CZ292686B6 - Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit - Google Patents
Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit Download PDFInfo
- Publication number
- CZ292686B6 CZ292686B6 CZ20013356A CZ20013356A CZ292686B6 CZ 292686 B6 CZ292686 B6 CZ 292686B6 CZ 20013356 A CZ20013356 A CZ 20013356A CZ 20013356 A CZ20013356 A CZ 20013356A CZ 292686 B6 CZ292686 B6 CZ 292686B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- labeled
- basophils
- ige
- antibody
- allergen
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 230000007815 allergy Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims description 172
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 101000897042 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 31
- 102100021969 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 31
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 24
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 19
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 19
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 18
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 101000818522 Homo sapiens fMet-Leu-Phe receptor Proteins 0.000 description 7
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 7
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 7
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 102100021145 fMet-Leu-Phe receptor Human genes 0.000 description 7
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 4
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 3
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 3
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 3
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 3
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000009434 Actinidia chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 1
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000238713 Dermatophagoides farinae Species 0.000 description 1
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010038452 Interleukin-3 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010790 Interleukin-3 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009959 type I hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen spočívá v tom, že se krevní vzorek s přídavkem interleukinu-3 v množství 0,05 až 5 ng/ml, vztaženo na objem vzorku, a příslušně ředěného alergenu v množství 0,5 až 100 jednotek/ml inkubuje po dobu 15 až 45 minut při teplotě odpovídající fyziologickému prostředí, načež se při teplotě 0 až +10 .degree.C přidá značená protilátka anti-CD63 v množství 3 až 30 .mi.l/100 .mi.l krve a značená protilátka proti povrchovému znaku basofilu v množství 3 až 30 .mi.l/100 .mi.l krve a vzorek se po promíchání inkubuje po dobu 15 až 30 minut v ledové lázni, načež se zlyzuje a podrobí průtokové cytometrii. Kit pro stanovení přecitlivělosti na alergeny obsahuje na 100 testů 1 ng až 1 .mi.g interleukinu-3, 200 ml pufru, 0,3 až 3 ml značené protilátky anti-CD63 a 0,3 až 3 ml značené protilátky proti povrchovému znaku basofilu, 4,33 .mi.g N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-fenylalaninu a případně běžná vehikula.ŕ
Description
Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu stanovení aktivace basofilů v krvi pacienta po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na některé látky pomocí dvojího značení.
Dosavadní stav techniky
Ke zjištění přecitlivělosti organismu na některé látky se používají jednak testy in vivo (kožní testy, dvojitý slepý pokus) a jednak testy in vitro. V současné době je tendence spíše provádět testy in vitro, a to roto, aby pacient nebyl zatěžován alergenem. Dalšími důvody pro testy in vitro jsou věk pacienta, obava z hypersenzitivní reakce, komfort pacienta (na rozdíl od kožních vpichů, kdy jednomu vpichu odpovídá stanovení jednoho alergenu, při in vitro testech je možno v jednom náběru stanovit několik alergenů).
V současné době nejrozšířenějším testem in vitro je stanovení specifických IgE protilátek (slgE) v krvi pacienta, tj. konečného produktu specifické odpovědi buněk. Nejběžnějším principem testu je enzymová imunoanalýza (ELISA) v různých modifikacích. Stanovení je možno provádět s časovým odstupem od náběru pacienta a z jednoho náběru je možno stanovit protilátky proti více alergenům. Výsledky se však někdy rozcházejí s kožními testy, například pokud pacient nepřišel po nějakou dobu do styku s alergenem, mohou protilátky vymizet, i když přecitlivělost zůstává. Často se také stanovují křížově reagující protilátky a metoda je celkově špatně standardizovatelná.
Proto se v poslední době začaly rozvíjet metody, které sledují bezprostřední odpověď buněk na podnět. V současné době se pozornost soustřeďuje na basofily, což jsou specializované efektorové buňky imunitního systému, které hrají důležitou roli v alergických reakcích. Jejich stimulací dochází k aktivaci buněk, jež se projevuje jednak expresí některých receptorů na jejich povrchu (CD63) a jedna tvorbou některých cytokinů (podporují tvorbu slgE) a mediátorů (například histamin, leukotrieny atd.), které jsou zodpovědné za některé klinické projevy alergie.
