DE2644249C2

DE2644249C2 -

Info

Publication number: DE2644249C2
Application number: DE19762644249
Authority: DE
Inventors: John Frederick Selly Oak Birmingham Gb Kennedy; Martin Frank Stirchley Birmingham Gb Chaplin
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1976-09-30
Filing date: 1976-09-30
Publication date: 1988-12-22
Also published as: DE2644249A1

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebene Zusammensetzung, deren Verfahren zur Herstellung gemäß Anspruch 6 und deren Verwendung gemäß Anspruch 7. Die Ansprüche 2 bis 5 betreffen Ausgestaltungen der Zusammensetzung.

Verbindungen mit biologischer oder chemischer Aktivität, beispielsweise Biopolymere, wie Enzyme, Antikörper, Proteine und Peptide, werden häufig bei chemischen und biochemischen Reaktionen eingesetzt. Für diese und andere Zwecke ist es vorteilhaft, die Verbindungen in wasserunlöslicher, leicht abtrennbarer Form bereitzustellen. Methoden, mit welchen dieses Ziel erreicht wird, sind bekannt. Unlöslich gemachte (insolubilisierte) Enzyme haben sich beispielsweise nunmehr klar als wertvolle biochemische Hilfsmittel durchgesetzt. Es wurden bereits verschiedene Insolubilisierungsmatrizen eingesetzt, beispielsweise im Falle der Adsorption an Ionenaustauschern (vgl. C. J. Gray und T. H. Yeo, Carbohyd. Res. 27 [1973], Seite 235) und der kovalenten Verknüpfung eines Teils des Enzymmoleküls mit bestimmten Stellen eines vorgeformten Polymeren (vgl. S. A. Barker, S. H. Doss, C. J. Gray, J. F. Kennedy, M. Stacey und T. H. Yeo, Carbohyd. Res. 20 [1971], Seite 1).

Aus der DE-OS 25 22 484 ist ein inerter Träger bekannt, auf dem eine Schale aus einem Polymer aufgetragen ist und diesen umgibt, auf welchem ein Enzym fixiert ist.

Aus der DE-OS 22 29 298 ist ein Verfahren bekannt, bei dem auf einen inerten Träger eine Schicht aus einem Polymer aufgebracht wird, welches in Wasser unlöslich ist und freie Aldehydgruppen trägt und worauf ein Enzym mit dem Polymer umgesetzt wird.

Keine der beiden vorgenannten Druckschriften erwähnt die Verwendung von metallischen Trägern. Auch der Einsatz von Aminobenzoesäure-Aldehyd-Kondensationsprodukten geht aus diesen Druckschriften nicht hervor.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Das Substrat besitzt zweckmäßig die Form von Metallpulver oder Metallstangen bzw. -stäben. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können folgende Vorteile erzielt werden:

a) die verknüpften organischen Verbindungen können wiederholt eingesetzt werden;
b) die verknüpfte organische Verbindung kann gegenüber Hitze und anderen, die Inaktivierung fördernden Bedingungen beständiger als die entsprechende freie oder lösliche Verbindung sein;
c) die verknüpfte Zusammensetzung besitzt die vom Metallsubstrat herrührende hohe Dichte und Teilchengröße sowie Form;
d) die verknüpfte Zusammensetzung sedimentiert aufgrund ihrer hohen Dichte rasch und läßt sich leicht aus einer Suspension in wäßrigen oder anderen flüssigen Medien abtrennen;
e) wenn das Metallsubstrat magnetisch ist, ermöglicht es die schnelle und einfache Abtrennung der verknüpften Zusammensetzung aus flüssigen Medien mit Hilfe eines magnetischen Feldes, daß jeglicher Wasch- oder Inkubationsprozeß rasch und wirksam abgeschlossen werden kann, wobei eine genaue Regelung der Temperatur der Lösung oder der Reaktionsdauer gewährleistet wird;
f) zur Durchführung der Umsetzungen sind keine Innenrührerstäbe erforderlich, da die Lösungen von unter den Einfluß eines rotierenden magnetischen Feldes gebrachten magnetischen Metallsubstraten gründlich gerührt werden können;
g) das Verfahren der Wasserinsolubilisierung von Enzymen kann auch zur Konzentrierung der Enzyme angewendet werden, die in einem Gärmedium, einem Zellenextrakt, einer biologischen Flüssigkeit oder anderen wäßrigen Flüssigkeiten erzeugt werden, welche diese Enzyme entweder allein oder im Gemisch mit anderen Verbindungen enthalten. Ferner kann mehr als ein spezielles Enzym oder Antiserum bei der Insolubilisierung gleichzeitig mit dem metallbeschichteten Träger verbunden werden. Aufgrund ihrer hohen Sedimentationsgeschwindigkeit und ihrer magnetischen Eigenschaften lassen sich derartige Präparate von stabilen, wasserunlöslich gemachten Enzymen oder Antiseren auf Metallträgern zuweilen isolieren, wenn andere insolubilisierte Enzym- oder Antiserumpräparate schwierig oder überhaupt nicht gewinnbar sind (beispielsweise, wenn sie in einer kolloidalen Suspension vorliegen, oder wenn andere ungelöste Teilchen zugegen sind); und
h) die Verwendung von an Metallstäbe bzw. -stangen kovalent gebundenen Antiseren ermöglicht einen vereinfachten radioimmunologischen Test (Radioimmunoassay), bei welchem die Zugabe und Abtrennung des Antikörpers (oder Antigens) leicht, vollständig und rasch (ohne Zentrifugierung) nach einer Methode erfolgt, welche vom Durchführenden weniger fachliches Können abverlangt.

