CH629596A5 - Hydrophobe, spezifisch reagierende membran. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine hydrophobe spezifisch reagierende Membran, auf ein Verfahren zu deren 15 herstellung und auf die Verwendung der Membran in einem Gerät zur quantitativen Messung der elektrischen Spannungsdifferenz zur Ermittlung der Anwesenheit von mit einem immobilisierten Protein reaktionsfähigen Verbindungen unter Einsatz einer immunochemischen Reaktion.
20 Die spezifische Reaktion eines besonderen Proteins mit einem anderen besonderen Protein ist bekannt, beispielsweise die Entwicklung eines spezifischen Abwehrstoffs in Tieren, um besondere Antigene zu bekämpfen. Diese Spezifität eines Proteins für ein anderes Protein wurde in der Affinitäts-Chromatogra-25 phie eingesetzt, um ein spezifisches, in einer besonderen Lösung vorhandenes Protein abzutrennen.
Die selektive Reaktion zwischen zwei Verbindungen besteht für viele Substanzen, so reagieren Proteine, einschliesslich Hormone und Enzyme, sowie Poly- und Monosaccharide selektiv 30 mit spezifischen Verbindungen, wobei alle derartigen Reaktionen im nachstehenden als «immunochemische Reaktion» bezeichnet werden. Obwohl im nachstehenden der Einfachheit halber in erster Linie Protein und mit Protein reaktionsfähige Gruppen erläutert werden, ist zu beachten, dass anstelle von 35 Proteinen und mit Protein reaktionsfähigen Gruppen auch andere Kombinationen von spezifisch miteinander reagierenden Verbindungen oder Gruppierungen zum Einsatz gelangen können.
Materialien für Affinitäts-Chromatographie, beispielsweise 40 Säulenfüllungen, werden auf hydrophilen polymeren Oberflächen gebildet, die aufgrund ihrer polaren Art reaktive Stellen aufweisen, an denen mit Protein reaktionsfähige Verbindungen gebunden werden. Die hydrophile Art des Substrats wird durch die bindung des Proteins nicht beeinträchtigt.
45 Ein Protein, beispielsweise ein Antikörper oder Antigen, zeigt in einer Pufferlösung eine elektrische Ladung, deren Grösse und Polarität vom isoelektrischen Punkt des Proteins und der Zusammensetzung des Puffers abhängen. Diese Ladung wechselt zufolge der Antikörper/Antigen-Reaktion. Obwohl der so Wechsel der elektrischen Ladung eine feststellbare Grössenord-nung aufweist, ist die Immobilisierung eines Proteins auf einer hydrophilen Membran unbefriedigend, da die ionisierende Wirkung von Wasser auf die polaren Gruppen des hydrophilen Substrats so gross ist, dass die geringe elektrische Spannung des 55 durch die immunochemische Reaktion erzeugten Spannungswechsels überdeckt wird.
Es wurde nun gefunden, dass wenn der ganze Antikörper kovalent an der Oberfläche eines hydrophoben Polymers gebunden ist, das wiederum auf einem elektrischen Leiter ange-6o ordnet ist, die Ladung der Oberfläche der Polymer/Lösungs-Grenzfläche von der Ladung des immobilisierten Antikörpers abhängt. Bei Vorhandensein des entsprechenden Antigens in der Lösung tritt, wenn die Bindungsstelle des Antikörpers während der Immobilisation, d.h. Bindung an das Polymer, nicht 65 zerstört wurde, die immunochemische Reaktion an der Grenzfläche unter Wechsel der Spannung der Oberflächenladung auf. Dieser Wechsel kann potentiometrisch gegen eine in die gleiche Lösung eingetauchte Bezugselektrode gemessen werden.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die im Patentanspruch 1 definierte Membran. Eine Ausführungsform der erfin-dungsgemässen Membran mit der Fähigkeit der Immobilisierung eines Proteins, die ein Substrat aus einem hydrophoben durch Lösungsmitteleinwirkung quellbaren Polymer aufweist, und in welcher ein Kohlenwasserstoff, üblicherweise eine aliphatische Verbindung mit einer entsprechenden reaktiven Gruppe aus einem Lösungsmittelsystem absorbiert werden kann, zeigt an das Substrat gebunden eine zur Hauptsache Kohlenwasserstoffkette mit einer mit einem Protein reaktionsfähigen Gruppe, beispielsweise einer Oxiran-, d.h. Epoxidgruppe, oder einer anderen, mit Protein reaktionsfähigen Gruppe. Die Kette kann andere als C-C-Bindungen, beispielsweise Ätherbindungen, aufweisen und wird im nachstehenden als «zur Hauptsache Kohlenwasserstoffkette» bezeichnet.
