DE2631610C2

DE2631610C2 - Verfahren zum Nachweis von Hepatitis in Seren

Info

Publication number: DE2631610C2
Application number: DE2631610A
Authority: DE
Inventors: Shirley Ann Millis Mass. Mjos; Roger Norman Medfield Mass. Piasio
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1975-07-21
Filing date: 1976-07-14
Publication date: 1985-12-05
Also published as: JPS607231B2; GB1527397A; FR2319130A1; JPS5212923A; FR2319130B1; IT1154004B; DE2631610A1; US4034072A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachwels von Hepatltls-assozllertem Antigen (HAA) In Seren, bei dem eine Serumprobe mit einem Reagens Inkubiert wird, welches Antikörper gegen HAA auf einem wasserunlöslichen Träger enthalt, wobei eine Komplexbildung zwischen dem Antigen und dem Antikörper erfolgt, das Reagenz abgetrennt und der auf dem festen Träger befindliche Komplex mit radioaktiv markierten Antikörpern gegen HAA unter Bedingungen, die eine Komplexbildung der Antikörper mit dem zuvor gebildeten Komplex erlauben, Inkubiert wird, die Umsetzungsprodukte abgetrennt und auf Radioaktivität gemessen werden.
M Stoffe lassen sich In flulden Medien auch bei sehr geringer Konzentration durch radioaktive Kennzeichnung nachweisen. Bei der radioaktiven Immunprüfung (RIA, radlolmmunoassay) werden radioaktiv gekennzeichnete Stoffe In einer Anttkörper-Anttgenumsetzung zum Nachweis oder zur Konzentrationsmessung von Stoffen verwendet, für die Antikörper bestehen. Die Prüfung macht sich die Beobachtung zu Nutze, daß eine bekannte Menge des radioaktiv gekennzeichneten Stoffs mit einer radioaktiv nicht gekennzeichneten, unbekannten Menge dieses Stoffes bei der Besetzung einer begrenzten Menge komplexbildender Stellen auf dem Antikörper In Wettbewerb tritt. Durch radioaktive Zahlung der Umsetzungsprodukte kann die unbekannte Konzentration ermittelt werden.

Ein wesentlicher Schritt hierbei Ist die Trennung der Immunchemisch komplexgebundenen Stoffe von der Inkubationslösung, die möglichst vollständig, einfach und rasch möglich sein soll. Wesentlich erleichtert wird <o diese Trennung durch Verwendung von Antikörpern oder Antlgenen, welche durch Anheftung oder Bindung an wasserunlösliche Träger Immobilisiert wurden (sogen, festphaslge RIA oder SPRIA, solid phase radlolmmunoassay).

Es 1st bekannt, Antikörper und Antigene an die verschiedensten Trager zu binden, so z. B. an organische Träger, US-PS 35 55 143 oder über Silankuppler an anorganische Stoffe, US-PS 36 32 761.

« Ein brauchbares, rasches und mit guter Empfindlichkeit arbeitendes SPRIA-Verfahren zum Nachwels von HAA fehlt jedoch bisher, vgl. »Radloassay Test Kits and Components«, Laboratory Management, Sept. 1974, S. 29-42 und US-PS 38 67 517, wonach zum Nachwels HAA sandwlchartlg zwischen einem Immobilisierten Antl-HAA-Antlkörper und einem gekennzeichneten Antl-HAA-Antlkörper angeordnet werden muß. Nach einer Ausbildung sollen die ungekennzeichneten Antikörper durch Anheftung an die Innenwand eines Reagenzglases so immobilisiert werden.

Aus der US-PS 38 67 517 Ist ein Verfahren zum HAA-Nachwels bekannt, bei dem eine Serumprobe mit einem Reagenz Inkubiert wird, welches Antikörper gegen HAA auf einem wasserunlöslichen Träger enthält, wobei eine Komplexblldung zwischen dem Antigen und dem Antikörper erfolgt, das Reagenz abgetrennt und der auf dem festen Träger befindliche Komplex mit radioaktiv markierten Antikörpern gegen HAA unter Bedingungen, die eine Komplexblldung der Antikörper mit dem zuvor gebildeten Komplex erlauben inkubiert wird, die Umsetzungsprodukte abgetrennt und auf Radioaktivität gemessen werden.

Wie aus Blochem. J., VoI 117, 1970, S. 257-261, zu entnehmen 1st, können die Antikörper auch In kovalenter Bindung an den Träger vorliegen, wobei die Bindung über Silankuppler erfolgt.

