RU2273029C2 - Способ и набор для определения индуцированной аллергеном активации базофилов для определения гиперчувствительности к некоторым веществам - Google Patents
Способ и набор для определения индуцированной аллергеном активации базофилов для определения гиперчувствительности к некоторым веществам Download PDFInfo
- Publication number
- RU2273029C2 RU2273029C2 RU2004109985/15A RU2004109985A RU2273029C2 RU 2273029 C2 RU2273029 C2 RU 2273029C2 RU 2004109985/15 A RU2004109985/15 A RU 2004109985/15A RU 2004109985 A RU2004109985 A RU 2004109985A RU 2273029 C2 RU2273029 C2 RU 2273029C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- basophils
- antibody
- allergen
- ige
- antibodies
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 title abstract 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 24
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 24
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims description 24
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 32
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract description 7
- 230000007815 allergy Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 30
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 29
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 25
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 21
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 101000897042 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 9
- 102100021969 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 4
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 4
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 3
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 3
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 3
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 1
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 1
- 101710091342 Chemotactic peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 108010077678 Tetraspanin 30 Proteins 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области аллергологии. Сущность: изложен способ определения активации базофилов после стимуляции аллергеном для определения гиперчувствительности к некоторым веществам, при котором образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 50 нг/мл, в зависимости от объема образца, и соответственно разведенный аллерген в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 минут, после чего добавляют окрашивание анти-СD63-антителом в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и антителом против поверхностного рецептора базофилов в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, и образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 минут, а затем лизируют и подвергают проточной цитометрии. Второй объект: набор для такого определения. Технический результат - повышение эффективности аллергодиагностики. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 24 табл., 4 ил.
Description
Область изобретения
Изобретение касается способа определения ответа базофилов в крови пациента после стимуляции аллергеном с целью определения гиперчувствительности к некоторым веществам с помощью двойного мечения.
Предпосылки изобретения
Для определения гиперчувствительности организма к некоторым веществам используются либо тесты in vivo (кожные тесты, двойное спелое испытание), либо тесты in vitro. В настоящее время преобладают тесты in vitro, таким образом избегают аллергенной нагрузки на пациента. Другими аргументами в пользу тестов in vitro являются возраст пациента, вероятность возникновения реакции гиперчувствительности, комфортное состояние пациента (в отличие от кожных уколов, где один укол соответствует определению одного аллергена, тесты in vitro делают возможным определение нескольких аллергенов после однократного взятия крови).
В настоящее время наиболее широко используемым тестом in vitro является измерение уровня специфических IgE-антител (sIgE) в крови пациента, т.е. конечного продукта специфического ответа клеток. Наиболее широко распространенным принципом этого теста является твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) в различных модификациях. Определение может быть выполнено с некоторой задержкой после взятия крови у пациента. Из одной порции крови могут быть определены антитела против многих аллергенов. Однако эти результаты могут иногда отличаться от кожных тестов. Например, антитела к аллергену могут исчезать, когда пациент не контактирует с этим аллергеном в течение некоторого времени, даже если речь идет о реакции гиперчувствительности. Часто обнаруживают также перекрестно-реагирующие антитела, и способ в принципе может быть плохо стандартизован.
Поэтому в последнее время стали разрабатываться способы, которые контролируют непосредственный ответ клеток на стимуляцию. Особое внимание было уделено базофилам. Они представляют собой специализированные эффекторные клетки иммунной системы, играющие важную роль в аллергической реакции. Сенсибилизированные клетки активируются специфическим аллергеном. Об активации можно судить, с одной стороны, по экспрессии некоторых рецепторов на поверхности этих клеток (CD63), а с другой стороны, по продукции цитокинов, которые поддерживают продукцию sIgE, и медиаторов, таких как гистамин, лейкотриены и т.д. Они ответственны за некоторые клинические проявления аллергии.
Эти способы все еще далеки от широкого применения. В настоящее время гистамин и сульфидолейкотриены могут быть определены в супернатанте после стимуляции клеток аллергеном с помощью ELISA-тестов. Недостаток заключается в необходимости разделения клеток. В процессе разделения может иметь место неспецифическая активация. Кроме того, пациент не должен принимать никаких противогистаминных средств в течение по крайней мере 48 часов.
Определение экспрессии антигена активации CD63 на базофилах имеет следующие преимущества: 1) работа с цельной кровью, 2) применение тех же растворимых аллергенов, что и для кожных тестов, 3) возможность определить 1-й тип реакций гиперчувствительности к аллергену, даже если в периферической крови не присутствуют sIgE. Кроме того, клетки не активируются перекрестно-реагирующими антителами к аллергену из-за их низкой аффинности. Но определение базофилов путем окрашивания анти-IgE-антителами имеет некоторые ограничения.
При очень низком уровне общих IgE (<80 МЕ/мл) базофилы могут быть окрашены с большим трудом (слабая флуоресценция), а при высоком уровне IgE добавленные антитела (анти-IgE) могут связываться сывороточными IgE.
Введение проточной цитометрии, т.е. способа, который позволяет метить клетки при помощи поверхностных рецепторов, сделает возможным развитие способов, которые основаны на мониторинге клеточного ответа. Таким образом, этот способ сделает возможным определение непосредственного ответа базофилов на аллерген in vitro. В периферической крови содержится очень низкий процент базофилов (около 1%). Они принадлежат к группе гранулоцитов, с которыми они разделяют большинство поверхностных антигенов. В настоящее время известно, что они в отличие от других клеток несут на своей поверхности FcεRI-рецепторы и связывают IgE. Этот факт используется для их окрашивания анти-IgE-антителами. Поэтому базофилы метят флуоресцентными антителами против IgE (ср. Basotest, производимый фирмой Orpegen Pharma).
