und Temperaturbereichen als in Lösung resistent. Für bei immunchemischen Verfahren verwendete Antigene und Antikörper gelten ähnliche Feststellungen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß sich auf diese Weise Reaktionspartner durch einfaches Filtrieren, Zentrifugieren und Dekantieren aus Reaktionsgemischen entfernen lassen, wodurch Reaktionen zeitlich sehr genau gesteuert werden können. Außerdem lassen sich Substanzen durch Affinitätschrorratographie mit Hilfe fixierter Materialien einfach trennen.
Für die Fixierung biochemischer Materialien sind bereits mehrere Verfahren bekannt So wird z. B. von Catt et al. 1967 in Science 158, Seite 1570/1571, 1967 eine Methode beschrieben, bei der Antikörper an PoIystyrolröhrchen adsorbiert wurden. Von Axen et al. wurde 1967 in Nature 214,1302 (1967) eine Arbeit über die chemische Bindung von Peptiden und Proteinen an Polysaccharide veröffentlicht.
1970 stellten Kagedal und Akerström in Acta Chem. Scand. 24,1601 (1970) ein Verfahren zur Kopplung von biologisch wichtigen Molekülen an Polysaccharide vor, wobei die Moleküle kovalent gebunden wurden. In der US-PS 36 52 761 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe dessen Antigene und Antikörper kovalent über ein Kopplungsmittel an anorganische Träger gebunden werden können.
Alle diese Verfahren haben gewisse Nachteile. Bei dem von Catt beschriebenen Verfahren kann das adsorptiv gebundene Material wieder desorbiert werden; bei dem Verfahren von Axen et al. sowie Kagedal und Akerström muß mit toxischen Substanzen, wie Bromcyan. gearbeitet werden, beim Verfahren gemäß der US-PS 36 52 761 muß bei hohen Temperaturen, z. B. 625°C, unter Sauerstoff gearbeitet werden und es ist ein Reinigen des Glases mit Salpetersäure nötig.
Aus der DE-OS 2619571 ist ein Verfahren zum Fixieren enzymaktiver Acylasen an silikatischen Trägermassen, nämlich Aluminiumhydrosilikaten mit Schichtgitterstri'kturen, bekannt, bei dem die Verknüpfung über aminogruppenhaltige Verbindungen erfolgt. Dieses bekannle Verfahren ist aber sowohl hinsichtlich der anzuwendenden Ausgangsstoff*.· als auch des Verknüpfungsmechanisnws begrenzt Eine breite Anwendbarkeit dieses bekannten Verfahrens zur Aufbringung einer Vielzahl von biochemischen Präparaten auf Träger ist daher nicht gegeben,
Aufgabe der Erfindung ist es, die oben beschriebenen Nachteile zu überwinden und insbesondere ein an einen Festkörper gekoppeltes biochemisches Material zur Verfugung zu steÜen, das eine hohe Stabilität aufweist Die Herstellung der angestrebten Präparate solr in einfacher Weise und ohne daß toxische Substanzen verwendet werden müssen, möglich sein.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch auf einen Träger aufgebrachte, stabilisierte, unlöslich gemachte biochemische Präparate gelöst die dadurch gekennzeichnet sind, daß biochemische Materialien, wie z.B. Antigene, Antikörper, Hormone, Aminosäuren, Haptene, Proteine, Enzyme etc, kovalent an eine Kieselsäureheteropolykondensatschicht aus einem Copolymerisat aus
a) mindestens einem substituierten Siian der allgemeinen Formel (I)
in der R Wasserstoff, Halogen, Alkoxy oder — NR'2 (R' = Wasserstoff und/oder Alkyl) bedeutet, R" Alkyl, Alkenyl, Aryl oder Aralkyl darstellt und η eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, b) mindestens einem funktioneilen Silan der allgemeinen Formel (II)
SiRn(R'"YV-n)
in der R die vorstehende Bedeutung hat, R"' Alkylen, Phenylen, Alkylphenylen oder Alkylenphenylen darstellt, Y Halogen oder eine gegebenenfalls substituierte Amino-, gegebenenfalls substituierte Anilino-, Aldehyd-, keto-. Carboxy-, Hydroxy-, Mercapto-, Cyano-, Hydroxyphenyl-, Diazo-, Carbonsäurealkylester-, Sulfonsäure-(-SO3H) oder Phosphorsäuregruppe (-PO3Hz) bedeutet und η eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, sowie
c) gegebenenfalls mindestens einem hydrolisierbaren Kieselsäurederivat der allgemeinen Formel (III)
SiR4
(IU)
in der R die vorstehende Bedeutung hat, jedoch nicht alle Reste R Wasserstoff sind.
gebunden sind, die ihrerseits auf eine mechanisch tragfähige Unterlage aufgebracht ist. Als biochemische
Yt Materialien kommen beispielsweise in Betracht: Serumbestandteile, Proteine, Enzyme, Antigene, Antikörper und Haptene und Hormone, insbesondere Albumine, Globuline, Aminosäuren, geeignet substituierte Steroide etc, ganz besonders Immunglobuline, Anti körper und Hormone.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser biochemischer Präparate, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Kieselsäureheteropolykondensat herstellt, dieses auf eine
dl Unterlage aufbringt und gegebenenfalls nach einer Nachbehandlung das biochemische Material ankoppelt. Schließlich ist ein weiterer Gegenstand die Verwendung dieser stabilisierten biochemischen Präparate als
Mittel, ζ, B. Trennmittel, Adsorbentien etc bei immunchemischen Verfahren, wie z.B. Radioimmunoassays, Affinitätschromatogruphie etc,
Pie Erfindung zeigt die außerordentlichen Vorteile, technisch besonders einfach realisierbar und weitgehend unabhängig von der Art und Zusammensetzung der verwendeten Unierlage zu sein.