In einer Ausführungsform weisen die an das polymere Substrat gebundenen, zur Hauptsache Kohlenwasserstoffketten Gruppen auf, die spezifisch mit einer chemischen Verbindung reagieren, vorzugsweise Kohlenwasserstoffketten mit endständigen, spezifisch mit einem Polypeptid reagierenden Gruppen. Zweckmässig enthält die Membran Kohlenwasserstoffketten, wovon jede eine reaktive, zur Bindung einer spezifisch mit einem Protein reaktionsfähige Gruppe aufweist, die über die Kette an die Membran gebunden wird, indem die beiden reaktionsfähigen Gruppen miteinander zur Reaktion gebracht werden. Zweckmässig sind die mit Protein reaktionsfähigen Gruppen Antikörper oder Antigene.
Die Ausführungsform der erfindungsgemässen hydrophoben Membran mit der Fähigkeit zur Immobilisierung von Protein kann zur Umhüllung einer gut elektrisch leitfähigen Elektrode, beispielsweise aus Platin, eingesetzt werden. Ein Protein, beispielsweise ein Antikörper, mit Selektivität für die Reaktion mit einem besonderen Protein, z.B. Antigen, kann mit der Bindungsstelle des Proteins zur Reaktion gebracht werden. Eintauchen einer solcherart umhüllten Elektrode, zusammen mit einer Bezugselektrode, in eine wässrige, das Antigen enthaltende Lösung ergibt ein elektrisch empfindliches System, das dazu befähigt ist, die Änderung der elektrischen Ladung an der Grenzfläche Lösung/Polymer aufgrund der Aufnahme eines besonderen Proteins, z.B. Antigens, durch die Elektrode mit einem immu-noreaktiven Antikörper, zu messen. Alternativ kann das Antigen auf der Membran immobilisiert werden, um selektiv den Antikörper aufzunehmen.
Die Erfindung ermöglicht somit die Bildung einer Elektrode, die mit einer spezifisch reagierenden Membran umhüllt ist.
Mittels einer solcherart umhüllten Elektrode wird es ermöglicht, die Gegenwart und gegebenenfalls die Kenzentration einer Verbindung in einem Gemisch, das die Verbindung zusammen mit anderen Molekülen, beispielsweise Lösungsmittelmolekülen, enthält, durch Kontakt des Gemischs mit der spezifisch mit der Verbindung reagierenden Membran zu ermitteln, durch Feststellung der Veränderung der Spannung der elektrischen Ladung der Membran. Zweckmässig erfolgt dies durch Vergleich mit einer entsprechenden Bezugselektrode.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der beschriebenen hydrophoben polymeren Membran mit selektiver immunochemischer Fähigkeit, d.h. einer spezifisch reagierenden Membran aus einem hydrophoben Polymer. Das Poylmer ist in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, insbesondere in aliphatischen Lösungsmitteln, quellbar. Besonders geeignete Polymere sind hydrophobe Polymere, die keine gebundenen polaren Gruppen aufweisen, beispielsweise thermoplastische Polymere, wie Polyvinylchlorid, Polystryrol, Polyäthylen und -propylen, Silikongummi, Polyurethan, Polycarbonat, Polytetrafluoräthylen. Es können auch thermohärtende Polymere, wie Epoxydharze und vernetzte Polyester, zum Einsatz gelangen. Bevorzugte Polymere sind solche, die durch Eintauchen oder Aufschrumpfen als Überzugsschicht auf eine Elektrode gebracht werden können.