Сущность изобретения
Авторы изобретения считают, что определение активации базофилов представляет собой способ, который наиболее приближен к условиям in vivo, при этом авторы попытались преодолеть недостатки окрашивания базофилов с помощью анти-IgE-антител. Авторы обнаружили, что более предпочтительно метить базофилы антителом, направленным против поверхностного рецептора, специфичного для них. Таким образом, недостатки, связанные в основном с низким уровнем IgE, могут быть преодолены, поскольку это мечение не зависит от указанного выше уровня. В настоящее время известно, что на базофилах экспрессируется рецептор для интерлейкина-3 (IL-3), который обозначается как CD123. Поэтому для окрашивания базофилов можно выбрать флуоресцентно меченое антитело, которое было получено против этого рецептора. Другим поверхностным маркером для окрашивания базофилов может быть CD203c, так что можно использовать анти-СD203с-антитело.
Определение осуществляют в цельной крови. В том случае, если клетки чувствительны к аллергену, то после его добавления и в течение последующей инкубации аллерген свяжется с IgE-антителами, которые специфичны к данному аллергену. Связь антиген-антитело станет для клеток сигналом к началу активации и последующему запуску процессов, которые завершатся дегрануляцией базофилов и высвобождением медиаторов, ответственных за аллергическую реакцию in vivo. Ответ базофилов контролируют путем определения экспрессии СD63-антигена. Базофилы окрашивают антителами против рецептора, который они несут на своей поверхности, предпочтительно антителом против CD123 (рецептора для IL-3) или против CD203c-рецептора. Если в организме нет антител против добавленного аллергена, связанных с базофилами пациента, то реакция антиген-антитело не возникнет, и таким образом не будет иметь место активация клеток, а следовательно, и экспрессия CD63.
Краткое описание Фигур
Приложенные Фигуры демонстрируют серии гистограмм, полученных при помощи проточного цитометра Coulter Epics XL для каждого тестируемого пациента.
Значения отдельных гистограмм:
Гистограмма 1 - Распределение клеток в соответствии с прямым (FS от англ. forward scattering) и боковым (SS от англ. side scattering) светорассеянием. Окно (Гейт) N очерчивает область, где находятся базофилы.
Гистограмма 2 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител (окно F).
Гистограмма 3 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-СD123 (или анти-CD203с/РЕ)-антител (окно А).
Гистограмма 4 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. связывания с анти-IgE/FITC.
Гистограмма 5 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. связывания с анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ).
Гистограмма 6 - Процентное распределение базофилов, которые окрашены анти-IgE/FITC (окно F, Гистограмма 2).
Квадрант 1 (В1) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - другие клетки, не базофилы, присутствующие в окне F.
Квадрант 2 (В2) - Клетки, меченые как анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами.
Квадрант 3 (В3) - Неокрашенные клетки.
Квадрант 4 (В4) - Клетки, окрашенные анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами.
Гистограмма 7 - Процентное распределение базофилов, которые окрашены анти-CD123/PE (окно А, Гистограмма 3).
Квадрант 1 (G1) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - другие клетки, не базофилы, присутствующие в окне F.
Квадрант 2 (G2) - Клетки, окрашенные как анти-СD123/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами.
Квадрант 3 (G3) - Неокрашенные клетки.
Квадрант 4 (G4) - Клетки, меченые анти-СD23/РЕ (или анти-СD203с/РЕ)-антителами.
Гистограмма 8 - Распределение базофилов, которые мечены анти-CD123/PE (или анти-СD203с/РЕ), на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител.
Фигуры 1-1 - 1-8 иллюстрируют общую экспрессию CD123+/IgE+ на базофилах, как функцию концентрации общего IgE в сыворотке, приведенную в Таблице 1.
Фигуры 2-1 - 2-5 иллюстрируют общую экспрессию CD203c+/IgE+ на базофилах, как функцию концентрации общего IgE в сыворотке, приведенную в Таблице 2.
Фигуры 3-1 - 3-4 иллюстрируют:
Фигура 3-1 - Образец без стимуляции (отрицательный контроль КО).
Фигура 3-2 - Образец, стимулированный FMLP (неспецифический контроль).
Фигура 3-3 - Образец, стимулированный аллергенами осы.
Фигура 3-4 - Образец, стимулированный аллергенами пчелы.
Значения гистограмм на Фигурах 3-1 - 3-4:
Гистограмма 1 - Распределение клеток в соответствии с прямым (FS) и боковым (SS) светорассеянием. Окно N очерчивает область, где находятся базофилы.
Гистограмма 2 - Определяет базофильную область на основе бокового светорассеяния (SS) и связывания анти-IgE/FITC-антител (окно В).
Гистограмма 3 - Процентное распределение базофилов в соответствии со связыванием антител:
Квадрант 1 (С1) - Клетки, окрашенные СD63/РЕ-антителами - другие активированные клетки, не базофилы, присутствующие в окне В (Гистограмма 2).
Квадрант 2 (С2) - Клетки, окрашенные как анти-СD63/РЕ-антителами, так и анти-IgE/FITC-антителами, т.е. активированные клетки.
Квадрант 3 (С3) - Неокрашенные клетки.
Квадрант 4 (С4) - Клетки, окрашенные анти-IgE/FITC-антителами - неактивированные базофилы.
Гистограмма 4 - Распределение клеток в соответствии с интенсивностью их флуоресценции, т.е. со связыванием анти-IgE/FITC.