Gegenüber dem in der DE-OS 26 19 571 beschriebenen Verfahren ist der Gegenstand der Erfindung wesentlich vielseitiger anwendbar, und zwar sowohl hinsichtlich der angewendeten Träger als auch der aufzubringenden biochemischen Materialien. So kann erfindungsgemäß eine Vielzahl von biochemisch interessanten Materialien in stabiler Weise auf mechanisch tragfähig«; Unterlagen aufgebracht werden, wobei die Systeme sowohl hinsichtlich ihrer chemischen Art als auch ihrer mechanischen Eigenschaften modifiziert und somit an das jeweilige Anwendungsproblem angepaßt werden können.
Durch die Erfindung werden somit Kieselsäureheteropolykondensalüchichten zur Aufbringung auf die Unterlage in Betracht gezogen, welche aus den oben genannten Komponenten a) und b) oder a), b) und c) erhalten worden sind.
Bevorzugt werden Polykondensate, die durch Kondensation der folgenden drei Komponenten erhalten werden:
a) mindestens eines substituierten Silans der allgemeinen Formel SiR/,R"(4-i>), in der R Chlor, Niedrigalkoxy, insbesondere Ethoxy oder Methoxy, oder Dimethylamine bedeutet, R" für Alkyl, insbesondere Methyl oder Ethyl, Aryl, insbesondere Phenyl oder Aralkyl, insbesondere Benzyl oder ToIj 1, steht, und η eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
b) mindestens eine; funktioneilen Silans der allgemeinen Formel SiR«(R'"Y)(4-i7), worin R für Chlor, Niedrigalkoxy, insbesondere Ethoxy oder Methoxy, oder Dimethylamine steht, R'" für Niedrigalkylen siieht, Y für gegebenenfalls substituiertes Amino oder Anilino, Carbonyl, Carboxy, Diazo oder Halogen steht und r, eine ganze Zahl von 1 bis 3, insbesondere 1 ist, und
c) gegebenenfalls mindestens eines hydrolysierbaren Kieselsäurederivats der allgemeinen Formel SiR4, worin R für Chlor, Niedrigalkoxy, insbesondere Ethoxy oder Methoxy, oder Dimethylamine steht.
Die hierin verwendete Bezeichnung »niedrig« soll Gruppen mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, Kohlenstoffatomen bezeichnen.
Geeignete Ausgangsverbindungen sind z. B.
(EtO)4Si, SiCl4, (MeO)4Si, Si(NH2J4, (CHa)2SiCl2, (CHj)2Si(OMe)2, (CHj)2Si(OEt)2, (C6Hs)2SiCI2, (EtO)3Si(CH2)3NH2, (EtO)3Si(CH2J3CN etc.,
die nach Angaben von W. Noil, Chemie und Technologie der Silikone, Verlag Chemie, 1968 hergestellt werden können.
Zur Herstellung des Kondensats werden gemäß der Erfindung die einzelnen Komponenten unter Feuchtigkeitsausschluß und gegebenenfalls gelöst in organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen, insbesondere niedrigen Alkoholen mit 1 bis 4 C-Atomen, vorzugsweise MeOH und StOH, Ketonen, insbesondere Alkyl- ketonen, vorzugsweise Aceton, Ethern, insbesondere Alkylethern, vorzugsweise Diarylether, Amiden, vorzugsweise Dimethylformamid, und Gemische davon vermischt. Gleichzeitig oder anschließend wird gegebenenfalls ein Katalysator, der Protonen oder Hydroxyljonen abspalten kann, oder Amine enthält, zugegeben.
Die Kondensation der einzelnen Komponenten kann in einer Stufe oder in mehreren Teilstufen, vorzugsweise in einer oder in zwei Stufen, erfolgen. Im ersteren Fall werden die Komponenten in einer Stufe durchkondensiert Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die benötigte Wassermenge und gegebenenfalls ein Katalysator bereits am Anfang dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Im zweiten Fall wird zunächst eine Vorkondensation vorgenommen. Nach Zugabe der benötigten Wassermenge zu dem Vorkondensat erfolgt dann die Endkondensation. Die Endkondensation kann nach dem Aufbringen des
Vorkondensats auf die Unterlage durchgeführt werden. Die Kondensation erfolgt ,bei Temperaturen von
-20 bis +1300C, vorzugsweise 0 bis 65° C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur. Die Dauer der
Kondensation beträgt 1 Min. bis 24 Std. Die Dauer der Kondensation bzw. der Vorkondensation beeinflußt die
mechanischen Eigenschaften der erhaltenen Schichten.
Das Vorkondensat bzw. das durchkondensierte Produkt kann im Reaktionsmedium auf die Unterlage
aufgebracht und damit verbunden werden. Es kann aber auch durch Abdampfen des Lösungsmittels (gegebenenfalls im Vakuum) isoliert werden und zu einem späteren Zeitpunkt entweder als solches oder gelöst in einem organischen Lösungsmittel auf die Unterlage aufgebracht werden. Gegebenenfalls wird die stöchio- metrisch erforderliche Wassermenge zugesetzt.