Erfindungsgemäß sind somit verschiedene Metalle mit einem stabilen, wasserunlöslichen Überzug zu versehen, wobei biologisch aktive Proteine in einer Weise kovalent gekuppelt bzw. gebunden werden können, daß das Produkt die biologischen Eigenschaften des Proteins sowie die mechanischen und magnetischen Eigenschaften des Metallträgers aufweist.

Das Metall soll fest und so beschaffen sein, daß es mit Wasser - entweder in ungeschützter oder nötigenfalls in geschützter Form - nicht reagiert. Es ist vorzugsweise (jedoch nicht zwingend) magnetisch, z. B. ferromagnetisch; dies bringt für einige Zwecke Vorteile mit sich, beispielsweise, was die leichte Abtrennung aus flüssigen Medien, das einfache Waschen oder die leichte automatisierte Übertragung und Zählung (z. B. zur Verpackung) betrifft. Die Wahl des jeweiligen Metalls hängt sehr stark von den Bedingungen der Überzugsaufbringung ab. Aufgrund der Verwendung eines sauren Monomeren sind die stärker elektropositiven Metalle weniger zufriedenstellend, da rasch Wasserstoff gebildet wird, der bei der Abscheidung zu einem Reißen der Oberfläche des Polymer-Zwischenprodukts führt. Das Metall kann auch in modifizierter Form, z. B. eingebettet in einen Träger, eingesetzt werden. Im freien oder eingebetteten Zustand kann das Metall rein, unrein oder als Legierung vorliegen. Außerdem stehen sogenannte "magnetische Kunststoffe" sowie bestimmte magnetische Metalloxide zur Verfügung, welche ebenfalls am Metallsubstrat verwendbar sind. In sämtlichen vorgenannten Fällen kann die Metalloberfläche in Derivate, wie einen Oxidfilm, umgewandelt werden.

Wenn das Endprodukt für einen kompetitiven radiologischen Test eingesetzt werden soll, verwendet man am besten ein Metall mit relativ geringer Strahlungsabsorption. Als Metalle bevorzugt werden Aluminium, Kobalt, Eisen, Zinn und insbesondere Nickel.

Das Metallsubstrat kann eine an die jeweiligen Anforderungen angepaßte Form aufweisen. Es ist häufig zweckmäßig, Metallpulver zu verwenden. Wahlweise kann das Metallsubstrat in Form von ferromagnetischen Metallstäben vorliegen, von welchen nur einer auf einmal verwendet zu werden braucht. Man kann den Stäben eine solche Form verleihen, daß während des Rührens keine Abnutzung erfolgt. Die Stäbe können auch mit Hilfe eines geeigneten magnetischen Feldes in "aufgehängtem" bzw. schwebendem Zustand eingesetzt werden, wobei kein Teil die Wände des Reaktionsgefäßes berührt. Bei einer bevorzugten Substratform ist ein Metallstab mit einem Überzug aus einem Gemisch des Polymer-Zwischenprodukts und des als Pulver vorliegenden Metalls versehen. Beispiele für andere geeignete Metallsubstratformen sind Oberflächen, Platten, Teilchen, Kugeln, Stangen, Stäbe und unregelmäßige Gebilde.

Das Polymer-Zwischenprodukt bzw. intermediäre Polymere soll am Metallsubstrat einen zusammenhängenden, haftfähigen Überzug bilden und zur Verknüpfung bzw. Kupplung mit der organischen Verbindung befähigt sein. Es ist vorzugsweise (jedoch nicht zwingend) hydrophil und makroporös. Es kann zweckmäßig in situ am Metallsubstrat erzeugt werden.

