DE68903446T2

DE68903446T2 - Photochemische verknuepfung von chelatgruppen mit biomolekuelen.

Info

Publication number: DE68903446T2
Application number: DE8989114680T
Authority: DE
Inventors: Geetha Gopalakrishnan; Antoine A Noujaim; Thomas Ritchie Sykes
Original assignee: Biomira Inc
Current assignee: Oncothyreon Canada Inc
Priority date: 1988-08-08
Filing date: 1989-08-08
Publication date: 1993-03-25
Anticipated expiration: 2009-08-09
Also published as: JPH02140286A; EP0354543B1; EP0354543A1; ATE82140T1; DE68903446D1

Description

Konjugationsverbindungen von Chelatbildnern und Biomolekülen sind bekannt.
Lee, EP-A-173 629 (Cytogen); Rodwell, U.S. 4 671 958; Stavrianopoulos U.S. 4 707 352; Palk, U.S. 4 652 440; Gansow, W086/006384.
Bifunktionelle Chelatbildner (BFCAs) werden verwendet, um ein chelatisierbares Ion mit einem Biomolekül zu assoziieren. Eine funktionelle Gruppe des BFCA chelatisiert dabei das Ion, während die andere mit dem Biomolekül kuppelt. Die erhaltenen Konjugate sind als diagnostische und therapeutische Mittel wertvoll. Beispielsweise werden radioaktiv marktierte Proteine, wie Human-Serumalbumin (Hnatowich, et al., Int. J. Appl. Radiat. Iso., 33: 327 [1982]) und Fibrinogen (Layne, et al., J. Nucl. Med., 23: 627 [1982]) als Radiopharmaceutica für Blutvolumenbestimmung bzw. die Bestimmung von Blutgerinseln bei Patienten verwendet. M.W. Brechbiel, et. al., (Inorg. Chem. 25: 2772 [1986]) beschreiben die Verwendung von MoAB B72.3-Chelatorkonjugaten in klinischen Versuchen für die Diagnose von colorectalem Krebs beim Menschen und es gibt sicherlich viele andere. (Biochem. Biophys. Acta. 780: 151 [1985]).
Zur Reaktion mit einem Protein kann die Aminofunktion (-NH&sub2;) von Amino-benzyl-EDTA in eine Diazogruppe (- N&sub2;&spplus;) (Sundberg, et al., J. Med. Chem., 17: 1304 [1974]) oder in eine Isothiocyanat- (-NCS) oder Bromacetamido (-NHCOCH&sub2;Br)-Funktion (Meares, et al., Anal.
Biochem., 142: 68 [1984])) übergeführt werden. In DTPA wird für denselben Zweck die -CH&sub2;N-(CH&sub2;COOH)&sub2;- Gruppe modifiziert, so daß es ein Dianhydrid (Hnatowich, et al., J. Immunol. Methods, 65: 147 [1983]), ein Carboxycarbon-Anhydrid (Krecjarek, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77: 581 [1977]), ein Succinimid (Najafi, et al., Nucl. Med. Biol. 13: 345 [1986]) oder ein Benzyl-isothiocyanat trägt.
Sundoro, U.S. 4 680 338 ist ein typisches Patent auf eine bifunktionelle Verbindungsgruppe, die geeignet ist, für die Konjugation eines Liganden (beispielsweise eines Chelators) mit einem Amin-enthaltenden Protein.
In der Gesamtübersicht über die Verwendung von BFCAs gibt es üblicherweise zwei Formen. Das Protein kann "vorchelatisiert" werden, wobei das BFCA zuerst an das Protein gebunden wird und das Metallion zu dem gereinigten (Entfernung von ungebundenem BFCA) Protein gegeben wird. Alternativ kann das BFCA zuerst an das Metallion gebunden werden und dann an das Protein. In diesem Fall werden durch die Endreinigung ungebundenes BFCA und ungebundene Metallionen entfernt. In der praktischen Anwendung sind beide Wege in Abhängigkeit von den Anforderungen nützlich. Die Herstellung eines prechelatisierten Proteins ist bevorzugt, wenn große identische Chargen hergestellt werden sollen, wenn radioaktive Metallionen verwendet werden und wenn die am Ende stattfindende Metallionenbindung hocheffizient ist. Die Prechelatisierung des Metallions ermöglicht normalerweise die quantitative Bildung des Metallchelats, da beide Reaktanten bei einer hohen Konzentration gehalten werden können und zusätzliche Reagenzien zur Förderung dieses Prozesses verwendet werden können (beispielsweise Zinnionenreduktion von Pertechnetat in Anwesenheit von BFCA). Außer wenn die Bindung des BFCA an das Protein eine Reaktion mit hoher Ausbeute ist, können jedoch gegebenenfalls teuere Metallionen (beispielsweise Radioindium) vergeudet werden.
Die gebräuchlichen proteinreaktiven Gruppen an BFCAs (beispielsweise Diazo-, Isothiocyanat-, Bromacetamid-, Anhydrid-, Succinimid- und Benzimidat-Gruppen) reagieren mit Polyaminosäuren primär über einen elektrophilen Angriff an den Aminosäuren Cystein, Lysin, Tyrosin und Tryptophan.
Beispielsweise werden in GB-A-2137612 Metallchelatkomplexe beschrieben, die eine an ein Biomolekül gebundene chelatisierende Gruppe aufweisen, und die hergestellt werden durch Umsetzen von aktivierten Derivaten der komplexbildenden Säure, beispielsweise Säurechloriden, Säureanhydriden, aktivierten Estern, Nitrenen oder Isothiocyanaten, mit nukleophilen Gruppen des Biomoleküls, wie Amino-, Hydroxy-, Thio- oder Imidazol-Gruppen.