Als Katalysatoren kommen bei der Kondensation Säuren, insbesondere verflüchtigbare Säuren, vorzugsweise Salzsäure oder Essigsäure, Wasser, Basen, insbesondere Alkalihydroxide oder Amii.e, vorzugs weise Natronlauge, und niedrige Alkylamine in Be tracht. Die Katalysatormenge beträgt vorzugsweise 3%. Bei sauren Katalysatoren werden kürzere Kondensationszeiten bevorzugt Während der Vorkondensation findet einerseits eine Umalkoxylierung der Silane statt andererseits eine über die gewählten Reaktionsbedingungen gesteuerte Oligomerisierung unter gleichzeitiger Etherabspaltung. So wird z. B. gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Ablauf der festge- legten Vorkondensationszeit das in Lösung befindliche Kieselsäureheteropolykondensat auf die stabile Unterlage als solches oder unter Zuhilfenahme stöchiometrischer Mengen Wassers bei erhöhter Temperatur aufgebracht Beim Abdampfen des Lösungsmittels werden dann zwischen den SiOH-Gruppen des Kieselsäureheteropolykondensats und reaktiven Gruppen der Unterlage kovalente Bindungen geknüpft. Die aufgebrachten Srhichten werden gegebenenfalls mit Wasser nachbehandelt und/oder eingebrannt An die funktio neuen Gruppen dieser so aufgebrachten Schicht können nun nach an sich bekannten Methoden der organischen Chemie und Biochemie biochemisch interessierende Materialien gekoppelt werden.
Das Verhältnis der einzelnen Komponenten sowir
die Bedingungen der Kondensation bestimmen die Eigenschaften der erhaltenen Schichten. Der Anteil der hydrolysierbaren Kieselsäurederivate bestimmt die Beschaffenheit der Oberfläche der Schicht, z. B. die
spezifische Oberfläche, der Anteil der substituierten Silane (vgl. Komponente a) die Hafteigenschaften und der Anteil der funktioneilen Silane (vgl. Komponente b) die Anzahl der Kopplungsstellen an der Oberfläche. Die Kieselsäureheteropolykondensate enthalten, bezogen auf Oxide, 60 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise 65 bis 85 Gew.-%, insbesondere 75 bis 80Gew.-% der Komponente a), I bis 15gew.-°/o, vorzugsweise 2 bis IOGew.-%, insbesondere 4 bis 8 Gew.-% der Komponente b) und 0 bis 30Gew.-%. insbesondere 5 bis in 2OGew.-°/o, ganz besonders 8 bis l5gew.-%. z. b. 9 bis 12 Gew.-% der Komponente c).
Die organischen Lösungen des Kondensats sind 5 bis 40%ig, insbesondere 10 bis 35°/oig, vorzugsweise 25 bis 30%ig. Als Katalysator wird vorteilhaft bis zu 3% ι => Wasser oder Säure verwendet.
Als mechanisch tragfähige Unterlagen kommen alle festen Körper geeigneter Stabilität in Betracht, insbesondere Glas, Minerale, z. B. Hydroxyapatit, Quarz etc., Keramik, z. B. Porzellan, Steingut etc.. keramische Materialien, z. B. Schamotte etc.. Metalloxide, z. B. Aluminiumoxid, Eisenoxid etc.. Metalle, z. B. Aluminium. Eisen etc.. Holz, Papier. Kohle, Kunststoffe, z. B. PVC. Polyethylen etc.. organische Hochpolymere, z. B. Cellulose, Polysaccharide etc., und dergleichen, Vorzugs- r> weise Glas, z. b. Objektträger, zylindrische Fläschchen aus Borosilikatglas (z. b. mit 5 ml Inhalt). Schmelzgläschen (z. B. 8 χ 70 mm) etc.. Keramik, Metalloxide. Metalle und Kunststoffe, z. B. Polypropylen, Copolymerisate aus Acrylsäure und Ethylen etc. )"
Es hat sich nicht als notwendig erwiesen, die zu beschichtenden Unterlagen vorzubchandeln bzw. chemisch zu reinigen, worin eine weitere Vereinfachung gegenüber herkömmlichen Methoden zu sehen ist. Die das Kondensat enthaltende Lösung wird als solche r> oder unter Zugabe von stöchiometrischen Mengen Wassers auf die Unterlage aufgebracht. Bei erhöhter Temperatur, vorteilhaft 75 bis 1500C, vorzugsweise 100 bis 120°C, wird innerhalb von 15 bis 45 Min., vorzugsweise 20 bis 40 Min., das Lösungsmittel abge- -to dampft und die Silikonschicht wird vernetzt und kovalent an die Unterlage gebunden.
Als generell anwendbare Beschichtungsverfahren können beispielsweise verwendet werden:
43
a) Eintauchen der zu beschichtenden Unterlage in die Lösung des Kieselsäureheteropolykondensats bzw. bzw. in das Vorkondensat und Abdampfen des Lösungsmittels (s. o.).
b) Aufsprühen der kieselsäureheteropolykondensathaltigen Lösungen auf die zu beschichtende Unterlage und Abdampfen des Lösungsmittels (s.o.),
c) Füllen von behälterförmigen Unterlagen mit kieselsäureheteropolykondensathaltigen Lösungen und Abdampfen des Lösungsmittels
und ähnliche.
Vorteilhafterweise wird die mit der Kieselsäureheteropolykondensatschicht versehene Unterlage zur vollständigen Vernetzung des Kieselsäureheteropolykondensats mit Wasser oder Wasserdampf nachbehandelt. Das Wasser bzw. der Dampf kann Temperaturen von 4 bis 1500C aufweisen, wobei die Stabilität der Schicht mit der Temperatur steigt Die Nachbehandlungszeit kann 2 bis 30 min betragen. Vorteilhaft hat sich eine Nachbehandlung von 10 bis 20 min mit Kochwasser bewährt Die Schicht kann anschließend 5 bis 30 min bei Temperaturen von 100 bis 15O0C, vorteilhaft 15 bis 25 min bei 110 bis 130°C, eingebrannt werden. Die Dicke der Schichten hat keinen Einfluß auf deren Funktionstüchtig'keit.