Obwohl verschiedene Methoden existieren, nach welchen sich die organische Verbindung mit dem Polymer-Zwischenprodukt verknüpfen läßt, beruht die wichtigste Verknüpfungsart auf kovalenten Bindungen, welche aus einer chemischen Wechselwirkung reaktiver Gruppen an den beiden Komponenten hervorgehen. Verknüpfungen dieses Typs sind bekannt und können beispielsweise mit Hilfe von salpetriger Säure, eines Dialdehyds oder eines Carbodiimids erreicht werden. Das Polymer- Zwischenprodukt kann zu diesem Zweck mit einem breiten Spektrum von reaktiven Gruppen versehen werden; Beispiele dafür sind aliphatische Amino-, aromatische Amino-, nötigenfalls geschützte Sulfhydryl-, Hydroxyl-, nötigenfalls geschützte Aldehyd- und Carbonsäuregruppen. Geeignete Polymere, welche diese oder andere brauchbare Gruppen tragen, können für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden. Die reaktiven Gruppen können zuweilen in das Polymere am Metallsubstrat eingeführt werden. Das Polymere kann im Gemisch mit einem inerten Füllstoff eingesetzt werden.

Als Aminobenzoesäure zur Herstellung des Polymeren sind bevorzugt die 2-, 3- und 4-Aminobenzoesäuren sowie die 2,4- und 3,5-Diaminobenzoesäuren; geeignet sind jedoch auch beispielsweise Aminosalicylsäuren, Glucosaminobenzoesäuren und Alkylformylaminobenzoesäuren. Als Aldehyde zur Bildung des Polymeren sind Formaldehyd und Acetaldehyd bevorzugt, obwohl auch andere Mono- und Dialdehyde (wie Glutaraldehyd) geeignet sind. Durch Verwendung eines Gemisches eines Mono- und eines Dialdehyds (wie von Formaldehyd und Glutaraldehyd) kann man erreichen, daß die zweiten Aldehydgruppen des letzteren Aldehyds nicht umgesetzt zurückbleiben und für die Verknüpfung mit der organischen Verbindung zur Verfügung stehen.

Das Polymer-Zwischenprodukt kann zweckmäßig durch Emulsions-, Lösungs- oder Suspensionspolymerisation in einem (im allgemeinen wäßrigen) flüssigen Medium, welches das Metallsubstrat enthält, hergestellt werden. Man kann beispielsweise einen Aldehyd langsam in eine ein Metallsubstrat enthaltende wäßrige Lösung einer Aminobenzoesäure eintragen und das beschichtete Metallprodukt aus der Flüssigkeit isolieren. Andererseits kann es zweckmäßig sein, eine rings um das Metall als Kern stattfindende Perlpolymerisation anzuregen. Wahlweise kann das Metallsubstrat, z. B. nach der Tauchmethode, mit einem Überzug aus den vorgeformten Polymeren versehen werden.

Anstatt die organische Substanz unmittelbar mit dem Polymer- Zwischenprodukt zu verknüpfen, kann es vorteilhaft sein, zwischen den beiden Komponenten eine Brücke zu erzeugen. Methoden zur Schaffung derartiger Brücken sind bekannt. Ein Vorteil der Brückenbildung besteht darin, daß die organische Verbindung in einem höheren Abstand vom Polymer-Zwischenprodukt angeordnet werden und daher eine höhere spezifische Wirkung entfalten kann. Ein weiterer Vorteil beruht darauf, daß dadurch an das Polymer-Zwischenprodukt verschiedene funktionelle Gruppen, welche eine Verknüpfung mit der organischen Verbindung gestatten, gebunden werden können.

Das Polymer-Zwischenprodukt kann durch Bestrahlung aktiviert werden, wodurch freie Radikale für die Verknüpfung mit der organischen Verbindung geschaffen werden. Andererseits kann man durch Imprägnieren des Polymer-Zwischenprodukts mit einem Übergangsmetallsalz Stellen für eine Chelatkupplung mit der organischen Verbindung erzeugen.

Die organische Substanz ist vorzugsweise ein Biopolymeres, d. h. ein polymeres (oder oligomeres) Material biologischen Ursprungs oder mit biologischer Wirkung, wie Hormon-, Antigen-, Antikörper-, Enzym- oder Rezeptoraktivität. Beispiele für Biopolymere sind Proteine und proteinartige Substanzen (wie Glykoproteine, Polysaccharid/Protein-Komplexe, Immunoglobuline oder Enzyme), Peptide und Glykopeptide, Polysaccharide, wie Stärke oder Dextran, Nucleinsäuren sowie Derivate davon. Auch synthetische Biopolymere, welche gerade verfügbar werden, sind erfindungsgemäß verwendbar.

