CN112142639B - 一种基于醛基的手性氨基酸识别探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于醛基的手性氨基酸识别探针及其制备方法和应用，包括：称取脯氨酸、碳酸钾，倒入四氢呋喃溶液，冰水浴中滴入苯甲酰氯，一定温度下反应2～5小时，旋干后用盐酸调节pH至析出白色絮状物，使用乙酸乙酯萃取并旋干得到第一步产物。称取N,N'‑二环己基碳二亚胺、4‑二甲氨基吡啶和4‑氯水杨醛，用二氯甲烷溶解，滴加到第一步产物中反应3～5小时。抽滤并旋干后，通过硅胶柱和手性色谱柱进一步纯化制备得到基于醛基的手性氨基酸识别探针，并将其应用于生物体液样本中手性氨基酸的靶向分离定量与伯胺类化合物的非靶向扫描中。最低检测限可达0.001umol/L，灵敏度高，准确度高。

Description

一种基于醛基的手性氨基酸识别探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基于醛基的手性氨基酸识别探针及其制备方法和应用，属于生物体液样本中手性氨基酸的分离与定量领域。
背景技术
手性是自然界的基本属性，手性化合物互成镜像，但相互不能重叠。随着近年来越来越多的研究结果表明手性代谢物具有不同的生理功能和潜在毒性，手性代谢组学成为广泛关注的研究对象。手性氨基酸是代谢组学中的重要成分，因此分离并定量复杂生物基质中的手性氨基酸，对新药发现、疾病标志物的筛选、阐释生理功能具有重要的意义。除甘氨酸之外，其他氨基酸均具有R和S手性构型。研究已发现R型丝氨酸、R型天冬氨酸与阿尔兹海默症等神经退行性疾病的发病机理相关；R型丙氨酸在胃癌病人的胃液中的含量比正常人的显著增高，或对胃癌的发病机理阐释起到关键性作用。然而由于生物体液中的天然R型氨基酸含量很低，又受到生物基质中的多种内源性成分的干扰，加上这些手性氨基酸大多不具有发色团，极性大，传统的色谱柱难以保留，其分离与检测难度不言而喻。已有各种基于衍生方法的毛细管电泳、液相色谱、气相色谱及其质谱联用技术应运而生。其中，液质联用技术具有灵敏度高、特异性好、分辨率高、高通量等优点，是对复杂生物基质进行各种代谢组学分析的强大武器，在化学、医药、生物等研究领域广泛应用。
醛基可与氨基酸反应生成希夫碱，已有报道基于醛基的手性胺识别探针BPBr和BPB。BPB未开发液质联用方法，使得目标氨基酸的分析易受到复杂的生物基质的影响，不能准确定量生物样本中手性氨基酸的含量。BPBr能够在温和条件下结合液质联用技术成功对生物样本中的伯胺类化合物进行分离和检测，显示了该探针的有效性和优越性。然而目前已开发的衍生试剂和分析方法还存在诸如难以克服基质效应、检测灵敏度不够高等问题，所以对于灵敏的有效的手性氨基酸识别探针的需求仍然迫切。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种检测灵敏度高和准确度好的基于醛基的手性氨基酸识别探针及其制备方法和应用，通过借助液质联用技术实现靶向分离定量生物体液样本中的手性氨基酸与非靶向扫描伯胺类化合物。
基于上述目的，本发明提供一种基于醛基的手性氨基酸识别探针，所述探针的结构式为：
Figure BDA0002615281100000021
本发明还提供了上述的基于醛基的手性氨基酸识别探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取脯氨酸、碳酸钾放入反应容器中，倒入四氢呋喃溶液，在冰水浴中缓慢向反应容器中滴入苯甲酰氯，将混合物在一定温度下搅拌反应2～5小时，将反应液旋转蒸发除去溶剂。加入少量纯净水溶解，用盐酸调节pH至析出白色絮状物，使用乙酸乙酯萃取目标中间体，合并乙酸乙酯层的溶液，加入无水硫酸钠除水后，旋转蒸发后得到第一步产物。
(2)称取N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和4-氯水杨醛，用二氯甲烷溶解后，缓慢加入到第一步的产物中反应，将混合物在一定温度下回流反应3～5小时。反应结束后抽滤，将滤液旋转蒸发后得到淡黄色油状产物，通过硅胶柱和手性色谱柱进一步纯化制备后得到基于醛基的手性氨基酸识别探针。
反应过程为：
Figure BDA0002615281100000022
Figure BDA0002615281100000031
