JPH0220065B2 - - Google Patents

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JPH0220065B2
JPH0220065B2 JP17471982A JP17471982A JPH0220065B2 JP H0220065 B2 JPH0220065 B2 JP H0220065B2 JP 17471982 A JP17471982 A JP 17471982A JP 17471982 A JP17471982 A JP 17471982A JP H0220065 B2 JPH0220065 B2 JP H0220065B2
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JP
Japan
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phycoerythrin
leu
fluorescent
fluorescence
cells
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JP17471982A
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Sutoryaa Rubaato
Namiotsuto Gureizaa Arekusandaa
Toshiaki Ooi Baanon
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Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
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Publication date
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Publication of JPH0220065B2 publication Critical patent/JPH0220065B2/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
螢光試験材料は、分子および細胞の分離、およ
び分析のために重要な試薬である。それらの応用
の特別な例としては：(1)螢光流量血球測定、螢光
−活性化細胞選別、および螢光顕微鏡の方法（手
段）による細胞の準集団の固定および分離、(2)螢
光免疫検査法おける第二の種と結合する（例、抗
原−抗体反応）物質の濃度の測定、(3)螢光染色の
技術によるゲルおよび他の不溶性支持体における
物質の局在化を挙げることができる。これらの技
術（方法）は、ヘルセンベルグらによつて、“細
胞免疫学”３版、22章、ブラツクウエル サイエ
ンテフイク パブリケケーシヨン社、1978年（螢
光−活性化細胞の選別）およびゴールドマンによ
る“螢光抗体法”アカデミツク プレス社、ニユ
ーヨーク、1968年（螢光顕微鏡および螢光染色
法）に記載されている。 前記の目的のために、螢光体（fluorescer）を
用いる場合、螢光体の選択について、多くの制約
がある。一方の制約は、螢光体の特徴である吸収
および発光であり、化合物が検出されるサンプル
（例、血液、尿、脳脊髄液）においてこのような
化合物と連合している多くのリガンド、受容体、
および物質が、螢光を発し、螢光標識の正確な螢
光測定を妨げる。他方、螢光体がリガンドおよび
受容体と結合（複合）することができ、このよう
な結合が螢光体に影響を与えることも考慮すべき
である。多くの場合、他の分子との結合（複合）
は、螢光体の螢光特徴に実質的変化を与え、いく
つかの場合、本質的に螢光体の量子効率の破壊お
よび減少をもたらす。第三に考慮すべきことは、
螢光体の量子効率である。これに関して、一方で
は螢光分子が、隣接接触の場合、相互作用し、自
己−クエンチングを生ずる。他方では、螢光体と
他の化合物または容器壁との非特異結合、それ自
体によつて、または螢光体が結合する化合物との
抱合においてどちらかにある。 上記に示めされた方法の応用の可能性および価
値は、好ましい螢光物質の有効性に密接に関連し
ている。特に、長波長可視領域販（黄−赤）にお
いて、発光する螢光物質が必要である。広く螢光
物質として使用されているフルオレセインは、緑
領域において、有用な螢光体である。しかしなが
ら、好都合な赤螢光標識ロダミンは、フルオレセ
インより効果が薄いとされている。螢光活性化細
胞選別の分野で、この欠陥は、強い影響を与え
る。この強力な、多方面にわたる、十分に可能性
のある手段は、また認識されておらず、それは一
般に有効なな螢光体の限界を、とらえらでいるか
らである。２および３−パラメーター螢光選別
は、効果的に開発されておらず、それは十分に、
良い長波長発光実験材料が入手困難だからであ
る。 組織学、細胞学、免疫検査を含む他の手段（方
法）は、より長波長での高量子効率、吸収、およ
び螢光特性をもつ螢光体、接合のための単純な作
用（手段）を有する螢光体および本質的に非−特
異性妨害のない螢光体の使用によつて実際的に好
ましい結果が得られる。 リガンド−受容体反応を含むシステムにおい
て、螢光標識体として、ビリン補欠分子族を有す
るタンパクを用いる。ビリタンパクは容易に接合
し、長波長可視領域において、吸収および発光の
高量子効率を提供し、リガンド−受容体反応を含
む方法の感度および精度を高める。ビリタンパク
は、各々に、併用して、または非−タンパク性螢
光体とともに使用することが可能である。 第１図は、フイコエリスリン−イムノグロブリ
ン接合体（PE−Ｓ−Ｓ−IgG）およびその反応
性前駆物質、チオラート化フイコエリスリン
（PE−SHおよび活性化イヌノグロブリン（IgG
−Ｓ−Ｓ−Pyr）の高圧液体クロマトグラムを示
す。 第２図は、PE−Ｂ−Ａ染色した抗−IgGイム
ノグロリンを帯びる脾細胞を含む細胞集団の螢光
−活性化細胞選別分析を示す。 第３ａ図は、標準フルオレセイン発光フイルー
の組み合わせを利用しての螢光顕微鏡による、標
識した抗−イムノグロブリンを含むアガロースビ
ーズの混合物の視覚化が可能である。その場合、
いくつかのビーズは、PE−Ｂ−Ａで標識化し、
いくつかのビーズは、フルオレセイン−アビジン