Als feste Träger wenden nach K. E. Klrkham und W. M. Hunter (Herausgeber) Radlolmmunoassay Methods, f»" Edlngburgh, 1971, S. 405-412, Plastlkröhrchen, dünne Scheiben oder Partikel verwendet.

Es bestand jedoch nach wie vor ein Bedürfnis nach genauerer und vor allem schnellerer Arbeltswelse.

Aufgabe der Erfindung Ist ein zuverlässig und mit großer Nachwelsempflndltchkeit durchführbares, vor allem aber sehr viel schneller arbeitendes Verfahren zum Nachwels von HAA In Seren auf Grundlage der SPRlA.

Zur Lösung wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß als feste, wasserunlösliche Träger slllzlumhaltlge Partl-6* kel mit einer Oberfläche von wenigstens 1 qm/g und einer Mindestgröße von 0,1 μιη, oder, falls die Partikel porös und von einer Größe sind, daß Ihre Gesamtfläche Im wesentlichen von den Poren bestimmt wird, einem durchschnittlichem Porendurchmesser von wenigstens 100 nm, an die In an sich bekannter Welse die Antikörper über einen Silankuppler kovalent gebunden sind, verwendet werden.

Hierdurch laßt sich eine zuverlässige und sehr rasche Arbeitsweise erzielen.

Nach bevorzugter Ausgestaltung werden die Nachweismittel in einer etwa 10-300 μg Kompositum pro Test in 0,1-0,2 ml Wasser enthaltenden Suspension vorgesehen, wobei die Antikörper an Kieselsäure- oder poröse Glaspartikel der durchschnittlichen Größe 0,1-10 μπ>, vorzugsweise 0,1-3 um gekoppelt sind.

Die bevorzugten Serumproben reichen von etwa 100-1000 μΐ, und die erste Inkubation dauert etwa S Minuten. s Die zweite Inkubation wird vorzugsweise mit durch I¹²¹ gekennzeichneten Antl-HAA-Antikörpern mit einer radioaktiven Zählung von wenigstens 20 000 cpm durchgefohlt.

Ein wesentliches Umsetzungsmittel zur Durchfahrung des Verfahrens besteht aus einem als G-S-Ab kennzeichenbaren Kompositum, worin G einen Träger aus slllzlumhaltlgen Partikeln, Insbesondere aus Kieselsäure oder porösem Glas, S ein Sllankupplungsmlttel mit einer (an der Oberfläche G in bekannter Welse gebundenen) slllzlumfunktlonellen Gruppe und einer nur kovalenten Bindung an Ab, (einen Anti-HAA-Antikörper) modifizierbaren organofunktlonellen Gruppe bezeichnet. Die Bindung von Ab über S-G ist nicht Gegenstand der Erfindung, vgl. hierzu US-PS 36 52 761. Jedoch sind die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Trägers G für die Prufempflndlichkeit und Geschwindigkeit von großer Bedeutung.

Die physikalischen Eigenschaften und Grenzwerte des Trägers erhellen aus einem Prüfbelspiel. Das Ausgangsmaterial (das Umsetzungsmittel G-S-Ab) wird mit einer unbekannten Serumprobe Inkubiert. 1st HAA vorhanden, so entsteht unter Immunchemischer Komplexbildung des HAA mit der Ab Komponente G-S-Ab-HAA, das sodann selnarselts mit einer Lösung der gekennzeichneten Antikörper (Ab·) Inkubiert wird und als Umsetzungsprodukt G-S-Ab. HAA.Ab* bildet, unter Immunchemischer Komplexbildung der Ab Komponente (mit I¹²⁵ gekennzeichnetes Anti-HAA) mit HAA. Ein genauer HAA Nachwels erfordert eine im wesentlichen vollständlge Trennung des Umsetzungsproduktes von der Lösung der gekennzeichneten Antikörper. Sie wird durch Wahl einer Partikelgröße gewährleistet, welche groß genug Ist, um mit dem In klinischen Laboratorien verfügbaren Zentrifugen auszentrlfuglert zu werden. Hierfür sollte die durchschnittliche Partikelgröße wenigstens etwa 0,1 pm betragen.