优选地，步骤(1)中，以摩尔比计，所述的脯氨酸：苯甲酰氯：碳酸钾＝0.8～1.5:0.8～1.5:1.5～3.8。
优选地，步骤(1)中，所述的脯氨酸的物质的量(mmol)与四氢呋喃的体积之比(mL)＝0.8～1.2:4～7。
优选地，步骤(1)中，所述的搅拌反应的温度为10～25℃。
优选地，步骤(2)中，以摩尔比计，所述的N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)：4-二甲氨基吡啶(DMAP)：4-氯水杨醛的摩尔比＝1～2:0.2～0.4:1.2～2.2。
优选地，步骤(2)中，所述的回流反应的温度为30℃～40℃。
同时，本发明还提供了所述的基于醛基的手性氨基酸识别探针在靶向分离定量生物体液样本中的手性氨基酸与非靶向扫描伯胺类化合物中的应用。
优选地，基于醛基的手性氨基酸识别探针在靶向分离定量生物体液样本中的手性氨基酸与非靶向扫描伯胺类化合物中的应用，包括以下步骤：
(1)基于醛基的手性氨基酸识别探针溶解于乙腈中作为储备液，储备液的浓度为4～12mmol/L。
(2)取步骤(1)中的探针储备液和经前处理后的生物体液样本，在乙腈溶液中常温反应20～360分钟。
(3)借助液质联用技术和MRM模式(多反应监测模式)，实现基于醛基的手性氨基酸识别探针对生物体液中的手性氨基酸的靶向定量和伯胺类化合物的非靶向扫描。
优选地，步骤(2)中，所述的生物体液样本为唾液、尿液或血液中的至少一种。
将其应用于生物体液样本中手性氨基酸的靶向分离定量与伯胺类化合物的非靶向扫描中。最低检测限可达0.001umol/L，灵敏度高，准确度高。
本发明所达到的有益效果：
1、本发明提供的基于醛基的手性氨基酸识别探针BPCl，是一种在乙腈溶液中溶解性和稳定性都良好的新化合物，由脯氨酸的刚性结构提供了手性选择轴，苯环上的醛基可以与手性氨基酸快速识别并反应，脯氨酸N上的大体积保护基团形成空间位阻效应利于识别不同手性构型的氨基酸类化合物，同时有利于生成的非对映异构体通过液相色谱在C18色谱柱上保留并分离。通过结构上引入天然同位素氯原子，借助天然同位素35Cl和37Cl的比例近似为3：1，不但可以实现对天然体液样本中的手性氨基酸在质谱上进行靶向扫描并准确定量，而且也可以对天然体液样本中的伯胺类化合物进行非靶向扫描(醛基与氨基反应)。由于探针与手性氨基酸的结合产物中有四分之三的氯同位素含量被用于定量，而之前的探针BPBr只有二分之一的溴同位素含量被用于定量，加上氯原子与溴原子标记的探针的反应活性不同，使得探针BPCl对手性氨基酸的检测限浓度是探针BPBr的检测限的1/50～1/1.2，最低检测限可达0.001umol/L。因此探针BPCl的检测限更低，灵敏度更高，检测优势增加。另外，由于该探针在检测灵敏度和反应活性的突出优势，与之前的探针BPBr相比，该探针不仅可以分析蛋白氨基酸，还可以分离与定量生物样本中的微量非蛋白质氨基酸(如瓜氨酸、2-氨基丁酸、高丝氨酸、高半胱氨酸)。
2、本发明提供的基于醛基的手性氨基酸识别探针BPCl的制备方法，原料成本低廉，合成步骤简便易操作，反应条件温和，通过两步合成路线以及后续的硅胶柱纯化和手性色谱柱制备得到了能够识别手性氨基酸的基于醛基的探针，纯度大于99％。
3、本发明提供的基于醛基的手性氨基酸识别探针BPCl的应用，将上述制备得到的基于醛基的手性氨基酸识别探针应用于天然体液样本(唾液、血浆和尿液)的手性蛋白和非蛋白氨基酸的靶向定量和伯胺类化合物的非靶向扫描中，借助液相色谱-质谱联用技术，将目标化合物与内源性成分分离，消除基质效应的影响，成功实现对手性蛋白和非蛋白氨基酸类化合物进行分离与靶向定量。由于反应动力学差异，BPCl与相同构型的手性蛋白和非蛋白氨基酸反应后产物的质谱峰面积大于相反构型的手性氨基酸。即在相同浓度下，(R)-BPCl与R构型氨基酸产物的质谱峰面积会大于与S构型氨基酸产物的质谱峰面积，因此，对于监测生物体液样本中的微量R构型氨基酸的含量具有显著的优势，可选择性地放大微量R构型氨基酸的质谱峰面积响应。并且根据质量数差值为2和峰面积比值近似为3可排除非靶向扫描中的假阳性结果，灵敏度高，重现性好，准确度高，稳定性好。为了可以在非靶向扫描中得到更多伯胺类化合物的信息，可以结合使用(S)-BPCl对生物体液样本再进行扫描，获取更全面的信息，(R)-BPCl和(S)-BPCl只是本身构型和选择性增强质谱响应的氨基酸构型不同，在应用方面，二者适用于相同的液相-质谱联用方法。