で標識化する。 第３ｂ図は、赤フイルターの組み合わせと利用
しての螢光顕微鏡下に、第３ａ図におけるよう
に、同じ細胞集団の視覚化を示す。 特異結合対（ペアー）のメンバーと（該対は、
リガンドおよび受容体からなる）接合させたビリ
タンパク（ビリタンパクは、フイコビリタンパク
と同じ意味をもつ）を含んでなる組成物を提供す
る。これらの組成物は、特異結合対の補体メンバ
ーに、非−共有結合によつて標識化するために使
用される。方法の広い多様性は、リガンドもしく
は受容体の存在の測定、分析、または検出のため
にリガンドの受容体への拮抗的もしくは非拮抗的
結合が含まれる。それらの技術（手段）の多く
は、補体メンバーをもつ特異結合対の標識化した
メンバーの非共有結合の結果として螢光の存在も
しくは不存在に依存する。 本発明に係る接合体は、ビリタンパクを共有的
にまたは非共有的に、通常は共有的に特別のリガ
ンドもしくは受容体に合させることである。ビリ
タンパクは、少なくても約30000d（ｄ−ダルト
ン）の分子量をもち、更に一般的には少なくても
約40000dであり、600000もしくはそれ以上のダ
ルトルのものもありうるが一般には約300000dを
越えることはない。 ビリタンパクは、通常２−３の異なつたサブユ
ニツトからなり、そのサブユニツトは、約10000
−60000分子量の範囲にある。ビリタンパクは、
一般的に、藻類およびシアノバクテリアの広範囲
の変種から自然の形態で得られるものを用いる。
ビリタンパクにおけるタンパクの存在は、タンパ
ク性および非タンパク性分子への結合（複合）の
ための官能基の広範囲をもたらす。官能基として
は、アミノ基、チオ基、カルボキシ基が含まれ
る。いくつかの例では、官能基を導入し、ビリタ
ンパクが他のタンパクと結合（複合）するため
に、特にチオ基が、望ましい。 接合する受容体もしくはリガンドの性質によつ
て、同じくビリタンパクの性質によつて、二つの
成分の割合は、広範囲に変化し、その場合１つの
リガンドもしくは受容体に複数のビリタンパク、
または１つのビリタンパクに複数のリガンドもし
くは受容体となりうる。小さい分子、すなわち分
子量が2000d以下の場合、一般的に平均して少な
くても１つおよび約100以下、通常、約60以下で、
１つのビリタンパクと結合しうる。大きい分子、
すなわち少なくても約2000分子量、更に、一般的
には、少なくても約5000分子量、リガンドもしく
は受容体に対するビリタンパクの割合は、広く変
化し、複数のビリタンパクは、接合体において存
在する可能性がありまたは、複数の結合対メンバ
ーは、複合体に存在する可能性がある。更に、い
くつかの例で、錯体は、共有的に小さいリガンド
をビリタンパクに結合させることによつて形成
し、補体受容体をもつ特異結合対錯体を形成し、
その場合受容体は、ひき続いての錯体におけるリ
ガンドもしくは受容体として作用する。 リガンドは、補体受容体があるために特に興味
のある化合物である。大部分、興味あるリガンド
は、生理学的活性をもち、自然に存在するか、ま
たかは合成化合物である。化合物の１グループ
は、分子量約125−2000の範囲内にあり、更に一
般的には約125−1000および、薬剤、小さいペプ
チド、ビタミン、酵素基質・補酵素、殺虫剤、ホ
ルモン、脂質など広範囲な種類を含む。これらの
化合物の大部分は少なくても１つのヘテロ原子、
通常はカルコゲン（酸素またはイオウ）または窒
素、をもち、脂肪族、脂環式、芳香族、または複
素環式、またはそれらの組み合わせである。図示
した化合物には、エピネフエリン、プロスタグラ
ジン、チロキシン、エストロゲン、コルチコステ
ロン、ジギトキシン、アスピリン、ペニシリン、
ヒドロクロロチアジデ、キニジン、オキシトシ
ン、ソマトスタチン、ジフエニルヒダントイン、
レチノール、ビタミンＫ、コバルアミン、ビチオ
ンおよびホラートが含まれる。 より大きな分子量の化合物、一般的には5000も
しくはそれ以上の分子量をもつ化合物には、ポリ
（アミノ酸）−ポリペプチドおよびタンパク−多糖
類、核酸、およびその組み合わせ（例、グリコサ
ミノグリカン、グリコタンパク、リボゾーム）が
含まれる。図示した化合物には、アルブミン、グ
ロブリン、ヘモグロビン、ＴおよびＢ細胞のよう
な細胞上の表面タンパク（例、Leu、Thy、
Ia、）、腫膓特異抗原、α−フエトタンパク、ノチ
ノール結合タンパク、Ｃ−反応性タンパク、酵
素、コレラ毒、ジフテリア毒、ボツリン毒、蛇
毒、テトロドトキシン、サツクストキシのような
毒素、コンカナバリン、麦芽アグルチニン、およ
び大豆アグルチニンのようなレクチン、イムノグ
ロブリン、補助因子、リンパ液、ムコタンパク、
ポリシヤル酸、キチン、コラーゲン、ケラチンな
どを含む。 標識化された分子に依存して、広い範囲にわた
つての連結基は、ビリタンパクの他分子への結合
に用いられる。小さい分子量をもつ大部分（2000
分子量以下）は、連結のために興味ある官能基
は、カルボニル基（還元的アミン化するためのア
ルデヒド）、またはカルボキシル基、〔カルボジイ
ミドと結合させるかもしくは活性化エステルとし
て（例、Ｎ−ヒドロキシ、スクシニミド）〕であ
り、ビリタンパクに存在するアミノ基と共有結合
を形成（チオエーテルまたはジスルフイド）し、
その場合、ビリタンパクは、活性化オレフインお
よび加えられたメルカプト基または会合したメル
カプト基（例、エルマン試薬：イソチオシアネー
ト、ジアゾニウムニトレンまたはカルベン）で変
性されうる。ビリタンパクがタンパクと接合する
場合、種々の二官能性試薬、たとえば、ジアルデ
ヒド、テトラゾニウム塩、二価酸または類似物が
用いられ、または任意に、含まれているタンパク
の一方もしくは両方が、他のタンパクに結合（複
合）のため変性されうる〔例、メルカプト基が存
在するかまたは１つのタンパクに導入し、または
活性化したオレフイン（例、マレイミド）を他の
タンパクに導入する〕。 広範囲の種類の化合物をタンパクに接合させる
ことに関する参考文献があり、例としては、タン
パク、11A巻、３版、N.ノイラスおよびR.L.ヒル
編集、アカデミツク、プレス社、ページ、１−
103（1976）；A.N.グレゼルら、“タンパクの化学
変性”生化学および分子生物学における実験テク
ニツク、４巻、パート１、T.S.ワークおよびE.ワ
ーク編集、ノース．ホーランド．バブリツシング
Co.（1975）；およびK.ペーターら、Ann.Rev.