Angesichts der Größe der verschiedenen entstehenden Komplexe kommt der Trägeroberfläche und Porösität große Bedeutung zu. So gestaltet beispielsweise im Regelfall eine große Oberfläche eine vergleichsweise starke Beschickung mit Ab und letzten Endes einen sehr empfindlichen, genauen Nachweis. Eine Oberfläche kann durch Zerkleinerung von Partikeln und/oder poröse Partikel vergrößert werden. Im vorliegenden Falle hat die zulässige durchschnittliche Porengröße aber eine praktische untere Grenze, bedingt durch die Größe der Komplexe und die erforderliche Diffusion, die bei etwa 1 qm/g liegt, und durch Zerkleinerung bis auf eine durchschnittliche Korngröße von etwa 0,1-10 μιη oder durch Verwendung sorgfältig ausgewählter Porengrößen erreicht werden kann.

Die Größe des für den Nachweis verwendeten sandwichartigen Komplexgeblides beträgt etwa 1 χ 10* Dalton. Durch eine Reihe von Versuchen konnten die praktischen Mindestvoraussetzungen der physikalischen Trägereigenschaften ermittelt werden. Zur Aufnahme der Komplexe und für die Diffusion der Umsetzungsteilnehmer sollte bei Wahl eines porösen Trägers die durchschnittliche Porenweite (Durchmesser) etwa 100 nm betragen. Diese Größenordnung erhält man z. B. bei Partikelgrößen von 0,037-0,074 nm. Derart große Partikel bleiben allerdings nicht lange In Suspension und erfordern die Durchführung im Kolonnenverfahren oder bei absatzweisem Vorgehen Rührung bzw. Bewegung. Bevorzugt wird die Durchführung mit einer Suspension von Partikeln Im Mikronbereich. Die verwendbaren Porengrößen (> 100 nm) nehmen zusammen mit der durchschnittlichen Korngröße ab. Die physikalischen Eigenschaften der für den Nachweis geeigneten Träger sind also das Ergebnis einer spezifischen, gegenseitigen Abhängigkeit der Korngrößen, der erforderlichen Oberfläche, Diffusion, Trennung und Mlndestporengröße.

Es wurde z. B. gefunden, daß poröses Glas mit einer durchschnittlichen Korngröße von 1-3 μπι und einer durchschnittlichen Porenweite von SS nm kein rationeller Träger 1st, well der größere Teil der vergleichsweise großen Gesamtoberfläche durch Poren gebildet wird, die zur Aufnahme des 1 χ 60* Dalton großen Komplexes zu klein sind. Dagegen kann ein aus Glas mit 55 nm großen Poren auf 0,1-0,4 μιη (Im Durchschnitt) zerkleinerten Partikeln erfolgreich eingesetzt werden, well die verfügbare Gesamtfläche Im wesentlichen durch den Oberflächenbereich und nicht durch die Inneren Poren gebildet wird. An dem entgegesetzten Extrem sind unporöse Partikel der Größe 0,037-0,074 mm wegen der minimalen Gesamtfläche für die praktische Verwendung nicht geeignet.

Die bisher günstigsten Träger sind unporöse Partikel der durchschnittlichen Größe 1-3 μΐη. Sie bieten eine ausreichende Fläche für eine starke Beschickung (und gute Empfindlichkeit), können zur optimalen Diffusion der Umsetzungsteilnehmer während der Inkubation suspendiert werden und sind relativ einfach zu handhaben.

Die durchschnittliche Partikelgröße (2 um) liefert eine Gesamtoberfläche von etwa 7 qm/g. Ebenfalls geeignet, wenn auch nicht ganz so günstig, waren unporöse Partikel der durchschnittlichen Größe von 5-10 um (etwa 3 qm/g Gesamtoberfläche). Die größten, praktisch brauchbaren, unporösen Partikel sind etwa 10 μτη Im Durchschnitt.

Die Tabelle I enthält verschiedene Kombinationsmöglichkeiten von Gesamtoberflächen, durchschnittlichen Poren- und Partikelgrößen von slllzlumhaltlgen Trägern, sowie eine Zusammenfassung der Prüfergebnisse für 60 _

jeden Träger, wobei »-« nicht gut brauchbar, »+« praktisch sehr brauchbar, »1/2+« einigermaßen praktisch I

brauchbar bezeichnen. ■

Tabelle I

Tragereigenschaften	porös	Porenweite	Prüf
	ja/nein	(durchschnittlich)	ergebnisse
Oberfläche Partikelgröße		in nm
qm/g (durchschnittlich)