Weitere Beispiele für geeignete organische Verbindungen sind monomere Verbindungen mit biologischer Aktivität sowie andere Substanzen, deren Verbindung mit Metallsubstraten u. U. angestrebt wird, z. B. Antibiotika, Enzyminhibitoren, Toxine, wasserabstoßende Substanzen und enzymspezifische Liganden. Die Erfindung schließt auch die Verwendung von radioaktiv markierten Formen sowie von chemisch oder enzymatisch modifizierten Formen dieser Verbindungen ein.

Viele der genannten organischen Verbindungen enthalten reaktive Gruppen, über welche sie mit dem Polymer-Zwischenprodukt verknüpft werden können. Zahlreiche Biopolymere enthalten beispielsweise Phenol-, Tyrosyl- oder Histidinylgruppen, welche sich für die Diazokupplung eignen, oder Carboxylgruppen oder andere Gruppen mit Eignung zur Verknüpfung über eine Carbodiimidreaktion. Wenn solche Gruppen nicht vorhanden sind, müssen im allgemeinen geeignete Gruppen, wie aromatische Hydroxyl-, Amino- oder Carboxylgruppen, eingeführt werden. Die Bedeutung der Carbodiimidreaktion besteht darin, daß sie ein Beispiel für eine Umsetzung darstellt, welche eine Verknüpfung ohne Mithilfe einer Säure gestattet. Es wurde festgestellt, daß der Einsatz einer Säure bei der Kupplungs- bzw. Verknüpfungsreaktion zuweilen die Eigenschaften des Polymer-Zwischenprodukts beeinträchtigt.

Es ist zu berücksichtigen, daß die Modifizierung der organischen Verbindung (entweder durch Einführung reaktiver Gruppen oder durch Verknüpfung mit dem Polymer-Zwischenprodukt) die gewünschte chemische oder biologische Wirkung beeinträchtigen oder zuweilen sogar aufheben kann. Der auf dem einschlägigen Gebiet bewanderte Fachmann, dem dieses Problem vertraut ist, kennt den für die betreffende chemische oder biologische Aktivität maßgeblichen Teil des organischen Moleküls und wird bestrebt sein, sicherzustellen, daß jegliche Modifizierung der organischen Verbindung diesen Teil des Moleküls nicht angreift. Es ist jedoch häufig unmöglich, vorauszusagen, ob eine bestimmte organische Verbindung ihre biologische oder chemische Aktivität beibehält, wenn sie mit einem speziellen Polymer-Zwischenprodukt auf einem bestimmten Metallsubstrat verknüpft wird. Zur Auffindung einer geeigneten organischen Verbindung sowie eines geeigneten Polymer-Zwischenprodukts und Metallsubstrats ist somit zuweilen ein bestimmtes Ausmaß an routinemäßigen Versuchen unbedingt erforderlich. Die biologische oder chemische Aktivität der Zusammensetzung kann geringer als, gleich wie oder höher als die Aktivität der ungebundenen organischen Verbindung sein.

Die organische Verbindung kann nach bekannten Methoden mit dem Polymer-Zwischenprodukt verknüpft werden. Man kann die Verbindung häufig in einem wäßrigen Medium lösen oder suspendieren und mit Hilfe von salpetriger Säure, Glutaraldehyd, eines Carbodiimids oder von salpetriger Säure und m-Diazobenzol mit dem Polymer-Zwischenprodukt kuppeln bzw. verknüpfen. Salpetrige Säure kann bekanntlich in situ aus Natriumnitrit und einer Säure (wie Salz- oder Perchlorsäure) hergestellt werden. Das Polymer-Zwischenprodukt wird im allgemeinen vor der Verknüpfung mit der organischen Verbindung auf das Metallsubstrat aufgebracht.

Nach der Verknüpfung mit der organischen Substanz ist es normalerweise zweckmäßig, die unverbrauchten reaktiven Stellen am Polymer-Zwischenprodukt zu blockieren. Man erreicht dies zweckmäßig mit Hilfe eines Blockiermittels, z. B. bei einem diazotierten Aminobenzoesäure/Formaldehyd-Polymeren mit Hilfe einer phenolischen Verbindung, wie 2-Naphthol oder Thyrosin, oder mit Natriumborhydrid.

Wenn die chemische oder biologische Aktivität der organischen Verbindung erschöpft ist, kann man die Verbindung zusammen mit dem Polymer-Zwischenprodukt durch Hydrolyse abtrennen und das Metallsubstrat unter neuerlicher Überzugsaufbringung wiederverwenden.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Die Beispiele 1 bis 10 betreffen Metallsubstrate, welche einen Überzug aus dem Polymer-Zwischenprodukt aufweisen.

Die Beispiele 11, 12, 13, 18 und 19 beziehen sich auf die Verknüpfung der organischen Verbindung mit dem Polymer- Zwischenprodukt.