Biochem.，46巻、423−51頁（1977）が挙げられ
る。実施例での市販用交叉−連結試薬は、ピーア
ス1981−82ハンドブツクおよびピーアスカタログ
ページ161−166（ピーアスケミカルCo.，ロツクフ
オード、イリノイ）に示されている。 前記載の既知の連結方法を用いることができ
る。たとえばフイコビリタンパクをイミノチオラ
ンと反応させ、それによつて入りやすいスルフヒ
ドリル基を導入する。接合体の他の成分は、スク
シニミジルピリジルチオプロピオネートとの反応
によつて、活性化されうる。二つの製造された接
合体の成分の混合物は、ジスルフイド結合を通じ
て会合する。任意に、スクシニミジルピリジルチ
オプロピオネートを用いるかわりに、タンパクを
無水マレイン酸と反応させ、マレイミドを生成
（形成）させ、得られたマレイミドをチオエーテ
ルを形成するためにスルフヒドリル、変性タンパ
クと結合させる。 前記載のように興味ある特異結合対メンバーと
ビリタンパクとの共有結合のかわりに、非−共有
結合を用いることができる。たとえば、所望なら
ば、ビリタンパクとアビジンを結合させる場合、
ビオチンを、共有的にカルボニル基を通じて結合
させ、得られたビオチニル化ビリタンパクをアビ
ジンと結合させ、その際標識化したアビジンビリ
タンパクが得られる。 すでに述べたように、ビリタンパクは、天然に
存在する化合物であり広範囲な源（種）に発見さ
れ、各々の源（種）は、一つ以上のビリタンパク
を含む。 本発明に係る有用なフイコビリタンパクの例
は、アロフイコシアニン、フイコシアニン、フイ
コエリスリン、アロフアコシアニンＢ，Ｂ−フイ
コエリスリン、フイコエリスロシアニンおよびｂ
−フイコエリスリンである。フイコビリタンパク
の構造は研究されており、それらの螢光スペクト
ル特性は、知られている。A.N.グレーザー、
（“ビリン補欠分子族を有する光合成補助タンパク
“値物生化学、８巻、M.DハツチおよびN.K.ボー
ドマン編集、アカデミツク プレス社、51−96頁
（1981）、およびA.N.グレーザー、“フイコビリタ
ンパクに特別に関連のある光合成補助色素系の構
成および進展”、“タンパク構造と機能の進展”
B.S.ジグマンおよびM.A.ブラジエル、編集アカ
デミツク プレス社、ページ221−244（1980）に
記載されている。螢光発光最大値を含む分光特性
を、いくつかのありふれたフイコビリタンパクに
ついて表１に示めす。
【表】
【表】 特別に興味のあるのは、少なくても約450nmの
大吸収値をもつビリタンパクであり、好ましくは
少なくても約500nmで、少なくても15nmのスト
ーク．シフトをもち、好ましくは25nmであり、
および少なくても約500nmの最大螢光発光値をも
ち、好ましくは少なくても約550nmである。実験
材料である接合体は、広範囲にわたる方法で用い
られ、各々の分子として、またはウイルス、細
胞、組織、小器官（例、成形原質、核など）のよ
うな複雑な有機体のなかに存在している抗原の検
出、診断、測定および研究のための既知の方法論
を進歩させる。実験材料としての接合体の使用の
一つは、細胞の螢光染色である。細胞は、顕微鏡
下に、特別な決定要素位置の存在の診断基準とな
る螢光体の存在を観察することができ、または細
胞は、螢光活性化選別（FACS）においても用い
られる。１つもしくはそれ以上のビリタンパクを
用いる場合は、ビリタンパクの最大螢光発光が少
なくても15nm好ましくは約25、離れていること
が良い。任意に、ビリタンパクをビリタンパク以
外のもの、たとえばフルオレセイン、ダンジル、
アンベリフエロン、ベンツオキサジアゾール、ピ
レン、ローズベンガルなどのような螢光体と接合
させて用いることもでき、その場合、最大発光値
が少なくても約15nm、好ましくは約25nm離れて
いるのが良い。 螢光体の組み合わせを使用することによつて、
一つは、特別な細胞型、生物体の系（種）、ウイ
ルス株、天然の複合体、または異なるタンパクも
しくは抗原との相互作用などのように部分性凝集
（サブセツト−アグレゲーシヨン）の検出ができ
る。特に興味のある組み合わせは、同じレーザー
光源をもつ活性化されうるビリタンパクとフルオ
レセインとの組み合わせである。すなわち最大吸
収約450−500nmの範囲内（例、フイコエリスリ
ン）にあるビリタンパクである。 実験材料としてのビリタンパクの他の使用は、
免疫検査もしくは拮抗タンパク結合検査において
であり、その場合実験材料としてのビリタンパク
は、螢光体標識化物として作用する。。ビリタン
パクは、リガンドもしくは受容体、特に抗体と結
合する。一方、抗体の大部分はIgG、であり、
IgA，IgD，IgEおよびIgMのような他の抗体を
使用することができる。更に種々、天然に存在す
る受容体を用いることもでき、特にアビジンのよ
うな高結合特異性をもつ受容体が好ましい。受容
体、ビリタンパクまたは両方にビオチニル化する
ことによつて、アビジンを経て、いろいろの分子
に連結できる。広範囲の螢光分析については知ら
れている。それらの２，３は、米国特許番号
3998943；3985867；3996345；4036946；
4067959；4160016および4166105、開示されてお
り、関連した部分は、参照として、明細書にとり
こまれている。 ビリタンパクは、多くの好ましい特性を持つ： (1) 可視領域の長波長側に、非常に高い吸収効率
をもつ、 (2) 高い螢光量子収率をもつ、 (3) 非常に安定なタンパクであり、保管の安定性
が良い、 (4) 水溶液における溶解性が高い、 (5) ビリタンパクユニツトは、広範囲の生物学的
特異分子と容易にカツプリングする、 (6) 細胞と非特異的に結合しない。 ビリタンパク−生物分子接合体の螢光は、分子
レベルで、フルオレセイン接合体の強度の30倍以
上である。本発明に係る長波長−発光−螢光接合
体は短波長発光体よりも付加的な有利な点であ
る。細胞および体液におけるたいての生物分子
は、可視スペクトルの赤端において吸収、および
発光しない。結果としてビリタンパク接合体は、
より短波長で発光する接合体より内因性生物分子
による妨害を受けにくい。更に、紫外領域よりむ
しろスペクトルの赤側において容易に測定でき、
その理由としてはプラスチツク物質は、吸収しな
いし、黄→赤のスペクトル領域において、吸収、
発光しないことが挙げられる。 次に実施例は、図面の方法によつて説明される