Die polymere Membran wird danach während genügend langer Zeitdauer mit einem zur Quellung der Membran befähig-5 ten Lösungsmittelsystem behandelt, um die Membran zumindest in solchem Ausmass zu quellen, dass die Kohlenwasserstoffkette in genügender Konzentration in die Membran eingearbeitet wird, wie nachstehend beschrieben. Das Lösungsmittelsystem enthält ausser einem zweckentsprechenden Lösungsmit-io tel eine Kohlenwasserstoff Verbindung mit einer reaktiven Bindungsstelle, vorzugsweise in der Nähe oder am freien Ende der Kohlenwasserstoffkette. Für die Quellung der polymeren Membran werden vorzugsweise Lösungsmittel verwendet, die durch Trocknung des Polymers leicht aus diesem entfernt werden kön-i5 nen. Somit werden im allgemeinen Lösungsmittel mit niederem Molekulargewicht solchen mit höherem Molekulargewicht vorgezogen.
Wie im nachstehenden erläutert, wird der Einsatz eines Lösungsmittels mit tieferem Siedepunkt und das leichter ver-20 dampfbar ist als die Kohlenwasserstoffverbindung mit der reaktiven Bindungsstelle, verwendet. Ein zweckmässiges Lösungsmittelgemisch für Polyvinylchlorid enthält Petroläther mit einem Siedebereich von 30-60 °C und Toluol. Andere Lösungsmittel oder Gemische davon können auch für das Quellen von 25 Polyvinylchlorid oder anderen Polymermaterialien verwendet werden und sind dem Fachmann bekannt oder können durch einfache Vorversuche leicht ermittelt werden.
Eine typische Kohlenwasserstoffverbindung mit einer reaktiven Bindungsstelle ist n-Decanol. Andere besonders geeignete 30 Verbindungen sind beispielsweise n-Hexanol, n-Decylamin, n-Hexylamin, n-Decansäure und weitere derartige Verbindungen mit einem labilen Wasserstoffatom.
Nach Einweichen der polymeren Membran im Gemisch des Lösungsmittels und der Kohlenwasserstoffverbindung während 35 genügend langer Zeitdauer, um das benötigte Ausmass an Quellung zu erzielen, wird die Membran bei zweckmässiger Temperatur getrocknet, um das Lösungsmittel, jedoch keine wesentlichen Anteile der Kohlenwasserstoffverbindung mit der reaktiven Bindungsstelle, zu entfernen. Bei Verwendung von Petrolio äther, Toluol und Lösungsmitteln mit ähnlichem Siedebereich beträgt die Trocknungstemperatur beispielsweise 50-100 °C, zweckmässig 50-60 °C, vorzugsweise unter Vakuum. Die Entfernung des Lösungsmittels führt zu einer Membran mit einer geringen Konzentration von daran gebundenen Kohlenwasser-45 stoffketten, wovon jede eine reaktionsfähige Gruppe aufweist, beispielsweise eine Hydroxyl-, Amin- oder Carboxylgruppe.
Die Auswahl des Lösungsmittels mit entsprechendem Siedepunkt und des bei dessen Entfernung anzuwendenden Druk-kes erfolgt zweckmässig im Hinblick auf die Art und Eigen-50 schaffen der Membran und der Kohlenwasserstoffverbindung, wobei die Lösungsmittel, welche die zum Einsatz gelangenden Polymere quellen, bekannt sind.