Tyto metody nejsou dosud příliš rozšířeny. V současné době je možno stanovovat histamin a sulfidoleukotrieny v supematantu po předchozí stimulaci buněk alergenem pomocí testů ELISA. Nevýhodou je nutná separace buněk, při které může dojít k nespecifické aktivaci. Pacient také nesmí nejméně 48 hodin užívat antihistaminika.
Výhody stanovení exprese aktivačního znaku CD63 na basofílech jsou 1) práce s plnou krví, 2) používání solubilních alergenů, stejných jako při provádění kožních testů, 3) možnost stanovení přecitlivělosti I. typu na alergen, i když nejsou v periferní krvi přítomny slgE. Kromě toho nejsou buňky aktivovány křížově reagujícími protilátkami vzhledem k jejich nízké afinitě. Nevýhodou je to, že při velmi nízké hladivě celkového IgE (<80 IU/ml) se basofily velmi špatně značí a při vysoké hladině IgE může dojít k vyvázání přidané protilátky (anti-IgE).
Zavedením průtokové cytometrie, tj. metody, která dovoluje značení buněk pomocí povrchových znaků, se mohou rozvíjet metody, které jsou založeny na sledování buněčné odpovědi. Tato metoda tedy dovoluje sledovat bezprostřední reakci basofilů na alergen in vitro. V periferní krvi je zastoupení basofilů velmi nízké (asi 1 %) a patří do skupiny granulocytů, s nimiž sdílejí většinu povrchových znaků. V současné době se k jejich značení využívá faktu, že na svém povrchu, na rozdíl od jiných buněk, nesou receptor FcsRI, na který se vážou protilátky EgE. Basofily se proto značí fluorescenčně značenou protilátkou proti IgE (například metoda Basotest; výrobce Orpegen Pharma).
-1 CZ 292686 B6
Podstata vynálezu
Protože jsme přesvědčeni, že stanovení aktivace basofilů je metoda, která se blíží nejvíce poměrům in vivo, snažili jsme se překonat nevýhody značení basofilů pomocí anti-IgE protilátek. Zjistili jsme, že mnohem výhodnější je značit basofily pomocí protilátky, zaměřené proti povrchovému znaku, který je pro ně charakteristický. Je tak možno překonat nevýhody související hlavně s nízkou hladinou IgE, neboť toto značení je na ní nezávislé. V současné době je známo, že receptor pro interleukin-3 (IL-3) je exprimován na basofilech a nese označení CD123. Z tohoto důvodu je možno pro označení basofilů zvolit značenou protilátku, která je připravena proti tomuto znaku. Dalším povrchovým znakem pro značení basofilů může být CD203c, takže je možno použít protilátku anti-CD203c.
Předmětem vynálezu tedy je způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen, jehož podstata spočívá v tom, že se krevní vzorek s přídavkem interleukinu-3 v množství 0,05 až 50 ng/ml, vztaženo na objem vzorku, a příslušně ředěného alergenu v množství 0,5 až 100 jednotek/ml vzorku inkubuje po dobu 15 až 45 minut při teplotě odpovídající fyziologickému prostředí, načež se při teplotě 0 až +10 °C přidá značená protilátka anti-CD63 v množství 3 až 30 μΐ/ΐ 00 μΐ krve a značená protilátka proti povrchovému znaku basofilů v množství 3 až 30 μ1/100 μΐ krve a vzorek se po promíchání inkubuje po dobu 15 až 30 minut v ledové lázni, načež se zlyzuje a podrobí průtokové cytometrii.
Předmětem vynálezu je rovněž kit pro stanovení přecitlivělosti na alergeny na základě měření aktivace basofilů, jehož podstata spočívá vtom, že na 100 testů obsahuje 1 ng až 1 pg interleukinu-3, 200 ml pufru, 0,3 až 3 ml značené protilátky anti-CD63 a 0,3 až 3 ml značené protilátky proti povrchovému znaku basofilů, 4,33 mg N-formyl-L-Hnethionyl-L-leucyl-Lfenylalaninu a popřípadě běžná vehikula.
