DE69108439T2 - Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins. - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins.

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Description

    Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins.
    • Stand der Technik
  • Van einer im fortgeschrittenen Stadium van Diabetes auftretenden Komplikatian wird die Genesung des Patienten entscheidend beeinflußt. Deshalb ist die Vermeidung der Komplikation dieser Krankheit für die Heilung von Diabetes am wichtigsten.
  • Es wird darüber berichtet, daß Protein im Blut eines Diabetespatienten einer nicht enzymatischen Glykation unterliegt, wodurch nicht enzymatisches glykiertes Protein im Blut im Vergleich mit einem gesunden Menschen erhöht wird, wobei die Beziehung zwischen dem nicht enzymatisch glykierten Protein und der Krankheit ausführlich studiert wurde (Biochem. Biophys. Res. Commun., 67, 103 (1975), J. Biol. Chem., 254,702 (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2393 (1982), Diabetes, 31,283 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2918 (1978), J. Clinical Pathology, 37, 841 (1984), Annals of Clinical Biochemistry, 21, 2 (1984)
  • Es wird davon ausgegangen, daß nicht enzymatisch glykiertes Hämoglobin, das eine zufriedenstellende Korrelation zum Blutzuckerspiegel der vorangegangenen 1-2 Monate zeigt, zusammen mit dem nüchternen Blutzucker, der den aktuellen Glykometabolismus wiederspiegelt, als Index der Blutzuckerkontrolle brauchbar ist, wobei dieser allgemein als Index der Heilung von Diabetes übernommen wurde. Der Blutzuckerspiegel unterliegt jedoch in großem Maße einer tagesmäßigen Präzision, während beim nicht enzymatisch glykierten Hämoglobin eine lange Zeit erforderlich ist, bis eine Bestätigung der Heilwirkung auftritt.
  • Mit dem Ziel einer schnelleren Bestätigung der Wirkung der Behandlung wird Fructosamin bestimmt, welches die Kapazität der Reduktion des nicht enzymatisch glykierten Proteins im Blut darstellt und den Stand des Blutzuckers für die vorangegangenen 1-2 Wochen wiederspiegelt, wobei davon bei der Heilung von Diabetes Gebrauch gemacht wird. In diesem Fall wirft jedoch der Einfluß von koexistierenden Reduktionsmaterialien, wie beispielsweise Bilirubin und L- Ascorbinsäure, Probleme auf (J. Clin. Lab. Inst. Reag., Vol. 13, Nr. 1, Seite 87 (1990)). Als Index kurzeitiger Blutzuckerkontrolle ist das nicht enzymatisch glykierte Albumin bekannt, so daß ausgiebige Forschungsarbeiten und Untersuchungen durchgeführt wurden, um eine einfache Methode zur Bestimmung dieses Materials zu entwickeln.
  • Darüberhinaus handelt es sich beim nicht enzymatisch glykierten Protein entweder um ein Schiffbasen-Derivat (instabil) oder ein Ketoamin-Addukt (stabil), das auf eine Amadori-Umlagerung und Stabilisierung der Schiffbase zurückzuführen ist ("Rinsho Kensa", Journal of Medical Technology, Bd. 33, Nr. 8, Seite 893 (1989)).
  • Darüberhinaus ist es wichtig geworden, die Amadori- Umlagerungsprodukte zu bestimmen, was durch kurzzeitige Blutzuckeränderungen nicht beeinträchtigt wird und den Blutzuckerspiegel für eine festgelegte vergangene Zeit zufriedenstellend wiedergibt.
  • Als konventionelles Verfahren zur Bestimmung von glykiertem Protein gibt es die isoelektrische Fokussierungselektrophorese, Kationenaustausch-Chromatographie, Spektrophotometrie, kolorimetrische Analyse, HPLC-Analyse, Minisäuleverfahren und Affinitätschromatographie (Diabetologia, 31, 627-631 (1988), "Kensa to Gijutsu" (Modern Medical Laboronatory), Bd. 14, Nr. 11, Seite 1,155 (1986)), wobei die Analyse zur Bestimmung von glykiertem Protein in Proben (i.e. Testprobelösung) klinisch umfangreich verwendet wird.
  • Von keiner der obigen Verfahren kann jedoch behauptet werden, daß sie in jeder Hinsicht, wie beispielsweise Empfindlichkeit der Messung, Funktionskontrollvermögen und Testprobebehandlungszeit, zufriedenstellend ist, wobei es in der Praxis Unzulänglichkeiten gibt, die verbessert werden müssen. Folglich gab es eine Nachfrage danach, ein Verfahren zu etablieren, das leicht, genau und in einem kurzen Zeitraum eine Analyse einer großen Anzahl von Testproben erlaubt.
  • Man ging davon aus, sich zur Lösung der obigen Probleme an die Verwendung von immunologischen Assay zu halten, und es gibt Berichte darüber, daß die Bestimmung von glykierten Protein mittels Radioimmunoassay (RIA) durch die Herstellung eines Antiserums oder eines monoklonales Antikörpers mit besonderer Affinität zum Glycitol-Lysinrest möglich ist, der eine der glykierten Stellen des glykierten Proteins darstellt (J. Clin. Invest., 72,1427 (1983), Jap. J. Clin. Path., Ergänzung zu Bd. 33, Seite 226 (1985), J. Japan Diab. Soc., Bd. 29, Seite 581 (1986), Clinica. Chimica. Acta. 153, 293 (1986), J. Japan, Diab. Soc., Bd. 28, Seite 695 (1985)).