Diese Tatsache limitiert die maximale theoretische Anzahl von Chelaten, die bei einem Protein mit vorgegebener fixer Aminosäurezusammensetzung erreichbar ist. Dies kann zu Problemen führen, wenn ein hoher Metallionengehalt erforderlich ist, um die Empfindlichkeit der Detektion zu steigern (beispielsweise wenn hochspezifische radioaktive Proben erforderlich sind) oder um die Kinetik und den Wirkungsgrad der Metallionenbindung zu verbessern (beispielsweise für kurzlebige radioaktive Metallionen oder wenn die Markierungsausbeuten gering sind). Im allgemeinen können diese BFCAs nur verwendet werden, zum Kennzeichnen von Biomolekülen, die spezifische chemische funktionelle Gruppen besitzen, und eine Vielzahl von Modifikationen desselben BFCA können erforderlich sein, um für eine Vielzahl von verschiedenen Biomolekülen geeignet zu sein.
In Gegensatz dazu können die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten fotoaktivierten BFCAs wesentlich höhere Mengen an Chelatbindung an Proteine und andere Biomoleküle erreichen. Die Verwendung einer fotoaktivierten reaktiven Gruppe zur Bindung eines Chelatbildners an ein Biomolekül wurde bisher nicht beschrieben.
Fotoaktivierbare Mittel, einschließlich Arylaziden, wurden zur Immobilisierung eines Antigens oder Antikörpers auf einem Träger verwendet. Siehe Kramer, U.S. 4 689 310; Scheebers, U.S. 4 716 122; AU-A-47690/85 (Organogen). Dattagupta, U.S. 4 713 326 kuppelte eine Nukleinsäure fotochemisch an einen Träger. Andere Moleküle wurden ebenfalls durch diese Technik unlöslich gemacht. Lingwood, U.S. 4 597 999. Padney, et al., J. Immunol. Meth., 94: 237-47 (1986) konjugierten ein haptenisches primäres aromatisches Amin (3-Azido-N-ethylcarbazol) an verschiedene Proteine, um ein synthetisches Antigen herzustellen.
Ferner können ein "Pro-Arzneimittel ("prodrug")" oder "Protoxin" hergestellt werden, die in das aktive Arzneimittel oder Toxin durch fotochemische Spaltung einer Brückengruppe übergeführt werden. Zweig, U.S. 4 202 323; Senter, U.S. 4 625 014; Edelson, U.S. 4 612 007; Reinherz, U.S. 4 443 427 (col. 4).
Fotoaffinitätsmarkierung von Enzymen ist ebenfalls bekannt. Chowdry, Ann. Rev. Biochem., 48: 293-305 (1979). Bei dieser Technik kann eine Probenverbindung mit einer Biomatrix wechselwirken, in der ein spezifischer Rezeptor oder eine Bindungstruppe anvisiert wird. Bei der Bildung des spezifischen Komplexes durch die gegenseitige Affinität wird das Paar über eine reaktive Gruppe der Probe chemisch verbunden. Dies erleichtert die Identifikation und Charakterisierung des Rezeptors selber sehr. Der große Vorteil von Proben, die eine fotoaktive Gruppe einführen, ist, daß der Bindungsprozeß aktiviert werden kann, nachdem alle nichtspezifischen Wechselwirkungen der Probe ausgeschaltet wurden, und so findet keine oder nur untergeordnete Bindung oder Verlust der Probe durch Hydrolyse statt. Diese Fotoaffinitätsreagenzien können entweder über synthetische Ruten für einfach Moleküle oder über Konjugation eines fotoaktiven Liganden für komplexere Makromoleküle hergestellt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die eine Verbindung mit einer chelatisierenden Gruppe und einer Gruppe enthält, die, wenn sie fotoaktiviert wird, hochreaktiv wird, d. h. die in Kohlenstoff-Wasserstoff-, oder Stickstoff-Wasserstoff- oder Sauerstoff-Wasserstoff-Bindungen insertieren kann, und ein Verfahren zur fotochemischen Bindung von chelatisierenden Gruppen an Biomoleküle zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die eine Verbindung mit einer chelatisierenden Gruppe und einer fotoaktivierbaren Gruppe umfaßt, die durch Fotoaktivierung mit einer Kohlenstoff-Wasserstoff-, Stickstoff-Wasserstoff- oder Sauerstoff-Wasserstoff-Bindung reagieren kann, und ein Verfahren zur Bindung eines chelatisierbaren Ions mit einem Biomolekül, das die folgenden Schritte in beliebiger Reihenfolge umfaßt: (a) Fotoaktivieren der oben genannten Verbindung in Anwesenheit eines Biomoleküls, wodurch die fotoaktivierte Gruppe an das Biomolekül gebunden wird, und (b) Einbinden eines chelatisierbaren Ions in diese Verbindung unter Chelatisierungsbedingungen.