Stanovení se provádí v plné krvi. Po přidání alergenu a během následné inkubace dochází u buněk, které jsou citlivé na přidaný alergen, kjeho vazbě na IgE protilátky, které jsou specifické proti danému alergenu. Vazbou antigen-protilátka dostávají buňky pokyn k zahájení aktivace a tím k rozběhnutí průchodů, které končí degrenulací basofilů a uvolněním mediátorů in vivo odpovědných za alergickou reakci. Odpověď basofilů se sleduje měřením exprese aktivačního antigenu CD63 pomocí značené protilátky anti-CD63. Basofily jsou značeny protilátkou proti znaku, který nesou na svém povrchu, výhodně protilátkou proti znaku CD 123 (receptor pro IL—3) nebo proti znaku CD203c. Pokud na basofilech pacienta nejsou navázány protilátky proti přidanému alergenu, nedochází k reakci antigen-protilátka, a tím ani k aktivaci buněk, a tudíž ani k expresi CD63.
Přehled obrázků na výkresech
Na připojených obrázcích je pro každého testovaného pacienta uveden soubor histogramů, získaných průtokovým cytometrem Coulter Epics.
Obr. 1-1 a 1-2 představují srovnání detekce basofilů pomocí protilátek anti-IgE/FITC a CD123ZPE.
Na obr. 1-1 je znázorněna společná exprese CD123+/IgE+ na basofilech při koncentraci celkového IgE v séru 66,5 U/ml (pro pacienta č. 18765, uvedeného níže v tabulce 1).
Obrázek 1-1 sestává z těchto částí.
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu F se nachází buňky odpovídající basofilům.
-2CZ 292686 B6
Histogram 2: sledování exprese znaku CD 123 na basofilech značených anti-IgE/FITC v gatu F
Kvadrant Bl: basofíly značené pouze anti-igE/FITC - 18,6 %, nenesou znak CD 123
Kvadrant B2: basofíly značené jako anti-IgE/FITC, tak CD123PPE- 81,4 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: buňky, které jsou značeny pouze protilátkou CD123/PE - 0 %
Histogram 3: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD123/PE
- v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilům
Histogram 4\ sledování značení protilátkou anti-IgE/FITC na basofilech značených CD123/PE v gatu A
Kvadrant Gl: basofíly značené pouze anti-IgE/FITC a nenesou znak - CD123 0 %
Kvadrant G2: basofíly značené jako anti-igE/FITC, tak CD123/PE - 73,0 %
Kvadrant G3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant G4: buňky, které jsou značeny pouze protilátkou CD123/PE - 27 %
Z histogramu 1 a 2 vyplývá, že při detekci basofílů pomocí protilátky anti-igE/FITC se mezi předpokládanými basofílními buňkami nachází i jiné, které je sice možno touto protilátkou značit, ale není je možno značit protilátkou CD123/PE (CD123-povrchový znak specifický znak basofíly) a jsou to tedy jiné buňky než basofíly (histogram 2, kvadrant Bl - 18,6 % buněk). Basofíly se nachází v kvadrantu B2- 81,4 %.
Z histogramu 3 a 4 vyplývá, že ne všechny basofíly, které jsou značeny CD123/PE, je možno značit i protilátkou proti IgE. V kvadrantu G4 se nachází basofíly, které nejsou značeny pomocí anti-igE/FITC - 27 %.
Na obr. 1-2 je znázorněna společná exprese CD123+/IgE+ na basofilech při koncentraci celkového IgE v séru 41,9 U/ml (pro pacienta č. 18455, uvedeného níže v tabulce 1).
Obrázek 1-2 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-igE/FITC - v gatu F se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 2: sledování exprese znaku CD 123 na basofilech značených anti-igE/FITC v gatu F.
Kvadrant Β1: basofíly značené pouze anti-igE/FITC - 79 %, nenesou znak CD123
Kvadrant B2: basofíly značené jak anti-igE/FITC, tak CD123/PE - 21 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: buňky, které jsou značeny pouze protilátkou CD123/PE - 0 %
Histogram 3: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD123/PE
- v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilům.