  • Alle obigen immunologischen Verfahren machen von einem glykierten Protein-Antikörper vom Anti-Reduktionstyp zur Herstellung des Amadori-Umlagerungsproduktes des glykierten Proteins Gebrauch und sind als Verfahren zur Bestimmung des glykierten Proteins ausgezeichnet. Diese Verfahren haben jedoch in der Hinsicht Probleme, daß es erforderlich ist, die gesamte Menge eines bestimmten glykierten Proteins genau abzutrennen und zu bestimmen, welches eine hohe Signifikanz hinsichtlich klinischer Analyse aufweist (J. Japan Diab. Soc., Ergänzung zu Bd. 34, Seite 96(1986)).
  • Phenylboronsäure-Affinitätschromatographie, die im Hinblick auf kleine Schwankungen der Temperatur, des pH oder der Ionenstärke weniger Beeinflussung unterliegt, ist ein ausgezeichnetes Verfahren zur Abtrennung von glykiertem Protein und es wurde von Amicon Corporation und Pierce Chemical Company etc. eine Ausrüstung für den klinischen Einsatz entwickelt (UK Patentoffenlegungsschrift Nr. 2 024 829 und US Patent Nr. 4 269 605). Diese Verfahren weisen jedoch Probleme auf, wie beispielsweise, daß eine vergleichsweise große Menge einer Probe erforderlich ist und eine Protein-Mengenbestimmung involviert ist, die nicht spezifisch ist.
  • Desweiteren gibt es ein Verfahren, in welchem das glykierte Protein mittels immobilisierter Phenylboronsäure abgetrennt wird, wobei ein markierter Antikörper mit spezifischer Affinität zu einem bestimmten Protein verwendet wird (Japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 100 660/1987) Dieses Verfahren hat jedoch in der Hinsicht Probleme, daß Schwankungen der Prozentgehalte von den unterschiedlichen Arten des glykierten Proteins beeinträchtigt werden, und daß es erforderlich ist, die Gesamtmenge eines bestimmten Proteins einzeln zu messen, um dessen Glykationsprozentsatz zu bestimmen.
  • Desweiteren gibt es ein Verfahren der Analyse eines glykierten Albumins, das auf Änderungen der Fluoreszenzwellenlänge beruht, wobei ein fluoreszenzmarkiertes Boronsäurederivat als Reagens für die Detektion des glykierten Albumins verwendet wird (Clin. Chem. Acta. 149, 13 (1985)). Dieses Verfahren ist jedoch als Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins theoretisch ungeeignet, weil das Reagens mit unbestimmten glykierten Protein reagiert, so daß die Gesamtmenge des bestimmten Proteins einzeln bestimmt werden muß, so daß das Verfahren in Bezug auf das bestimmte Protein als Meßverfahren für Proteine eine geringe Spezifität aufweist.
  • Um diese Probleme zu lösen, wurde ein Verfahren vorgeschlagen, das in der Japanischen Offenlegungsschrift 16 954/1989 beschrieben ist, in welchem ein bestimmtes Protein mittels eines immobilisierten Antikörpers abgetrennt wird, wobei ein monoklonaler Antikörper, der glykierte reduzierte Stellen, wie beispielsweise Glycitol-Lysin oder Glycitol- Valinreste, spezifisch erkennen kann, zur Bestimmung der Menge eines bestimmten Proteins oder dessen Glykationsprozentsatzes verwendet wird. Dieses Verfahren ist deshalb ein ausgezeichnetes Verfahren, da der Glykationsprozentsatz bestimmt werden kann, ohne daß eine Bestimmung der Gesamtmenge des bestimmten Proteins erforderlich ist. Es weist jedoch solche Probleme wie beispielsweise geringe Reproduzierbarkeit oder Linearität der Standardkurve auf, wobei die erkennbare glykierte Stelle nur einen Teil der gesamten glykierten Stellen ausmacht und fünf Stunden oder mehr zur Bestimmung erforderlich sind.
  • Außerdem gibt es ein Verfahren, bei welchem ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes Boronsäurederivat mit Hämoglobin in der Probe umgesetzt wird, wobei das Hämoglobin von einem auf einem Träger immobilisierten Antikörper eingefangen, die Gesamtmenge an Hämoglobin kolorimetrisch bestimmt und das glykierte Hämoglobin fluorometrisch bestimmt wird, um den Glykationsprozentsatz des Hämoglobins zu bestimmen (US Patent Nr. 4 861 728). Dieses Verfahren ist jedoch in der Hinsicht kein wirtschaftliches Verfahren, da es ein mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Boronsäurederivat erfordert, das in einem großen Überschuß zur Gesamtmenge des in der Probe vorliegenden glykierten Hämoglobins und zur Menge des auf einem Träger immobilisierten Antikörpers vorliegt. Außerdem weist es Probleme hinsichtlich des Operationssteuerungvermögens, Bequemlichkeit sowie Unbeständigkeit in der Hinsicht auf, daß zwei verschiedene Messungen, i.e. Kolorimetrie und Fluorometrie, für die Bestimmung des Glykationsprozentsatzes erforderlich sind.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wurde angesichts der Nachteile, die die oben diskutierten Verfahren des Standes der Technik aufweisen, erdacht und es ist ihre Aufgabe, ein Analyseverfahren zu schaffen, das eine Kombination von immunologischen Techniken und eines Affinitätsadsorptionsverfahrens darstellt und die Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins in einem leichten Arbeitsvorgang, einer kurzen Zeitdauer und exakt erlaubt.