附图说明
图1为本发明中(R)-BPCl探针的高效液相色谱图(254nm)；
图2为本发明中BPCl探针的核磁氢谱图；
图3为本发明中BPCl探针的核磁碳谱图；
图4为本发明中(R)-BPCl探针与标准溶液中酪氨酸(Tyr)、2-氨基丁酸(2-Abua)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和瓜氨酸(Cit)反应后产物的质谱多反应监测(MRM)谱图；
图5为本发明中(R)-BPCl探针与(R)-BPBr对谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)的检测限比较图；
图6为本发明中(R)-BPCl探针与标准溶液中苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)反应后产物的标准曲线图；
图7为本发明中(R)-BPCl探针与标准溶液、尿液、血浆和唾液中R和S构型的缬氨酸(Val)反应后产物的标准曲线图；
图8为本发明中(R)-BPCl探针与标准溶液、尿液和血浆中的丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)反应后产物的质谱多反应监测(MRM)谱图；
图9为本发明中(R)-BPCl探针测得的尿液中R和S构型的丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)的含量值；
图10为本发明中(R)-BPCl探针测得的血浆中R和S构型的丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)的含量值；
图11为本发明中(R)-BPCl探针的与唾液中丙氨酸(Ala)和甲硫氨酸(Met)反应后产物的质谱色谱图；
图12为本发明中(R)-BPCl探针测得的唾液中R和S构型的丙氨酸(Ala)和甲硫氨酸(Met)的含量值；
图13为本发明中(S)-BPCl探针对尿液、血浆和唾液进行以m/z 218(-)为子离子的非靶向扫描得到的伯胺类化合物的质谱总离子流图；
图14为本发明中(S)-BPCl探针与尿液反应得到的分别以m/z 218(-)和m/z 105(+)为子离子的伯胺类化合物的质谱多反应监测(MRM)谱图，根据质量数差值为2和峰面积比值近似为3来排除假阳性结果，标记星号的峰即为符合条件的伯胺类化合物。
具体实施方式
下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明地保护范围。
实施例1：制备基于醛基的手性氨基酸识别探针，步骤如下：
(1)称取6mmol光学纯脯氨酸、15mmol碳酸钾放入反应容器中，倒入四氢呋喃溶液30mL，在冰水浴中缓慢向反应容器中滴入7mmol苯甲酰氯，将混合物在16℃下搅拌反应3小时，在40℃下将反应液旋转蒸发除去溶剂。加入少量纯净水溶解，用盐酸调节pH至析出白色絮状物，使用乙酸乙酯萃取目标中间体，合并乙酸乙酯层的溶液，加入无水硫酸钠除水后，在40℃下旋转蒸发得到第一步产物。
(2)称取8mmol N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、1.2mmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和10mmol 4-氯水杨醛，用二氯甲烷溶解后，缓慢加入到第一步的产物中反应，将混合物在35℃下回流反应3.5小时。反应结束后抽滤，将滤液旋转蒸发后得到淡黄色油状产物，通过硅胶柱和手性色谱柱进一步纯化制备后得到基于醛基的手性氨基酸识别探针。通过高效液相色谱法对目标探针进行纯度鉴定，借助核磁共振(NMR)分析对目标探针进行结构鉴定。
如图1所示的(R)-BPCl的高效液相色谱图(254nm)，从图中可知，(R)-BPCl探针的纯度大于0.99。