An die mit funktioneilen Gruppen versehene Kieselsäureheteropolykondensatschicht können nun durch bekannte Methoden der organischen und Biochemie, die der Fachliteratur entnommen werden können, biochemische Materialien kovalent angekoppelt werden. Geeignete Methoden werden z. B. in der US-PS 36 52 761 beschiieben. Je nach Reaktivität der funktionellen Gruppen der anzukoppelnden biochemischen Materialien bzw. der Kieselsäureheteropolvkondensatschicht müssen die funktioneilen Gruppen der Kieselsäureheteropolykondensatschicht nach den Methoden der organischen Chemie weiter modifiziert werden. Im allgemeinen ist es nötig, zunächst die Kieselsäureheteropolykondensatschicht zu derivatisieren und anschließend das gewünschte Material anzukoppeln. Als Derivatisierungsmittel kommen beispielsweise Amine. Carbonsäuren, Säurechloride, Thiocarbamate, Thiocarbaminsäurechlorid. Diazoverbindungen, Ester, Sulfide etc. in betracht.
Die Wahl der Modifizierung hängt dabei von den notwendigen Bedingungen der nachfolgenden Kopplungsreaktion ab, da hierbei in Temperatur-, pH-Bereichen und Medien gearbeitet werden muß. bei denen eine irreversible Denaturierung oder ein Aktivitätsverlust der biochemischen Materialien weitgehend ausgeschlossen ist bzw. bei denen die gewünschten Charakteristiken dieser Materialien nicht wesentlich verändert werden. In der Regel werden biochemische Materialien deshalb bei Raumtemperatur in wäßrigem Medium in pH-Bereicher, von pH 3 bis pH 11 angekoppelt. Andererseits ist darauf zu achten, daß die Kopplungsreaktion mit genügender Geschwindigkeit abläuft, um die biochemischen Materialien nicht zu lange nicht-physiologischen Bedingungen auszusetzen.
Weiterhin muß berücksichtigt werden, daß die Aktivität der fixierten biochemischen Materialien häufig von der Länge des Spacers abhängt, über den das Material an die Oberfläche gebunden ist.
Unter Beachtung der vorstehenden Gesichtspunkte lassen sich Kieselsäureheteropolykondensatschichten herstellen bzw. modifizieren, die nach Beschichtung mit biochemischem Material optimale Resultate liefern. Eine Modifizierung einer Gamma-Aminopropylgruppen enthaltenden Schicht kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß die Schicht mit einer wäßrigen, etwa 2,5%igen Glutaraldehydlösung bei Raumtemperatur ^*0 bis 60 min behandelt wird. Das Diazodenvat der obengenannten Schicht kann z.B. durch Umsetzung mit p-Nitrobenzoylchlorid, Reduktion der Nitrogruppe zum Amin und Diazotierung mit salpetriger Säure hergestellt werden.-Wenn die Kieselsäureheteropolykondensatschicht aufgrund der Verwendung geeigneter funktioneller Silane als Ausgangsverbindung bereits Anilinogruppen enthält, dann kann sofort mit salpetriger Säure diazotiert werden. Durch Umsetzen von Aminogruppen der Kieselsäureheteropolykondensatschicht mit Thiophosgen gelangt man zum Isothiocyanoderivat
Die sorgfältig gewaschenen, auf stabilen Unterlagen befindlichen, derivatisierten Kieselsäureheteropolykondensate werden dann im geeigneten Puffersystem, z. B. Acetat (pH 4,0), Phosphat (pH 7,0), Bicarbonat (pH 93% Boratpuffer (pH 8,0) etc, mit dem biochemischen Material inkubiert Hierbei werden zwischen den Kieselsäureheteropolykondensatderivaten und den
biochemischen Materialien kovalente Bindungen geknüpft. Die Inkubationszeiten betragen im allgemeinen 1 bis 72 h bei Raumtemperatur. Nach Entfernen des Überschusses von biochemischem Material werden die somit erhaltenen stabilisierten biochemischen Materialien entweder an Luft oder im Vakuum getrocknet oder zunächst mit etwa 0,5- bis 2°/oigen Lösungen von Polyvinylalkohol behandelt und anschließend getrocknet. Die trockenen Präparate können bei Temperaturen bis zu 50°C gelagert werden.
Anhand der folgenden Beispiele sei die Erfindung weiter erläutert.
Beispiel I
7,5 ml Aceton p. a., 7,5 ml Ethanol p. a. und 0,6 ml Tetraethoxysilan p.a. wurden miteinander vermischt und unter Luftausschluß aufbewahrt (Lösung A). Desgleichen wurden 7,5 ml Aceton, 7,5 ml Ethanol und 0.35 ml Gamma-Aminopropyltriethoxysilan vermischt und unter Luftausschluß aufbewahrt (Lösung B). Lösung C wurde durch Vermischen von 2,5 ml Aceton, 2,5 ml Ethanol und 10 ml Dimethyldiethoxysilan erhalten und ebenfalls unter Luftausschluß aufbewahrt.
Zur Vorkondensation wurden volumenäquivalente Mengen der Lösungen A, B und C gemischt (Lösung M) und unter Luftausschluß bei Raumtemperatur 2,5 h umgesetzt.
Anschließend wurden jeweils 0,2 ml des Vorkondensats in Glasfläschchen (Fiolax Klarglas 4Ox 15mm) gefüllt und mit 15μΙ destilliertem Wasser versetzt. Die FHschchen wurden bei 120°C auf einem Rotationsgerät 30 min gedreht (5 U/s). Dann wurden die so beschichteten Fläschchen 15 min mit kochendem Wasser gespült und bei 150°C getrocknet. In die beschichteten Gläschen wurden 2 ml einer 2,5%igen wäßrigen Glutaraldehydlösung gefüllt und bei Raumtemperatur 12 h stehen gelassen. Anschließend wurde mit Wasser gewaschen. Dann wurde Antiserum gegen Trijodthyronin (T3) von Hasen, hergestellt nach Angaben von R.-D. Hesch und M. Hübner in Acta biol. med. ge: m. 28,861 (1972), in Phosphatpuffer (pH 7.7) (Verdünnung 1 :50 OCO) eingefüllt und wieder 12 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde abgesaugt, durch normales Hasenserum in Phosphatpuffer (pH 7.7) (Verdünnung 1:25 000) ersetzt und lh bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde entfernt und es wurde mit Wasser gewaschen.