Nach der Bindung der Kohlenwasserstoffkette an die polymere Membran kann eine Reihe weiterer Behandlungen erfol-55 gen, um eine spezifisch reagierende Membran, d.h. eine Membran mit der Fähigkeit, eine spezifische Verbindung, beispielsweise ein Protein, ein Enzym oder ein Mono- oder Polysaccharid, wie in einer immunochemischen Reaktion, aufzunehmen, zu erhalten.
so Es ist zu beachten, dass in die Kohlenwasserstoffkette vor deren Bindung an die Membran eine entsprechende, spezifisch reaktionsfähige Gruppe eingeführt werden kann, wobei es in diesem Fall notwendig sein wird, sicherzustellen, dass diese Gruppe ihre Reaktionsfähigkeit nicht zum Ausdruck bringt, 65 vorzugsweise durch Sicherstellung, dass diese Gruppe nicht weniger als 4-6 C-Atome von der Membran hinweg angeordnet ist. Die reaktionsfähige Gruppe kann jedoch auch nach der Bindung der Kette an die Membran in die Kette eingeführt werden.
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Spezifisch reaktionsfähige Gruppen sind erhältlich durch Berührung der Membran mit einem entsprechenden, mit der Koh-lenswasserstoffkette reaktionsfähigen Material, um die notwendige spezifische Aktivität zu schaffen, oder es kann eine Bindungsgruppe eingesetzt werden, um eine entsprechend spezifisch reaktionsfähige Gruppe an die reaktionsfähige Gruppe der Kette zu binden. Derartige Alternativen sind dem Fachmann bekannt, und die Auswahl der zweckmässigen Reihenfolge erfolgt im Hinblick auf die Art der verschiedenen betroffenen Materialien und Gruppen.
Der Einsatz einer Bindungsgruppe für Protein kann beispielsweise die nachstehende Reihenfolge umfassen:
Nach dem Trocknen der poylmeren Membran wird diese in eine Lösung eingetaucht, die eine spezifisch mit Protein reaktionsfähige Bindungsstelle und eine andere Bindungsstelle, die mit der reaktionsfähigen Gruppe der an die Membran gebundenen Kohlenwasserstoffkette reaktionsfähig ist, aufweist. Wenn
Membran
•OH
beispielsweise die reaktionsfähige Gruppe der Kohlenwasserstoffkette eine Hydroxylgruppe ist, kann als typische mit Protein reaktionsfähige Verbindung Epichlorhydrin, wobei eine Epo-xid-Äther-Bindegruppe gebildet wird, zum Einsatz gelangen. In 5 die Membran können andere Kohlenwasserstoffmoleküle eingeführt werden, beispielsweise aliphatische Amine, vorzugsweise primäre und sekundäre Amine, Carboxylgruppen enthaltende aliphatische Verbindungen und dergleichen, die mit Epichlorhydrin oder einem Bisepoxid, das für die Reaktion ein Paar io Oxiranringe enthält, reaktionsfähig sein können. Es ist erwünscht, dass keine Wahrscheinlichkeit von Vernetzung zwischen einem Paar von an die Membranoberfläche gebundenen Gruppen vorhanden sei.
15 Eine Reihe von zweckmässigen Behandlungen zur Erzielung eines an eine polymere Membran gebundenen aliphatischen Alkohols kann folgendermassen dargestellt werden:
Aliphatischer Alkohol
O-CH.-CH-CH
2 V
Cl-CH.CH-CH
V
Epichlorhydrin
HCl
Proteine mit Aminogruppen sind befähigt zur Reaktion mit nähme eines spezifischen Proteins in einer immunochemischen der an die Membran zu bindenden Oxirangruppe zur Bildung Reaktion befähigt ist.
einer Membran mit einem immobilisierten Protein, das zur Auf- Andere Methoden zur Herstellung einer Membran mit einem immobilisierten Protein sind beispielsweise:
a) Thiophosgen der Isocyanat-Kupplung
/
Membran / >- NH_ + CSC1
/
/ Aliphatisches Amin Phosgen
/
/ / /
/ / / /
•N=C=S
■N=C=S
2HC1
p-nh2 —
Protein
S il
■N-C-H-P H H
b) Azo-Kupplung Membran
' NH_
Aliphatisches Amin
H II kJ
O NO„
Cl C=0
Ó
NO„
p-Nitrobenzoylchlorid
*aS204
Natrium-thiosulfat
° NH2 (HCl)
N—C-f^| + NaNO
H II k I 2
5 nh2
N-Cf^l +
H II
Protein
0 ~ N=NH
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Ein anderes Protein-Kupplungssystem umfasst die Bildung verändert. Die geringe Veränderung wird durch das Messgerät, einer Diimid-Bindung zwischen der Kohlenwasserstoffkette und das eine hohe Impedanz der Elektrodenverbindung aufweist,
einem Proteinmolekül, wobei eine aliphatische Verbindung mit registriert, so dass die Anwesenheit der betreffenden Verbin-
einer Carboxylgruppe mit Carbodiimid zur Reaktion gebracht dung angezeigt wird. Durch Eichung kann das Messgerät für und das erhaltene Reaktionsprodukt mit einem entsprechenden 5 quantitative Bestimmung des in der Lösung vorhandenen Men-
Protein zur Reaktion gebracht wird. genanteils der betreffenden Verbindung eingestellt werden.