如图2所示的BPCl的核磁氢谱图，从图中可知，1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ＝10.1793(s,1H),7.8541-7.8375(d,1H),7.6037-7.5899(d,2H),7.4633-7.4101(m,3H),7.3869-7.3703(d,1H),7.3525(s,1H),4.8968-4.8684(dd,1H),3.7677-3.7197(m,1H),3.6690-3.3.6226(m,1H),2.5602-2.4903(m,1H),2.4123-2.3470(m,1H),2.2278-2.1498(m,1H),2.0655-2.0125(m,1H)ppm。
如图3所示的(R)-BPCl的核磁碳谱图，从图中可知，13C NMR(500MHz,CDCl3)δ＝188.0555,170.6098,170.1541,152.4269,141.4116,135.6989,131.3727,130.7990,128.5926,127.5667,127.3619,127.1787,124.3216,59.7159,50.2582,29.4454,25.9425ppm。
应用实施例1：基于醛基的手性氨基酸识别探针结合液相色谱质谱联用技术分离手性氨基酸
配制R和S构型氨基酸比例为1：1的各10mmol/L的氨基酸混合标准溶液以及5mmol/L的(R)-BPCl储备液。向氨基酸标准溶液中加入氘代内标Phe-d5、Trp-d5、Val-d8溶液充分混匀，取氨基酸混合标准溶液、PBS7.0缓冲溶液和乙腈按照1：1：2的体积比例充分混匀，取10uL混合溶液与(R)-BPCl探针在乙腈中反应25分钟。取5uL反应液进液相色谱-质谱联用仪器中分析。使用150mm*4.6mm*3.5um的C18色谱柱，选择负离子MRM模式监测各种氨基酸的质谱峰响应信号。以酪氨酸(Tyr)、2-氨基丁酸(2-Abua)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和瓜氨酸(Cit)为例，这几种氨基酸的R和S构型的探针反应产物在C18柱上分离良好，R构型的探针结合产物都比S构型的探针结合产物晚出峰，且R构型的探针结合产物的质谱峰面积都大于S构型的探针结合产物的质谱峰面积，显示(R)-BPCl探针对R构型氨基酸的质谱信号选择性放大的优势。这几种氨基酸的色谱峰分离度Rs值范围为0.9～3.1，手性区分值范围为3.31～6.67。其他氨基酸在该方法条件下也得到良好的液相色谱分离度和质谱手性区分值，且重复性良好。图4为(R)-BPCl探针与标准溶液中酪氨酸(Tyr)、2-氨基丁酸(2-Abua)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和瓜氨酸(Cit)反应后产物的质谱多反应监测(MRM)谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为质谱峰强度。不断降低氨基酸混合标准溶液的浓度直至各手性氨基酸的质谱峰面积响应的信噪比接近3，得到各手性氨基酸的检测限，以部分氨基酸为例，图5为(R)-BPCl与(R)-BPBr对谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)的检测限比较图，从图中可知，(R)-BPCl比(R)-BPBr的检测灵敏度更高，(R)-BPCl对其他氨基酸的检测限也有不同程度的降低。
应用实施例2：基于醛基的手性氨基酸识别探针结合液相色谱质谱联用技术定量手性氨基酸
配制不同浓度梯度范围的R和S构型的各氨基酸混合标准溶液以及5mmol/L的(R)-BPCl储备液，向氨基酸标准溶液中加入氘代内标Phe-d5、Trp-d5、Val-d8溶液充分混匀，取氨基酸混合标准溶液、PBS7.0缓冲溶液和乙腈按照1：1：2的体积比例充分混匀，取10uL混合溶液与(R)-BPCl探针在乙腈中反应25分钟。取5uL反应液进液相色谱-质谱联用仪器中分析。使用150mm*4.6mm*3.5um的C18色谱柱，选择负离子MRM模式监测各种氨基酸的质谱峰响应信号，制作各氨基酸的标准曲线，横坐标为浓度，纵坐标为氨基酸与内标峰面积的比值，以使基质效应最小作为内标的选择标准。以苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)为例，S和R构型的苯丙氨酸和色氨酸的线性均良好，R2大于0.99，且四次重复实验结果的RSD值小于15％。