Die Beispiele 14 bis 18 veranschaulichen die biologische Wirkung der gebundenen Verbindung.

Herstellung von metallbeschichteten Polymerträgern Beispiel 1

Man löst 6 g p-Aminobenzoesäure in 100 ml siedendem destilliertem Wasser, setzt 15 g Nickelpulver zu und beläßt es 5 Min. in der Lösung. Die siedende Lösung wird dann tropfenweise mit 0,1 bis 1 ml 40%iger Formaldehydlösung versetzt. Das Produkt wird abfiltriert, schwach gemahlen und mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird unter Verwendung von 3,5-Diaminobenzoesäure an Stelle von p-Aminobenzoesäure wiederholt.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird unter Verwendung von m-Aminobenzoesäure an Stelle von p-Aminobenzoesäure wiederholt.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird unter Verwendung von o-Aminobenzoesäure an Stelle von p-Aminobenzoesäure wiederholt.

Beispiel 5

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Acetaldehyd an Stelle von Formaldehyd wiederholt.

Beispiel 6

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Kobaltpulver an Stelle von Nickelpulver wiederholt.

Beispiel 7

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Eisenpulver an Stelle von Nickelpulver wiederholt.

Beispiel 8

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Aluminiumpulver an Stelle von Nickelpulver wiederholt.

Beispiel 8a

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Zinnpulver an Stelle von Nickelpulver wiederholt.

Beispiel 9

Beispiel 1 wird unter Verwendung von Nickelstäben (100 bis 200, 7,5 mm×2,0 mm Durchmesser) an Stelle des Nickelpulvers wiederholt (das Mahlen entfällt).

Beispiel 10

Die beschichteten Stäbe von Beispiel 9 werden zu p-Aminobenzoesäure (6 g) in siedendem destilliertem Wasser gegeben. Der Ansatz wird ununterbrochen mäßig geschüttelt. Man fügt allmählich Nickelpulver (5 g) bis zur Bildung eines weiteren Überzugs hinzu. Das Produkt wird abfiltriert und mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen.

Beispiel 11 Kupplung von metallbeschichteten Enzymträgern mit β-D-Glucosidase unter Verwendung von salpetriger Säure

Der metallbeschichtete Enzymträger (100 mg oder ein beschichteter Metallstab) wird fünfmal mit jeweils 12 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann in ein Gemisch aus 5 ml eiskalter 1 N Natriumnitritlösung und 5 ml eiskalter 0,6 bis 1 N Salzsäure eingetragen. Man rührt den Ansatz 1 bis 2 Min. bei 0 bis 4°C. Der diazotierte Träger wird dreimal mit jeweils 15 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,8; 0 bis 4°C) gewaschen und während 2 bis 18 Std. bei 0 bis 4°C mit β-D-Glucosidase (aus süßen Mandeln, 1 bis 4 mg/ml) in 1 bis 2 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,8) gekuppelt. Anschließend dekantiert man die wäßrige Lösung und setzt eine gesättigte Lösung von β-Naphthol in gesättigtem Natriumacetat (5 ml) zu. Das Gemisch wird 2 Std. bei 0 bis 4°C gerührt. Man wäscht das erhaltene Produkt vor der Verwendung zehnmal mit jeweils 15 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,8) und einer Lösung des Enzymsubstrats (o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid; 1 mg/1 ml) im Acetatpuffer.

Beispiel 12 Kupplung von metallbeschichteten Enzymträgern mit β-D-Glucosidase unter Verwendung von salpetriger Säure und m-Diaminobenzol

Der einen Metallüberzug aufweisende Enzymträger wird mit der β-D-Glucosidase analog Beispiel 11 gekuppelt, wobei die Salzsäure vor der Verwendung mit 2 mg m-Diaminobenzol versetzt wird.

Beispiel 13 Kupplung von metallbeschichteten Enzymträgern mit β-D- Glucosidase unter Verwendung von Glutaraldehyd

Der metallbeschichtete Enzymträger (100 mg oder ein beschichteter Metallstab) wird fünfmal mit jeweils 12 ml destilliertem Wasser gewaschen und in 2 ml einer 2,5%igen Glutaraldehydlösung eingetragen. Nach 2- bis 5stündigem Rühren bei 20°C dekantiert man die wäßrige Lösung und wäscht das Produkt fünfmal mit jeweils 12 ml 0,1 N Acetatpuffer (pH 4,8) aus. Der Träger wird während 6 bis 18 Std. bei 0 bis 4°C mit der β-D-Glucosidase im Acetatpuffer (1 mg/ml; 2 ml) gekuppelt. Das erhaltene Produkt wird vor der Verwendung zehnmal mit jeweils 15 ml Acetatpuffer gewaschen.