  • Die Erfinder haben umfangreiche Forschungsarbeiten und Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, ein einfaches Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins zu realisieren, und sie haben herausgefunden, daß der Glykationsprozentsatz eines bestimmten Proteins in einer Probe durch Umsetzung der Probe, i.e. Testprobelösung, mit einer festen Phase eines Antikörpers oder dessen aktiven Fragments (i.e. der Teil des Antikörpers, von welchem das Antigen erkannt wird), das an einem festen Träger unlöslich anhaftet, leicht bestimmt werden kann, wobei der Antikörper eine spezifische Affinität zu dem zu messenden bestimmten Protein aufweist, und zwar durch Einfangen des bestimmten Proteins auf die feste Phase, Auftrennen der Flüssigphase (i.e. Probe) und der festen Phase, Herbeiführung der Reaktion des markierten Boronsäurederivats mit Affinität zur cis-Diolgruppe, die an der glykierten Stelle des bestimmten an die feste Phase gebundenen Proteins vorliegt, wodurch das markierte Material an die glykierte Stelle gebunden wird und Bestimmung der Menge des markierten Materials, das an die feste Phase gebunden oder nicht gebunden ist. Diese Erfindung basiert auf diesem Befund.
  • Insbesondere wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins geschaffen, das die Schritte umfaßt, daß eine Probe, die das bestimmte Protein enthält, mit einer festen Phase eines Antikörpers oder dessen aktiven Fragmentes, das an einem Träger haftet, in Kontakt gebracht wird, wobei der Antikörper eine spezifische Affinität zu dem bestimmten Protein aufweist, wodurch das bestimmte Protein an die feste Phase selektiv gebunden wird, die Probe und die feste Phase aufgetrennt werden, dann ein markiertes Boronsäurederivat mit Affinität zu der glykierten Stelle des Proteins mit der abgetrennten festen Phase in Kontakt gebracht wird, wodurch eine Markierungssubstanz auf die glykierte Stelle des bestimmten Proteins, das an die feste Phase gebunden ist, gebunden wird, die festen und flüssigen Phasen des umgesetzten Gemisches anschließend aufgetrennt werden und die Menge der Markierungssubstanz in der abgetrennten festen oder flüssigen Phase bestimmt wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins geschaffen, wie oben erwähnt, worin das Boronsäurederivat eine Dihydroxyborylgruppe enthält.
  • Gemäß der Erfindung wird darüberhinaus ein Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins geschaffen, wie oben erwähnt, worin eine Probe aus einer aus extrahiertem Urin, Blut, Plasma und Serum bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
  • Gemäß der Erfindung wird darüberhinaus ein Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins geschaffen, wie oben erwähnt, worin das markierte Boronsäure-Derivat durch Markierung mit einem Bestandteil aus einer Gruppe, die aus einem Isotop, einem Enzym, einem Co-Enzym, einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Chemilumineszenzmittel und einem spezifischem Bindungsprotein besteht, erhalten wird.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren kann das Boronsäure-Derivat hauptsächlich das Amadori-Umlagerungsprodukt (stabil) des glykierten Proteins binden, so daß keine Entfernung der Schiffbasen-Derivate (instabil) des glykierten Proteins durch eine Vorbehandlung der Probe erforderlich ist (Clin. Chem., 28, 10. 2088-2094 (1982)).
  • Wie oben gezeigt, wird das einzig gewünschte bestimmte Protein, wie beispielsweise Albumin oder Hämoglobin, spezifisch von der Testprobelösung abgetrennt. Zu diesem Zweck wird das bestimmte Protein an eine feste Phase eines Antikörpers oder dessen aktiven Fragments, das eine spezifische Affinität zu dem bestimmten Protein aufweist, gebunden und durch eine Immunoreaktion des Antikörpers oder dessen in Bezug auf das bestimmte Protein aktiven Fragments an einem Träger angebracht und das glykierte Protein in dem gebundenen bestimmten Protein anschließend mit einem markierten Boronsäure-Derivat bestimmt (das durch Markierung mit einem Isotop, einem Enzym oder einem anderen Markierungsmaterial an das Boronsäure-Derivat erhalten wurde). So ist es möglich, eine effiziente Bestimmung des Amadori-Umlagerungsproduktes (das aus der Stabilisierung der Schiffbasen-Derivate des glykierten Proteins durch die Amadori-Umlagerung resultiert) vorzunehmen, ohne daß die Herstellung irgendeines Antikörpers erforderlich ist, der nur über spezifische Affinität zum glykierten Protein verfügt.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist ein Graph, der eine Standardkurve zeigt, die die Beziehung zwischen der Extinktion, die auf die Mengenbestimmung des markierten Materials zurückzuführen ist und des Glykationsprozentsatzes des menschlichen Serumalbumins darstellt;
  • Fig. 2 ist eine Veranschalichung, die ein vereinfachtes Modell eines Albuminmoleküls zeigt;
  • Fig. 3 ist eine Veranschaulichung, die ein vereinfachtes Modell eines glykierten Albumin-Moleküls zeigt;
  • Fig. 4 ist eine Veranschaulichfung, die ein vereinfachtes Modell eines Antialbumin-Antikörpers zeigt, der an einen Träger gebunden ist und der das Albumin ungeachtet dessen, ob es glykiert ist oder nicht, einfängt; und
  • Fig. 5 ist eine Veranschaulichung, die ein vereinfachtes Model eines markierten Boronsäurederivats zeigt, das in besonderer Weise nur auf die glykierte Stelle des glykierten Albumins, das von dem in Fig. 4 gezeigten Träger eingefangen ist, gebunden ist.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung wird im folgenden genauer beschrieben. Dies ist jedoch so auszulegen, daß Materialien und Materialgruppen, die im folgenden angegeben sind, keineswegs einschränkend sind.