Гистограмма 5 - Распределение клеток по интенсивности их флуоресценции, т.е. по связыванию CD63/PE.
Фигуры 4-1 - 4-8 иллюстрируют сравнение результатов анти-IgE /FITC-CD63/PE и анти-CD123/PE-CD63/FITC.
Примеры
Пример 1
Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS (забуференный физиологический раствор) в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP (хемотаксического пептида N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина) в концентрации 0,433 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут, затем переносят в ледяную баню. Затем в каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-CD123-антител, меченых РЕ (от англ. phycoerythrine - фикоэритрин; от фирмы Becton Dickinson), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH4Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.
Пример 2
Тест выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля - 100 мкл FMLP в концентрации 0,433 мкг/мл. В тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут, затем переносят в ледяную баню. Затем в каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител, меченых РЕ (от фирмы Immunotech), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH4Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.
Пример 3
Тест выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,5 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля - 100 мкл FMLP в концентрации 0,433 мкг/мл. В тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую тест-пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител, меченых РЕ (от фирмы Immunotech), и 5 мкл моноклональных анти-СD63-антител, меченых FITC (от фирмы Caltag). Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH4Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.
Пример 4
Анализ осуществляют с помощью набора, который содержит 1 мл раствора IL-3 (Sigma) в концентрации 0,05 мкг/мл, 200 мл PBS, 2 мл анти-СD63 -антител, меченых FITC (Beckman-Coulter), 2 мл анти-СD203с-антител, меченых РЕ (Beckman-Coulter), 10 мл раствора FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл и 200 мл лизирующего раствора NH4Cl. Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител и 20 мкл моноклональных анти-СD63-антител. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH4Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.
Пример 5
Анализ осуществляют с помощью набора, который содержит 1 мл раствора IL-3 (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл, 200 мл PBS, 2 мл анти-СD63-антител, меченых FITC (Beckman-Coulter), 2 мл анти-СD203с-антител, меченых РЕ (Beckman-Coulter), 10 мл раствора FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл и 200 мл лизирующего раствора NH4Cl. Анализ выполняют на образце цельной крови, собранной в гепарине. Для каждого теста 100 мкл цельной крови и 10 мкл раствора IL-3 в PBS в концентрации 0,05 мкг/мл переносят с помощью пипетки в тест-пробирку. Для отрицательного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл PBS, для положительного контроля в тест-пробирку добавляют 100 мкл FMLP в концентрации 4,33 мкг/мл, и в тест-пробирку с анализируемым образцом добавляют 100 мкл соответственно разведенного аллергена. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Затем образцы переносят в ледяную баню. В каждую пробирку вносят 20 мкл моноклональных анти-СD203с-антител и 20 мкл моноклональных анти-СD63-антител. Образцы тщательно перемешивают и инкубируют в ледяной бане в течение 15-20 минут. Дальнейшую обработку осуществляют при комнатной температуре. Эритроциты в образцах лизируют путем добавления лизирующего агента, например, 2 мл NH4Cl. После лизиса образцы центрифугируют при 1000 об/мин. Образцы декантируют и к осадку добавляют 0,5 мл PBS. Измерение на цитометре осуществляют с образцом, приготовленным таким способом.
Результаты измерений на проточном цитометре Coulter Epics XL (Beckman-Coulter) приведены в следующих Таблицах и проиллюстрированы на приложенных Фигурах.
Ключ к сокращениям и терминологии:
IL-3 - интерлейкин-3
PBS - забуференный физиологический раствор
FMLP - N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланин
FITC - флуоресцеинизотиоцианат
РЕ - фикоэритрин
DF - Dermathophagoides farinae (акарид)
DP - Dermathophagoides pteronyssinus (акарид)
окно (gate), установка (селекция) окна (gating) - в области цитометрии: определение области, где будут анализироваться клетки, например клетки, окрашенные моноклональными антителами.
| Таблица 1: Общая экспрессия CD123+/IgE+ на базофилах, как функция общей концентрации IgE в сыворотке |
|||
| № пациента | IgE | CD123+IgE+ | |
| Ед/мл | окно IgE+ | окно CD 123+ | |
| МН | 48 | 79% | 56% |
| 18455 | 41,9 | 21% | 19% |
| 15931 | >17800 | 32% | 80% |
| 17669 | 169 | 92% | 91% |
| 18394 | 428 | 38,6% | 84,5% |
| 18483 | 53 | 85% | 100% |
| 18539 | 251 | 72% | 87% |
| 18535 | 12,5 | 12% | 2,5% |
| 18507 | 11,1 | 6,2% | 3% |
| 18517 | >2000 | 62,7% | 65,3% |
| 18765 | 66,5 | 81,4% | 73% |
| 12529 | 22 | 93% | 71% |
| 12580 | 395 | 88% | 80% |
| 12560 | 10,3 | небольшое кол-во клеток | 4,8% |
| 12530 | 95 | 68% | 69% |
| 19864 | 91 | 82,7% | 84.1% |
| JK | 200 | 91% | 85% |
Таблица и Фигуры 1-1 - 1-8 дают несколько примеров двухцветного окрашивания базофилов. Определили процентное содержание базофилов, окрашенных анти-IgE-антителами, которые несут также CD123-рецептор, и наоборот, процентное содержание базофилов, окрашенных анти-CD123, которые являются также анти-IgE-положительными.