Nachdem die mit Protein reaktionsfähige Bindungsverbin- Für die Bezugselektrode kann Elektrodenmaterial in einem dung, d.h. eine Verbindung, die eine immobilisierende Gruppe weiten Bereich der bekannten Materialien verwendet werden,
enthält, beispielsweise Epichlorhydrin, zwecks Bildung der obwohl gefunden wurde, dass es vorteilhaft ist, als Bezugselek-
proteinbindenden Gruppe mit dem labilen Wasserstoff atom der io trode eine zweite Immunoelektrode zu verwenden, die praktisch an die Membranoberfläche gebundenen Kette zur Reaktion ge- identisch ist mit der Messelektrode mit der Ausnahme, dass die bracht wurde, wird die Membran vorzugsweise gewaschen und spezifisch reaktionsfähigen Bindungsstellen mit einem entspre-
in eine Lösung eingelegt, die das zu immobilisierende Protein chenden reaktionsfähigen Blockierungsmittel blockiert sind, so enthält. Für diese Reaktion wird Zimmertemperatur bevorzugt, dass die Bezugselektrode nicht mehr auf das jeweils zu ermit-und im allgemeinen wird die Reaktion während 1-2 Tagen fort- 15 telnde Material anspricht. Diese Bezugselektrode spricht jedoch schreiten gelassen. Im allgemeinen wird die Reaktion in durch nicht selektive Adsorption anderer Moleküle in der Prü-
schwach basischem Medium ausgeführt. flösung an, wie auch die Messelektrode, so dass die Wirkung
Nach der Bindung des Proteins erfolgt eine Behandlung zum nicht selektiver Adsorption, falls solche auftritt, kompensiert
Wegspülen der Rückstände von unreagierten Materialien und werden kann und die Messung der Spannung einer aktiven weitere Reaktion mit einer Verbindung nur Neutralisation von 20 Mess-Immunoelektrode gegen die Spannung einer entsprechen-unreagierten, mit Protein reaktionsfähigen, d.h. immobilisieren- den Bezugs-Immunoelektrode mit blockierten Bindungsstellen den Gruppen, die nach der Reaktion mit dem Proteinmolekül wirdsam die Auswirkung von nicht spezifischen Wechselwirkun-
zurückblieben. Unreagierte mit Protein reaktionsfähige Grup- gen eliminieren kann.
pen neigen dazu, polare Art aufzuweisen und sind auch daher Fig. 1-3 der Zeichnung sind Diagramme betreffend die Wirunerwünscht, da sie nicht spezifisch mit Proteinen reagieren und 25 kungsweise der erfindungsgemässen Membran.