  • Der erfindungsgemäß verwendeten Antikörper kann beliebig hergestellt worden sein. So kann beispielsweise Antiserum oder Aszites, die von einem Säugetier, wie beispielsweise einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen erhalten wurden und die durch Verabreichung eines bestimmten Proteins immunisiert wurden oder ein daraus gewonnenes Antigen in situ oder nach der Verarbeitung zu einem polyklonalen Antikörper durch ein allgemein bekanntes Verfahren, wie beispielsweise Aussalzen, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Elektrophorese und Affinitätschromatographie, verwendet werden. Außerdem ist es möglich, Antikörper, die aus Hybridzellen (Hybridomas) von Antikörper-Produktzellen (wie beispielsweise Milzzellen und Lymphknotenzellen) von Säugetieren o.a. erhalten und mittels Antigen- und Myelomazellen sensibilisiert wurden, entweder in situ oder nach einer allgemein bekannten Reinigungsart, wie beispielsweise Aussalzen oder unterschiedliche chromatographische Methoden, zu verwenden.
  • Diese Antikörper können in Form ihrer Moleküle verwendet werden oder es ist möglich, ihre aktiven Fragmente (i.e. ihren Teil, von dem das Antigen erkannt wird) wie beispielsweise Fab, Fab'- oder F(ab')2, die durch enzymatische Behandlung hergestellt wurden, zu verwenden.
  • Die Form des festen Trägers kann in Abhängigkeit vom Zweck passend ausgewählt werden. Beispiele der Form sind perlenförmig, testplattenförmig, röhrenförmig, scheibenförmig, sphärisch, stiftenförmig und latexförmig. Das Material des Trägers kann eines sein, das für Träger gewöhnlicher Enzym-Immunoassays (EIA) verwendet wird. Beispiele sind Glas, Polysaccharide (z.B. Cellulose, Dextran, Stärke und Dextrin) oder dessen Derivate, Kieselgel, poröse Keramiken, Metalloxide sowie unterschiedliche synthetische Harze (wie beispielsweise Polymere oder Copolymere von beispielsweise Propyren, Vinylchlorid, Vinylacetat, Vinylpropionat, Acrylsäure, Acrylester, Methacrylsäure, Methacrylester, Styrol, Methylstyrol, Butadien, Isopren, Acrylamid, Acrylonitril, Methacrylonitril und andere). Diese Träger werden entweder in situ oder nach einer Einführung einer reaktiven funktionellen Gruppe, wie beispielsweise Sulfonylgruppe und Aminogruppe mittels allgemein bekannter Mittel verwendet.
  • Der Antikörper kann am Träger auf eine Weise, wie für immobilisierte Enzyme, wie beispielsweise physikalisches Absorptionverfahren, Verfahren der kovalenten Bindung und Vernetzungverfahren, angebracht werden (siehe beispielsweise Ichiro Chibata, "Immobilized Enzyme", herausgegeben 20. März 1975 von Kodansha Company, Seiten 9 bis 75).
  • Das Boronsäure-Derivat kann eine beliebige Struktur mit einer Dihydroxybutyl-Gruppe aufweisen. Beispiele sind 1- Amino-2-Phenylethylboronsäure, 3-[(Aminocarbonyl)amino]phenylboronsäure, 3-Aminophenylboronsäure, 3-(Hydroxy)phenylboronsäure, 2-(Hydroxyamino)phenylboronsäure und das Hydrochlorid von 4-(Hydroxyamino)phenylboronsäure.
  • Besonders geeignet sind Boronsäure-Derivate mit einer Aminogruppe.
  • Als Vernetzungsmittel zur Bindung des Boronsäure-Derivats mit dem Markierungsmaterial zur Herstellung des markierten Boronsäure-Derivats kann Glutaraldehyd, Perjodsäure, Maleimid-Verbindungen (z.B. N-Succinimidyl-2-maleimidoacetat, N- Succinimidyl-4-maleimidobutyrat, N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat und N-Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat) und Dimaleimid-Verbindungen (z B. N,N'-Oxydimethylendimaleimid und N,N'-o-Phenylendimaleimid) verwendet werden.
  • Als Markierungsmaterial zu Markierung des Boronsäure-Derivats kann eins verwendet werden, das häufig für immunologische Assays verwendet wird und vergleichsweise leicht auf die eine oder die andere Weise detektiert werden kann. Spezifische Beispiele des Materials sind Isotope, Enzyme (wie beispielsweise β-Galactosidase, Peroxidase, basische Phosphatase, Glucose-Oxidase und Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase), Substrate von Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. Fluorescein-Derivate, Rhodamin- Derivate und Umbelliferon), chemische Lumineszenzmittel (z.B., Luminol-Derivate und Isoluminol-Derivate), Co-Enzyme und prosthetische Gruppen (z.B., Biotin, Nicotinamide- Adenin-Dinucleotide) sowie spezifische Bindungsproteine (wie beispielsweise Avidin), wobei mit der Bezeichnung "spezifische Bindung" ein Bindungsvermögen an lediglich spezifische Verbindungen gemein ist.
