KR100377336B1

KR100377336B1 - 엔-포밀-리신의 제조방법 및 이를 이용한 글리케이션화단백질의 분석방법

Info

Publication number: KR100377336B1
Application number: KR10-2000-0068488A
Authority: KR
Inventors: 주천기; 이광원; 이석종; 김정아; 김장현
Original assignee: 학교법인 카톨릭학원
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2003-03-26
Also published as: KR20020038326A

Abstract

본 발명은 L-리신 염산과 [¹⁴C]-L-리신을 포름산에 용해시킨 후 아세트산무수물과 반응시키는 단계와, 상기의 반응액을 수산화칼륨용액과 반응시킨 후 증발, 여과시키는 단계와, 상기의 여과액을 양이온교환컬럼에 용리시켜 분취하여 N-포밀-리신을 분리한 후 정성하는 단계와, 상기의 N-포밀-리신 분취액을 결정화시키는 단계로 구성되는 [¹⁴C]-N-포밀-리신의 제조방법과 단백질 분석시료, 당류, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 및 [¹⁴C]-N-포밀-리신을 혼합하여 여과한 후 배양하는 단계와, 상기의 배양된 반응혼합액을 채취하여 여과지에 점적하여 트리클로로아세트산으로 세척하여 건조시키는 단계와, 상기의 건조된 반응혼합물을 액체 신틸레이션 계수기로 측정하는 단계로 구성되는 [¹⁴C]-N-포밀-리신를 이용한 글리케이션화 단백질의 분석방법을 제공함으로써 단백질 변성 억제활성을 가진 천연물을 효과적으로 탐색하고 이를 통하여 상품화할 수 있으며, 단백질 변성을 쉽게 측정할 수 있는 키트(kit)를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

엔-포밀-리신의 제조방법 및 이를 이용한 글리케이션화 단백질의 분석방법{Method for the preparation of N-formyl-lysine and the analysis of glycation induced-protein crosslinking assay thereby}

본 발명은 [¹⁴C]-N-포밀-리신(N-formyl-lysine)의 제조방법 및 이를 이용한 글리케이션화 단백질의 분석방법에 관한 것으로써, 특히 단백질의 글리케이션(glycation)반응이 진행됨에 따라 형성되는 단백질의 교차결합(crosslink) 정도를 화학적으로 합성한¹⁴C로 균일하게 표식된 N-포밀-리신으로 정확하게 정량화할 수 있는 분석방법에 관한 것이다.

단백질 변성반응 가운데 대표적인 글리케이션 반응은 단백질의 아미노기가당류의 알데히드기와 쉬프 염기(Schiff base)를 형성하여 아마도리(Amadori) 재전위를 통하여 비효소적으로 변성과정을 거치게 되는 것을 말한다. 글리케이션 반응이 계속 진행되면 고리화반응, 분열, 탈수와 산화반응 과정을 통하여 영구적으로 변성되고, 형광성, 단백질 교차결합등의 특이적이고 복잡한 성질을 가진 최종 산물인 개량된 글리케이션 종말산물(Advanced Glycation End products ; AGEs)이 만들어지게 된다. 이러한 비효소-글리케이션 반응은 콜라겐(collagen), 크리스탈린(crsystallin)과 같이 오래 유지되는 단백질에서 진행되는 중요한 변성반응이며 백내장, 당뇨 합병증, 동맥질환과 치매의 발병 기전에 관여할 수 있다는 보고들이 잇따르고 있다.

글리케이션 반응이 진행되는 동안 단백질 교차결합 정도를 예측하기 위해서 여러 가지 방법이 사용되어 왔다.

첫째로, SDS-PAGE( Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)를 이용한 방법으로서 SDS-PAGE는 분리되는 물질의 크기에 따라서 아크릴화된 겔에서 적은 분자량의 것이 먼저 이동하여 분리하게 되는 원리를 이용하는 것이다.(Laemmli,U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, 680-685, 1970). 그러나 글리케이션화된 단백질에는 겔착색(gel staining) 정도가 약하게되고 고분자량을 지닌 중합체 단백질은 SDS-PAGE의 전개 겔의 상단 부분에 압축된 형태로 걸리기 때문에 겔 스케너의 유효범위를 벗어나는 단점이 있어 정량화 방법으로는 한계가 있다.