Beispiel 14 Aktivität von an einen metallbeschichteten Enzymträger gebundenen β-D-Glucosidasepräparaten mit o-Nitrophenyl-β-D- glucopyranosid als Substrat

Die Aktivität der gebundenen β-D-Glucosidasepräparate (100 mg oder ein beschichteter Stab) wird durch Inkubation mit o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (1 mg/ml) in 1 ml 0,1 N Acetatpuffer (pH 4,8; 20°C) bestimmt. In verschiedenen Zeitabständen werden Teilmengen von jeweils 0,1 ml entnommen und zu jeweils 0,5 ml 0,1 N Natriumcarbonatlösung gegeben. Man bestimmt jeweils die dekadische Extinktion (bei 420 nm) der erhaltenen Lösung. Eine Einheit der β-D-Glucosidaseaktivität wird als die Aktivität von einem µg des ungebundenen Enzyms festgelegt.

Beispiel 15 pH-Abhängigkeit der Aktivität von freier und an einen metallbeschichteten Enzymträger gebundener β-D-Glucosidase mit o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid als Substrat

Bei diesem Versuch wird das gemäß Beispiel 1 erhaltene gebundene Enzym eingesetzt und die Kupplung gemäß Beispiel 11 durchgeführt. Das freie und das gebundene Enzym werden bei verschiedenen pH-Werten nach folgenden Methoden auf ihre Aktivität geprüft:

(a) Freies Enzym

Das Enzym und das Substrat (Endkonzentrationen jeweils 1 mg/ml) werden in den geeignet gepufferten Lösungen (vgl. Tabelle I) 30 Min. bei 20°C inkubiert. Anschließend wird eine Teilmenge (0,1 ml) des Reaktionsgemisches in 0,5 ml 0,1 N Natriumcarbonatlösung eingetragen. Man bestimmt die optische Dichte bei 420 nm.

(b) Gebundenes Enzym

100 mg des metallgebundenen Enzyms werden in Gegenwart des Substrats (1 mg/1 ml; 1 ml) in den geeignet gepufferten Lösungen (vgl. Tabelle I) 30 Min. bei 20°C gerührt. Eine Teilmenge (0,1 ml) des Überstands wird in 0,5 ml 0,1 N Natriumcarbonatlösung eingetragen. Man bestimmt die optische Dichte bei 420 nm.

Die Ergebnisse sind aus Tabelle I ersichtlich.

Tabelle I

Beispiel 16 Wiederverwendbarkeit von an einen metallbeschichteten Enzymträger gebundener β-D-Glucosidase

100 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten metallbeschichteten Enzymträgers werden analog Beispiel 11 mit b-D-Glucosidase gekuppelt. Das Produkt wird wiederholt gemäß Beispiel 14 unter Verwendung von o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid als Substrat auf die β-D-Glucosidaseaktivität getestet. Zwischen den Inkubationen wäscht man dreimal mit jeweils 15 ml 0,1 N Acetatpuffer (pH 4,8).

Aktivitätsbestimmung% der ursprünglichen Aktivität

1 (100)
2103 3122 4124 5130 6127 7117 8132

Beispiel 17 Hitzebeständigkeit von insolubilisierter β-D-Glucosidase

100-mg-Proben von gebundener (metallbeschichteter Enzymträger; Beispiel 1, Beispiel 11) β-D-Glucosidase und löslicher β-D-Glucosidase mit in derselben Größenordnung liegender Aktivität werden bei 20°C bzw. 37°C inkubiert und gemäß Beispiel 4 getestet. Sowohl das lösliche als auch das insolubilisierte Enzym liegen in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,8) vor; die Inkubationszeit für den Enzymtest hinsichtlich o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid als Substrat beträgt jedoch insgesamt 3 Minuten. Die Substrat-Vergleichsproben werden gleichzeitig inkubiert; die Einzeltests werden korrigiert.

Beispiel 18 Kupplung von metallbeschichteten Enzymträgern mit Antiseren gegen das Follikelreifungshormon