  • Für das Markieren mit einem Isotop kann ein Verfahren verwendet werden, das "Jap. J. Clin. Path.", Spezialausgabe Nr. 53, Seiten 24 bis 25 (1983), herausgegeben am 28. Februar 1983 von Kanahara Shuppan oder "Kensa to Gijutsu", Spezialband 16, Nr. 7, Seiten 581 bis 582 (1988) herausgegeben am 15. Juni 1988 von Igaku Shoin, entspricht. Andere Markierungsverfahren, die verwendet werden können, entsprechen Eiji Ishikawa, Tadashi Kawakami und Kiyoshi Miyai "Enzymeimmunoassay", Nr. 3, Seiten 75 bis 151, herausgegeben am 15. Mai 1987 von Igaku Shoin oder Ichiro Chibata "Immobilized Enzym", Seiten 9 bis 75, herausgegeben am 20. März 1975 von Kodansha Company.
  • Die Probe, (z.B. Testprobelösung), die geprüft werden soll, ist nicht eingeschränkt, solange eine Bestimmung des glykierten Proteins erforderlich ist. Beispiele sind solche, die von lebendem Organismus abstammen und glykiertes Protein enthalten, wie beispielsweise Urin, Blut, Plasma und Serum und Gemische von Protein und Zucker, wie beispielsweise Glukose und Glukose-6-Phosphat. Glykiertes Protein ist im "Jap. J. Clin. Path.", Bd. 33, Nr. 8, Seiten 879 bis 899 (1989) beschrieben.
  • Zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins in einer Probe ist es wichtig, eine Probe zu verwenden, die das bestimmte Protein wenigstens in einer Konzentration enthalten kann, die zur Bindung des bestimmten Proteins an die gesamte fixierte Menge eines Antikörpers oder an dessen an einem Träger angebrachten aktiven Fragment ausreichend ist.
  • Zur Bindung des markierten Boronsäure-Derivats an die glykierte Stelle des glykierten Proteins wird das erstere normalerweise in Form einer Lösung mit pH 8 bis 9 verwendet, die durch Verwendung einer Ammoniumacetatpuffer-Lösung, Morpholin-Salzsäure-Pufferlösung, 2-Amino-2-methyl-propan- 1,3-diol-Salzsäure-Pufferlösung etc. erhalten wurde.
  • Um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, sind in den Fig. 2 bis 5 als Beispiele vereinfachte Reaktionsmodelle von Albumin als dem bestimmten Protein gezeigt.
  • Fig. 2 zeigt ein Model eines Albuminmoleküls. -NH&sub2; deutet eine Aminogruppe des Albumins an. Fig. 3 zeigt ein glykiertes Albumin (welches aus der Amadori-Umlagerung des an die Aminogruppe des in Fig. 3 gezeigten Albumins gebundenen Zuckers resultiert). Fig. 4 zeigt einen Zustand, in welchem der an einem Träger angebrachte Antialbumin- Antikörper Albumin einfängt, ungeachtet dessen, ob das Albumin glykiert ist oder nicht. Fig. 5 zeigt einen Zustand, in welchem ein markiertes Boronsäure-Derivat in besonderer Weise auf die einzige glykierte Stelle des eingefangenen glykierten in Fig. 4 gezeigten Albumins gebunden wird. Das * in Fig. 5 deutet ein Markierungsmaterial an.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Menge des bestimmten Proteins, das an die feste Phase gebunden ist, eine festgelegte Menge, weil eine Probe verwendet wird, die das bestimmte Protein mit mindestens einer Konzentration enthält, die zur Bindung des bestimmten Proteins an die gesamte fixierte Menge eines Antikörpers oder dessen an einem Träger angebrachten aktiven Fragmentes ausreicht. So kann der Glykationsprozentsatz des bestimmten Proteins durch die Bestimmung der Menge des markierten Materials, das an die glykierte Stelle des bestimmten Proteins gebunden ist, gemessen werden, ohne daß eine separate Bestimmung der Gesamtmenge des bestimmten Proteins erforderlich ist. Außerdem erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins exakter, bequemer und in einer kürzeren Zeit im Vergleich mit dem Verfahren des Stands der Technik.
  • Beispiele der Erfindung sind im folgenden gegeben, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, ohne daß dies eine Einschränkung der Erfindung bedeutet.
    • Beispiel 1 (1) Herstellung des nicht enzymatisch glykierten Albumins und nicht glykierten Albumins
  • 50 mg menschliches Serumalbumin (erhältlich von Sigma Chemical Company), 50 mg D-Glucose und 4 mg Natriumborhydrid wurden in 10 mM (wobei M Mol/l ist) Phosphatpuffferlösung mit pH 8,0 aufgelöst und die entstandene Lösung für 10 Tage bei 37ºC gehalten. Dieses Albumin wurde mittels Gelfiltrationschromatographie mit "Sephadex G-25" (erhältlich von Pharmacia Company als gelfiltrationschromatographisches Medium) und 0,25 M Ammoniumacetat- Pufferlöung mit pH 9,0 als Eluent entsalzt, gefolgt von Affinitätschromatographie mit einem Adsorbens mit 3 Amminophenylboronsäure (erhältlich von Aldrich Chemical Company, Inc.), das daran gebunden ist, und mit 0,25 M Ammoniumacetatpufferlösung mit pH 9,0 und 0,25 M Acetatpufferlösung mit pH 4,0 als Eluent. Das Albuminextrakt mit der 0,25 M Ammoniumpufferlösung mit pH 9,0 als Eluent wurden als eine nicht glykierte Albuminfraktion abgetrennt, während das Albuminextrakt mit der 0,25 M Essigsäurepufferlösung mit pH 4,0 als eine nicht enzymatisch glykierte Albuminfraktion abgetrennt wurden. Diese Fraktionen wurden gereinigt.