둘째로, 형광 분석을 이용한 방법으로서 구체적인 예로 미합중국 공개특허 제 5877025호는 글리케이션화된 단백질의 용액상 분석방법에 관한 것으로서 글리케이션화된 단백질 시료와 보론산(boronic acid)기를 포함하는 광냉광(photoluminescent)또는 화학냉광(chemiluminescent) 화합물의 반응을 이용하는 방법에 대하여 개시되어 있다. 그러나 상기의 방법은 단백질 교차결합도를 측정할 수 이는 유효한 방법이나 다른 글리케이션 종말 산물도 함께 측정되며 관련된 아미노산인 리신의 확인이 어렵다는 두 가지 문제점이 있다.

셋째로 아미노산 분석을 이용한 방법으로서, 정량 하고자 하는 단백질을 6N의 염산(HCl)에 넣고 20시간동안 110℃에서 산 가수분해를 시켜서 얻은 아미노산을 액체 크로마토그래피로 분석하는 방법이다.( C. W. Gehrke, P.P. Rexroad, R.M. Schisla, R.M. Absheer, R.W. Zumwalt, Quantitative analysis of cystine, methionine, Lysine and nine amino acids by a single oxidation-4-hour hydrolysis method, J Ass. off. Anal. chem. 70(1987)171-174.) 상기의 방법은 단백질변성되면 해당 아미노산이 검출되지 않는다. 따라서 변성된 아미노산의 정성이 가능하지만 글리케이션화된 종말산물은 산 분해에 약하기 때문에 변성정도를 확인할 수 없는 문제점이 있다.

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로써, 본 발명의 목적은 화학적으로 합성한¹⁴C로 균일하게 표식된 N-포밀-리신의 제조방법을제공하는 것이며, 또한 [¹⁴C]-N-포밀-리신을 이용하여 글리케이션화된 단백질의 교차결합 정도를 정량화할 수 있는 분석방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 의해 합성한 [¹⁴C]N-포밀-리신을 박층크로마토그래피로 전개하여 확인한 후 측정한 방사선사진(Autoradiogram).

도 2는 실시예 1-3의 수정체 단백질의 교차결합도를 분석한 결과를 나타낸 그래프.

상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 L-리신 염산과¹⁴C-L-리신을 포름산에 용해시킨 후 아세트산무수물과 반응시키는 단계와, 상기의 반응액을 수산화칼륨용액과 반응시킨 후 증발, 여과시키는 단계와, 상기의 여과액을 양이온교환컬럼에 용리시켜 분취하여 N-포밀-리신을 분리한 후 정성하는 단계와, 상기의 N-포밀-리신 분취액을 결정화시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 [¹⁴C]-N-포밀-리신의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명을 단백질 분석시료, 당류, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 및 [¹⁴C]-N-포밀-리신을 혼합하여 여과한 후 배양하는 단계와, 상기의 배양된 반응혼합액을 채취하여 여과지에 점적하여 트리클로로아세트산으로 세척하여 건조시키는 단계와, 상기의 건조된 반응혼합물을 액체 신틸레이션 계수기로 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 [¹⁴C]-N-포밀-리신를 이용한 글리케이션화 단백질의 분석방법을 제공한다.

이하, 상기한 [¹⁴C]-N-포밀-리신의 제조방법에 대하여 각 단계별로 살펴보면 다음과 같다.

첫 번째 단계는 L-리신 염산과 [¹⁴C]-L-리신을 포름산에 용해시킨 후 아세트산무수물과 반응시키는 단계로서, L-리신 염산(L-Lysine·HCl)을 0.292g과 1 mCi의¹⁴C로 균등하게 표식된 [¹⁴C]-L-리신을 96% 포름산(formic acid) 4㎖가 들어있는 플라스크에 녹인 후 얼음에서 냉각하면서 2㎖의 아세트산무수물(acetic anhydride)을 0.4㎖씩 10분 간격으로 천천히 1시간 안에 저어주면서 다 넣는다. 아세트산무수물을 다 넣은 후 실온에서 2시간 동안 저어준 후 10㎖의 냉각수를 넣고 1시간 동안 또다시 실온에서 저어준다.