Die fotoaktivierbaren bifunktionellen Chelatbildner (Ph-BFCA) stellen eine neue Klasse von chemischen Verbindungen mit merklichen Vorteilen als Mittel für die Kennzeichnung von Biomolekülen mit chelatisierbaren Ionen dar:
1. Sie sind zugänglich für die Kennzeichnung aller Typen von Biomolekülen. Der Bindungsmodus erfordert, einzigartig für fotoaktive Spezies, nur eine einfache Kohlenstoff-Wasserstoff-, Sauerstoff-Wasserstoff- oder Stickstoff-Wasserstoff-Bindung, und die Allgegenwärtigkeit dieser Strukturen in praktisch allen Biomolekülen sichert universelle Träger.
2. Die Ausbeute der Konjugate kann quantitativ sein. Dies ermöglicht die direkte Verwendung des chelatisierten Produkts ohne einen zweiten Schritt für die Entfernung von ungebundenem Chelat. Dadurch wird ein zeitaufwendiger problematischer Schritt ausgeschaltet und die Verwendung dessen, was ein teures Reagenz sein kann, effizient.
3. Der Grad der Konjugation ist leicht kontrollierbar und im allgemeinen unabhängig von dem Biomolekül und potentiell unbegrenzt. Wenn die Ausbeute quantitativ ist, wird die Anzahl an gebundenen chelatisierenden Gruppen eine einfache Funktion des anfänglichen Reaktanten- Verhältnisses. Demzufolge sollte das anfängliche Verhältnis von Reagenz zu Biomolekül 10 sein, wenn eine Bindung von 10 Chelatbildnern gewünscht wird. Unter Vorgabe des nichtspezifischen Markierungsprozesses kann dieses Merkmal auf jedes beliebige Biomolekül angewendet werden. Die Anzahl der gebundenen Chelatgruppen kann weit über denen liegen, die erreichbar sind mit Reaktionen, die spezifisch für chemische Gruppen sind. Beispielsweise kann ein Biomolekül, das 10 freie Aminogruppen enthält, mit einem Reagenz, das Aminogruppen erfordert, nicht weiter konjugiert werden, im Gegensatz zu dem unbegrenzten Potential mit der neuen Klassen von Reagenzien. Die Einführung von weniger sperrigen fotoaktiven Gruppen, wie einem Azido- oder Diazo-Substituenten, ist hinsichtlich sterischen Anfordernissen besser (Bayley, et al., Methods Enzymol., 46 : 69 [1977]).
4. Die Kupplung läuft unter relativ milden Bedingungen und schnell ab verglichen mit vielen chemischen Konjugationsverfahren. Einfache Lösung in einem beliebigen stabilisierenden Puffer bei leicht basischem pH und eine kurzzeitige Bestrahlung (< 10 Minuten) mit einer Lichtquelle geeigneter Wellenlänge und Intensität ist alles, was erforderlich ist. Es wird erwartet, daß diese Bedingungen eine minimale biologische Beschädigung bewirken, was wichtig ist für Struktur-Funktions-abhängigen Biomoleküle, wie Enzyme oder Antikörper.
Die PF-BFCA-Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben die Struktur
Ch - gegebenenfalls Abstandshalter - PF
worin Ch eine Ionen-chelatisierende Gruppe und PF eine fotoaktivierbare funktionelle Gruppe, wie eine Azidogruppe, ist.
Die fotoaktivierten Reaktionen eines PF-BFCA mit Biomolekülen stellen ein mildes, hoch effizientes Verfahren zur Einführung von chelatisierenden funktionellen Gruppen in beliebige Biomoleküle dar. Das relativ unselektive Markierungsmuster dieser Reagenzien soll es ermöglichen, Moleküle, die vorher nur unter Schwierigkeiten oder gar nicht mit spezifischen Metallionen markiert werden konnten, in dieser Weise studieren zu können. Substanzen, wie Oligosaccharide, Mucine, Lipide und bestimmte Proteine, die wenig geeignete Stellen für die spezifischen chemische Bindung enthalten, sind nun geeignete Träger. Andere biologisch aktive Materialien, wie Arzneimittel, Dextran und Polyethylenglycole, können nun wirksamer als Träger von Metallionen-Sonden eingesetzt werden. Metallionen-enthaltende Biomoleküle sind sehr nützlich als NMR-Kontrastmittel (beispielsweise durch Einlagerung von Gd oder Mn) und als Fluoreszenzmarkierer (beispielsweise durch Einlagerung von Eu oder Tb). Die Fähigkeit zur Markierung von zwei oder mehr Biomolekülen, jedes mit einem unterschiedlichen Metallion, ermöglicht ihren Einsatz in Analysenverfahren (beispielsweise RIA oder IRMA), um viele Spezies in einer einzigen Probe zu detektieren. Da es ein großes Angebot an radioaktiven Metallionen gibt, können die chelatisierten Biomoleküle für alle Arten von in vitro und in vivo Anwendungen radioaktiv markiert werden. Für nuklearmedizinische Bilderzeugung bevorzugte Radioisotopen, wie &sup6;&sup7;Ga, ¹¹¹In oder 99mTc können wirksamer eingesetzt werden als solche für spezielle Verfahren, wie PET (beispielsweise &sup6;&sup8;Ga) und radiopharmazeutische Therapie (beispielsweise &sup9;&sup0;Y).