somit in einem Gerät zur Feststellung eines Proteins zu fehlerhaften Resultaten führen können. Beispiel 1
Bei Ausführung des beschriebenen Verfahrens zur Herstel- Eine protein-immobilisierte Membran wurde auf einer Pla-
lung einer erfindungsgemässen Membran wird im allgemeinen tinelektrode gebildet durch Eintauchen in eine Polyvinylchlo-die Verwendung einer Kohlenwasserstoffverbindung bevorzugt, 30 ridlösung und anschliessendes Trocknen, wobei eine Beschich-
die eine genügende Kettenlänge aufweist, um die Anordnung tung einer Dicke von ungefähr 25 [im gebildet wurde,
der reaktionsfähigen Gruppe in einiger Entfernung von der Die beschichtete Elektrode wurde während 3 h bei Zim-
Oberfläche der Membran zu ermöglichen. Im allgemeinen hat mertemperatur in ein Lösungsmittelgemisch, enthaltend je 4,5
die verwendete Kohlenstoffverbindung in der Hauptkette min- Vol.Teile Petroläther und Toluol sowie 1 Vo.Teil des Kohlen-
destens 6 C-Atome. Eine bevorzugte Kettenlänge der Haupt- 35 Wasserstoffs n-Decanol eingetaucht und danach während 16 h in kette der Kohlen Wasserstoff Verbindung enthält 8-12 C-Atome einem Vakuumofen bei 50 °C wärmebehandelt.
und wird in jedem Fall vorzugsweise so gewählt, dass die spezi- Die getrocknete Elektrode wurde dann in eine Lösung, ent-
fisch reaktionsfähige Gruppe von der Oberfläche der Membran haltend 10 Gew.-% Epichlorhydrin in einer 1 mol%igen Lö-
durch mindestens 4, vorzugsweise mindestens 6 oder sogar 8 sung von Natriumhydroxid von 60 °C während 2 h eingetaucht.
C-Atome getrennt ist. Falls eine mit Protein reaktionsfähige 40 Dann wurde die Elektrode mit destilliertem Wasser gespült und
Bindungsverbindung, die damit zur Reaktion gebracht wird, danach während 48 h bei Zimmertemperatur in eine wässrige eine wesentliche Kettenlänge aufweist, so dass die schlussendli- Lösung, enthaltend 0,5 Mol-% Natriumbicarbonat und das che mit Protein reaktionsfähige Gruppe von der Oberfläche der Protein Concanavalin A eingetaucht.
Membran durch mindestens 6 C-Atome getrennt ist, muss die Diese Mess-Immunoelektrode wurde dann aus der Lösung
Kette der verwendeten Kohlenwasserstoffverbindung natürlich 45 genommen, mit einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,5 Mol-%
nicht so lang sein. Bicarbonat-Puffer, dann mit einer wässrigen Lösung, enthaltend
Die erfindungsgemässe Membran ist insbesondere nützlich 0,1 Mol- % Kaliumhydrogenphthalat-Puffer und 1 Mol- % Na-
für die Verwendung in einem Gerät zur qualitativen und vor- triumchlorid bei einem pH-Wert von 3,0, dann mit dest. Was-
zugsweise quantitativen Ermittlung der Anwesenheit einer be- ser, dann mit einer wässrigen Lösung, enthaltend 0,1 Mol- %
sonderen Verbindung in einer bestimmten Mischung, beispiels- 50 Tris-(hydroxy-methyl)-aminomethan-Puffer und 0,5 Mol-%
weise Lösung, die eine solche Verbindung enthalten kann. Äthanolamin bei einem pH-Wert von 7,8 gespült, wobei das
Hierfür wird eine entsprechende Ausführungsform der er- Äthanolamin zur Blockierung allfälliger unreagierter Epoxy-
findungsgemässen Membran auf der Messelektrode, der «Im- gruppen zum Einsatz gelangte.