두 번째 단계는 첫 번째 단계의 반응액을 수산화칼륨용액과 반응시킨 후 증발, 여과시키는 단계로서, 0.112g의 KOH를 99.9% 메탄올에 녹여 상온에서 저어준 용액과 첫 번째 단계의 반응액을 혼합한 후 회전증발기(Rotary evaporator)에 넣고 증발시킨다. 이 과정에서 염화칼륨(KCl) 결정이 생성되면 메탄올을 넣어 하얀 결정인 KCl과 용액을 분리하여 결정은 버리고 용액만 메탄올에 녹여 시럽형태가 될 때까지 3∼5회 정도 반복하면서 용액과 하얀 결정을 분리한다. 2∼3 ㎖의 증류수를 넣어 시럽형태를 용액으로 만든 후, 0.2㎛ 친수성 여과지로 거른다.

세 번째 단계는 양이온교환컬럼에 용리시켜 분취하여 N-포밀-리신을 분리한 후 정성하는 단계로서, 두 번째 단계에서 합성한 반응액 속에는 N-포밀-리신, N-디-포밀-리신과 리신이 함께 존재하므로 양이온교환수지(Amberite IR-120)를 이용하여 N-포밀-리신을 분리한다. 두 번째 단계의 반응액을 양이온교환컬럼에 넣어준 다음 증류수 100 ㎖로 컬럼을 세척한 후, 100 ㎖의 0.2 M 피리딘(pyridine)으로컬럼을 용리(elution)시키면서 4㎖ 분획으로 시료를 수집한다. 상기의 양이온교환 수지는 다음과 같은 방법으로 활성화시킨다. 양이온교환 수지에 피리딘을 넣어준 후, 피리딘 상등액을 버리고 증류수로 수지를 2회 세척한 후 수지(약 40㎖)를 컬럼에 가하고 증류수로 용리액(eluent)의 pH가 증류수의 pH와 가깝게 될 때까지 세척한 다음 3㎖의 아세트산(acetic acid)과 15㎖의 증류수를 혼합한 용액을 넣어 컬럼에 넣고 다시 증류수로 용리액의 pH가 증류수의 pH가 될 때까지 세척한다.

N-포밀-리신을 함유하고 있는 분획을 확인하기 위하여 각각의 분획을 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)판에 점적하여 용매(n-부탄올:아세트산:물=3:1:1)로 전개한 다음 TLC판을 건조시킨 다음, 발색재(0.5 g 과망간산칼륨(potassium permanganate)/100㎖ 1N NaOH)를 TLC판에 분무시켜서 노란색 점이 나온 N-포밀-리신을 R_f값으로 확인한다. 도 1에 [¹⁴C]N-포밀-리신을 TLC로 전개하여 확인한 후 방사선사진(Autoradiogram)으로 확인한 결과를 나타내었다.

네 번째 단계는 N-포밀-리신 분취액을 결정화시키는 단계로서, N-포밀-리신을 함유한 분획 시험관(tube)을 합치고 이를 메탄올과 함께 회전증발기에서 증발시킨다. 갈색 시럽이 형성된 후 하얀 결정이 생성되면 메탄올을 넣고 2∼3회 반복하여 증발시킨 후 다시 이소프로판올를 넣고 증발시킨다. 마지막으로 메탄올을 넣고 증발시킨 후 수분이 완전히 날아간 상태의 하얀 결정이 형성되면 최종적으로 갈색 병에 담아 4℃에 보관한다.

단백질 구성 아미노산 가운데 α위치에 있는 아미노기는 펩타이드 결합에 이용되므로 반응에 참여할 수 없기 때문에 단백질의 글리케이션 반응에 의한 교차결합은 단백질의 구성 아미노산 중 화학식 1에 나타낸 리신의 ε위치에 있는 아미노기가 반응한다.

리신의 α위치에 있는 아미노기를 포밀기(-CHO)로 막은 화학식 2의 N-포밀-리신을 제조하여 단백질 분석시료에 첨가하면 단백질이 글리케이션 반응에 의하여 교차결합될 때 N-포밀-리신도 같이 교차결합되므로 표식된 [¹⁴C]-N-포밀-리신을 사용하여 혼입(incorporation)되는 정도에 따라 교차결합도를 정확하게 정량할 수 있게 된다.