Из таблицы следует, что окрашивание базофилов анти-IgE-антителами соответствует сывороточным уровням IgE 100-400 Ед/мл. При низком уровне IgE (пациенты МН, 18535,18455,18507,12560) базофилы, окрашенные анти-IgE, не могут быть определены, поскольку антитела не связываются с ними. С другой стороны, при высоком уровне IgE (пациент 15931) наблюдается либо неспецифическое связывание антител с моноцитами, либо замещение добавленных антител сывороточным IgE.
| Таблица 2: Общая экспрессия CD203c+/IgE+ на базофилах, как функция общей концентрации IgE в сыворотке |
|||
| № пациента | IgE | CD203c+IgE+ | |
| Ед/мл | окно IgE+ | окно CD123c+ | |
| 19894 | 91 | 77,4% | 82,3% |
| 19397 | 42,9 | 77,9% | 67,7% |
| 20156 | 42,5 | 92,7% | 90,7% |
| МН | 48 | 91,5% | 45,4% |
| JK | 200 | 87,1% | 97,3% |
Таблица и приложенные Фигуры 2-1 - 2-5 дают несколько примеров двухцветного окрашивания базофилов. Определили процентное содержание базофилов, окрашенных анти-IgE-антителами, которые несут также СD203с-рецептор, и наоборот, процентное содержание базофилов, окрашенных анти-СD203с, которые являются также анти-IgE-положительными.
Активация базофилов, как функция концентрации IL-3
| Таблица 3 | ||||||||||
| Концентрация IL-3, нг/мл | Отрицательный контроль, КО | Неспецифический контроль, KN | Спец. стимуляция, смесь из 3 видов трав | |||||||
| 5 | 1,6% | 37,5% | 38,4% | |||||||
| 2,5 | 5,9% | 34,1% | 28,7% | |||||||
| 1,25 | 1,6% | 27,8% | 29,2% | |||||||
| 0,062 | 1,6% | 30,6% | 28,2% | |||||||
| 0 (PBS) | 1,0% | 15,2% | 3,9% | |||||||
| Таблица 4 | ||||||||||
| Концентрация IL-3, нг/мл | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, эпителий собаки | ||||||||
| 5 | 3,3% | 56,9% | ||||||||
| 2,5 | 6,3% | 53,4% | ||||||||
| 1,25 | - | 51,6% | ||||||||
| 0,625 | - | 49,4% | ||||||||
| 0,312 | 3,1% | 49,2% | ||||||||
| 0,156 | - | 51,8% | ||||||||
| 0,078 | 2,8% | 44,3% | ||||||||
| 0,039 | - | 42,5% | ||||||||
| 0 (PBS) | 6,4% | 40,7% | ||||||||
| Таблица 5 | ||||||||||
| Концентрация IL-3, нг/мл | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, DF (акарид) | Неспец, стимуляция, KN | |||||||
| 5 | 1,6% | 82,1% | 18,5% | |||||||
| 2,5 | 2,5% | 83,3% | 16,4% | |||||||
| 1,25 | 2,5% | 83,2% | 15,0% | |||||||
| 0,625 | 3,1% | 85,5% | 16,2% | |||||||
| 0,312 | 3,7% | 81,1% | 17,1% | |||||||
| 0,156 | 3,9% | 81,1% | 14,5% | |||||||
| 0 (PBS) | 2,6% | 17,0% | 10,9% | |||||||
| Таблица 6 | ||||||||||
| Конц. IL-3 в образце, нг/мл | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, DF (акарид) | ||||||||
| 41,3 | 2,8% | 81,9% | ||||||||
| 20,6 | 4,3% | 85,7% | ||||||||
| 10,3 | - | 87.7% | ||||||||
| 5,16 | - | 82,8% | ||||||||
| 2,58 | 5,1% | 78,5% | ||||||||
| 1,29 | - | 67,2% | ||||||||
| 0,65 | 3,8% | 51,3% | ||||||||
| 0 (PBS) | 6,3% | 6,2% | ||||||||
| Таблица 7 | ||||||||||
| Конц. IL-3 в образце, нг/мл | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, смесь из 3 видов трав | ||||||||
| 41,3 | 3,4% | 86,6% | ||||||||
| 20,6 | 5,3% | 86,7% | ||||||||
| 10,3 | - | 86,0% | ||||||||
| 5,16 | - | 80,9% | ||||||||
| 2,58 | 5,1% | 78,6% | ||||||||
| 1,29 | - | 66,1% | ||||||||
| 0,65 | 4,5% | 62,0% | ||||||||
| 0 (PBS) | 4,3% | 39,0% | ||||||||
Активация базофилов, как функция времени инкубации с аллергеном
| Таблица 8 | |||||||
| Время инкубации в минутах | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, DF (акарид) | Неспец. стимуляция, KN | ||||
| 15 | 5,8% | 85,0% | 24,3% | ||||
| 30 | 3,1% | 86,4% | 19,0% | ||||
| 45 | 2,5% | 77,9% | 19,5% | ||||
| Таблица 9 | |||||||
| Время инкубации в минутах | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, смесь видов трав -ST | Неспец, стимуляция, KN | ||||
| 15 | 4,3% | 32,4% | 40,9% | ||||
| 30 | 6,7% | 31,5% | 41,6% | ||||
| 45 | 11,4% | 35,1% | 15,0% | ||||
| Таблица 10 | |||||||
| Время инкубации в минутах | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, оса | Спец. стимуляция, пчела | Неспец. стимуляция, KN | |||
| 15 | 6,6% | 88,1% | 8,4% | 23,4% | |||
| 30 | 4,7% | 89,1% | 11,9% | 37,3% | |||
| 45 | 6,7% | 78,5% | 10,5% | 28,5% | |||
| Таблица 11 | |||||||
| Время инкубации в минутах | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, DF (акарид) | Спец. стимуляция, яичный белок | Неспец. стимуляция, KN | |||
| 15 | 2,4% | 7,6% | 6,8% | 41,6% | |||
| 30 | 2,9% | 4,5% | 7,4% | 42,1% | |||
| 45 | 4,8% | 13,0% | 4,6% | 22,4% | |||
Активация базофилов, как функция преинкубации крови с IL-3