Chelatisierbare Ionen und chelatisierende Gruppen

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf spezielle Chelatbildner beschränkt. Während EDTA und DTPA-Derivate bevorzugt sind, sind viele andere Chelatbildner bekannt. Siehe Meares, U.S. 4 678 667; Wieder, U.S. 4 352 751; Hnatowich, U.S. 4 479 930; Meares, U.S. 4 043 998; Ueda, U.S. 4 564 742; Davidson, U.S. 4 673 562; Hnatowich, U.S. 4 668 503, Arano, U.S. 4 559 221 und Costa, U.S.
3 809 632. Die folgende Tabelle zeigt Ionen, die durch verschiedene Agenzien chelatisiert werden:
Chelatisierende Gruppen Chelatisierbare Ionen
EDTA ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, 99mTc, &sup9;&sup0;Y
DTPA 99mTc, ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, &sup9;&sup0;Y, Gd
MA-DTPA ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, 99mTc, &sup9;&sup0;Y, Gd
CA-DTPA ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, 99mTc, &sup9;&sup0;Y, Gd
TETA; DOTA ¹¹¹In, &sup6;&sup7;Ga, &sup9;&sup0;Y
DADS 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re

Fotoaktivierbare funktionelle Gruppen

Die fotoaktivierbare funktionelle Gruppe (PF) ist eine chemische Struktur, die bei Bestrahlung mit Licht in eine reaktivere chemische Spezies (PF*) übergeführt wird, die mit allen oder fast allen der natürlich vorkommenden Aminosäuren und anderen chemischen Gruppen reagieren kann. Vorzugsweise weist PF eine niedrige chemische Reaktivität (im Dunkeln) und PF* eine hohe chemische Reaktivität auf.
In einer ersten Ausführungsform ist PF* ein Carben. Carbene werden typischerweise durch Spaltung von Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindungen erzeugt und sind außergewöhnlich reaktiv. Carbene reagieren sehr schnell mit einer Vielzahl von chemischen Funktionen: durch Koordiation an nukeophile Zentren (wodurch Carbanionen erhalten werden), durch Addition an Mehrfachbindungen (einschließlich denen aromatischer Systeme), durch Insertion in Einfachbindungen (einschließlich Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen), und durch Wasserstoff-Abstraktion (wodurch zwei frei Radikale erhalten werden, die dann kuppeln können). Wenn jedoch ein Wasserstoffatom an dem Kohlenstoffatom in der Nachbarschaft des Carbenzentrums ist, tritt leicht eine Wasserstoffwanderung auf, und führt zu einem unreaktiven Olefin. Aus diesem Grund darf das benachbarte Atom keinen Wasserstoff tragen.
Bei α-Ketocarbenen können ebenfalls intramolekulare Wolff-Umlagerungen stattfinden, was zu Ketenen führt.
Siehe "Carbene" (M. Jones, Jr. and R.A. Moss, eds.), Wiley (Interscience), New York, Vol. I, 1973; Vol. II, 1975.
Vorzugsweise werden Carbene aus Aryldiazirinen (beispielsweise Aryl-CHN&sub2;) oder aus fluorierten Diazoverbindungen (beispielsweise RC (O) (CF&sub3;) =N&spplus;=N&supmin;) hergestellt. Diese Vorläufer sind bevorzugt, da sie im Dunkeln stabil und weniger anfällig für Umlagerungen sind.