Die mit Trijodthyroninantikörper beschichteten Gläschen wurden in einem Radioimmunoassay eingesetzt. Dabei wurde in die einzelnen Gläschen je 100 μΙ Serumstandards, enthaltend 0, 50, 100, 200, 400 und 800ng/100ml Trijodthyronin, sowie 1 ml 125J-Tnjodlhyronin eingeiüllt. Nach 2stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde die Lösung abgesaugt und die Restaktivität in den einzelnen Gläschen gemessen. Dabei ergab sich eine Bindung von l25J-Trijodthyronin im Gläschen mit Ong/lOOml Trijodthyronin von Bo/T=34,2%. Die Restaktivität in den die Standards enthaltenden Gläschen, bezogen auf die Restaktivität im 0-Standard, ergab Bo/B für 50ng/100ml 74,7%, 100 ng/100 ml 68,5%, 200 ng/100 ml 52.7%, 400 ng/100 ml 37.0% und 800 ng/100 ml 26.4%.
Beispiel 2
Herstellung der Lösungen A, B, C und M erfolgte wie in Beispiel 1. 5 m! der Lösung M warden jedoch mit 0,1 ml 0,1 n-HCl versetzt und bei Raumtemperatur 7 min vorkondensiert Zur Beschichtung wurden je 0,2 ml in Glasfläschchen (Fiolax Klarglas) gegeben und mit 15 μΙ Wasser versetzt. Das Aufbringen der Schicht erfolgte wie in Beispiel 1.
Die so behandelten Gläschen wurden 1 h mit 2,5%iger Glutaraldehydlösung in 0,1 m-Acetatpuffer (pH 4,0), anschließend 12 h mit T3-Antiserum
(Verdünnung 1 :50 000) in 0,1 m-Acetatpuf'fer (pH 4,0) und schließlich mit Hasenserum (Verdünnung 1 :25 000) in Acetatpuffer (pH 4,0) behandelt. Der Funktionstest
in entsprechend Beispiel 1 lieferte eine Bindung Bo/T = 270/0.
Beispiel 3
Es wurden folgende Ausgangslösungen durch Ver-Ii mischen der Einzelkomponenten hergestellt und unter Luftausschluß aufbewahrt:
Lösung D: 7,5 ml Aceton, 7,5 ml Ethanol und 1,2 ml
Tetraethoxysilan
21) Lösung E: 7,5 ml Aceton, 7,5 ml Ethanol und 0,7 ml
Gamma-Aminopropyltriethoxysilan
Lösung C: 2,5 ml Aceton, 2,5 ml Ethanol und 10 ml
Dimethyldiethoxysilan.
r, Volumengleiche Mengen der Lösungen C, D und E wurden vermischt (Lösung N) und 2 h bei Raumtemperatur vorkondensiert. Je 0,2 ml des Vorkondensats wurden in Sch.melzgläschen (8 χ 70 mm) der Fa. Schott & Gen. gegeben. Anschließend wurde analog
«ι Beispiel 1 verfahren.
Die Gläschen wurden dann I h mit 2,5%iger wäßriger Glutaraldehydlösung behandelt, gewaschen, 12 h bei Raumtemperatur mit T3-Antiserum (Verdünnung I :50 00O) in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) inkubiert, gewaschen, 0,5 h mit I % Rinderserumalbumin (RSA) in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt, gewaschen und entsprechend Beispiel 1 mit I25J-T3 geprüft. Dabei wurde eine Bindung von Bo/T = 29,5% erhalten.
Beispiel 4
0,2 ml des Vorkondensats aus Beispiel 3 wurden in Schmelzgläschen (8 χ 70 mm) gegeben und mit 20 μΙ Wasser versetzt. Die Beschichtung wurde wie in
α-, Beispiel 1 aufgebracht. Die Gläschen wurden 0,5 h bei Raumtemperatur mit 2,5%iger Glutaraldehydlösung inkubiert, gewaschen, 4 h bei Raumtemperatur mit T3-Antiserum (Verdünnung 1:50 000) in 0.1m-Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt, gewaschen, 0.5 h mit
-,o 1% RSA in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) stehen gelassen, gewaschen und entsprechend Beispiel I im Radioimmunoassay eingesetzt. Dabei wurde eine Bindung von Bo/T = 21% festgestellt
Beispiel 5
5 ml der Lösung N (Beispiel 3) wurden mit 0,1 ml 0,1 η-Salzsäure versetzt und unter Luftausschluß 7 min bei Raumtemperatur vorkondensiert 0,2 ml des Vorkondensats wurden in Glasfläschchen (Fiolax Klarglas
(Λ 40 χ 15 mm) gegeben. Die Beschichtung wurde nach Beispiel 1 aufgebracht
Die Gläschen wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 2,5%igem wäßrigen Glutaraldehyd behandelt gewaschen, 12 h bei Raumtemperatur mit T3-Anliserum
b5 (Verdünnung 1 :50 000) in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) änkubiert, gewaschen, 0,5 h mit 0,0!% RSA (Behringwerke) in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt gewaschen und an Luft getrocknet. Entspre-
chend Beispiel 1 wurde die Beschichtung überprüft. Hierbei wurde eine Bindung von Bo/T = 31% erhalten.