    • (2) Herstellung des peroxidasemarkierten Phenylboronsäurederivates
  • 4 mg Peroxidase aus dem Meerrettich (von Sigma Company), 16 mg 3-Aminophenylboronsäure und 0,05% Glutaraldehyd wurden gemischt und bei Raumtemperatur für 48 Stunden umgesetzt. Anschließend wurden 2 mg Natriumborhydrid zugefügt und das System für 3 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurde das System mittels Gelfiltrationschromatographie mit "Sephadex G-25" und einer 0,25 M Ammoniumacetatpufferlösung mit pH 9,0 als Eluent entsalzt. Mittels eines Adsorbents, an welches das in (1) hergestellte nicht enzymatisch glykierte Albumin gebunden war, wurde Affinitätschromatographie mit einer 0,25 M Ammoniumacetatpufferlösung mit pH 9,0 und einer 0,25 M Essigsäurepufferlösung mit pH 4,0 als Eluent durchgeführt. Das peroxidasemarkierte Phenylboronsäure-Derivatextrakt mit der 0,25 M Essigsäurepufferlöung mit pH 9,0 wurde abgetrennt und gereinigt.
    • (3) Herstellung des Trägers mit daran angebrachten Antimenschlichem-Serum-Antikörper
  • Um den Anti-menschlichen-Serumalbumin-Antikörper durch Aufbringen auf eine festen Phase, i.e. Polystyrol-Kügelchen, unlöslich zu machen, wurden die Polystyrol-Kügelchen (mit einem Durchmesser von 6,35 mm) mit einer Lösung von Antimenschlichem-Serumalbumin-Antikörper (100 bis 200 ug/ml, 10 mM Phosphatpufferlösung mit pH 7,3) imprägniert und über Nacht bei 4ºC stehengelassen und anschließend in 0,1%-iges Rinder-Serumalbumin (BSA) getaucht und über Nacht bei 4ºC stehengelassen, wobei so ein Träger mit einem darauf angebrachten Anti-menschlichem-Serum-Antikörper (feste Phase) hergestellt wurde.
    • (4) Bestimmung des Glykationsprozentsatzes des menschlichen Serumalbumins
  • Nicht glykiertes Albumin und nicht enzymatisch glykiertes Albumin wurden gemischt, und Proben mit glykierten Albuminprozentsätzen von 10, 20, 40, 60, 80 und 100% durch Einstellen der menschlichen Serumalbumin-Konzentration auf 3 g/dl hergestellt, was der Albumin-Konzentration im Serum eines normalen gesunden Menschen entspricht.
  • 20 ul jeder Probe wurde mit einer physiologischen Salzlösung auf das 100-fache verdünnt, wobei so eine verdünnte Probe erhalten wurde.
  • 500 ul der verdünnten Probe wurde in ein Teströhrchen eingebracht und anschließend im Wasserbad für 5 Minuten bei 37ºC erhitzt. Anschließend wurde der Träger mit dem darauf angebrachten Anti-menschlichem-Serumalbumin-Antikörper in das Teströhren eingebracht und für 5 Minuten umgesetzt. Dann wurde der Träger und die flüssige Phase aufgetrennt und der Träger mit physiologischer Salzlösung gewaschen und mit 400 ul der Lösung des peroxidasemarkierten Boronsäure-Derivats (0,25 M Ammoniumacetat-Pufferlösung mit pH 9,0) bei 37ºC für 30 Minuten umgesetzt. Dann wurde der Träger mit 0,25 M Ammoniumacetat-Pufferlösung mit pH 9,0 gewaschen und mit 500 ul einer 1 mg/ml o-Phenylendiamin-Lösung (welche 0,1 M Phosphat-Citratpufferlösung mit pH 6,0 und 5 mM Wasserstoffperoxid enthielt) bei 37ºC für 10 Minuten umgesetzt. Die Reaktion wurde mit 2,0 ml 1 N Schwefelsäure beendigt und die Extinktion bei 492 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse der Messung sind in Fig. 1 gezeigt. Die auf der Ordinate gezeigten ΔA sind Werte, die durch Subtraktion der Extinktion des Blindwertes korrigiert wurden. Wie in Fig. 1 gezeigt, kann eine Standardkurve erhalten werden, die eine Beziehung zwischen der Extinktion und dem Prozentsatz des glykierten Proteins darstellt. Es hat sich herausgestellt, daß die Extinktion linear proportional zur Zunahme des glykierten Proteinprozentsatzes zunimmt, was eine Möglichkeit einer exakten Bestimmung durch das erfindungsgemäße Anlayseverfahren andeutet.
  • Es hat sich auch herausgestellt, daß die für die Analyse benötigte Zeit etwa 1 Stunde und die erforderliche Probenmenge 20 ul betrug, was eine Möglichkeit der Bearbeitung großer Mengen an Proben in einer kurzen Zeitdauer andeutet, wobei es einer sehr geringen Probenmenge bedarf.
    • Beispiel 2
  • Elektrophoretische Auftrennung von Albumin in einer Serumprobe und Bestimmung des Glykationsprozentsatzes des extrahierten Albumins
    • (1) Elektrophoretische Auftrennung von Albumin
  • Eine Serumprobe wurde durch Zugabe von 5 g D-Glukose zu 10 ml eines eingestellten Standardserums "Moni-Trol II.X" (von American Dade Company) und Stehenlassen des entstandenen Systems für 2 Tage bei 37ºC hergestellt. Ein Teil der Serumprobe wurde mit 10 (Gew./Gew.-%) Polyacrylamid-Gel elektrophorisiert und das Gel anschließend für etwa 1 Stunde in einer wässrigen Trichloressigsäurelösung getaucht, um einen dem Albumin entsprechenden Teil auszuschneiden. Das ausgeschnittene Gel wurde anschließend in ein Teströhrchen gegossen und mit 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung mit pH 7,3 bis zur Neutralität gewaschen. Das Gel wurde dann zerdrückt und das Albumin durch Zentrifugaltrennung extrahiert.