| Таблица 12 | |||||||||
| Время инкубации в минутах | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, смесь видов трав - ST | Неспец. стимуляция, KN | ||||||
| 0 | 5,3% | 99,1% | 28,0% | ||||||
| 10 | 5,8% | 96,8% | 53,0% | ||||||
| Таблица 13 | |||||||||
| Время преинкубации в минутах | Отрицат. контроль, КО | Спец. стимуляция, береза | Спец. стимуляция, сельдерей | Спец. стимуляция, киви | Спец. стимуляция, смесь видов трав | Неспец. стимуляция, KN | |||
| 0 | 2,7% | 94% | 94,7% | 11,9% | 98,4% | 48% | |||
| 10 | 4,1% | 94% | 94% | 12,5% | 99% | 74,5% | |||
| Таблица 14 | |||||||||
| Время инкубации в минутах | Отрицательный контроль, КО | Спец. стимуляция, смесь видов трав - ST | Неспец, стимуляция, KN | ||||||
| 0 | 5,3% | 99,1% | 28,0% | ||||||
| 10 | 5,8% | 96,8% | 53,0% | ||||||
Активация базофилов, как функция разведения аллергена
| Таблица 15 | ||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||
| Разв. 5х | Разв. 10х | Разв. 20х | ||||||
| Сельдерей | 50,6% | 80,3% | 91% | |||||
| Береза | 46,5% | 46,2% | 46,3% | |||||
| Цветки пшеницы | 7,7% | 13,5% | 8,6% | |||||
| Таблица 16 | ||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||
| Разв. 10х | Разв. 20х | Разв. 40х | Разв. 80х | Разв. 100х | ||||
| Оса | 30,9% | 13,2% | 10,4% | - | - | |||
| Пчела | 29,7% | 40,8% | 50,0% | 41,5% | 36,8% | |||
| Таблица 17 | ||||||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||||||
| Разв.10х | Разв. 100х | Разв. 1000х | ||||||||||
| Яблоко | 52,8% | 7,5% | 1,0% | |||||||||
| Грецкий орех | 12,6% | 57,2% | 5,6% | |||||||||
| Таблица 18 | ||||||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||||||
| Разв. 10х | Разв. 100х | Разв. 1000х | ||||||||||
| Райграс | 31% | 25% | 21% | |||||||||
| Тимофеевка | 32% | 32,5% | 25% | |||||||||
| Таблица 19 | ||||||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||||||
| Разв. 10х | Разв. 100х | Разв. 1000х | ||||||||||
| Смесь из 3 видов трав | 42% | 43,5% | 54,3% | |||||||||
| Таблица 20 | ||||||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||||||
| Разв. 10х | Разв. 100х | Разв. 1000х | ||||||||||
| Смесь из 3 видов трав | 39% | 10.7% | 6,7% | |||||||||
| Таблица 21 | ||||||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||||||
| Разв. 10х | Разв. 100х | Разв. 1000х | ||||||||||
| Оса | 54,8% | 58% | 11,2% | |||||||||
| Пчела | 56,6% | 51,8% | 58,8% | |||||||||
| Таблица 22 | ||||||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||||||
| Разв. 10х | Разв. 100х | Разв. 1000х | ||||||||||
| Оса | 59,8% | 67% | 15,4% | |||||||||
| Пчела | 54,6% | 56,3% | 22,8 | |||||||||
| Таблица 23 | ||||||||||||
| Аллерген | Концентрация аллергена 100 Ед/мл | |||||||||||
| Разв. 10х | Разв. 100х | |||||||||||
| Оса | 24,8% | 16,8% | ||||||||||
| Пчела | 6.2% | 11% | ||||||||||
Активация, как функция концентрации IL-3 и разведения аллергена
| Таблица 24 | ||||
| Концентрация IL-3, нг/мл. | Отрицат. контроль, КО | Спец. стим., пчела 10х | Спец. стим., пчела 100х | Неспец, стим., KN |
| 2,5 | 6,9% | 85,2% | 94,7% | 41,1% |
| 1,25 | 3,4% | 77,1% | 75,2% | 39,4 |
| 0,625 | 2,2% | 86,9% | 80,2% | 42,4% |
Базовая концентрация аллергена составляет 100 Ед/мл
| Нормальные значения: | КО <8% |
| с аллергеном <15% |
Сравнение результатов пациента, полученных описанным способом (базофилы, окрашенные анти-IgE, анти-CD123 или анти-203-антителами), с тестом, названным BASOTEST, доступным от фирмы ORPEGEN
Сравнение: анти-IgE/CD63 против Basotest
Образец 1
| Отрицат. контроль, КО | Спец. стим., береза | Спец. стим., сельдерей | Спец. стим., смесь трав | |
| IgE/CD63 | 6,0% | 93% | 95,8% | 12,9% |
| Basotest | 5,5% | 87,8% | 90% | 13,5% |
Образец 2
| Отрицат. контроль, КО | Спец. стим., пчела | Спец. стим., оса | Спец.стим., береза | Спец. стим., смесь трав | |
| IgE/CD63 | 1,6% | 0,9% | 63,6% | 2,0% | 1,0% |
| Basotest | 3,6% | 1,0% | 68,1% | 1,6% | 1,3% |
Сравнение: анти-СВ123 против Basotest
Образец 3
| Отрицат. контроль, КО | Спец. стим., DF (акарид) | Спец. стим., DP (акарид) | Спец. стим., смесь трав | |
| CD123/CD63 | 6,4% | 11,8% | 11,7% | 12,3% |
| Basotest | 2,4% | 2,9% | 4,2% | 11,7% |
Образец 4
| Отрицат. контроль, КО | Спец. стим., оса | Спец. стим., пчела | Неспец, стим., KN | |
| CD123/CD63 | 2,3% | 8,5% | 5,2% | 46,1% |
| Basotest | 1,0% | 5,2% | 1,5% | 42,3% |
Сравнение: Basotest против анти-CD123/CD63, анти-СD203с/СD63
Образец 5.