Beispiel 6
Gläschen aus Beispiel 5 wurden 2 h bei 600C mit einer jeweils 10%igen Lösung von Tributylamin und p-Nitrobenzoylch'orid in Chloroform inkubiert, mit Chloroform gewaschen, 1 h mit 5%iger wäßriger Natriumdithionitlösung gekocht, mit Wasser gewaschen, 10 min mit l°/oiger Natriumnitritlösung in 4 η-Salzsäure bei 0"C behandelt und gründlich mit eiskaltem Wasser gewaschen. An die so hergestellten Diazogruppen der Kieselsäureheteropolykondensatschicht wurde T3-Antiserum (Verdünnung I : 50 000) durch 12 h Inkubation bei Raumtemperatur in 0,05 m-Natriumbicarbonatpuffer (pH 9,6) angekoppelt. Anschließend wurde 0,5 h mit 0,01% RSA in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt. Die Gläschen wurden im Radioimmunoassay analog Beispiel 1 geprüft. Hierbei ergab sich eine Bindung von Bo/T = 47,8%. Die einzelnen Standards hatten Werte b/Bo von 50 ng/100 ml = 79,0%, 100 ng/100 ml = 60,3%,
200 ng/100 mli 37,5%, 400 ng/100 ml = 25,7%,
800 ng/100 ml =14,1%.
Beispiel 7
Gläschen aus Beispiel 5 wurden mit einer l%igen wäßrigen Terephthalaldehydlösung 2 h im Wasserbad bei 60 bis 80° C behandelt, mit Wasser gewaschen, 12 h bei Raumtemperatur mit T3-Antiserum (Verdünnung 1 :50 000) in Phosphatpuffer (pH 6,4) inkubiert, gewaschen, 0,5 h mit 0,01% RSA in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 6,4) behandelt, mit 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 0,01% Natriumazid und 1% Polyvinylalkohol (PVA), gespült und bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Im Funktionstest entsprechend Beispiel 1 wurde eine Bindung von Bo/T = 33,9% gefunden.
Beispiel 8
Gläschen aus Beispiel 5 wurden 4 h mit einer 2,5%igen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd bei Raumtemperatur behandelt, gewaschen, 12 h mit Immunglobulinen gegen hTSH (Verdünnung I : 10 000), hergestellt nach Angaben von J. L Vaitukaitis et al. in J. Clin. Endocr. Metab. 33, 1049 (1971), angereichert nach der Methode von J. S. Baumstark et al. Arch. Biochem. Biophys. 108, 514 (1964), in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) inkubiert, gewaschen, 0,5 h mit 0,01% RSA in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt, mit 0,01% Natriumazid und 1% PVA in 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) gespült und getrocknet.
Die mit TSH-Antikörper beschichteten Gläschen wurden im Radioimmunoassay mit Hilfe von 125J-TSH geprüft Hierbei wurde eine Bindung von Bo/T = 56,8% erhalten.
Beispiel 9
Nach Beispiel 6 diazotierte Gläschen wurden 12 h mit Immunglobuiinen gegen TSH (Verdünnung 1 :10 000) in 0,1 m-Natriumcarbonatpuffer (pH 8,4) inkubiert, gewaschen, 03 h mit 0,01% RSA in Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt, mit 0,01% Natriumazid und 1% PVA in 0,0! m-Phosphatpuffer (pH 7,4) gespült und getrocknet Die Funktionsprüfung entsprechend Beispiel 8 ergab eine Bindung von Bo/T=64,4%.
Beispiel 10
1,5 ml Diphenyldichlorsilan wurden mit 3,5 ml Ethanol vermischt {Lösung F). Volumengleiche Mengen
ι der Lösungen D, E (s. Beispiel 3) und F wurden vermischt (Lösung G) und 2 h unter Luftausschluß bei Raumtemperatur vorkondensiert. 0,2 ml des Vorkondensats wurden in Glasfläschchen (Fiolax Klarglas) gegeben und mit 15 μΙ Wasser versetzt. Die Beschichtung
in wurde analog Beispiel 1 aufgebracht.
Die nach Beispiel 6 diazotierten Gläschen wurden 12 h mit T3-Antiserum (Verdünnung 1:50 000) in 0,1 m-Natriumcarbonatpuffer (pH 8,4) inkubiert, gewaschen, 0,5 h mit 0,01% RSA in Phosphatpuffer
r. (pH 7,4) behandelt, mit 0,01% Natriumazid und 1% PVA in 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) gespült und getrocknet. Der Funktionstest entsprechend Beispiel 1 erbrachte eine Bindung von Bo/T = 24,3%.
B e i s ρ i e I 11
Volumengleiche Mengen der Lösungen D, E und F wurden vermischt und unter Luftausschluß bei Raumtemperatur 24 h vorkondensiert. Anschließend wurde 2> wie im Beispiel 10 verfahren. Der Funktionstest erbrachte eine Bindung von Bo/T = 24,1%.
Beispiel 12
jo 5 ml der Lösung G wurden mit 1 ml Wasser versetzt und 2 h vorkondensiert. Anschließend wurde vom ausgefallenen Hochpolymeren abfiltriert, die Lösungsmittel am Hochvakuum abgezogen und das zurückgebliebene weiße Pulver unter Luftausschluß aufbe-
Ii wahrt.
0,1 g des Polymeren wurden in 50 ml Aceton gelöst, 0,1 ml dieser acetonischen Lösung wurden in Glasfläschchen (Fiolax Klarglas, 4Ox 15 mm) gegeben. Die Beschichtung wurde wie in Beispiel 1 aufgebracht. An die Oberfläche der Gläschen wurde wie in Beispiel 10 T3-Antiserum gekoppelt. Im Funkiionstest nach Beispiel 1 wurde eine Bindung von Bo/T = 30% erzielt.
Beispiel 13
1 ml der acetonischen Lösung des Polymeren aus Beispiel 12 wurden in Kunststoffgefäße aus einem Copolymerisat aus Polyethylen und Acrylsäure 92 :8,
■in Inhalt 1 ml, gebracht Nach 20 see wurde die Lösung wieder ausgegossen und die Gefäße getrocknet.