    • (2) Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von Albumin
  • Der Glykationsprozentsatz von Albumin in einer Serumprobe und von Albumin, das aus dem elektrophoretischen Gel extrahiert wurde, wurden in einer Weise, wie in Beispiel 1, bestimmt. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 1 unterhalb angegeben. Tabelle 1 Glykationsprozentsatz (%) Glykation im Serum Albumin extrahiert aus Gel
  • Der Glykationsprozentsatz von Albumin in der Serumprobe und derjenige des aus dem Gel extrahierten Albumins waren im wesentlichen gleich. D.h., daß die Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von Albumin ohne nachteilige Beeinträchtigung durch koexistente Materialien und vergleichbar zu dem Fall, wenn das Albumin einzeln durch Elektrophorese abgetrennt wurde, erhalten werden konnte.
    • Beispiel 3 Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von menschlichem Serumalbumin mittels avidinmarkierten Phenylboronsäure- Derivats und peroxidasemarkiertem Biotin (1) Herstellung des avidinmarkierten Phenylboronsäure- Derivats
  • 2 mg Avidin aus Eiweiß und 8 mg 3-Aminophenylboronsäure wurden in 2 ml einer 0,5 M Boratpufferlösung mit pH 10,5 gelöst und 1 ul eines 25 (Gew./Gew.-%) Glutaraldehyds zur Lösung zugegeben und anschließend für 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach 10 Minuten wurden 500 ul einer 0,25 M Tris-HCl-Pufferlösung zugegeben und die Reaktion beendigt, wobei das Gemisch anschließend noch für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Avidinmarkiertes Phenylboronsäure-Derivat wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 1, gereinigt, wobei sein pH mit 4N-Natriumhydroxid auf 9,0 eingestellt wurde.
    • (2) Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von menschlichem Serumalbumin
  • Proben menschlichen Serumalbumins mit Glykationsprozentsätzen von 0, 50 und 100% wurden in gleicher Weise, wie in Beispiel 1, hergestellt. Das Bestimmungsverfahren für die mittels einer avidinmarkierten Phenylboronsäure- Derivatlösung (0,25 M Ammoniumacetatpufferlösung mit pH 9,0) anstatt des peroxidasemarkierten Phenylboronsäure-Derivats durchgeführt, wobei so Avidin an die glykierte Stelle des glykierten Albumins gebunden wurde. Der Träger wurde mit physiologischer Salzlösung (welche 0,05 (Volumen/Volumen-%) Polyoxyethylensorbitanmonolaurat enthielt) gewaschen und mit einer Lösung aus peroxidasemarkiertem Biotin (von Sigma Company) (2,7 U/ml 0,25 M Ammoniumacetatpufferlösung mit pH 9,0) bei 37ºC für 10 Minuten umgesetzt. Dann wurde die Enzymaktivität in der Weise, wie in Beispiel 1, bestimmt. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Glykationsprozentsatz (%)
  • Der Wert nahm proportional zur Zunahme des Glykationsprozentsatzes (%) zu. Wie gezeigt, war es mittels der spezifischen und selektiven Eigenschaft von Avidin und Biotin als besondere Bindungsproteine möglich, den Glykationsprozentsatz von menschlichem Serumalbumin unter Verwendung eines avidinmarkierten Phenylboronsäure-Derivats und peroxidasemarkierten Biotins zu bestimmen.
    • Beispiel 4 Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von menschlichem Hämoglobin
  • Nicht enzymatisch glykiertes menschliches Hämoglobin und nicht glykiertes menschliches Hämoglobin wurden in gleicher Weise, wie in Beispiel 1, hergestellt, aufgetrennt und gereinigt. Der Glykationsprozentsatz wurde in gleicher Weise, wie in Beispiel 1, bestimmt, außer, daß ein Träger, an dem ein Anti-menschlicher-Hämoglobin-Antikörper angebracht war und eine peroxidasemarkierte Phenylboronsäurederivat-Lösung (2 U/ml) verwendet wurden. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Glykationsprozentsatz (%)
  • Als Ergebnis der Analysen wurde festgestellt, daß die Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von Hämoglobin genauso wie die von Albumin in der Weise, wie in Beispiel 1, möglich war.
    • Beispiel 5 Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von geringen Mengen Albumin im Urin (1) Herstellung einer Standard-Urinprobe
  • Urin wurde durch eine Ultrafiltrationmembran (von Toyo Roshi Company) deproteinisiert. Durch Zugabe eines nicht enzymatisch glykierten Albumins und nicht glykierten Albumins, hergestellt in Beispiel 1, zum deproteinisierten Urin wurden Standard-Urinproben hergestellt.
  • Die Albuminkonzentration wurde auf 5 ug/ml, der Albuminkonzentration eines gesunden Meschen, eingestellt.