が、方法の限界を示すものではない。 実施例 １ 本発明の螢光接合体の例として、フイコエリト
リン−イムノグロブリン接合体を調製した。フイ
コエリトリンに２−イミノチロランを添加して、
チオラート化フイコエリトリン（PE−SH）を調
製した。２−ピリジルジスルフイド基を含有する
活性化イムノグロブリン（IgG−Ｓ−Ｓ−Pyr）
を、Ｎ−スクシニミシル３−（２−ピリジルジチ
オ）−プロピオネートSPDPを添加して調製した。
次いでPE−SHをIgG−Ｓ−Ｓ−Pyrと混合する
ことにより、螢光接合体（PE−SS−IgG）を得
た。バリアンG3000SWカラムを用いた高圧液体
クロマトグラフイーHPLCにより、生成物を分析
した。このゲル過カラムは、主に、分子の流体
力学的半径に従つて、該分子を分離する。PE−
SHは注入後12分に溶出し、そしてIgG−Ｓ−Ｓ
−Pyrは約13分に溶出する。HPLCデータを示す
第１図を参照されたい。反応生成物PE−Ｓ−Ｓ
−IgGは8.5分にカラムから流出し、接合体がいず
れの成分よりもより大であるのでいずれの反応体
よりもよりすみやかに流出する。この接合体の試
料0.5mlの螢光発光は、10-10M未満のフイコエリ
トリン接合体で容易に検出できた。 実施例 ２ フイコエリトリン−アビジン接合体の合成によ
り、他の生体分子へのフイコビリタンパクの結合
の第二の例を示す。ｍ−マレイミドベンゾイルＮ
−ヒドロキシスクシニミドエステルMBSを添加
することにより、アビジンを活性化した。MBS
のエステル基を、アビジン上の求核体と反応させ
た。次いで、チオラート化フイコエリトリンのス
ルフヒドリル基を、活性化アビジン分子上のマレ
イミド基と反応させた。未結合アビジンを、カル
ボキシメチルセフアデツクスを用いたカラムクロ
マトグラフイーにより反応混合物から除去した。 実施例 ３ フイコエリトリン−アビジン接合体の合成に対
する別に方法により、他の生体分子に対するフイ
コビリ蛋白質の結合の第三の例を示す。ビオチニ
レート化フイコエリトリンを、フイコエリトリン
とビオチンのＮ−ヒドロキシスクシニミドエステ
ルとを反応せしめて得た。ビオチニレート化フイ
コエリトリンにアビジンを添加してフイコエリト
リン−ビオチン−アビジン接合体PE−Ｂ−Ａを
得た。過剰のアビジンを、ゲル過により除去し
た。ビオチニレート化分子に強固に結合したPE
−Ｂ−Ａを、次いでフルオロセンス−活性化分類
実験における螢光染色として用いた。イムノグロ
ブリンＤ（IgD）に対し特異的親和性を有するビ
オチニレート化単クローン性抗体を、脾臓細胞の
混合物に添加した。この単クローン性抗体は、約
40％の脾臓細胞の表面に存在する、IgG分子と結
合する。過剰の抗体を、洗浄して除去する。次い
で、この細胞混合物に、PE−Ｂ−Ａを添加する。
この高螢光接合体のアビジン単位は、抗−IgGイ
ムノグロブリンを有する細胞表面上のビオチン基
と結合する。この細胞体群の螢光−活性化細胞分
類分析は第２図に示される。フイコエリトリン接
合体によつてラベルされた細胞の螢光強度を、平
行して実験した螢光接合体で得られたものと比較
した。得られた知見は、フイコビリタンパクが、
細胞の螢光分析に対して有効な長波長の螢光標識
であることを実証している。 実施例 ４ 上述のフイコエリトリン−ビオチン−アビジン
接合体を、抗原を保有する螢光−染色ビーズに対
しても使用した。標的イムノグロブリンに対し特
異的親和性を有するビオチニレート化単−クーロ
ン性抗体を、共役的に結合した標的抗原を保有す
るアガロースビーズ（不溶性物質）に添加した。
これらのビーズを洗浄し、次いでPE−Ｂ−Ａを
添加した。この螢光フイコビリタンパク接合体で
標識したビーズを、螢光顕微鏡で検査した螢光放
出に対して企図された標準のフイルーター組合わ
せを用いて観察すると、標識ビーズが黄色で出現
した。より長波長のフイルターを用いると、標識
ビーズズはオレンジー赤色で出現した。螢光−ア
ビジン標識ビーズPE−Ｂ−Ａ標識ビーズの混合
物も又、螢光顕微で検査した。PE−Ｂ−Ａ標識
ビーズは、螢光標識ビーズから容易に区別でき
た。何故なら、それらは螢光光学を用い、緑色
（第３ａ図）よりもむしろ黄色であつたからであ
る。より長波長のフイルターウエト（wet）を用
いると、PE−Ｂ−Ａビーズのみがわずかに染色
され、この場合オレンジ−赤色である（第３ｂ
図）。これらの実験は、フイコビリタンパク−生
体分接合体が螢光顕微鏡に対する有効な螢光ステ
インである。 実施例 ５ フイコビリ蛋白質の調製 Ｒ−フイコエリトリンを、紅色値物、ガストロ
クロニウムコウルテリ（Gastroclonium
coulteri）（Rhodymeniales）（これは、tillwater
Cove，Monterey Peninsula，CAから採取され
た）から精製した。新たに調製した値物組織を、
蒸留水で洗浄し、PH7.0の燐酸ナトリウム緩衝液
50mM中に懸濁させ、次いでオステライザー
（Osterizer）ブレンダーを高速度に設定して３分
間ブレンドした。ホモジユナイザーを、数層のチ
ーズ状布を通して過し次いで、残留した特定の
物質を低速遠心分離で除いた。上澄み液を、固形
（NH4）2SO4を用いて飽和の60％にした。全ての
上記工程を４℃で行なつた。沈殿物を遠心分離に
より集め、PH7.0の燐酸ナトリウム50mMの
（NH4）2SO4の60％飽和液に再懸濁させ、次いで
DEAF−セルロース（微少粒体；Whatman、
Inc.，Chemical Sepaation Div.，Clifton，NJ）
を用いてスラリーにした。スラリーをカラムに充
填した。PH7.0の燐酸ナトリウム50mM中の
（NH4）2SO4濃度を減少させてカラムを段階的に
展開し、飽和の10％に低下させた。この点におい
て、PH7.0の燐酸ナトリウム200mMで溶出は完了
した。フイコエリトリンは、PH7..0の10％飽和
（NH4）2SO4−燐酸ナトリウム50mMおよびPH7.0
の燐酸ナトリウム200mMの間で溶出した。溶出
液を、（NH4）2SO4沈殿により濃縮し、PH7.0の燐
酸ナトリウム50mMに再溶解し次いで
（NH4）2SO4を４℃の飽和液に加えた。蛋白質は、
これらの条件のもとで４℃で放置することにより
晶出した。 シネココツクス（Synnechococcus）6301C−
phycocyanin（GlazerおよびFrang，Biol.Chem.