In einer zweiten Ausführungsform ist PF* ein Nitren. Nitrene werden hergestellt durch Photolyse von Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, sowie die, die in einem Azid vorliegen. Vorzugsweise werden Arylnitrene erzeugt durch Fotoaktivierung von Arylaziden. Arylazide sind chemisch weniger reaktiv als die Acyl-, Sulfonyl- oder Phosphorylazide und sind leicht herstellbar. Arylnitrene sind hoch reaktive, ungeladene elektronendefizitäre Spezies. Die Reaktionen, die ein Nitren eingehen kann, sind weitgehend denen ähnlich, die ein Carben eingehen kann, aber die Reaktivität von Nitrenen ist merklich geringer und demzufolge selektiver. Beispielsweise sind Nitrene in gewisser Weise elektrophil und bevorzugen eine O-H- gegenüber einer C-H-Bindung. Die Möglichkeiten eines Nitrens umfassen die Addition an eine Doppelbindung, um einen heterocyclischen Ring zu erhalten, nukleophile Angriffe, Abstraktion von Wasserstoff und Insertion in eine C-H-Bindung.
Wenn ein Nitren in situ an einem Bindungsort erzeugt wird, führen direkte Insertion, Abstraktion-Kupplung oder Additionsreaktionen zu einer covalenten Bindung der Markierung an die Stelle.
Siehe "Nitrenes", (W. Lwowski, ed., Wiley Interscience, New York, 1970); T.L. Gilchrist and C.W. Rees, "Carbenes, Nitrenes and Arynes," Nelson, London, 1969.
In einer dritten Ausführungsform ist PF* ein freies Radikal. Der Vorläufer ist vorzugsweise ein α,β-ungesättigtes Keton. Freie Radikale sind wirksame Wasserstoffabstraktoren mit einer Bevorzugung für Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen; es ist unwahrscheinlicher, daß diese mit Wassermolekülen in dem Medium reagieren.
Während PF* vorzugsweise ein Carben, Nitren oder ein freies Radikal ist, kann es aber auch eine andere fotoerzeugte hochreaktive Spezies sein, die mit Biomolekülen reagiert, insbesondere solchen, die Aminosäuren oder Zuckereinheiten enthalten. Es ist wünschenswert, daß PF* nicht nur mit Cystein, Lysin, Tyrosin und Tryptophan reagiert, sondern auch mit anderen Aminosäuren oder chemischen Resten.
Die Reaktivität des PF* kann in einigen Fällen verbessert sein. So steigern elektronenziehende Substituenten, wie Nitrogruppen, die Reaktivität von Arylnitrenen. Die elektronenziehende Kraft eines Substituenten wird angezeigt durch seine Induktivitätskonstante; siehe beispielsweise Fuson, Reactions of Organic Compounds 11-12 (1962). Der Wert für die Nitrogruppe beträgt 0,78.
Andere Eigenschaften des BFCA können ebenfalls modifiziert sein. Ein Nitrosubstituent kann verwendet werden, um das UV-Absorptionsspektrum eines Arylazids zu längeren Wellenlängen zu verschieben. Eine Trifluormethylfunktion kann verwendet werden, um eine Diazoacetylgruppe zu stabilisieren. Hydrophile Substituenten können verwendet werden, da um die Löslichkeit von BFCA in wäßrigem Medium zu verbessern.

Beispiel 1: Synthese von para-Azidobenzylethylendiamintetraessigsäure (AzBEDTA)