	1	- 3	μιη	-10	μιτι	ja	55
>300	2	- 5	μπι	- 4	μπι	ja	25
0,6	0,037- 0,074 mm	- 3	μπι	nein	—
~ 3	5	-10	μπι	nein	—
>10G	0,1	0,037- 0,074 mm	ja	55
~ 8	1	nein	—
	5	ja	150
	ja	250

1/2 +

Den Versuchen Ist zu entnehmen, daß die Trager eine Gesamtoberfläche von wenigstens etwa 1 qm/g, eine Partikelgroße von wenlgestens etwa 0,1 und Im Falle poröser Träger eine durchschnittliche Porenweite von wenigstens etwa 100 nm haben sollten. Dies erreicht man durch Verwendung von sillzlumhaltlgem Ausgangsmatertal mit Oxid- oder Hydroxidgruppen an der Oberfläche, welche mit dem slllzlumfunktlonellen Teil des Sllankupplers in Umsetzung treten können. Sie sind Im Handel erhältlich (z. B. Sylold poröse Kieselsaure, CPG-controlled pore glass) oder können nach der US-PS 35 49 524 hergestellt werden; es hat meist Poienweiten von 10-250 nm, wobei der praktisch brauchbare Bereich hler 100-250 nm ist.

Nach ganz besonders günstiger Ausbildung haben die porösen oder unporösen Partikel durchschnittliche Mindest- und Höchstwerte von 0,1-3 μπι, um einerseits das Zentrifugleren zu erleichtern, andererseits eine für die optimale Umsetzung und Diffusion günstige Suspension Im wäßrigen Medium zu erhalten.

Die Herstellung des Kompositums erfordert zwei Verfahrensschritte. Zunächst werden die Partikel mit einem Sllankoppler umgesetzt, um eine organische Basis für die Kopplung der Antikörper zu erhalten. Hierzu müssen die Partikel sauber sein und zur Bindung mit dem slllzlumfunktlonellen Teil des Silans an der Oberfläche verfügbare Oxid- oder Hydroxidgruppen aufweisen. Die evtl. erforderliche Säuberung kann In bekannter Welse erfolgen. Nach Ansetzung mit dem Sllan wird der Körper als »sllanlslert« bezeichnet, oder nach der organofunktlonellen Gruppe an der Oberfläche bezeichnet, z. B. »Arylamtn CPG« (geregelt poröses Glas - controlled porous glass), oder Alkylamln CPG. Im einzelnen vgl. US-PS 35 19 538 und 36 52 761, sowie 39 75 511. Nach der Sllanlslerung werden die organfunkttonellen Teile des Silans meist zur Kopplung mit den Antikörpern modifiziert, z. B. dlazotiert, und sodann mit den Anti-HAA-Antlkörpern In einer Lösung unter Bedingungen umgesetzt, welche eine maximale Bindung der Antikörper in einem aktiven (funktlonellen) Zustand gewährleisten. Es wird angenommen, daß die Anti-HAA-Antikörper Ihre komplexbildende Fähigkeit bei mehreren verschiedenen Kopplungsumsetzungen beibehalten.

Zur Sicherung einer maximalen Antikörperbeschickung wird i.d.R. die Menge der mit dem modifizierten Sllanträger umgesetzten Antikörper auf Trockengewichtsbasis Im Bereich von etwa lOO² für 1 ml unfraktlonlertes Antikörperserum pro g Träger gehalten. Nach Immobilisierung der Antikörper auf dem Träger werden sie zur Verwendung vorzugsweise In wäßrige Suspension gebracht, z. B. durch Schallbehandlung. Eine bevorzugte Suspension für einen einzelnen Versuch bzw. Nachwels besteht aus etwa 10-300 μg Kompositum pro 0,1-0,2 ml wäßrige Lösung, vorzugsweise mit 0,03M phosphatgepufferter Salzlösung zur Aufrechterhaltung eines pH-Berelchs von 6,5-8 gepuffert.

Das Umsetzungsmittel für einen Serum-Hepatitisnachweis besteht aus dem bis zum Gebrauch in einem verschlossenen Reagenzglas aufbewahrten Kompositum in wäßriger Lösung.

Für einen Nachwels werden etwa 200 μΐ des menschlichen Blutserums zu etwa 200 μΐ Suspension gegeben und vorzugsweise bei 45° C während 10 Minuten Inkubieren gelassen. Etwa vorhandenes HAA geht dann mit den immobilisierten Antl-HAA-Antlkörpern eine Komplexbildung ein, wobei die entstehenden Komposita als

G-S-Ab- HAA

bezeichnet werden können, worin G der Träger, S das Sllan, Ab der Antl-HAA-Antlkörper Ist, und HAA an diesen komplexgebunden Ist.