（1973年）248：65〜662）アナバエナ バリアビ
リス（Anabaena variabilis）アロフイアシアニ
ン（Bryant等、Arch，Microbiol.（1976年）
110：61〜75）およびＢ−フイコエリトリン
（GlazerおよびHexson，J.Biol.Chem.（1977年）
252：32〜42）を、上述の如く調製した。 実施例 ６ フイコエリトリン−アビジンの調製 ジメチルスルホキシドに溶解した１mg／mlのＮ
−ヒドロキシルスクシニミドビオチン（Sigma
Chemical Co.，St.Louis.MO又はBiosearch，
San Rafael，CA）の50μlアリコートを、PH7.5の
燐酸ナトリウム50mMに溶解した2.7mg／mlのＲ
−フイコエリトリン（又はＢ−フイコエリトリ
ン）１mlに添加し、試剤／フイコエリトリンモル
比13を得た。アビジンおよびビオチンを標識の研
究に用いることは、すでに開示されている
（Green，Adv.rotein Chem.（1975年）29：85〜
133；HeitzmannおよびRichards，PNAS USA
（1974年）71：3537〜3541）。室温で90分後、PH
7.5の100mMのグリシル−グリシン10μlを添加し
て反応を抑え、次いでビオチニレート化フイコエ
リトリン（Biot−PE）のこの混合物１mlをPH6.8
の燐酸ナトリウム50mMに対し４℃で３日間透析
し次いで未変性フイコチリトリンを同じ緩衝液に
溶解した５mg／mlのアビジン１mlに、撹拌しなが
らゆつくり加えた。フイコエリトリンに対する四
量体のアビジンのモル比は20であつた。フイコエ
リトリン−アビジン接合体（PE−アビジン）、フ
イコエリトリンおよびアビジンの混合物を、高圧
液体クロマトグラフイーで分画した。 実施例 ７ フイコエリトリン−イムノグロブリンＧ（PE−
IgG）の製造 125mMの燐酸ナトリウム、PH6.8に溶解した3.6
mg／mlのＲ−フイコエリトリン1.2mlに、15.5
mg／mlのイミノチオラン塩酸塩（Sigma
Chemical Co.）（Jue等、Biochemistry（1978年）
17：5399〜5406）600mlを添加して、チオラート
化フイコエリトリンを調製した。室温で90分後、
反応混合物を、PH6.8の燐酸ナトリウム50mMに
対し４℃で一昼夜透析し次いでPH7.5の緩衝液に
対して２日間透析した。５，5′−ジチオビス−
（２−ニトロ安息香酸）の少量の滴定により、フ
イコヒリトリンに対するスルヒドリル基の平均含
量が８であることが判明した。 エタノールに溶解した1.1mg／mlのＮ−スクシ
ニミジル３−（２−ピリジルチオ）−プロピオネー
ト（SPDP）（Phamrmacia Fine Chemicals，
Piscataway，NJ）（Carless等、Biochem.J.
（Tokyo）（1978年）173：723〜737）30μlを、PH
7.5の燐酸ナトリウム50mMに溶解した4.2mg／ml
のイムノグロブリンG700μlに添加した。イムノ
グロブリンは、γ2aサブクラスのマウスのａアロ
タイプに対し特異性を有する単クローン性のγ1
マウス抗−アロタイプ抗体であつた。IgGに対す
るSPDPのモル比は5.3であつた。反応を室温で
2.5時間行つた。チオラート化フイコエリトリン
（同じ緩衝液中の1.7mg／mlの400μl）を、この反
応混合物500μlに添加した。チオラート化フイコ
エリトリンに対する活性化IgGのモル比は4.7であ
つた。室温で12時間後、80mMのヨード酢酸ナト
リウム100μlを、残存するスヒドリル基をブロツ
クするため添加した。 実施例 ８ フイコエリトリン−蛋白質Ａの製造 0.1M燐酸ナトリウム−0.1M塩化ナトリウム
（PH7.4）に溶解したＢ−フイコエリトリン（4.08
mg／ml）0.5mlに、無水メタノールに溶したSPDP
（2.65mgSPDP／ml）10μlを添加し、SPDP／蛋白
質モル比10を得た。22℃で50分間反応を行ない、
そして100mM燐酸ナトリウム−0.1MNaCl（PH
7.4）で平衡化したセフアデエクスＧ−25（1.0×
17cm）カラムに、反応混合物を適用することによ
り該反応を終了させた。同じ緩衝液を用いて溶出
させたフイコエリトリンピークを集めそして４℃
で保存した。 100mM燐酸ナトリウム−100mM塩化ナトリウ
ム（PH7.4）に溶解したスタフイロコツカスアウ
レウス（Staphylococus aureus）産生の蛋白質
２mg／mlの0.5mlに、上記メタノール性SPDP溶液
2.6μlを添加し、SPDP／蛋白質モル比9.5を得た。
22℃で40分後、PH7.4の緩衝液に溶解した1mMの
ジチオトレイトール25μlを添加した。22℃で25分
後、反応混合物を上述の如くゲル過に委ねそし
て蛋白質Ａのピークを採取した。 適当量のフイコエリトリン−Ｓ−Ｓ−ピリジル
誘導体およびチオラート化蛋白質Ａを混合し、蛋
白質Ａに対するフイコエリトリンのモル比１：２
を得た。反応混合物は0.77mgのフイコエリトリ
ン／mlおよび0.27mgの蛋白質Ａ／mlを含有してい
た。22℃で６時間後、反応混合物を４℃で保存し
次いでこのようにして生じたフイコエリトリン−
蛋白質Ａ接合体を更に精製することなく使用し
た。 実施例 ９ 標的ビーズの製造 CNBr−活性化セフアロース4B（Pharmacia
Fine Chemicals）のスラリー２mlに、5.2mg／ml
のIgG1.2mlを添加してIgG−セフアロースビーズ
を調製した。免疫グロブリンは、ａアロタイプの
マウスγ2a骨髄腫抗体であつた。室温で２時間転
倒混合後、1Mのグリシン（PH7.5）２mlを添加し