图6为(R)-BPCl探针与标准溶液中苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)反应后产物的标准曲线图。在生物体液样本(尿液、血浆、唾液)中加入按照上面步骤配制的一系列浓度梯度的氨基酸混合标准溶液，得到各氨基酸的基质加标曲线，图7为(R)-BPCl探针与标准溶液、尿液、血浆和唾液中R和S构型的缬氨酸(Val)反应后产物的标准曲线图，横坐标为浓度，纵坐标为氨基酸与内标峰面积的比值，从图中可知，四条标准曲线的R2均大于0.99，且斜率相近，斜率的比值范围在85-115％之间，显示该实验方法下的基质效应可以忽略，其他氨基酸的基质效应也符合条件。
应用实施例3：基于醛基的手性氨基酸识别探针结合液相色谱质谱联用技术测定尿液中的手性氨基酸含量
配制5mmol/L的(R)-BPCl储备液，向尿液中加入氘代内标Phe-d5、Trp-d5、Val-d8溶液充分混匀，取尿液、PBS7.0缓冲溶液和乙腈按照1：1：2的体积比例充分混匀，离心沉淀蛋白后，取10uL混合溶液与(R)-BPCl探针在乙腈中反应25分钟。取5uL反应液进液相色谱-质谱联用仪器中分析。使用150mm*4.6mm*3.5um的C18色谱柱，选择负离子MRM模式监测尿液中各种氨基酸的质谱峰响应信号。将得到的尿液中各氨基酸与内标的峰面积比值代入各氨基酸的标准曲线中计算出尿液样本中各氨基酸的实际含量。以部分氨基酸为例，图8的(A)(B)(D)(E)显示了(R)-BPCl探针与标准溶液和尿液中丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)反应后产物的质谱多反应监测(MRM)谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为质谱峰强度。图9为(R)-BPCl探针测得的尿液中R和S构型的丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)的含量值。
应用实施例4：基于醛基的手性氨基酸识别探针结合液相色谱质谱联用技术测定血浆中的手性氨基酸含量
配制5mmol/L的(R)-BPCl储备液，向血浆中加入氘代内标Phe-d5、Trp-d5、Val-d8溶液充分混匀，离心沉淀蛋白后，取血浆、PBS7.0缓冲溶液和乙腈按照1：1：2的体积比例充分混匀，取10uL混合溶液与(R)-BPCl探针在乙腈中反应25分钟。取5uL反应液进液相色谱-质谱联用仪器中分析。使用150mm*4.6mm*3.5um的C18色谱柱，选择负离子MRM模式监测血浆中各种氨基酸的质谱峰响应信号。将得到的血浆中各氨基酸与内标的峰面积比值代入各氨基酸的标准曲线中计算出血浆样本中各氨基酸的实际含量。以部分氨基酸为例，图8的(A)(C)(D)(F)显示了(R)-BPCl探针与标准溶液和血浆中丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)反应后产物的质谱多反应监测(MRM)谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为质谱峰强度。图10为(R)-BPCl探针测得的血浆中R和S构型的丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)的含量值。
应用实施例5：基于醛基的手性氨基酸识别探针结合液相色谱质谱联用技术测定唾液中的手性氨基酸含量
配制5mmol/L的(R)-BPCl储备液，向唾液中加入氘代内标Phe-d5、Trp-d5、Val-d8溶液充分混匀，离心沉淀蛋白后，取唾液、PBS7.0缓冲溶液和乙腈按照1：1：2的体积比例充分混匀，取10uL混合溶液与(R)-BPCl探针在乙腈中反应25分钟。取5uL反应液进液相色谱-质谱联用仪器中分析。使用150mm*4.6mm*3.5um的C18色谱柱，选择负离子MRM模式监测唾液中各种氨基酸的质谱峰响应信号。将得到的唾液中各氨基酸与内标的峰面积比值代入各氨基酸的标准曲线中计算出唾液样本中各氨基酸的实际含量。以部分氨基酸为例，图11显示了(R)-BPCl探针与唾液中丙氨酸(Ala)和甲硫氨酸(Met)反应后产物的质谱色谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为质谱峰强度。图12为(R)-BPCl探针测得的唾液中R和S构型的丙氨酸(Ala)和甲硫氨酸(Met)的含量值。