Diese Verbindung wurde als das geeignetste Beispiel dieser Klasse von fotoaktiven BFCA (PF-BFCA) gewählt, bedingt durch die Erfahrung in der Synthese von EDTA-Derivaten, der außergewöhnlichen Stabilität von Metallion-EDTA-Komplexen für in vitro und in vivo Verwendung und bedingt durch die Vorteile von Arylaziden als fotoaktive funktionelle Gruppen. Die gesamte Synthese wurde unter Verwendung von analysenreinen Chemikalien und zweifach destiliertem entionisiertem Wasser durchgeführt.
Der als Ausgangsmaterial dienende Vorläufer para-Aminobenzylethylendiamintetraessigsäure 1 wurde synthetisiert wie durch Yeh, et al., Anal. Biochem., 100: 152 (1979) beschrieben. Dieses Material wurde in das Diazoniumzwischenprodukt 2 unter Verwendung von saurem Natriumnitrit übergeführt. Zu einer gerührten Suspension von 1 (19,36 mg; 0,048 mMol) in 250 ul 12,2 M HCl bei 0ºC wurden 125 ul 0,5 M NaNO&sub2; (0,0625 mMol) gegeben und die Mischung 1 h gerührt. Zu dieser Zeit wurde überschüssige salpetrige Säure zerstört durch Zugabe von 5 mg Harnstoff unter kontinuierlichem Rühren für weitere 20 min. Das Produkt wurde analysiert durch Umsetzen einer Teilmenge mit Resorcinol, um einen gefärbten Komplex zu bilden, der spektrophotometrisch bei 385 nm vermessen werden kann. Unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 21500 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ wurde die gesamte Diazoniumausbeute auf etwa 75% bestimmt. Dieses Zwischenprodukt wurde in das Azido-analoge 3 durch Behandlung mit Natriumazid übergeführt. Zu der ungereinigten Lösung von 2 wurden 35 ul 2,86 M NaN&sub3; (6,5 mg, 0,1 mMol) in Wasser unter starkem Rühren über 1 h bei 0ºC gegeben. Diese saure Lösung wurde vorsichtig mit NaoH neutralisiert und als Natriumsalz durch Gefriertrocknung konzentriert. Das erhaltene Pulver wurde in Wasser gelöst und auf eine 0,8 · 15 cm P-2 Biogel- (Bio-Rad) -Säule geladen. Die Fraktionen wurden unter Verwendung von Wasser eluiert und auf das Endprodukt untersucht unter Verwendung von TLC (Rf 0,75; Celluloseplatten entwickelt in Acetonitril 7 : 3 Wasser). Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, und eine Gesamtausbeute von etwa 70% wurde erhalten. Die gereinigte Verbindung wurde durch IR und NMR analysiert, wie in Fig. 4 bzw. Fig. 5 gezeigt. Aus den resultierenden Spektren wurde die folgende Charakterisierung von para-Azidobenzylethylendiamintetraessigsäure (Natriumsalz) erhalten.
IR(KBr): 3386 cm&supmin;¹ (-OH) 2122 cm&supmin;¹ (-N&sub3;) ¹H-NMR (300 MHz, D&sub2;O, pH-12): 7.040 (d, 2H, J=9Hz); 6.880 (d, 2H, J=9Hz); 3.240 (d, 1H, J=16Hz); 3.090 (m, 1H); 2.905 (d, 1H, J=16Hz); 2.763 (d, 1H, J=16Hz); 2.692 (d, 1H, J=16Hz); 2.683 (d, 1H, J=16Hz); 2.625 (d, 1H, J=16Hz); 2.443 (d, 1H, J=16Hz); 2.312 (t, 2H, J=14Hz); 2.271 (d, 1H, J=16Hz); 2.194 (d, 1H, J=12Hz); 2.156 (d, 1H, J=12Hz).
Die Titelverbindung war in Dunkeln bei 4ºC über mindestens 4 Wochen stabil.

Beispiel 2: Chelatisierung von Radioisotopen durch AzBEDTA

Eines der geeignetsten radioaktiven Metallionen, die üblicherweise für radioimmunoabbildende Studien verwendet werden, ist Indium-111 (In-111) und deshalb wurde dieser Tracer gewählt für die Bindungsstudien, um diese auf gebräuchliche Methoden anwendbar zu machen. Um den Konjugationsgrad zu bewerten, wurden einfache Analysenverfahren mit Standardradioisotop-Tracer-Methodik kombiniert.
Die Chelatisierung von In-111 durch AzBEDTA wurde durchgeführt durch Zugabe einer radiochemisch reinen Lösung (kein Carrier zugegeben) (10-100 ul) von In-111 in 0,05 M HCl (Atomic Engergy of Canada Ltd.) zu einer Lösung (20-200 ul) von AzBEDTA (0,05 mMol) in 0,1 M Citrat und Umsetzen bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Es findet eine quantitative Überführung in AzBEDTA-In-111 statt, wie durch TLC-Analyse (Acetronitril : Wasser 7 : 3, Cellulose) gezeigt wird, in der In-111 am Ausgangspunkt bleibt und das Chelat mit einem Rf-Wert von 0,7 wandert.