て反応を抑制した。次いでビーズを徹底的に洗浄
した。オバルブミン−セフアロースビーズおよび
アビジン−セフアロースビーズを同様にして調製
した。オバルブミン−セフアロースビーズをＮ−
ヒドロキシスクシニミドビオチンと反応させて、
ビオチン−セフアロースビーズを調製した。 分光測定 ベツクマン25型分光光度計（Beckman
Instruments，Inc.，Fullerton，CA）で吸収ス
ペクトルを測定した。DCSCU−２補正発光スペ
クトルユニツトを備えたパーキン−エルマー44B
型螢光計、又はスペツクフルオロローグ（Spex
Fluorolog）機器を用いて螢光スペクトルを得
た。エピーイルミネーシヨン光学を備えたツアイ
スユニバーサール（Zeiss Universal）顕微鏡を
用いて螢光鏡検法を行なつた。 高圧液体クロマトグラフイー 分子の流体力学的半径に従つて、主として分子
を分離するバリアンG3000SWゲル過カラムを
備えたウオーター（Waters）機器を用い、高圧
液体クロマトグラフイー法によりカツプリング反
応を追跡した。分析に対して20μlの蛋白質を10〜
20μlの容量で適用した。調製用実験において、試
料750μlを適用しそして400分画を集めた。溶離緩
衝液は200mMの燐酸ナトリウム（PH6.8）であ
り、そして流速は１ml／分であつた。 リンパ球の螢光染色 ヒトの末梢系血液リンパ球を、Ficoll−
Hypaque傾斜法を用いて調製した。回収した細
胞の生存数の計測は、細胞をアクリジンオレンジ
およびエチジウムブロミドで染色し次いで標準の
螢光光学を用いて螢光顕微鏡により螢光細胞を数
えることによつて行なつた。この染料組み合わせ
は、生存細胞を緑に死亡細胞をオレンジー赤色に
染色する。細胞の個数は常に95％以上生存に適し
ていた。 この研究において用いた抗−ロイ（Leu）抗体
は、全ての単クローン由来のハイブリドマ抗体
（Becton，Dickinson ＆ Co.Monoclonal
Center，Mountain View，CA）であつた。緑
色の螢光シグナルは、螢光化された抗体から直接
由来した。赤色の螢光シグナルは、フイコエリト
リン−アビジンでカウター染色されたビオチニレ
ート化抗体から由来した。螢光抗体の染色は一工
程又は二工程で行なわれた。直接に螢光化された
抗体を、５％（vol／vol）馬牛清および0.2％
（wt／vol）アジドを含有する、HEPES−緩衝化
（10mM）RPMI−1640媒地（フエノールレツド
およびビオチン不足）の50μl中106個の細胞と共
に氷上20分間インキユベートした。添加された抗
体の量は、該細胞数を染色するために最適である
ように、予じめ決定された。二色の染色に対し、
直接に螢光化された抗体およびビオチニレート化
抗体の双方が、媒地50μl中の106個の細胞と共に
氷上で20分間インキユベートされた。媒地で細胞
を２回洗浄後、フイコエリトリン−アビジン接合
体を、媒地50μl中の細胞に添加した。最終的に細
胞を媒地中３回洗浄する前に、該混合物を氷上で
更に20分間インキユベートした。螢光−活性化細
胞ソーターを用い、細胞を螢光分析用媒地0.5ml
中に再懸濁させた。 螢光−活性化細胞分析 改良されたBecton，Dickinson社の螢光−活性
化細胞ソーター（FACS）を、単細胞の螢光分
析に対し、使用した。560nmの二色性ミラーは発
光を短波成分（「緑色」チヤンネル）および長波
成分（「赤色」チヤンネル）に分けた。3.5の10進
法対数幅を有する対数的アンプリフアイヤーを両
チヤンネルに対し使用した。電子工学的補償
（Loken等、J.Histrochem.Cytochem.（1977年）
25：899〜907）は蛋光益出を赤色チヤンネルにそ
してフイコエリトリン益出を緑色チヤンネルに補
正した。これら補正されたシグナルは緑色および
赤色フルオロセンスとして言及されるであろう。
螢光（フルオロセンス）データは地勢図に以た等
高線地図として示された。等高線は、線状スケー
ルで細胞密度を画いている。マツプの領域におけ
る細胞数は、その領域における複数の等高線によ
つて示される量に比例する。この方法において必
要としかつFACSデータを示すコンピユータープ
ログラムは、ウエイン ムアー（Wayne
Moore）（スタンフアード大学）によつて作成さ
れた。 PE−アビジン接合体は、フイコエリトリンを
ビオチニレート化し、次いで過剰のアビジンを添
加することにより、調製された。Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドビオチンの13倍モル過剰を、フイ
コエリトリンと90分間反応させる場合、フイコエ
リトリンに対し平均１個のビオチンを導入した。
大過剰のアビジンを連続的に添加して得られた反
応混合物を、高圧液体クロマトグラフイーで分析
した。最初に、フイコエリトリン−アビジン接合
体が溶出し、続いてフイコエリトリン、そしてビ
オチニレート化フイコエリトリン更にアビジン
が、それらの流体力学的半径を基にして予期しに
如く溶出した。反応混合物は、実質的量のPE−
アビジン接合体（ピーク１およびピーク２）、更
にフイコエリトリン（ピーク３））およびアビジ
ン（ピーク４）を含有してした。ピーク２はビオ
チニレート化フイコエリトリン１分子に結合して
アビジン、１分子を含む接合体に対応し、一方ピ
ーク１並びにピーク１およびピーク２間の領域
は、３又はそれ以上の蛋白質分子から構成される
接合体からなるように思われる。ピーク２に対応
する分画を集めそしてプールした。主な種類は、
PE−アビジンである。一部分がフイコエリトリ
ンと反応せずそしてこの分画工程後、少量のアビ
ジンが残つた。ビオチンに対するこのPE−アビ