-3CZ 292686 B6
Histogram 4: sledování značení protilátkou anti-IgE/FITC na basofílech značených CD123PE v gatu A.
Kvadrant Gl: basofily značené pouze anti-IgE/FITC a nenesou znak CD 123-0 %
Kvadrant G2: basofily značené jak anti-IgE/FITC, tak CD123/PE-19 %
Kvadrant G3: buňky, které nejsou značeny pouze protilátkou CD123/PE - 81 %
Z histogramu 1 a 2 vyplývá, že při detekci basofilů pomocí protilátky anti-IgE/FITC se mezi předpokládanými basofilními buňkami nachází i jiné, které je sice možno touto protilátkou značit, ale není je možno značit protilátkou CD123/PE (CD123-povrchový znak, specifický znak pro basofily) a jsou to tedy jiné buňky než basofily (histogram 2, kvadrant B1 - 79 % buněk). Basofily se nachází v kvadrantu B2-21 %.
Z histogramu 3 a 4 vyplývá, že ne všechny basofily, které jsou značeny CD123/PE, je možno značit i protilátkou proti IgE. V kvadrantu G4 se nachází basofily, které nejsou značeny pomocí anti-IgE/FITC - 81 %.
Obr. 2-1 a 2-2 představují srovnání detekce basofilů pomocí protilátek anti-IgE/FITC aCD203c/PE.
Obr. 2-1 znázorňuje společnou expresi CD203c+/IgE+ na basofílech při koncentraci celkového IgE v séru 91 U/ml (pro pacienta č. 19864, uvedeného níže v tabulce 2).
Obrázek 2-1 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu F se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 2: sledování exprese znaku CD203c na basofílech značených anti-IgE v gatu F.
Kvadrant Bl: basofily značené pouze anti-IgE/FITC - 22,6 %, nenesou znak CD203c/Je
Kvadrant B2: basofily značené jak anti-IgE/FITC, tak CD203c/PE - 77,4 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: buňky, které jsou značeny pouze protilátkou CD203c/PE - 0 %
Histogram 3: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD203c/PE - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 4: sledování značení protilátkou anti-IgE/FITC na basofílech značených CD203c/Pe gatu A.
Kvadrant Gl: basofily značené pouze anti-IgE/FITC a nenesou znak CD203c- 0 %
Kvadrant G2: basofily značené jak anti-IgE/FITC, tak CD203c/PE- 82,3 %
Kvadrant G3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant G4: buňky, které jsou značeny pouze protilátkou CD203c/PE - 17,7 %
-4CZ 292686 B6
Z histogramu 1 a 2 vyplývá, že při detekci basofílů pomocí protilátky anti-IgE/FITC se mezi předpokládanými basofilními buňkami nachází i jiné, které sice je možno touto protilátkou značit, ale není je možno značit protilátkou CD203c/PE (specifický znak pro basofily) a jsou to tedy jiné buňky než basofily (histogram 2, kvadrant B1 - 22,6 % buněk). Basofily se nachází v kvadrantu B2 - 77,4 %.
Z histogramu 3 a 4 vyplývá, že ne všechny basofily (jsou značeny CD203c/PE) je možno značit i protilátkou proti IgE. V kvadrantu G4 se nachází basofily, které nejsou značeny pomocí anti-IgE/FITC- 17,7 %.
Obr. 2-2 znázorňuje společnou expresi CD203c+/IgE+ na basofilech při koncentraci celkového IgE v séru 42,9 U/ml (pro pacienta č. 19397, uvedeného níže v tabulce 2).
Obrázek 2-2 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou antiIgE/FITC - v gatu F se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 2: sledování exprese znaku CD203c na basofilech značených anti-IgE v gatu F.
Kvadrant Bl: basofily značené pouze anti-IgE/FITC - 2,1 %, nenesou znak CD203c/PE
Kvadrant B2: basofily značené jak anti-IgE/FITC, tak CD203c/PE - 77,9 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: buňky, které jsou značeny pouze protilátkou CD203c/PE - 0 %
Histogram 3: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD203c/PE - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilm.
Histogram 4\ sledování značení protilátkou anti-IgE/FITC na basofilech značených CD203c/PE gatu A.