Danach wurde mit l%igem Glutaraldehyd in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) 30 min inkubiert, gewaschen, 2 h mit T3-Antiserum (Verdünnung 1 :100 000) in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) behandelt, 0,5 h mit 0,1% RSA in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) gespült und getrocknet. Im Funktionstest nach Beispiel 1 wurde eine Bindung von Bo/T=27% erhalten.
Beispiel 14
1 ml der acetonischen Lösung aus Beispiel 12 wurden in Glasfläschchen (Fiolax Klarglas, 40x15) gegeben. Die Lösung wurde nach 20 see ausgegossen und an die an der Glaswand haftende Schicht bei 150°C 15 min eingebrannt Anschließend wurde wie in Beispie! 10 verfahren. Der Funktionstest nach Beispiel 1 zeigte eine Bindung von Bo/T=30%.
Beispiel 15
Anstelle der Lösung C in Beispiel 3 wurde eine 0,01 m-Lösung von
(CH3O)3Si-CH2CH2CH2-NH-CO-(C6H4)NH2
in Ethanol/Aceton verwendet. Analog den Verfahrensschritten in Beispiel 3 wurden Glasfläschchen (Fiolax Klarglas, 4Ox 15 mm) beschichtet.
Die Gläschen wurden mit 1% Natriumnitrit in 4 n-Salzsäure 10 min bei 00C behandelt, gut gewaschen und anschließend 12 h mit T3-Antiserum (Verdünnung 1:50 000) in 0,1 m-Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,4) inkubiert, gewaschen, 0,5 h mit 0,01% RSA in 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) stehen gelassen, mit 0.01% Azid und 1% PVA in 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) gespült und getrocknet. Im Funktionstest analog Beispiel 1 wurde eine Bindung von BoAT = 24,8% erhalten. . .
Beispiel 16
Gläschen aus Beispiel 6 wurden 1 h mit 2,5%igem wäßrigen Glutaraldehyd behandelt und zweimal mit Wasser gewaschen. Dann wurde mit 6,5 ng l25J-Trijodthyronin (6 696 460cpm, spez. Aktivität 1113mCi/mg) in 1 ml 0,1 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) inkubiert. Nach
2 h waren 76%, nach 3 h 79%, nach 4 h 81%, nach 12 h 97% des T3 gebunden. Durch 30 min Waschen mit 0,1 m-Glycinpuffer (pH 2,3) wurde adsorptiv gebundenes Hormon entfernt. 84% des Hormons entsprechend 5,5 ng T3 waren kovalent an die Gläschen gebunden.
Beispiel 17
Gemäß Beispiel 16 wurde mit 8 ng ""J-Thyroxin (T4) (6 312 700cpm, spez. Aktivität 927 mCi/mg) inkubiert. Die Bindung nach 2 h betrug 55%, nach 4 h 60% und nach 12 h 69%. Nach dem Waschen verblieben
3 158 410cpm oder 56% des T4 (entsprechend 4.5 ng) kovalent an die Gläschen gebunden.
Beispiel 18
Gemäß Beispiel 16 wurde mit 17 ng '"J-hTSH (1 943 111 cpm, spez. Aktivität 117 mCi/mg) inkubiert. Die Bindung nach 3 h betrug 10%, nach 4 h 11% und nach 12 h 14%. Nach dem Waschen mit Glycinpuffer verblieben 13% oder 2 ng hTSH kovalent gebunden.
Beispiel 19
Gemäß Beispiel 16 wurde mit 29 ng I25j-Rindergammaglobulin (RGG) (850 000 cpm, spez. Aktivität 28 mCi/mg) inkubiert. Die Bindung nach 2 h betrug ίο 5%, nach 12 h 6%.
Nach dem Waschen mit Glycinpuffer waren 4,5% entsprechend 1,3 ng RGG kovalent gebunden.
Beispiel 20
υ Nach Beispiel 6 diazotierte Gläschen wurden mit 6,5 ng I25J-T3 aus Beispiel 16 in 0,1 m-Bicarbonaipuffer (pH 8,0) inkubiert. Die Bindung nach 2 h betrug 36%, nach 4 h 41% und nach 12 h 78%. Nach dem Waschen mit Glycinpuffer verblieben bi% entsprechend 4 ng des Haptens kovalent gebunden.
Beispiel 21
Gemäß Beispiel 20 wurde mit 8 ng ihj.-jy aus
Beispiel 17 inkubiert. Die Bindung nach 2 h betrug 45%,
2\ nach 12 h 49%. Nach dem Waschen mit Glycinpuffer waren 42% entsprechend 3,3 ng der Aminosäure T4 kovalent gebunden.
Beispiel 22
jo Entsprechend Beispiel 20 wurde mit 17 ng 125J-Thyreotropin (hTSH) aus Beispiel 18 inkubiert. Die Bindung betrug nach 2 h 13%, nach 12 h 24%. Nach dem Waschen mit Glycin verblieben 17% entsprechend 2,8 ng des Proteokormons kovalent an Gläschen gebun-
j·-, den.
Beispiel 23
Gemäß Beispiel 20 wurde mit 29 ng '«J-RGG aus
Beispiel 19 inkubiert Die Bindung betrug nach 2 h 14%, nach 3 h 16%, nach 12 h 20%. Nach dem Waschen mit Glycin waren 19% entsprechend 5 ng des Proteins kovalent an die Gläschen gebunden.