Der metallbeschichtete Enzymträger (100 mg; Beispiel 1) wird fünfmal mit jeweils 12 ml destilliertem Wasser gewaschen und danach in ein Gemisch aus 5 ml eiskalter 1 N Natriumnitritlösung und 5 ml eiskalter 0,6 bis 1,0 N Salzsäure eingetragen. Man rührt den Ansatz 1 bis 2 Min. bei 0 bis 4°C. Der diazotierte Träger wird dann dreimal mit jeweils 15 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,8; 0 bis 4°C) gewaschen und während 6 Std. bei 0 bis 4°C mit Antiseren gegen menschliches Hypophysen-Follikelreifungshormon (gewonnen aus Kaninchenblut nach mehrfacher Injektion von reinem menschlichem Hypophysen- Follikelreifungshormon; 4 mg/ml) in 2 ml des Acetatpuffers gekuppelt. Anschließend dekantiert man die wäßrige Lösung und setzt eine gesättigte Lösung von β-Naphthol in gesättigtem Natriumacetat (5 ml) zu. Das Gemisch wird 2 Std. bei 0 bis 4°C gerührt. Das erhaltene Produkt wird zehnmal mit jeweils 15 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,8) gewaschen und aufgrund seiner Eigenwirkung oder in Gegenwart von überschüssigem Follikelreifungshormon nach dem Radioimmunoassay von W. R. Butt und S. S. Lynch, Clinica. Chim. Acta 22 (1968), Seite 79, auf das Bindungsvermögen gegenüber dem Follikelreifungshormon (follikelstimulierenden Hormon) getestet.

Beispiel 19 Kupplung von metallbeschichteten Enzymträgern mit Antiseren gegen das Follikelreifungshormon unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids

15 bis 20 polymerbeschichtete Stäbe (Beispiel 4) werden mit 10 mg Follikelreifungshormon-Antiserum in 1 ml destilliertem Wasser versetzt. Dann fügt man so lange 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid hinzu, bis die Lösung 0,1 molar ist. Dann stellt man den pH-Wert mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 4,8 oder 8,0) auf 5,0 ein und hält die Lösung 24 Std. bei Raumtemperatur und dem genannten pH-Wert. Nach der Kupplung werden die Stäbe gründlich (10×15 ml) mit 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,8) gewaschen.

Es zeigt sich, daß das Produkt von Beispiel 18 dazu befähigt ist, in Gegenwart von Gemischen aus markiertem und unmarkiertem Follikelreifungshormon eine Inhibierungskurve zu erzeugen.

Wie erwähnt, können Aminobenzoesäuren in wäßriger Lösung zur Herstellung des Polymer-Zwischenprodukts eingesetzt werden. Formaldehyd ergibt bei solchen Reaktionen unter alkalischen Bedingungen in der Regel Kondensationsprodukte mit dem Aminostickstoff, bildet jedoch in Gegenwart von Säuren Methylenbrücken. Diese Brücken entstehen in o- und p-Stellung zum aromatischen Aminrest und in m-Stellung zur aromatischen Carbonsäure.

Das bevorzugte Aldehyd/Aminobenzoesäure-Molverhältnis im Polymer-Zwischenprodukt beträgt 1 : 7 bis 2 : 1. Das optimale Molverhältnis Formaldehyd/4-Aminobenzoesäure beträgt etwa 1 : 5; wenn der Formaldehydgehalt über diesen Wert hinaus (relativ zur Aminobenzoesäure) erhöht wird, nimmt das Enzymkupplungsvermögen allmählich ab. Es wird angenommen, daß die überwiegende Reaktion bei niedrigen Formaldehydkonzentrationen zur Ausbildung von Methylenbrücken zwischen den aromatischen Ringen führt, wogegen bei ansteigender Konzentration ein größerer Anteil der funktionellen Aminogruppen durch Kondensation mit dem überschüssigen Formaldehyd blockiert wird. Der Anteil der Aminobenzoesäure, welcher am Metall zum Polymer-Zwischenprodukt reagiert, hängt stark von der spezifischen Oberfläche des Metalls ab. Häufig bleibt ein hoher Anteil der Aminobenzoesäure nach der Umsetzung in der Reaktionsflüssigkeit zurück. Man nimmt an, daß ein gewisser Anteil des Formaldehyds durch den durch Umsetzung der heißen Benzoesäure mit dem Metall gebildeten Wasserstoff reduziert wird, wodurch die Zahl der Gasblasen, welche unter der entstehenden Harzmatrix eingeschlossen werden könnten, herabgesetzt wird. Möglicherweise reduziert der freigesetzte Wasserstoff auch das Amin/Formaldehyd-Gemisch unter Bildung von sekundären Aminen.

Die IR-Analyse des Produkts von Beispiel 1 ergibt gegenüber jener der 4-Aminobenzoesäure ausgeprägte Unterschiede. Am deutlichsten erkennbar sind diese im C-H-Deformationsbereich innerhalb der Ebene (1000 bis 1300 cm^-1) und im C-H-Deformationsbereich aus der Ebene (800 bis 950 cm^-1) aufgrund der Änderung des Benzolsubstitutionsschemas sowie im N-H-Streckbereich (3300 bis 3500 cm^-1) und im N-H-Deformationsbereich (1600 bis 1650 cm^-1). Außerdem erscheint ein Absorptionsmaximum bei 1380 cm^-1, welches möglicherweise auf das Carboxylation zurückzuführen ist. Das Polymere wird anscheinend durch elektrostatische Bindungen am Metall festgehalten.