Kvadrant Gl: basofily značené pouze anti-IgE/FITC a nanesou znak CD203c - 0 %
Kvadrant G2: basofily značené jak anti-IgE/FITC, tak CD203c/PE - 67,7 %
Kvadrant G3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0%
Kvadrant G4: buňky, které jsou značeny pouze protilátkou CD203c/PE - 32,3 %
Z histogramu 1 a 2 vyplývá, že při detekci basofilů pomocí protilátky anti-IgE/FITC se mezi předpokládanými basofilními buňkami nachází i jiné, které sice je možno touto protilátkou značit, ale není je možno značit protilátkou CD203c/PE (specifický znak pro basofily) a jsou to tedy jiné buňky než basofily (histogram 2, kvadrant Bl - 22,1 % buněk). Basofily se nachází v kvadrantu B2 - 77,9 %.
Z histogramu 3 a 4 vyplývá, že ne všechny basofily (jsou značeny CD203c/PE) je možno značit i protilátkou proti IgE. V kvadrantu G4 se nachází basofily, které nejsou značeny pomocí anti-IgE/FITC-32,3%.
Z obrázků 1-1 až 2-2 vyplývá, že značení basofilů protilátkou proti IgE není specifické a jsou značeny ještě i jiné buňky než basofily, což může vyšetření zkreslit. Na druhé straně při nízké hodnotě IgE nedochází ke značení všech basofilů pomocí protilátky anti-IgE/FITC (obr. 1-2).
-5CZ 292686 B6
Obr. 3-1 až 3-4 představují sledování aktivace basofilů u pacienta č. 19864 po stimulaci hmyzími alergeny (vosa, včela).
Obr. 3-1 znázorňuje výsledky u vzorku bez stimulace, tj. nulovou kontrolu.
Obrázek 3-1 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2·. sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených anti-IgE v gatu A.
Kvadrant Bl: basofily značené pouze CD63/PE - 0 %
Kvadrant B2: basofily (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen CD63 - 5,1 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofily (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-) - 94,9 %.
Obr. 3-2 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného nespecificky FMLP, tj. nespecifickou kontrolu.
Obrázek 3-2 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených anti-IgE v gatu A.
Kvadrant Bl: basofily značené pouze CD63/PE - 0 %
Kvadrant B2: basofily (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen CD63 - 49,3 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofily (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-)- 50,7 %
Obr. 3-3 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny vosy.
Obrázek 3-3 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených anti-IgE v gatu A.
Kvadrant Bl: basofily značené pouze CD63/PE - 0 %
Kvadrant B2: basofily (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen - CD63-5,0 %
-6CZ 292686 B6
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofily (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-), 95,0 %
Obr. 3—4 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny včely.
Obrázek 3-4 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofílech značených anti-IgE v gatu A.
Kvadrant Bl: basofily značené pouze CD63/PE- 0 %
Kvadrant B2: basofily (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen CD63-61,8 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofily (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-)-38,2 %
Obr. 4-1 až 4-8 představují sledování aktivace basofilů pacienta č. 15931 po stimulaci potravinovými alergeny. Na obr. 4-1 až 4—4 je značení basofilů pomocí CD123/Pe, na obr. 4-5 až 4-8 značení basofilů pomocí protilátky anti-IgE/FITC.
Obr. 4-1 znázorňuje výsledky u vzorku bez stimulace, tj. nulovou kontrolu.
Obrázek 4-1 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD123/PE v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofílech značených CD123/PE v gatu A.
Kvadrant Bl: basofily značené pouze CD63/FITC - 0 %
Kvadrant B2: basofily (značené CD123/PE) exprimující aktivační antigen CD63-6 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofily (značené CD123/PE), které nejsou aktivovány (CD63-)- 94 %
Obr. 4-2 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny bílku.
Obrázek 4-2 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD123/PE - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofilům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofílech značených CD123/PE v gatu A.
Kvadrant Β1: basofily značené pouze CD63/FITC - 0 %
-7CZ 292686 B6
Kvadrant B2: basofíly (značené CD123/PE) exprimující aktivační antigen CD63- 57 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofíly (značené CD123/PE), které nejsou aktivovány (CD63-)-43 %
Obr. 4-3 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny mléka.