| Отрицательный контроль, КО | Неспец. контроль, KN | Спец. стим., эпителий собаки | |
| Basotest | 3,5% | 78,8% | 5,1% |
| CD123/CD63 | 5,8% | 68,6% | 10,7% |
| CD203/CD63 | 4,2% | 84,8% | 6.7% |
Сравнение: анти-IgE/CD63 против Basotest, анти-CD123/CD63, анти-CD203c/CD63
Образец 6
| CD 123 или CD203/IgE | Отрицательный контроль, КО | Неспец. контроль, KN | Спец. стим., DF (акарид) | |
| IgE/CD63 | - | 3,1% | 19,0% | 86,4% |
| Basotest | - | 5,4% | 19,0% | 85,9% |
| CD123/CD63 | 85% | 2,4% | 32,0% | 85,3% |
| CD203/CD63 | 96,7% | 5,9% | 36,5% | 92,3% |
Сравнение: анти-IgE/FITC-CD63/PE, анти-CD123/PE-CD63/FITC и CD203c/PE-CD63/FITC.
Анализировали гиперчувствительность к аллергенам пчелы и осы. Результаты проиллюстрированы на Фигурах 3-1 - 3-4 и выражены в виде процентного содержания положительных базофилов, т.е. базофилов, которые чувствительны к аллергену (на Фигурах Гистограмма 3 или 6, квадрант 2 - клетки, которые несут как маркер базофилов, так и антиген активации CD63). КО - образец без стимуляции (отрицательный контроль).
| Клеточное мечение | КО, % | оса, % | пчела, % |
| IgE/CD63 | 5,1 | 5,0 | 61,8 |
| CD123/CD63 | 1,5 | 3,4 | 56,6 |
| CD203c/CD63 | 3,5 | 6,2 | 50,3 |
| Нормальные значения: | КО <8% |
| с аллергеном <15% |
Для сравнения для пациента были определены специфические IgE-антитела против следующих аллергенов:
| оса | 0,35 Ед/мл |
| пчела | 1,4 Ед/мл положительными являются значения >0,35 Ед/мл |
Благодаря уровню общего IgE (около 90 МЕ/мл) все три способа окрашивания базофилов согласуются со сравниваемыми результатами.
Окрашивание клеток антителами против IgE (анти-IgE/FITC) и против антигена активации CD63 (CD63/PE). Сравнение результатов: анти-IgE/FITC-CD63/PE против анти-CD123/PE-CD63/FITC
Была проанализирована гиперчувствительность к аллергенам яичного белка, коровьего молока и цветков пшеницы.
Результаты проиллюстрированы на Фигурах 4-1 - 4-8 и выражены в виде процентного содержания положительных базофилов, т.е. базофилов, которые чувствительны к аллергену (на Фигурах Гистограмма 3 или 6, квадрант 2 - клетки, которые несут как маркер базофилов, так и антиген активации CD63), КО - образец без стимуляции (отрицательный контроль).
| Мечение базофилов | КО, % | яичный белок, % | коровье молоко, % | цветки пшеницы, % |
| IgE/CD63 | 6,0 | 57,2 | 62,6 | 5,8 |
| CD123/CD63 | 6,0 | 57 | 70,7 | 11,1 |
| Нормальные значения: | КО <8% |
| с аллергеном <15% |
Для сравнения для пациента были определены специфические IgE-антитела против следующих аллергенов:
| яичный белок | >25 Ед/мл |
| коровье молоко | >25 Ед/мл |
| цветки пшеницы | 1,71 Ед/мл; положительными являются значения >35 Ед/мл |
Из-за высокого уровня общего IgE (>17800 МЕ/мл) более подходящим является окрашивание базофилов анти-CD123-антителами, чем анти-IgE-антителами (по-видимому, имеет место их связывание с сывороточным IgE).
Расхождение между результатами спец. IgE против цветков пшеницы (1,7-положительные) и негиперчувствительностью, обнаруженной авторами изобретения, подтверждает их находку, что в процессе определения sIgE имеет место неспецифическое связывание. Одновременно определяют перекрестно-реагирующие антитела (ложно-положительные результаты), которые являются антителами с низкой аффинностью и которые не часто вызывают клинические реакции.