Die Polymermatrix am Metall enthält freie Aminogruppen, welche zur Insolubilisierung von Enzymen durch Diazokupplung mit Enzym-Tyrosingruppen eingesetzt werden können. Als Beispiel für ein typisches Enzym wird eine β-D-Glucosidase verwendet, die leicht verfügbar ist und rasch analysiert wird.

Das pH-Aktivitätsprofil der gebundenen β-D-Glucosidase (Beispiel 15) weist relativ zum freien Enzym eine Verbreiterung auf. Dieser Effekt tritt im alkalischen Bereich am deutlichsten in Erscheinung. Die teilweise oder gänzliche Ionisierung der Carbonsäuregruppen führt zu einer negativ geladenen Matrix, wodurch der lokale pH-Wert der Lösung über den für die Hauptmenge der Lösung gemessenen Wert angehoben wird. Dies ist eine weitere Bestätigung der elektrostatischen Natur der Metall/Matrix-Bindung.

Der Wiederverwendbarkeitstest ergibt eine anfängliche Steigerung der Enzymaktivität. Daraus geht hervor, daß nach der routinemäßigen Wäsche nur eine geringe oder gar keine physikalische Absorption von aktiver β-D-Glucosidase am Träger stattfindet. Es kann jedoch eine anfängliche allmähliche Elution von inaktiver β-D-Glucosidase oder Enzyminhibitor erfolgen, wodurch die scheinbare Aktivität des an die Matrix gebundenen Enzyms bis zur Abtrennung verringert wird.

Durch mäßig rasches, magnetisches Rühren der Zusammensetzung wird die spezifische Aktivität selbst in Gegenwart des Substrats um etwa 1% pro Stunde herabgesetzt. Diese Einbuße fällt im vorliegenden Falle, wo die Inkubationen in der Regel lediglich 3 bis 5 Minuten dauern, nicht ins Gewicht und kann durch weniger kräftiges Rühren noch vermindert werden. Der Aktivitätsverlust ist vermutlich auf die allmähliche Abtragung des Überzugs durch Reibungseffekte zurückzuführen.

Die insolubilisierten organischen Verbindungen erweisen sich in vieler Hinsicht als wertvoll. Sie werden eingesetzt, wenn ihre im Verhältnis zur ungebundenen Verbindung erhöhte Beständigkeit, Wiederverwendbarkeit und Wiedergewinnbarkeit den zusätzlichen Arbeits- und Kostenaufwand des Kupplungsprozesses überkompensieren. Die insolubilisierten Verbindungen lassen sich von der Lösung leicht durch einfache Filtration oder Zentrifugierung abtrennen oder können bei kontinuierlichen Fließprozessen als Säulenpackungen verwendet werden. Ihre wiederholte Verwendbarkeit rechtfertigt die höheren Herstellungskosten völlig. Die vorteilhafte Fähigkeit zur Verknüpfung organischer Verbindungen mit leicht bearbeitbaren Metallen (z. B. Nickel oder Aluminium, wie im Falle der Verbindung von β-D-Glucosidase mit Nickeldraht oder Aluminiumfolie) eröffnet zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet der biologischen Technik. Der Metallträger kann beispielsweise in Form kleiner Kugeln bei Reaktionen in Säulen mit kontinuierlicher Strömung oder bei Affinitätschromatographie- Trennungen, als Metallschaufel bei unter Rühren durchgeführten Umsetzungen oder in Rohrform bei mit einem raschen Materialtransport verbundenen Reaktionen eingesetzt werden.

Claims

1. Zusammensetzung in Form eines wasserunlöslichen Trägers, auf den ein Überzug aus einem Polymeren aufgebracht ist, der sich zur Verknüpfung bzw. Kupplung mit einer organischen Verbindung eignet, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Träger um ein Metallsubstrat und beim Polymeren um ein Kondensationsprodukt aus einer Aminobenzoesäure und einem Aldehyd handelt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall des Substrats Nickel, Kobalt, Eisen oder Aluminium ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall des Substrats ferromagnetisch ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Metallsubstrat in Stab- bzw. Stangen- oder Pulverform vorliegt.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Aldehyd Formaldehyd ist.

6. Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aldehyd allmählich in eine das Metallsubstrat enthaltende wäßrige Lösung der Aminobenzoesäure einträgt und das beschichtete Metallprodukt aus der Flüssigkeit abtrennt.

7. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verknüpfung bzw. Kupplung mit einem Protein.