Obrázek 4-3 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD123/PE v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených CD123/PE v gatu A.
Kvadrant Bl: basofíly značené pouze CD63/FITC - 0 %
Kvadrant B2: basofíly (značené CD123/PE) exprimující aktivační antigen CD63-70,7 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofíly (značené CD123/PE), které nejsou aktivovány (CD63-)- 29,3 %
Obr. 4—4 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny pšeničné mouky.
Obrázek 4-4 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišené buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou CD123/PE - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených CD12/PE v gatu A.
Kvadrant Bl: basofíly značené pouze CD63/FITC - 0 %
Kvadrant B2: basofíly (značené CD123/PE) exprimující aktivační antigen CD63- 11,1 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofíly (značené CD123/PE), které nejsou aktivovány (CD63-)- 88,9 %
Obr. 4-5 znázorňuje výsledky u vzorku bez stimulace, tj. nulovou kontrolu.
Obrázek 4-5 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-igE/FITC - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených anti-igE/FITC v gatu A.
Kvadrant Β1: basofíly značené pouze CD63/PE- 0 %
-8CZ 292686 B6
Kvadrant B2: basofíly (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen CD63-6,0 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofíly (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-)- 94 %.
Obr. 4-6 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny bílku.
Obrázek 4-6 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených anti-IgE/FITC v gatu A.
Kvadrant Bl: basofíly značené pouze CD63/PE - 0 %
Kvadrant B2: basofíly (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen CD63- 57,2 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofíly (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-)- 42,8 %
Obr. 4-7 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny mléka.
Obrázek 4—7 sestává z těchto částí:
Histogram Γ. rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC - v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených anti-IgE/FITC v gatu A.
Kvadrant Bl: basofíly značené pouze CD63/PE- 0 %
Kvadrant B2: basofíly (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen CD63 - 62,6 %
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofíly (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-)- 37,4 %
Obr. 4-8 znázorňuje výsledky u vzorku stimulovaného alergeny pšenice mouky.
Obrázek 4-8 sestává z těchto částí:
Histogram 1: rozlišení buněk podle bočního rozptylu světla (SS) a značení protilátkou anti-IgE/FITC v gatu A se nachází buňky odpovídající basofílům.
Histogram 2: sledování exprese aktivačního znaku CD63 na basofilech značených anti-IgE/FITC v gatu A.
Kvadrant Bl: basofíly značené pouze CD63/PE- 0 %
Kvadrant B2: basofíly (značené anti-IgE/FITC) exprimující aktivační antigen CD63 - 5,8 %
-9CZ 292686 B6
Kvadrant B3: buňky, které nejsou značeny ani jednou z protilátek - 0 %
Kvadrant B4: basofily (značené anti-IgE/FITC), které nejsou aktivovány (CD63-)- 94,2 %.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Vyšetření se provádí z plné krve odebrané do heparinu. Pro každý test se do zkumavky napipetuje 100 μΐ plné krve a 10 μΐ roztoku IL-3 v PBS (pufrovaný fyziologický roztok) o koncentraci 0,05 pg/ml. Do zkumavky pro negativní kontrolu se přidá 100 μΐ PBS, do zkumavky pro pozitivní kontrolu 100 μΐ roztoku FMLP (chemotaktický peptid N-formyl-Lmethionyl-L-leucyl-L-fenylalanin) o koncentraci 0,433 pg/ml a do zkumavky s testovaným vzorkem 100 μΐ příslušně ředěného alergenu. Vzorky se dobře promíchají a inkubují 30 minut v termostatu při 37 °C. Poté se přenesou do ledové lázně. Do každé zkumavky se napipetuje 20 μΐ monoklonální protilátky anti-CD123, značené PE (phycoerythrinem; od firmy Becton Dickinson) a 5 μΐ monoklonální protilátky anti-CD63, značené FITC, od firmy Caltag. Vzorky se dobře promíchají a inkubují v ledové lázni 15 až 20 min. Další zpracování se provádí při laboratorní teplotě. Erytrocyty ve vzorku se zlyzují přidání lyzačního činidla, například 2 ml NH4CI. Po zlyzování se vzorky zcentrifugují při 1000 ot/min. Vzorek se dekantuje a k sedimentu se přidá 0,5 ml PBS. S takto připraveným vzorkem se provede měření na cytometru.