ジン調製能力を、それをビオチン−セフアロース
ビーズに添加して試験した。これらの染色ビーズ
はフイコエリトリンの強烈なオレンジー赤色螢光
特性を示した。アビジンをビオチン−セフアロー
スビーズに先に添加すること、又はビオチンを
PE−アビジン接合体に先に添加することはこれ
らのビーズに対するPE−アビジンの結合をブロ
ツクした。このことはそれらが螢光顕微鏡のもと
で暗色に現われる事実から明らかにされた。同様
に、フイコエリトリン又はビオチニレート化フイ
コエリトリンのいずれかにより染色されたビオチ
ン−セフアロースビーズはオレンジ−赤色スペク
トル領域において螢光を発しなかつた。これらの
実験、並びに手短かに論議されるべき螢光−活性
化細胞分析により、PE−アビジンがビオチンお
よびビオチニレート化分子に特異的に結合してい
ることが判明した。更に、PE−アビジン接合体
の定量的収量および放出スペクトルは天然フイコ
エリトリンのそれらと実質上同じであつた。
520nmで放出する10-12Mのフイコエリトリン
（又はフイコエリトリン接合体）の試料１mlは、
576nmで螢光シグナルを与え、これは水に対し
631nmでのラマン散乱の２倍の強さである。かく
して、標準のフルオレンスキユーベツトにおいて
フイコエリトリン10-15モルが容易に検出できた。 フイコエリトリンの螢光強度をフルオレセイン
のそれと比較することは興味あることである。色
素の希溶液の螢光強度はcεQに比例し、ここでｃ
は励起波長でのモル吸光系数であり、そしてＱは
螢光定量的収量である。488nm（アルゴン−イオ
ンレーザー光線）における励起に対し；フイコエ
リトリンに対してε＝1.28×106cm-1M-1であり、
そしてＱ＝0.82であり；フルオレセインに対して
ε＝８×104cm-1M-1であり、Ｑ＝0.9である。従
つて、488nmで励起されたフイコエリトリンの溶
液はフルオレセインの等モル溶液の螢光強度の
14.5倍高い螢光強度を有する。観察された強度比
は、また放出波長に関し検出システムの効率にも
依存する。フイコエリトリン／フルオレセイン強
度比10が測定され、この時これらの物質の等モル
溶液が細胞ソーターを通して流された。細胞に結
合した103分子のフイコエリトリンが流量血球計
算の実験において検出できた。 IgG−セフアロースビーズは予期したように、
フイコエリトリン−タンパクＡ接合体で染色した
後、明かるいオレンジー赤色螢光を示した。何故
なら、蛋白質Ａはマウスγ2aイムノグロブリンの
Fe部分と結合することが知られている。ビーズ
のこの染色は溶解性IgG2aの添加によつて抑制さ
れた。同様に、単クローン性抗−アロタイプの抗
体とのフイコエリトリンの接合体は、共役的に結
合した標的イムノグロブリンを有するセフアロー
スビーズを染色した。これらのビーズは、もしも
溶解性標的イムノグロブリンをフイコエリトリン
−抗体接合体に最初に添加するか、又は溶解性抗
−アロタイプ抗体を最初にビーズに添加する場
合、螢光性とはならなかつた。かくして、蛋白質
および抗−アロタイプの抗体の特異的結合性が、
フイコエリトリンとそれらの接合体において保持
された。 PE−アビジン接合体を、二色螢光−活性化細
胞分析において赤色螢光ステインとして用いた。
ヒトＴ−リンパ球の表面上のロイ（Lei）抗原
（OKT抗原）の分布を調べた（LeuおよびOKT
抗原の強度は最近決定された。Leu−１＝
OKT1；Leu−２＝OKT8；Leu−３＝OKT4；
およびLeu−４＝OKT3）Leu−１およびLeu−
２は全てのＴ−細胞に存在することが知られてお
り、一方Leu−2aおよびLeu−2bは、サツプレツ
サーおよび細胞傷害Ｔ細胞と関係している。Leu
−１，Leu−２，Leu−３，およびLeu−４の密
度は、これらの抗原の一種に特異的である螢光抗
体を用いて細胞を染色し次いでこれらの細胞の緑
色螢光を測定することにより決定された。Leu−
3aの密度は、Leu−3aに対し特異的であるビオチ
ニレート化抗体でＴ−リンパ球を染色し、続いて
PE−アビジンを染色し、続いて赤色螢光を測定
することにより確めた。対照の実験において、細
胞を抗体ではなくPE−アビジンで染色した。こ
の点の原点近くのピークは、未染色の細胞が同じ
パターンを与える限りにおいて、それらの細胞の
自己螢光から由来する。かくして、PE−アビジ
ンはこれらの細胞に対して重大な親和性を有しな
い。これらの細胞を螢光抗−Leu−3bで染色した
結果は、二個のピークであり、原点近くの一方の
ピークはそれらの表面のLeu−3bがない細胞（〜
50％）から由来し、そして他のピークはLeu−3b
を表わす細胞（〜50％）から由来する。緑色シグ
ナルは、Leu−3bネガチブ細胞の自己螢光の50倍
の明かるさであり、一方それらの赤色シグナルは
同程度である。Ｔ−リンパ球をビオチニレート化
抗−Leu−3aで染色し、続いてPE−アビジンで
染色した場合、逆の結果が得られた。細胞表面に
Leu−3aを有する細胞の赤色螢光はネガチブ細胞
の30倍高いものであり、一方これらの二種の固体
群の緑色シグナルは同程度である。Leu−3aおよ
びLeu−3bに対し同時分析の結果いずれも抗原を
表わさない細胞から生じる原点近くのピークであ
り、そしてLeu−3aおよびLeu−3bの双方を有す
る細胞から生じる他のピークである。換言すれ
ば、Leu−3aを表わすどの細胞も又Leu−3bを表
わし、逆もそうである。3aおよび3bは同じタン
パク分子に関し非重複デテルミナントであること
が知られているからである。 ヒトの末梢系血液リンパ球に関するLeu−１，
Leu−２およびLeu−４に関するLeu−3aの分布
の二色螢光．活性細胞分析も又行なつた。観察さ
れたLeu1染色パターンはこのドナーからの末梢