Das Kompositum wird dann gewaschen, beispielsweise, Indem die Partikel auszentrlfuglert. In einer Waschlösung erneut suspendiert, und wiederum auszentrlfuglert werden. Eine Wäsche reicht meist aus, um das Kompositum von anderen Stoffen wie Serumproteinen oder überschüssigem Antigen zu befreien. Nach der Wäsche Ist das Kompositum je nach der Serumprobe

G -S-Ab HAA oder
G-S-Ab.

Es wird abgetrennt, mit 200 μΐ Lösung von gekennzeichneten Anil-HAA-Antlkörpem versetzt und vorzugsweise bei 45° C während 20 Minuten Inkubieren gelassen.

2ό 31 61U

Da HAA mit mehr als einem Antl-HAA-Antlkörper komplexbildend sein kann, entsteht bei Vorhandensein von HAA In der Serumprobe der Komplex

G-S-Ab HAA Ab*.

worin Ab* den radioaktiv gekennzeichneten Antikörper bezeichnet, wofür l'^as bevorzugt wird. Die vorstehenden Ausführungen dienen nur der Erläuterung. Die wirklichen Bindungen und Komplexbildungsabläufe sind meistens komplizierter.

Nach der Inkubation mit den gekennzeichneten Antikörpern werden die festphaslgen Inkubationsprodukte z. B. durch Zentrifugleren mit 2000 UpM während 1 Minute abgetrennt, und entweder die abgetrennten Komposlta oder das verbleibende Medium auf Radioaktivität gezählt und damit festgestellt, ob die Serumprobe HAA enthielt. Zur Berücksichtigung von Spurenresten des gekennzeichneten Materials und von Rauschen, Störungen etc. sollte der Nachwels unter Heranziehung von positiven oder negativen Vergleichsproben durchgeführt werden, wobei I. d. R. das mittlere Zählverhältnis der positiven zu negativen Vergleichsproben wenigstens 3: I betragen sollte. Ein sehr hohes Verhältnis der Probenzählwerte zu negativen Vergleichszählwerten Ist für die Auswertung und den klaren Nachweis eines positiven Befundes günstig, da nur als Grenzwerte angezeigte positive Befunde u. U. noch bestätigt werden müßten.

In beispielsweise durchgeführten Versuchen wurden Antl-HAA-Antlkörper mit verschiedenen sllizlumhaltigen Partikeln Innerhalb der für Suspensionsfähigkeit und Nachweisempfindlichkeit erforderlichen Poren- und Partikelgrößengrenzen gekoppelt. Es wurden etwa 2-3 g Abschnitte unter Verwendung der oben beschriebene Träger hergestellt. Die bevorzugten Stoffe wurden durch Sllanislerung der Träger mit ar-Aminopropyltrläthoxysllan (A-IlOO Union Carbide) zur Bildung einer Arylamlnoberfläche bereitet, wobei die letztere anschließend In bekannter Welse zur Bildung einer gegenüber einer Lösung der Antl-HAA-Antikörper stark umsetzungsfreudigen, diazotierten Oberfläche modifiziert wird. Etwa 1 ml rohes Antikörperserum wird mit 1 g dlaziertem Träger umgesetzt und ergibt ein Kompositum G-S- Ab, dessen Ab über Azoketten gekoppelt ist. In den unten aufgeführten Versuchen bestand der bevorzugte Träger aus unporösen Schmelzkleselsäurepartlkeln mit der durchschnittlichen Korngröße 1-3 μπι. Die besonders gute Brauchbarkeit dieses Trägers wurde In diesen Versuchen dadurch nachgewiesen, daß er mit der Suspension zur Nachweisbestätigung In bekannter oder bezogenen, HAA enthaltenden Blutproben eingesetzt wurde. Der HAA-Nachwels gilt dabei als erfolgreich geführt, wenn das Zählverhältnis (cpm) einer positiven Probe zu einer bekannten, negativen Vergleichsprobe wenigstens 3:1 beträgt. Dies wurde in den unten aufgezeichneten Versuchen sogar überschritten.