Příklad 2
Vyšetření se provádí z plné krve odebrané do heparinu. Po každý test se do zkumavky napipetuje 100 μΐ plné krve a 10 μΐ roztoku IL-3 v PBS o koncentraci 0,05 pg/ml. Do zkumavky pro negativní kontrolu se přidá 100 μΐ PBS, do zkumavky pro pozitivní kontrolu 100 μΐ roztoku FMLP o koncentraci 0,433 pg/ml a do zkumavky s testovaným vzorkem 100 μΐ příslušně ředěného alergenu. Vzorky se dobře promíchají a inkubují 30 min v termostatu při 37 °C. Poté se přenesou do ledové lázně. Do každé zkumavky se napipetuje 20 μΐ monoklonální protilátky anti-CD203c, značené PE, od firmy Immunotech a 5 μΐ monoklonální protilátky anti-CD63, značené FITC, od firmy Caltag. Vzorky se dobře promíchají a inkubují v ledové lázni 15 až 20 min. Další zpracování se provádí při laboratorní teplotě. Erytrocyty ve vzorku se zlyzují přidáním lyzačního činidla, například 2 ml NH4CI. Po zlyzování se vzorky zcentrifugují při 1000 ot/min. Vzorek se dekantuje a k sedimentu se přidá 0,5 ml PBS. S takto připraveným vzorkem se provede měření na cytometru.
Příklad 3
Vyšetření je provedeno z kitu, který obsahuje 1 ml roztoku IL-3 (Sigma) o koncentraci 0,05 pg/ml, 200 ml PBS, 2 ml protilátky anti-CD63 značené FITC (Immunotech), 2 ml protilátky anti-CD203c značené PE (Immunotech), lOml roztoku FMLP o koncentraci 4,33 pg/ml a 200 ml lyzačního roztoku. Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinu. Pro každý test se do zkumavky napipetuje 100 μΐ plné krve a 10 μΐ roztoku IL-3 v PBS (pufrovaný fyziologický roztok) o koncentraci 0,05 pg/ml. Do zkumavky pro negativní kontrolu se přidá 100 μΐ PBS, do zkumavky pro pozitivní kontrolu 100 μΐ roztoku FMLP o koncentraci 4,33 pg/ml a do zkumavky s testovaným vzorkem 100 μΐ příslušně ředěného alergenu. Vzorky se dobře promíchají a inkubují 30 min v termostatu při 37 °C. Poté se přenesou do ledové lázně. Do každé zkumavky se napipetuje 20 μΐ monoklonální protilátky anti-CD203c, a 20 μΐ monoklonální protilátky
-10CZ 292686 B6 anti-CD63. Vzorky se dobře promíchají a inkubují v ledové lázni 15 až 20 min. Další zpracování se provádí při laboratorní teplotě. Erytrocyty ve vzorku se zlyzují přidání lyzačního činidla, například 2 ml NH4CI. Po zlyzování se vzorky zcentrifugují při 1000 ot/min. Vzorek se dekantuje a k sedimentu se přidá 0,5 ml PBS. S takto připraveným vzorkem se provede měření na cytometru.
Příklad 4
Vyšetření se provádí z plné krve odebrané do heparinů. Pro každý test se do zkumavky napipetuje 100 μΐ krve a 10 μΐ roztoku IL-3 v PBS o koncentraci 0,5 pg/ml. Do zkumavky pro negativní kontrolu se přidá 100 μΐ PBS, do zkumavky pro pozitivní kontrolu 100 μΐ roztoku FMLP o koncentraci 0,433 pg/ml a do zkumavky s testovaným vzorkem 100 μΐ příslušně ředěného alergenu. Vzorky se dobře promíchají a inkubují 30 min v termostatu při 37 °C. Poté se přenesou do ledové lázně. Do každé zkumavky se napipetuje 20 μΐ monoklonální protilátky anti-CD203c, značené PE, od firmy Immunotech a 5 μΐ monoklonální protilátky anti-CD63, značené FITC, od firmy Caltag. Vzorky se dobře promíchají a inkubují v ledové lázni 15 až 20 min. Další zpracování se provádí při laboratorní teplotě Erytrocyty ve vzorku se zlyzují přidáním lyzačního činidla, například 2 ml NH4CI. Po zlyzování se vzorky zcentrifugují při 1000 ot/min. Vzorek se dekantuje a k sedimentu se přidá 0,5 ml PBS. S takto připraveným vzorkem se provede měření na cytometru.