munoelektrode» gebildet, beispielsweise in einer Schichtdicke Die erhaltene Messelektrode wurde dann über ein empfind-von 10-50 (im, besonders bevorzugt in einer Schichtdicke von 55 liches Messgerät elektrisch mit einer Bezugselektrode verbun-20-40 um. Vorzugsweise soll die Schichtdicke der Membran den. Im allgemeinen ist in der elektrischen Verbindung zwi-100 |xm nicht überschreiten und 5 (xm nicht unterschreiten. In sehen den beiden Elektroden eine grosse Impedanz erwünscht, der Membran wird ein Protein oder eine andere entsprechende Das Protein Concanavalin A ist dafür bekannt, gewisse Zweige Verbindung eines immunochemischen Paars immobilisiert. Die von Polysacchariden mit nicht reduzierenden a-D-Hexapyra-Messelektrode wird zusammen mit einer Bezugselektrode ein- 60 nosyl- oder ß-D-Fructofuranosyl-Endgruppen selektiv auszugesetzt. Die beiden Elektroden werden in ein Gemisch einge- fällen. Hefemannan gehört zu dieser Gruppe und ist als äusserst taucht, beispielsweise eine Lösung, die ein Protein oder eine reaktionsfähig bekannt. In Fig. 1 ist die Reaktion der Concana-andere Verbindung der zu identifizierenden Art enthält. Die valin A-Immunoelektrode auf verschiedene Konzentrationen Mess- und Bezugselektrode werden elektrisch über ein Messge- von Hefemannan bei pH-Werten von 6,0 bzw. 3,5 graphisch rät miteinander verbunden, das auf sehr schwache Veränderun- es dargestellt, wobei sich die Spannung im System abhängig von gen der elektrischen Spannung reagiert. Durch die Aufnahme der Konzentration des Hefemannans in der Lösung änderte, des betreffenden Proteins durch die Messelektrode wird die Keine Spannungsänderung wurde jedoch beobachtet, wenn der elektrische Spannung an der Polymer/Lösungs-Grenzfläche Messlösung eine Agarlösung zugesetzt wurde. Agar ist ein Poly-
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saccharid, das mit Concanavalin A nicht reagiert. Das Ausbleiben einer Änderung der elektrischen Spannung im System bei Anwesenheit von Agar in der Messlösung weist darauf hin, dass die Selektivität des Concanavalin A trotz der Immobilisierung der hydrophoben Membran beibehalten wurde.
Beispiel 2
Ein anderes Beispiel der Spezifität der Immunoelektrode ist in Fig. 3 der Zeichnungen dargestellt.
Eine Immunoelektrode wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei mit der an die Membran gebundenen Epo-xidgruppe Kaninchen-Antihuman-7S-Gamma-Globulin zur Reaktion gebracht wurde. Die Immunoelektrode wurde dann in eine Lösung von Human-7S-Gamma-Globulin mit einem pH-Wert von 5 eingetaucht, wobei die Konzentration der Lösung variiert wurde. Die Veränderung der Konzentration wurde elektrisch gemessen.
Die immunochemische Reaktion zwischen dem Kaninchen-Antihuman-7S-Gamma-Globulin und dem Human-7S-Gam-ma-Globulin ist dafür bekannt, dass sie bei einem pH-Wert von
7,8 nicht eintritt. Bei Eintauchen der immobilisiertes Kaninchen-Antihuman-7S-Gamma-Globulin enthaltenden Immu-noelektrode in eine Human-7S-Gamma-Globulin enthaltende Lösung erfolgte keine Veränderung der elektrischen Spannung.
5 Die immunochemischen Reaktionen blieben gleich, obwohl eine der Verbindungen auf eine hydrophoben polymeren Membran immobilisiert war.
Für die Elektrode bevorzugtes Material ist Platin, obwohl jedes andere zweckmässige, elektrisch leitende Material, entwe-io der Metall, wie Kupfer oder Silber, oder Nichtmetall, beispielsweise elektrisch leitfähiger Russ, verwendet werden kann. Die Elektrode kann jede beliebige Form aufweisen, z.B. eines Stabs, Drahts oder Blatts. Es ist zweckmässig, Flächenteile der Elektrode, die nicht von der Membran umhüllt oder bedeckt sind, zu 15 isolieren. Dies kann zweckmässig erfolgen durch Umhüllung solcher Flächenteile der Elektrode und gegebenenfalls von dazugehörenden elektrischen Leitungen, mit einem entsprechenden Isolationsmaterial, wobei beispielsweise für Platin Glas bevorzugt wird, obwohl auch andere Materialien, wie Polytetra-2o fluoräthylen, verwendet werden können.