Beispiel 3: Photolyse von [In¹¹¹] - AzBEDTA und Bindung an ein Protein

Photolyseapparatur und -verfahren

Das radioaktiv markierte AzBEDTA (AzBEDTA-In-111) wurde verwendet zur Bestimmung des Grades der Bindung an Rinderserumalbumin (BSA) über die fotoaktive Gruppe unter verschiedenen Bedingungen. BSA ist ein gebräuchlicher Laborstandard für verschiedene Verfahren, die ein Proteinmaterial erfordern. Es wurden Stammlösungen beider Reaktanten von verschiedenen Konzentrationen in verschiedenen Puffern hergestellt und die erforderlichen Volumina unmittelbar vor der Bestrahlung gemischt.
Die Photolyseapparatur ist eine Hanoria UV-Lampe (254 nm) in einer Quartz-überzogenen Zelle von 1 cm Weglänge, durch die Eiswasser schnell zirkuliert wird. Eine Anzahl von Proben kann gleichzeitig bestrahlt werden durch Mischung geeigneter Mengen des radioaktiven markierten Chelats und des Proteins in den erforderlichen Puffern in einem Quartzrohr (1,2 cm · 7 cm) und Einspannen dieser Rohre in einer solchen Weise, daß die Bestrahlung der Reaktionsmischung in einem Abstand von 10 cm von dem Zentrum der Lampe stattfindet. Der gesamte Aufbau wird in einen hohlen Behälter angeordnet, so daß das Photolyseexperiment sicher auf dem Arbeitstisch durchgeführt werden kann. Auf diese Weise werden verschiedene Verhältnisse von AzBEDTA-In-111 zu BSA gegeben (als 5%ige Lösung in dem geeigneten Puffer) und die Proben über verschiedene Zeitintervalle photolysiert (1-10 min).
Der Grad der Konjugation wurde durch einfache TLC-Analyse bestimmt. Eine Teilmenge der photolysierten Reaktionsmischung wurde punktförmig auf Celluloseplatten (0,8 · 8 cm) gegeben und in 0,1 molarer HCl : Methanol (3 : 7) entwickelt. In diesem System bleibt Proteingebundenes AzBEDTA-In-111 am Startpunkt und AzBEDTA-In-111 wandert mit einem RF-Wert von etwa 0,7. Da beide Spezies ein radioaktives Isotop enthalten, wurde der Prozentsatz in jeder Fraktion durch Messungen der Radioaktivität jeder Sektion auf der TLC-Platte berechnet. Die Anzahl von Chelatgruppen, die pro Molekül Protein gebunden sind, wird dann aus dem molaren Anfangsverhältnis der Reaktanten bestimmt.
Die Faktoren, die die Bildung des neuen PF-BFCA beeinflussen, wurden in einer Serie einfacher Experimente bewertet. Es scheint nur einen geringen Einfluß der Proteinkonzentration auf die Reaktion zu geben, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. Das Reaktionsvolumen scheint wichtig zu sein, wie in Tabelle 2 gezeigt wird, was ein Anzeiger sein kann für einige Aspekte des Lichtübergangsprozesses. Wenn die Konzentration des PF-BFCA relativ zu dem Protein erhöht ist, scheint der Prozeß wirksamer zu sein (Tabelle 3). Es ist zu beachten, daß die tatsächliche Zahl an gebundenen Chelaten sowohl eine Funktion der Reaktionsausbeute als auch des Anfangsverhältnisses ist, so daß die 18% einer 1 : 10 Reaktion in etwa 2 gebundenen Chelaten pro Proteinmolekül resultieren, verglichen mit 80% von 1 : 100, was 80 Chelate pro Molekül ergibt. Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, zeigt die Dauer der Bestrahlung eine deutliche positive Korrelation mit der Bindung. Wie erwartet ist der Grad der Fotoaktivierung bezogen auf die gesamte UV- und sichtbare Lichtenergie, die in das System gebracht wird. Die Bindung kann auch durch den pH-Wert des wäßrigen Mediums beeinflußt werden, in dem die Reaktion stattfindet. In basischen Lösungen ist die Reaktion quantitativ (Tabelle 5). Dies könnte erklärt werden durch die Neigung des Arylnitrens, ein Wasserstoffatom zu abstrahieren, was durch alkalische Bedingungen erleichtert wird.
Diese Studien zeigen, daß unter wohldefinierten Bedingungen die Reaktion zwischen ¹¹¹In-AzBEDTA und BSA eine quantitative Bindung des Chelats an das Protein erzeugt werden kann. Um dies zu verifizieren wurde BSA unter identischen Bedingungen mit nichtradioaktivem AzBEDTA konjugiert und ¹¹¹In-Citrat nach der Photolyse zugegeben. Die Analyse dieser Lösung zeigte eine ¹¹¹In-Bindung an das Protein über den zweiten Weg (d. h. die Prechelatisierung von Protein und unter Anwendung der Photolyse von fotoaktiven BFCA (PF-BFCA) in Anwesenheit eines Proteins und dann Zugabe des Metallions zu dem gereinigten Protein) für die Metallionenbindung unter Verwendung von BFCA und bestätigte die Anwesenheit von chelatisierenden Gruppen an dem mit AzBEDTA behandelten BSA.