应用实施例6：基于醛基的手性氨基酸识别探针结合液相色谱质谱联用技术非靶向扫描尿液、血浆和唾液中的伯胺类化合物
配制5mmol/L的(S)-BPCl储备液，取生物体液样本(尿液、血浆或唾液)、PBS7.0缓冲溶液和乙腈按照1：1：2的体积比例充分混匀，离心沉淀蛋白后，取10uL混合溶液与(S)-BPCl探针在乙腈中反应25分钟。取5uL反应液进液相色谱-质谱联用仪器中分析。使用150mm*4.6mm*3.5um的C18色谱柱，分别以m/z 218(-)和105(+)作为子离子，扫描并搜索可碎裂出该子离子的母离子，根据质量数差值为2和峰面积比值近似为3来排除假阳性结果，符合条件的化合物即为伯胺类化合物。图13显示了(S)-BPCl探针对尿液、血浆和唾液进行以m/z 218(-)为子离子的非靶向扫描得到的伯胺类化合物的质谱总离子流图，横坐标为保留时间，纵坐标为质谱峰强度。图14为(S)-BPCl探针与尿液反应得到的分别以m/z 218(-)和m/z 105(+)为子离子的伯胺类化合物的质谱多反应监测(MRM)谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为质谱峰强度。以526>218(-),528>218(-)和415>105(+),417>105(+)为例，根据质量数差值为2和峰面积比值近似为3为标准，标记星号的峰即为符合条件的伯胺类化合物，其他峰为假阳性结果。

Claims (7)

1.一种基于醛基的手性氨基酸识别探针，其特征在于，所述探针的结构式为：
Figure 317822DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的基于醛基的手性氨基酸识别探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 称取脯氨酸、碳酸钾放入反应容器中，倒入四氢呋喃，在冰水浴中向反应容器中滴入苯甲酰氯，将混合物在搅拌反应2～5小时，将反应液旋转蒸发除去溶剂，加入水溶解，用盐酸调节pH至析出白色絮状物，使用乙酸乙酯萃取目标中间体，合并乙酸乙酯层的溶液，加入无水硫酸钠除水后，旋转蒸发后得到第一步产物；
(2) 称取N,N'-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和4-氯水杨醛，用二氯甲烷溶解后，加入到第一步的产物中反应，将混合物回流反应3～5小时，反应结束后抽滤，将滤液旋转蒸发后得到淡黄色油状产物，通过硅胶柱和手性色谱柱进一步纯化制备后得到基于醛基的手性氨基酸识别探针。
3.根据权利要求2所述的基于醛基的手性氨基酸识别探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，以摩尔比计，所述的脯氨酸：苯甲酰氯：碳酸钾=0.8～1.5: 0.8～1.5: 1.5～3.8。
4.根据权利要求2所述的基于醛基的手性氨基酸识别探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的脯氨酸的物质的量与四氢呋喃的体积之比=0.8～1.2 mmol: 4～7 mL。
5.根据权利要求2所述的基于醛基的手性氨基酸识别探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的搅拌反应的温度为10～25℃。
6.根据权利要求2所述的基于醛基的手性氨基酸识别探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以摩尔比计，所述的N,N'-二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：4-氯水杨醛的摩尔比=1～2: 0.2～0.4: 1.2～2.2。
7.根据权利要求2所述的基于醛基的手性氨基酸识别探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的回流反应的温度为30℃～40℃。
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