性リンパ球の〜60％がＴ−細胞である。何故なら
Leu−１抗原は、全てのヒトの末梢系Ｔ−細胞上
に存在することが知られている。Leu−3aに対し
染色することによつて得られる像は全てのＴ−細
胞がLeu−3a抗原を有しないことを示している。
約80％のＴ−細胞はLeu−3aおよびLeu−１を有
する。これらの二重ポジテイブ細胞はヘルパーお
よび誘導物質Ｔ−サブ固体群を含んでいる。Leu
−2aおよびLeu−3aの分布に対し、別の結果が得
られた。分析された全てのリンパ球のわずか10％
は、Leu−2aが、サプレツサーおよび細胞傷害Ｔ
−細胞サブ固体群に関係する抗原であることを示
している。Leu−2aおよびLeu−3aに対する像は
Ｔ−細胞がLeu−2a又はLeu−3aを表わし、双方
とも抗原でないことを実証している。この相互の
排斥は、特定のＴ−細胞がサプレツサー−細胞傷
害又はヘルパー−誘発物質細胞のいずれかで、双
方ともでないことの事実と調和している。 Leu−4aの分布は、予期される如くLeu−１の
それに類似している。何故なら、Leu−４は全て
のヒトの末梢系Ｔ−細胞上に存することが知られ
ているからである。Leu−3aおよびLeu−４を染
色するに際し、Leu−3aに対し陽性であることが
判明した全ての細胞は、Leu−４に対しても陽性
であることが判明した。 上記結果は、ビリタンパク接合体が分子の分析
用の螢光試剤の価値ある種類のものであることを
実証している。螢光−活性細胞ソーターの例は、
ビリタンパクを用いることのできる分析の有用性
および変化の特異的な証拠である。488nmのアル
ゴン−イオンレーザ光線でのフイコエリトリンの
吸光係数は、高効率で螢光およびフイコエリトリ
ンを同時に励起することを可能とする。最高の螢
光放出はそれぞれ515nmおよび576nmにあり、従
つてそれらの発光寄与分は、適当なフイルターに
よつて容易に分離できる。フイコエリトリンを用
いる利点は、単色光のレーザー光線が二色分析に
対し十分であることである。 フイコビリタンパク接合体は、２個のレーザー
源を用いて３個のパラメーター分析を行なう可能
性を開いている。例えば、アロフイコシアニンは
第三の螢光色素として役立つことができた。この
ような三色の実験において、フルオレセインおよ
びフイコエリトリンは488nmアルゴン−イオン光
線によつて励起されそしてアロフイコシアニンは
ダイ（dye）レーザの625nm出力により（又はク
リプトン又はヘリウム−ネオンレーザーによつ
て）励起される。フイコビリタンパクの吸収およ
び発光スペクトルは、もしもＣ−フイコシアニン
接合体を用いる場合、４色の分析の可能性を示し
ている。フイコビリタンパクは、蛋白イムノアツ
セイに対し十分適している。フイコエリトリンの
如きフイコビリタンパクのフエムトモル量の螢光
を容易に検知できる。更に体液および支持媒体か
らの背景螢光は、スペクトルの赤色端への移行に
おいて著るしく減少する。フイコビリタンパクの
オレンジー赤色発光はこの点において特に有利で
ある。更に、フイコビリタンパクはペアの特異的
結合において、リガンド又はレセプターの作用を
防害することなく、あるいはフイコビリタンパク
の所望のスペクトルの特性を失うことなく、多様
のリガンドおよびレセプターに接合できる。 以上、本発明の明確な理解を目的として、本発
明を詳細に説明および実施例により詳説したが特
許請求の範囲に記載された範囲において、一定の
変更および修正は可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図はフイコエリスリン−イムノグロブリン
複合体、その反応性前駆物質、およびチオラート
化フイコエリスリンの高圧液体クロマトグラムで
あり、第２図はPE−Ｂ−Ａ染色した細胞の螢光
強度を表わすグラフであり、第３ａ図はPE−Ｂ
−Ａ染色ビーズ（粒子）およびフルオレセイン−
アビジン染色ビーズ（粒子）の螢光顕微鏡写真で
あり、第３ｂ図はPE−Ｂ−Ａ染色ビーズ（粒子）
の螢光顕微鏡写真である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ リガンドおよびレセプターからなる特異的結
    合ペアのメンバーに共有結合的に共役したビリタ
    ンパクを含んでなる、特異的結合メンバーを検出
    するために用いる螢光化合物。 ２ 上記メンバーがレセプターである、特許請求
    の範囲第１項記載の螢光化合物。 ３ 上記レセプターが、細胞表面抗原に対し特異
    的である、特許請求の範囲第２項記載の螢光化合
    物。 ４ 上記レセプターが抗体である、特許請求の範
    囲第２項又は第３項記載の螢光化合物。 ５ 上記特異的結合メンバーが、リガンドである
    特許請求の範囲第１項記載の螢光化合物。 ６ 螢光標識用として、螢光体および第一の特異
    的結合ペアのメンバーを含んでなる螢光試剤を用
    い、第一の特異的限定部位を有する細胞を検出す
    る方法であつて、リガンドおよびレセプターから
    なる特異的結合ペアのメンバーに共有結合的に共
    役したビリタンパクを含んでなる螢光化合物を用
    いることを含んでなる、前記方法。 ７ リガンドおよびレセプターからなる特異的結
    合ペアのメンバーに共有結合的に共役したビリタ
    ンパクを含んでなる螢光化合物と異なる吸収およ
    び発光特性を有しかつ第二の限定部位に結合する
    第二の特異的結合ペアのメンバーに結合された、
    第二の螢光試剤を用いる、特許請求の範囲第６項
    記載の方法。
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