    • (2) Bestimmung des Glykationsprozentsatzes von Albumin in Urin
  • Als Probe wurden 400 ul der Urinprobe in ein Teströhrchen eingebracht und zu der Probe 100 ul einer 0,25 M Ammoniumacetat-Pufferlösung mit pH 9,0, welche 2,5 (Gew./Volumen-%) Natriumchlorid und 2,0 (Volumen/Volumen) Polyoxyethylensorbitanmonolaurat enthielt, zugegeben. Der Glykationsprozentsatz wurde in der Weise, wie in Beispiel 1, bestimmt, außer daß die Antigen-Antikörper-Reaktionszeit von 5 Minuten auf 2 Stunden geändert und die Zeit der enzymatischen Reaktion von 10 Minuten auf 30 Minuten geändert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Glykationsprozentsatz(%) Beispiel
  • Aus den Standard-Urinproben mit Glykationsprozentsätzen von 0, 25 und 50 % konnten Standardkurven erhalten werden. Außerdem wurde der Glykationsprozentsatz mit Proben 1 und 2 aus dem Urin eines gesunden Menschen bestimmt, wobei diese im Bereich von etwa 2 bis 4% lagen.
  • Wie oben gezeigt, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins in einer Probe exakt, kurzfristig, bequem und schnell im Vergleich zum Verfahren des Stands der Technik.
  • Außerdem wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch die Verwendung einer Probe, welche ein bestimmtes Protein mit mindestens einer Konzentration enthält, die zum Binden der gesamten fixierten Menge eines Antikörpers oder dessen an einem Träger angebrachten aktiven Fragments ausreicht, daß eine fixierte Menge des bestimmten Proteins an die feste Phase gebunden wird, wobei es so möglich wird, den Glykationsprozentsatz des bestimmten Proteins zu bestimmen, ohne daß eine separate Bestimmung der Gesamtmenge des bestimmten Proteins erforderlich ist, sondern es wird die Menge des an die glykierte Stelle des glykierten Proteins gebundenen oder nicht gebundenen Markierungsmittels durch Verwendung eines markierten Boronsäure-Derivats bestimmt. Außerdem muß das markierte Boronsäure-Derivat, daß für die
  • estimmung erforderlich ist, lediglich in einer gegenüber der Menge des bestimmten Proteins, das an die feste Phase gebunden ist, überschüssigen Menge vorliegen, d.h., daß die Verwendung einer unnötig großen Menge eines markierten Boronsäure-Derivats nicht erforderlich ist, was im Hinblick auf Wirtschaftlichkeit gewünscht wird.

Claims (4)

1. Verfahren zur Bestimmung des Glykationsprozentsatzes eines bestimmten Proteins, das die Schritte umfaßt, daß eine Probe, die das bestimmte Protein enthält, mit einer festen Phase eines Antikörpers oder dessen aktiven Fragmentes, das an einem Träger haftet, in Kontakt gebracht wird, wobei der Antikörper eine spezifische Affinität zu dem bestimmten Protein aufweist, wodurch das bestimmte Protein an die feste Phase selektiv gebunden wird, die Probe und die feste Phase aufgetrennt werden, dann ein markiertes Boronsäurederivat mit Affinität zu der glykierten Stelle des Proteins in Kontakt gebracht wird, wodurch eine Markierungssubstanz auf die glykierte Stelle des bestimmten Proteins gebunden wird, die festen und flüssigen Phasen des umgesetzten Gemisches anschließend aufgetrennt werden und die Menge der Markierungssubstanz in der festen oder flüssigen Phase bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Boronsäure-Derivat eine Dihydroxyborylgruppe enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Probe aus einer aus Urin, Blut, Plasma oder Serum bestehenden Gruppe stammt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das markierte Boronsäure-Derivat mit einem Bestandteil, das aus der aus Isotopen, Enzymen, Coenzymen, Fluoreszenzfarbstoffen, Chemilumineszenzmitteln und spezifischen Bindungsproteinen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, markiert ist.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9024771D0 (en) * 1990-11-14 1991-01-02 Axis Research Assay
GB9024775D0 (en) * 1990-11-14 1991-01-02 Axis Research Chemical compounds
US6162645A (en) * 1997-03-13 2000-12-19 Abbott Laboratories Determination of % glycated hemoglobin
US6316265B1 (en) 1997-03-13 2001-11-13 Abbott Laboratories Determination of % glycated hemoglobin
KR100377336B1 (ko) * 2000-11-17 2003-03-26 학교법인 카톨릭학원 엔-포밀-리신의 제조방법 및 이를 이용한 글리케이션화단백질의 분석방법
US7195923B2 (en) 2001-01-31 2007-03-27 Scripps Laboratories, Inc. Ratiometric determination of glycated protein
DE10350880A1 (de) 2003-10-31 2005-06-02 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Bestimmung eines Analyten mittels einer Extraktionsschicht
US20070015291A1 (en) 2005-07-18 2007-01-18 Smith Henry J Rapid test for glycated albumin in blood
WO2008016193A1 (en) 2006-07-29 2008-02-07 I-Sens, Inc. Electrochemical determination system of glycated proteins
KR101005559B1 (ko) 2008-07-15 2011-01-05 주식회사 아이센스 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치
TWI472755B (zh) * 2012-03-06 2015-02-11 Univ Nat Central 利用交流阻抗法量測糖化蛋白比例之方法
MX2016012055A (es) 2014-03-20 2017-04-13 Bio Rad Laboratories Inc Ensayos de proteinas glicosiladas.
EP3397971B1 (de) 2015-12-30 2021-08-04 W. Health L.P. Verfahren zur bestimmung der menge von hba1c in einer blutprobe

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4269605A (en) * 1978-06-28 1981-05-26 Amicon Corporation Method and kit for separation of glycoproteins
US4861728A (en) * 1987-07-24 1989-08-29 Becton, Dickinson And Company Immunoassay of glycosylated hemoglobin using a labeled boron reagent

Also Published As

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EP0455225A2 (de) 1991-11-06

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