Сравнение результатов активации базофилов, sIgE и клинических проявлений
Аллерген: пчела
| Пациент | % активированных базофилов | Специфические IgE против аллергенов пчелы | Клинические проявления |
| Се-I | 51,8% | 14,6 | SSR |
| Ce-D | 56,3% | 1,4 | SSR |
| Во | 20% | <0,35 | SLR |
| Но | 5,2% | <0,35 | ? |
| En | 6,2% | <0,35 | ? |
| Ben | 82% | 1,33 | SSR |
| Hav | 5,7% | <0,35 | ? |
| Sev | 5,6% | <0,35 | ? |
| Sch | 77% | >17,5 | ? |
| Fru | 68,5% | >17,5 | ? |
| Bo | 40,8% | >17,5 | ? |
| Vla | 1,8% | 0,35 | ? |
| Vl | 1,7% | 0,35 | ? |
| Ja | 5,9% | 0,35 | ? |
| Kr | 2,5% | 0,75 | ? |
| Pru | 78,9% | 0,52 | ? |
| Tu | 2,0% | 0,65 | ? |
| He | 8,2% | 0,35 | ? |
| Ha | 11,9% | 0,35 | ? |
| Ba | 57,4% | 1,4 | SSR |
| Sko | 10,3% | 0,36 | ? |
SSR - тяжелая системная реакция, SLR - тяжелая местная реакция
| Положительные результаты: | >0,35 Ед/мл sIgE |
| >15% активированных базофилов |
Аллерген: оса
| Пациент | % активированных базофилов | Специфические IgE против аллергенов осы | Клинические проявления |
| Va | 88% | >17,5 | SSR |
| Ce-I | 58% | <0,35 | SSR |
| Ce-D | 59,9 | 5,9 | SSR |
| Во | 30% | <0,35 | SLR |
| Но | 7% | <0,35 | ? |
| En | 24,8% | 0,51 | ? |
| Ben | 8,5% | <0,35 | ? |
| Hav | 57,8% | 7,33 | SSR |
| Sev | 58% | <0,35 | SSR |
| Sch | 86% | >17,5 | SSR |
| Fru | 74,3% | 1,04 | ? |
| Bo | 30,9% | 1,33 | ? |
| Vla | 3,2% | <0,35 | ? |
| Vl | 2,1% | <0,35 | ? |
| Ja | 27,6% | 0,59 | ? |
| Kr | 71,5% | 0,75 | SSR |
| Pru | 78% | <0,35 | ? |
| Tu | 7,1% | 0.42 | ? |
| He | 76,1% | <0,35 | SSR |
| Ha | 89% | 0,87 | SSR |
| Ba | 8,1% | <0,35 | ? |
| Sko | 49,7% | <0.35 | SSL |
SSR - тяжелая системная реакция, SLR - тяжелая местная реакция
| Положительные результаты: | >0,35 Ед/мл sIgE |
| >15% активированных базофилов |
Claims (6)
1. Способ измерения активации базофилов для определения гиперчувствительности к аллергенам, характеризующийся тем, что образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 50 нг/мл в зависимости от объема образца и соответственно разведенный аллерген в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 мин, после чего добавляют меченое анти-СD63-антитело в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и меченое антитело против поверхностного маркера базофилов, выбранное из анти-СD123 или анти-СD203с антител, в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, затем образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 мин, лизируют и подвергают проточной цитометрии.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец крови с добавлением интерлейкина-3 в количестве от 0,05 до 5 нг/мл в зависимости от объема образца и соответственно разведенного аллергена в количестве от 0,5 до 100 единиц/мл инкубируют при температуре, соответствующей температуре живого организма, в течение 15-45 мин, после чего добавляют меченое анти-СD63-антитело в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови и меченое антитело, выбранное из анти-CD123 или анти-СD203с антител, в количестве от 3 до 30 мкл/100 мкл крови при температуре от 0 до +10°С, затем образец после встряхивания инкубируют в ледяной бане в течение 15-30 мин, лизируют и подвергают проточной цитометрии.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
5. Набор для определения гиперчувствительности к аллергенам, основанного на измерении активации базофилов, с помощью способа по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что он содержит, из расчета на 100 анализов, от 1 нг до 2 мкг интерлейкина-3, 200 мл буфера, 0,3-3 мл меченого анти-СD63-антитела и 0,3-3 мл меченого антитела против поверхностного маркера базофилов, выбранного из анти-СD123 или анти-СD203с антител, 4,33 мкг N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина и при необходимости традиционные растворители.