Die folgenden Tabellen II und III zeigen die Titrierverfahren für die verwendeten HAA-Proben und Anti-HAA-Antlkörper Im Vergleich zu den durch Gegenstromelektrophorese (CEP, counterelextrophoresls) erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle II Titrierverfahren für HAA-Antigen Das verwendete Hepatitis-Antigen wurde in PBS/BSA Puffer gelöst. Ag Lösung (-) CPM (+) CPM

Vergleiche	210 787 (1 : 1000 CEP) 278 778	Tabelle III
1 :20	13 109 13 228	Titrierverfahren für Antl-HAA-Antikörper
1 :200	111509 11 163
1 :2000	4 476 4 376
1 : 20 000	1 179 1 192
1 : 200 000	359 426

Die Proben werden Inkubiert, gewaschen, mit Reihenlösungen des Antikörpers versetzt, 30 Minuten inkubiert, gewaschen, zentrifugiert und abgesaugt.

Vergleiche 190 1200

201 1 190

1 : 10 209 201

190 189

"l : 100 273 220

216 215

1 : 1000 199 305

181 291

1:10000 111 491

210 501

1:100 000 101 1100

290 1200

Aus diesen Versuchen wurde der Tlter der nassen Antikörperlösung mit 1 : 10000 ermittelt. Dies ist die stärkste Verdünnung, welche eine Bindung des gekennzeichneten Antikörpers an das Antigen verhindert.

Tabelle IV Versuche zur HAA-Inkubatlonsdauer

Der Immobilisierte Hepatitis Antikörper [100-300 μg (Mlkrogramm) Kompositum in 100 μΐ PBS-BSA Puffer] wurde mit 2,0 ml Serumproben bei 40° C 10 Minuten bis 2 Stunden Inkubiert, einmal gewaschen, mit 0,2 ml Hepatitis Antikörper versetzt, 30 Minuten bei 45° C Inkubiert, zweimal gewaschen und gezählt.

Antigen Inkubationsdauer (-) CPM (+ 1 :1000 CEP) CPM

2 363 2 100

2 497 518 2 561

2 301 2 675

2 738 „ο Höz 2 269

Wie die Versuche zeigen. Ist die Ag-Ab-Umsetzung nach etwa 10 Minuten beendet. Tabelle V Probengrößen und Empfindlichkeitserhöhung

Hierau wurde die Größe der Proben verändert. Die positiven Proben bestanden aus einem im Handel bezogenen CEP, Vergleich in der Veränderung 1: 500

PfobengrüSe (μ!? (-) CPM M CPM

100 206 586

267 488

200 201 783

302 894

300 194 1217

199 1112

400 204 1212

1210

In Grenzfällen kann die Probe vergrößert und erneut getestet werden.

Wie diese Versuche zeigen, ermöglicht das erfindungsgemäße Umsetzungsmittel einen raschen Nachwels (+: - Verhältnis > 3 : 1). Die erste Inkubation dauert nur 10 Minuten, Gesamtprüfdauer 1st oft nur 30 Minuten, im Vergleich zu bisher 3 Stunden und mehr.

10 Minuten	550 400
30 Minuten	515 518
60 Minuten	605 519
120 Minuten	563 482

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachwels von Hepatltls-assozllertem Antigen (HAA) in Seren, bei dem eine Serumprobe mit einem Reagenz Inkubiert wird, welches Antikörper gegen HAA auf einem wasserunlöslichen Träger

enthalt, wobei eine Komplexbildung zwischen dem Antigen und dem Antikörper erfolgt, das Reagenz abgetrennt und der auf (L-m festen Trager befindliche Komplex mit radioaktiv markierten Antikörpern gegen HAA unter Bedingungen, die eine Komplexbildung der Antikörper mit dem zuvor gebildeten Komplex erlauben. Inkubiert wird, die Umsetzungsprodukte abgetrennt und auf Radioaktivität gemessen werden, dadurch gekennzeichnet, daß als feste, wasserunlösliche Trager slllzlumhaltlge Partikel mit einer Oberfläche von wenigstens 1 qm/g und einer Mindest größe von 0,1 μιη, oder, falls die Partikel porös und von einer Größe sind, daß ihre Gesamtfläche im wesentlichen von den Poren bestimmt wird, einem durchschnittlichem Porendurchmesser von wenigstens 100 nm, an die In an sich bekannter Weise die Antikörper Ober einen Silankuppler kovalent gebunden sind, verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel 0,1-10 μιη, vorzugsweise ■5 0,1-3 μιη, im Falle unporöser Partikel 1-3 μιη groß sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz In wäßriger Lösung oder Suspension in anteiligen Mengen von 10-300 pg auf 0,1-0,2 ml Wasser eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Inkubation nach S-IO Minuten beendet wird.