Beispiel 4: Photolyse eines monoklonalen Antikörpers

Um zu zeigen, daß die Reaktionsbedingungen für die Fotoaktivierung des Chelates die biologische Wirkung von Biomolekülen nicht beeinflußt, wurde ein monoklonaler Antikörper (MAb-155) in der Photolysevorrichtung verwendet und seine relative Immunreaktivität nach dem Verfahren gemessen. Die ELISA-Technik wurde verwendet, um die Bindungseffizienz von MAb-155 bei verschiedenen Konzentrationen gegenüber einem immobilisierten Antigen zu bestimmen. Wie in Tabelle 6 gezeigt wird, gibt es keine auffällige Änderung in der relativen Antigenbindung des MAb-155 nach 5 Minuten Photolyse, verglichen mit MAb-155 alleine oder in Anwesenheit des Chelats. Demzufolge ist gemäß der Bestimmung der immunologischen Funktion das MAb-155 durch das den Prozeß nicht beeinflußt und behält seine Reaktivität gegenüber Antigenmaterial bei. Tabelle 1 Parameter Wert % Bindung an das Protein Protein: Ph-BFCA Protein-Konzentration Puffer 0,1 M Citrat Gesamt-Reaktionsvolumen Photolyse-Dauer Tabelle 2 Parameter Wert % Bindung an das Protein Protein: Ph-BFCA Protein-Konzentration Puffer 0,1 M Citrat Gesamt-Reaktionsvolumen Photolyse-Dauer Tabelle 3 Parameter Wert % Bindung an das Protein Protein: Ph-BFCA Protein-Konzentration Puffer 0,1 M Citrat Gesamt-Reaktionsvolumen Photolyse-Dauer Tabelle 4 Parameter Wert % Bindung an das Protein Protein: Ph-BFCA Protein-Konzentration Puffer 0,1 M Citrat Gesamt-Reaktionsvolumen Photolyse-Dauer Tabelle 5 Parameter Wert % Bindung an das Protein Protein: Ph-BFCA Protein-Konzentration Puffer 2,0 M Phosphat 0,1 M Citrat Gesamt-Reaktionsvolumen Photolyse-Dauer Tabelle 6 ug MAb-155 pro Behälter optischer Dichtewert in standardisiertem ELISA +5 min Photolyse

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung mit einer chelatbildenden Gruppe und einer fotoaktivierbaren Gruppe, die bei Fotoaktivierung eine Reaktion mit einer Kohlenstoff-Wasserstoff-, Stickstoff-Wasserstoff- oder Sauerstoff-Wasserstoff-Bindung eingehen kann.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die fotoaktivierbare Gruppe so fotoaktivierbar ist, daß sie zu einem Carben wird.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die fotoaktivierbare Gruppe so fotoaktivierbar ist, daß sie zu einem Nitren wird.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die fotoaktivierbare Gruppe so fotoaktivierbar ist, daß sie zu einem freien Radikal wird.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die fotoaktivierbare Gruppe ein Arylazid ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die fotoaktivierbare Gruppe ein Aryldiazarin ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die fotoaktivierbare Gruppe eine Fluoralkyldiazoacetyl-Gruppe ist.

8. Verfahren zur Konjugation eines chelatisierbaren Ions mit einem Biolmolekül, umfassend die folgenden Schritten in beliebiger Reihenfolge: (a) Fotoaktivierung der Verbindung nach Anspruch 1 in Anwesenheit eines Biomoleküls, wodurch die fotoaktivierte Gruppe mit dem Biomolekül gekuppelt wird, und (b) Einführen eines chelatisierbaren Ions in diese Verbindung unter chelatisierenden Bedingungen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin Schritt (b) vor oder gleichzeitig mit dem Schritt (a) durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, worin Schritt (b) Schritt (a) folgt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, worin die fotoaktivierbare Gruppe fotoaktiviert wird, um ein Carben zu werden.

12. Verfahren nach Anspruch 8, worin die fotoaktivierbare Gruppe fotoaktiviert wird, um ein Nitren zu werden.

13. Verfahren nach Anspruch 8, worin die fotoaktivierbare Gruppe fotoaktiviert wird, um ein freies Radikal zu werden.

14. Verfahren nach Anspruch 12, worin die fotoaktivierbare Gruppe ein Arylazid ist

15. Verfahren nach Anspruch 11, worin die fotoaktivierbare Gruppe ein Aryldiazarin ist.

16. Verfahren nach Anspruch 11, worin die fotoaktivierbare Gruppe eine Fluoralkyldiazoacetyl-Gruppe ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin ein chelatisierbares Ion durch die chelatisierenden Gruppe chelatisiert ist.

18. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Biomolekül ein Antikörper ist.