6. Набор по п.5, отличающийся тем, что он содержит, из расчета на 100 анализов, от 1 до 100 нг интерлейкина-3,200 мл буфера, 0,3-3 мл меченого анти-СD63-антитела и 0,3-3 мл меченого антитела, выбранного из анти-СD123 или анти-СD203с антител, 4,33 мкг N-формил-L-метионил-L-лейцил-L-фенилаланина и при необходимости традиционные растворители.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20013356A CZ292686B6 (cs) | 2001-09-17 | 2001-09-17 | Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit |
| CZPV2001-3356 | 2001-09-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004109985A RU2004109985A (ru) | 2005-05-10 |
| RU2273029C2 true RU2273029C2 (ru) | 2006-03-27 |
Family
ID=5473556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004109985/15A RU2273029C2 (ru) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | Способ и набор для определения индуцированной аллергеном активации базофилов для определения гиперчувствительности к некоторым веществам |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040265925A1 (ru) |
| EP (1) | EP1430305A2 (ru) |
| JP (1) | JP2005509845A (ru) |
| AU (1) | AU2002362316A1 (ru) |
| CA (1) | CA2460629A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ292686B6 (ru) |
| MX (1) | MXPA04002430A (ru) |
| RU (1) | RU2273029C2 (ru) |
| WO (1) | WO2003025566A2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2609839C1 (ru) * | 2016-03-30 | 2017-02-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Способ дифференциальной диагностики гиперчувствительности к яду пчелы (apis mellifera) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005007695A2 (en) * | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Anti-cd63 antibodies and methods of use thereof |
| US7772011B2 (en) * | 2005-03-21 | 2010-08-10 | Ronald Joseph Harbeck | Method and kit for detection of autoimmune chronic urticaria |
| JP2009516718A (ja) * | 2005-11-23 | 2009-04-23 | ウニベルジテート チューリッヒ | 経皮アレルゲン投与によるアレルギー治療 |
| US20090017475A1 (en) * | 2006-02-16 | 2009-01-15 | Bracco Research S.A. | Method to Determine Pseudo-Allergic Reactions |
| JP2009236798A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-15 | Sysmex Corp | 好塩基球の分類計数方法 |
| US10114012B2 (en) * | 2008-10-31 | 2018-10-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and assays for detecting and quantifying pure subpopulations of white blood cells in immune system disorders |
| CN103823069B (zh) * | 2014-03-07 | 2016-06-08 | 天津医科大学 | 血清特异性IgE生物学活性检测方法及其所使用的试剂盒 |
| CN104677810B (zh) * | 2015-01-30 | 2017-08-22 | 广东医学院附属医院 | 嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法 |
| BR102018015288A2 (pt) * | 2017-08-08 | 2021-11-09 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Método para comprovar uma ativação de basófilos |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19781554D2 (de) * | 1997-01-20 | 2000-07-13 | Orpegen Pharma Gmbh | Basophilen-Degranulationstest |
-
2001
- 2001-09-17 CZ CZ20013356A patent/CZ292686B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-09-10 US US10/489,884 patent/US20040265925A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-10 CA CA002460629A patent/CA2460629A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-10 AU AU2002362316A patent/AU2002362316A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-10 MX MXPA04002430A patent/MXPA04002430A/es unknown
- 2002-09-10 EP EP02798672A patent/EP1430305A2/en not_active Withdrawn
- 2002-09-10 WO PCT/CZ2002/000049 patent/WO2003025566A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-09-10 RU RU2004109985/15A patent/RU2273029C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-09-10 JP JP2003529145A patent/JP2005509845A/ja not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Антитела. Методы/Под ред. Д.Кэтти. Книга 1. М.: Мир, 1991, с.30. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2609839C1 (ru) * | 2016-03-30 | 2017-02-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Способ дифференциальной диагностики гиперчувствительности к яду пчелы (apis mellifera) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2460629A1 (en) | 2003-03-27 |
| CZ292686B6 (cs) | 2003-11-12 |
| EP1430305A2 (en) | 2004-06-23 |
| AU2002362316A1 (en) | 2003-04-01 |
| MXPA04002430A (es) | 2005-06-03 |
| CZ20013356A3 (cs) | 2003-08-13 |
| WO2003025566A2 (en) | 2003-03-27 |
| US20040265925A1 (en) | 2004-12-30 |
| JP2005509845A (ja) | 2005-04-14 |
| WO2003025566A3 (en) | 2004-02-26 |
| RU2004109985A (ru) | 2005-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hamilton | Assessment of human allergic diseases | |
| Sainte-Laudy et al. | Analysis of anti-IgE and allergen induced human basophil activation by flow cytometry. Comparison with histamine release | |
| Foster et al. | Human dendritic cell 1 and dendritic cell 2 subsets express FcεRI: correlation with serum IgE and allergic asthma | |
| DE69917051T2 (de) | "flow-zytometrischer" vollblut- dendritzelle- immunfunctiontest | |
| EP2037269B1 (en) | Allergy test based on flow cytometric analysis | |
| Georgitis et al. | Venom skin tests in insect-allergic and insect-nonallergic populations | |
| Davis et al. | Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis | |
| US20120083007A1 (en) | Basophil Activation Based Allergy Diagnostic Test | |
| US20240151710A1 (en) | Methods for detecting immune response | |
| RU2273029C2 (ru) | Способ и набор для определения индуцированной аллергеном активации базофилов для определения гиперчувствительности к некоторым веществам | |
| JP2014507005A (ja) | 全身における組織恒常性の撹乱をモニターする方法及び手段 | |
| Torrero et al. | CD200R surface expression as a marker of murine basophil activation | |
| US9891213B2 (en) | Granulocyte-based methods for detecting and monitoring immune system disorders | |
| EP1019546B1 (en) | Methods for measurement of lymphocyte function | |
| US20200011865A1 (en) | Methods and kits for detecting basophil activation | |
| Aljadi et al. | A novel tool for clinical diagnosis of allergy operating a microfluidic immunoaffinity basophil activation test technique | |
| US11119109B2 (en) | Method for detecting basophil activation | |
| US20160041185A1 (en) | Methods of Detecting Complement Fixing and Non-Complement Fixing Antibodies and Systems for Practicing the Same | |
| KR101981147B1 (ko) | 수지상세포를 이용한 면역 소재의 면역증진 효과 평가방법 및 면역 소재 스크리닝 방법 | |
| EP2210097B1 (de) | Verfahren zur in vitro-diagnose und/oder in vitro-therapieverfolgung von infektionen | |
| Alves et al. | Application of the chemiluminescence systems to evaluate the role of Fcγ and complement receptors in stimulating the oxidative burst in neutrophils | |
| Cooksey et al. | Natural killer cells in renal allograft rejection | |
| US20050003461A1 (en) | Method for detecting allergies | |
| Kon et al. | Unstimulated basophils in atopic and nonatopic subjects express intracellular interleukin‐4: detection by flow cytometry | |
| EP1991868B1 (en) | Method to determine pseudo-allergic reactions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070911 |