Claims (14)

P&tentanspröche:
1. Auf einen Träger aufgebrachte, stabilisierte, unlöslich gemachte biochemische Präparate, dadurch gekennzeichnet, daß biochemische Materialien, wie z.B. Antigene, Antikörper, Hormone, Aminosäuren, Haptene, Proteine, Enzyme etc, kovalent an eine Kieselsäureheteropolykondensatschicht aus einem Copolymerisat aus
a) mindestens einem substituierten Silan der allgemeinen Formel (I)
(D
15
in der R Wasserstoff, Halogen, Alkoxy oder -NR'2 (R'=Wasserstoff und/oder Alkyl) bedeutet, R" Alkyl, Alkenyl, Aryl oder Aralkyl darstellt und π eine ganze Zahi von 1 bis 3 ist, b) mindestens einem funktioneilen Silan der allgemeinen Formel (II)
(II)
25
in der R die vorstehende Bedeutung hat, R'" Alkylen, Phenylen, Alkylphenylen oder Alkylenphenylen darstellt, Y Halogen oder eine gegebenenfalls substituierte Amino-, gegebenen- so falls substituierte Anilino-, Aldehyd-, Keto-, Carboxy-, Hydroxy-, Mercapto-, Cyano-, Hydroxyphenyl-, Diazo-, Carbonsäurealkylester-, Sulfonsäuren-SO3H) oder Phosphorsäuregruppe (-PO3H2) bedeutet und η r> eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, sowie c) gegebenenfalls mindestens einem hydrolysierbaren Kieselsäurederivat der allgemeinen Formel (III)
40
SiR1
(III)
in der R die vorstehende Bedeutung hat, jedoch nicht alle Reste R Wasserstoff sind,
gebunden sind, die ihrerseits auf eine mechanisch tragfähige Unterlage aufgebracht ist.
2. Präparat nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Kieselsäureheteropolykondensatschicht kovalent an die mechanisch iragfähigc Unterlage gekoppelt ist.
3. Präparat nach Anspruch I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die tragfähige Unterlage Glas, ein siliziumhaltiges Material, Metalloxid, Metall, keramisches Material, Mineral, Papier, Hydroxylgruppen enthaltendes Material. Kunststoff und dgl. ist.
4. Verfahren zur Herstellung von biochemischen Präparaten nach einem der Ansprüche I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kieselsäureheteropoiykondcnsat herstellt, dieses auf eine tragfähige Unterlage aufbringt und gegebenenfalls nach einer Nachbehandlung das biochemische Material ankoppelt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kieselsäureheteropolykondensat in der Weise herstellt, daß man die einzelnen Komponenten a) bis c), gegebenenfalls gelöst in einem organischen Lösungsmittel, bei Temperaturen von -20 bis +130"C, vorzugsweise 0 bis 65"C, gegebenenfalls in Gegenwart von Protonen oder Hydroxylionen abspaltenden Katalysatoren und gegebenenfalls in Gegenwart von Wasser in einer oder in mehreren Stufen, vorzugsweise in einer oder in zwei Stufen, kondensiert,
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangskomponenten a) bis c) 1 Min. bis 24 Std. vorkondensiert und anschließend in Gegenwart mindestens der zur Hydrolyse stöchiometrisch erforderlichen Wassermenge auskondensiert
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangskomponenten a) bis c) in Gegenwart mindestens der zur Hydrolyse stöchiometrisch erforderlichen Wassej fjenge in einer Stufe durchkondensiert.
8. Verfahren nach einem der Anspräche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangskomponenten a) bis c) vorkondensiert und das erhaltene Kondensat als solches oder gelöst in einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls nach Zugabe von stöchiometrischen Mengen von Wasser auf die tragfähige Unterlage aufbringt und die aufgebrachte Schicht gegebenenfalls mit Wasser behandelt und/oder bei erhöhter Temperatur einbrennt.
9. Verfahren nach einem der Anspräche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangskomponenten a) bis c) durchkondensiert und das erhaltene Kondensat als solches oder gelöst in einem organischen Lösungsmittel auf die tragfähige Unterlage aufbringt und die aufgebrachte Schicht gegebenenfalls mit Wasser behandelt und/oder bei erhöhter Temperatur einbrennt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kieselsäureheteropolykondensat gegebenenfalls nach Zugabe einer stöchiometrischen Wassermenge aus der organischen Phase isoliert und erforderlichenfalls nach Auflösung in einem organischen Lösungsmittel auf die tragfähige Unterlage aufbringt und die aufgebrachte Schicht gegebenenfalls mit Wasser behandelt und/oder bei erhöhter Temperatur einbrennt.
11. Verfahren nach einem der Anspräche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge der Komponenten a) bis c) so auswählt, daß das entstehende Kieselsäureheteropolykondensat, bezogen auf Oxide, 60 bis 90 Gew.-% der Komponente a), I bis l5Gew.-°/o der Komponente b) und 0 bis 30 Gew.-% der Komponente c) enthält.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel organische Lösungsmittel, wie z. B. Alkohole, Ketone, Ether, Amide und Gemische derselben verwendet.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Kondensation gegebenenfalls bis zu 3% Wasser, Säure, Base oder Amin als Katalysator zusetzt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13. dadurch gekennzeichnet, daß man das Kieselsäureheteropolykondensat als solches oder gelöst in einem organischen Lösungsmittel auf die Unterlage aufbringt und durch 10- bis 45minütiges Erhitzen auf 7.5 bis I5O"C mit der Unterlage verbindet.
15, Verfahren nach einem der Ansprüche 4 Ws 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kieselsäure" heteropojykondensatschicht mit Wasser oder Was* serdampf von 4 bis 150° C 2 bis 30 Μία nachbehandelt,
16, Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kieselsäureheteropolykondensatschicht bei Temperaturen von 100 bis 1500C 5 bis 30 Min. lang einbrennt
17, Verwendung der stabilisierten biochemischen Präparate nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Mittel, z,b. Trennmittel, Adsorbentien etc. bei immunchemischen Verfahren, wie z.B. Radioimmunoassays, Affinitätschromatographie etc.
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