이하, [¹⁴C]-N-포밀-리신를 이용한 글리케이션화 단백질의 분석방법을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

1 ㎖의 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer,pH 7.0)에 5mg의 수정체 단백질, 당류인 10 mM 트레오즈(threose), 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylene triaminepentaacetic acid, DTPA) , 2 μCi의 [¹⁴C]N-포밀-리신을 포함하는 반응혼합액을 0.2μ여과지를 사용하여 주사여과한 후 2㎖의 살균 저온용바이엘(cryogenic vial)에 넣은 다음, 37°C 배양기에 넣는다. 이 바이엘은 5일간 밀폐된 채로 있게 된다.

반응혼합물을 매일 50㎕씩 3번 채취하여 2.5㎝ 지름의 여과지 (Whatman 3 MM)에 각각 점적하여 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 세척한다. (Title: Measurement of the Incorporation of Radioactive Amino Acids intoProtein by a Filter-Paper Disk Method, Author: Rustry J. Mans and G. David Novell, Archives of Biochemistry Biophysics). 세척한 후 여과지를 완전히 건조한 다음 [¹⁴C]N-포밀-리신의 혼입(incorporation)도를 액체 신틸레이션 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 측정함으로써 단백질 교차결합도를 분석한다.

대조군 시료로서 1 ㎖의 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer,pH 7.0)에 5mg의 수정체 단백질, 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylene triaminepentaacetic acid, DTPA) , 2 μCi의 [¹⁴C]N-포밀-리신의 반응혼합액을 준비한 후 상기한 방법대로 동일하게 분석한다.

<실시예 2>

1 ㎖의 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer,pH 7.0)에 5mg의 수정체 단백질, 10 mM 트레오즈(threose), 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylene triaminepentaacetic acid, DTPA), 2 μCi의 [¹⁴C]N-포밀-리신, 10mM 아미노 구아니딘(amino guanidine) 포함하는 반응혼합액을 상기한 실시예 1과 동일한 방법으로 분석한다.

<실시예 3>

1 ㎖의 0.1M 인산완충용액(phosphate buffer,pH 7.0)에 5mg의 수정체 단백질, 10 mM 트레오즈(threose), 1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA) , 2 μCi의 [¹⁴C]N-포밀-리신, 10mM 디티오트레톨(dithiothretol) 포함하는 반응혼합액을 상기한 실시예 1과 동일한 방법으로 분석한다.

수정체 단백질의 교차결합도를 분석한 결과를 도 2에 나타내었으며 도 2의 결과로 부터 실시예 2의 10mM 아미노 구아니딘과 실시예 3의 10mM 디티오트레톨은 20mM 트레오즈에 의한 단백질의 교차결합도를 약 50% 억제하는 역할을 함을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의해 [¹⁴C]-N-포밀-리신를 이용하여 단백질의 글리케이션 반응이 진행됨에 따라 형성되는 단백질의 교차결합도를 정량 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 약제, 천연물, 화학물질, 식용품 등이 갖는 단백질변성에 대한 억제능력을 정확하고 간편하게 조사할 수 있다. 또한 단백질 변성 억제활성을 가진 천연물을 효과적으로 탐색하고 이를 통하여 상품화할 수 있으며, 단백질 변성을 쉽게 측정할 수 있는 키트(kit)를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

L-리신 염산과¹⁴C-L-리신을 포름산에 용해시킨 후 아세트산무수물과 반응시키는 단계와, 상기의 반응액을 수산화칼륨용액과 반응시킨 후 증발, 여과시키는 단계와, 상기의 여과액을 양이온교환컬럼에 용리시켜 분취하여 N-포밀-리신을 분리한 후 정성하는 단계와, 상기의 N-포밀-리신 분취액을 결정화시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 [¹⁴C]-N-포밀-리신의 제조방법.
단백질 분석시료, 당류, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 및 [¹⁴C]-N-포밀-리신을 인산완충용액(pH 7.0)에 혼합한 반응액을 여과한 후 배양하는 단계와, 상기의 배양된 반응혼합액을 채취하여 여과지에 점적하여 트리클로로아세트산으로 세척하여 건조시키는 단계와, 상기의 건조된 반응혼합물을 액체 신틸레이션 계수기로 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 [¹⁴C]-N-포밀-리신을 이용한 글리케이션화 단백질의 분석방법.