C
1 Blatt Zeichnungen
Claims (10)
1. Hydrophobe, spezifisch reagierende Membran in Form eines hydrophoben, organischen, polymeren Substrates, an dessen Oberfläche Kohlenwasserstoffketten teilweise absorbiert sind, die mit einer chemischen Verbindung spezifisch reagierende Gruppen enthalten.
2. Protein immobilisierende Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die teilweise an der Oberfläche des Substrates absorbierten Kohlenwasserstoffketten mit Protein reaktionsfähige Gruppen aufweisen.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
dass mindestens ein Teil der mit Protein reaktionsfähigen Gruppen ein Proteinmolekül enthält.
4. Membran nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
dass die mit Protein reaktionsfähigen Gruppen in unreagiertem Zustand ein die Reaktion blockierendes Molekül enthalten.
5 tels eines elektrischen Leiters über ein auf sehr schwache Veränderungen der elektrischen Spannung reagierendes Messgerät miteinander verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass man die Membran zur Bildung einer reaktiven Messelektrode in Form einer Hülle um die Messelektrode herum anordnet.
5. Membran nach einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Protein reaktionsfähige Gruppe ein Epoxid ist.
6. Membran nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenwasserstoffkette mindestens 6 C-Atome aufweist, die linear mit einer reaktiven Gruppe verbunden sind.
7. Membran nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass das organische, polymere Substrat in organischen Lösungsmitteln, insbesondere in aliphatischen Lösungsmitteln, quellbar ist.
8. Membran nach einem der Ansprüche 2, 3, und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Protein reaktionsfähige Gruppe das Reaktionsprodukt eines mit Protein reaktionsfähigen Moleküls mit einer reaktionsfähigen Kohlenwasserstoffverbindung und über diese an die Kohlenwasserstoffkette gebunden ist.
9. Membran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass das mit Protein reaktionsfähige Molekül Epichlorhydrin ist.
10. Membran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenwasserstoffverbindung ein aliphatischer Alkohol mit mindestens 6 C-Atomen in der Hauptkette, vorzugsweise n-Decanol, ist.
11. Verfahren zur Herstellung einer Membran nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man a) ein hydrophobes polymeres Substrat mit einem zum Quellen des polymeren Substrats befähigten Lösungsmittel und mit einer eine reaktionsfähige Gruppe aufweisenden aliphatischen Verbindung behandelt,
b) das mit dem Lösungsmittel imprägnierte polymere Substrat trocknet, um praktisch alles Lösungsmittel daraus zu entfernen und ein Substrat mit teilweise an dessen Oberfläche absorbierten aliphatischen Ketten mit einer reaktiven Gruppe zu erhalten, und c) eine zur Reaktion mit einem Protein befähigte Verbindung mit einer gleichen reaktiven Gruppe wie diejenige der aliphatischen Kette, mit dem Substrat zur Reaktion bringt, um ein Substrat mit einer an dieses gebundenen, mit einem Protein reaktionsfähigen Gruppe zu erhalten.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe c) ein Protein mit einer spezifischen Antikörper-oder Antigen-Reaktivität mit der mit einem Protein reaktionsfähigen Gruppe unter Bildung eines Substrats mit einem daran gebundenen, immobilisierten Protein zur Reaktion bringt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man in der Verfahrensstufe c) eine Verbindung mit unrea-gierten, mit einem Protein reaktionsfähigen Gruppen zur Reaktion bringt, um weitere Reaktion der mit dem Protein reaktionsfähigen Gruppen zu blockieren.
14. Verwendung einer Membran nach Anspruch 1 und 2 in einem Gerät zur quantitativen Messung der elektrischen Spannungsdifferenz zwecks Ermittlung der Anwesenheit von mit einem immobilisierten Protein reaktionsfähigen Verbindungen durch immunochemische Reaktion, wobei das Gerät eine Bezugselektrode und eine aus einem elektrischen Leiter aufgebaute Messelektrode aufweist und diese beiden Elektroden mit-
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EP0175585A1 (de) * | 1984-09-21 | 1986-03-26 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Dielektrische Wellenleitersensoren und ihre Anwendung in Immunoassays |
Also Published As
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