Příklad 5
Vyšetření je provedeno z kitu, který obsahuje 1 ml roztoku IL-3 (Sigma) o koncentraci 1 pg/ml, 200 ml PBS, 2 ml protilátky anti-CD63 značené FITC (Beckman-Coulter), 2 ml protilátky anti-CD203c značené PE (Beckman-Coulter), 10 ml roztoku FMLP o koncentraci 4,33 pg/ml a 200 ml lyzačního roztoku. Stanovení se provádí z plné krve odebrané do heparinů. Pro každý test se do zkumavky napipetuje 100 μΐ plné krve a 10 μΐ roztoku IL-3 v PBS o koncentraci 0,05 pg/ml. Do zkumavky pro negativní kontrolu se přidá 100 μΐ PBS, do zkumavky pro pozitivní kontrolu 100 μΐ roztoku FMLP o koncentraci 4,33 μβ/πύ a do zkumavky s testovaným vzorkem 100 μΐ příslušně ředěného alergenu. Vzorky se dobře promíchají a inkubují 30 min v termostatu při 37 °C. Poté se přenesou do ledové lázně. Do každé zkumavky se napipetuje 20 μΐ monoklonální protilátky anti-CD203c a 20 μΐ monoklonální protilátky anti-CD63. Vzorky se dobře promíchají a inkubují v ledové lázni 15 až 20 min. Další zpracování se provádí při laboratorní teplotě Eiytrocyty ve vzorku se zlyzují přidáním lyzačního činidla, například 2 ml NH4CI. Po zlyzování se vzorky zcentrifugují při 1000 ot/min. Vzorek se dekantuje a k sedimentu se přidá 0,5 ml PBS. S takto připraveným vzorkem se provede měření na cytometru.
Výsledky měření na průtokovém cytometru Coulter Epics (firmy Coulter) jsou uvedeny v tabulkách a znázorněny na připojených obrázcích:
Seznam zkratek a termínů:
IL-3 - interleukin-3,
PBS - pufrovaný fyziologický roztok,
FMLP - N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-fenylalanin,
FITC- fluorescein izothiokyanát
PE - phycoerythrin,
DF - Dermatophagoides farinae (roztoč),
DP - Dermatophagoides pteronyssinus (roztoč), gate, gatování - průtokové cytometrii vymezení oblasti, ve které chceme sledovat například značené buňky.
-11 CZ 292686 B6
Tabulka 1 Společná exprese CD123+/IgE+ na basofilech v závislosti na koncentraci celkového IgE v séru
| č. pacienta | IgEU/ml | CD123+IgE+ | |
| gate IgE+ | gate CD 123+ | ||
| MH | 48 | 79% | 56 |
| 18455 | 41,9 | 21 % | 19% |
| Ϊ5931 | > 17 800 | 32% | 80% |
| 17669 | 169 | 92% | 91% |
| 18394 | 428 | 68,6 % | 84,5 % |
| 18483 | 53 | 85% | 100 % |
| 18539 | 251 | 82% | 87% |
| 18535 | 12,5 | 12% | 2,5 % |
| 18507 | 11,1 | 6,2 % | 3% |
| 18517 | >2 000 | 62,7 % | 65,3 % |
| 18765 | 66,5 | 81,4% | 73% |
| 12525 | 22 | 93% | 71% |
| 12580 | 395 | 88% | 80% |
| 12560 | 10,3 | málo buněk | 4,8 % |
| 12530 | 95 | 68% | 69% |
| 19864 | 91 | 82,7 % | 84,1 % |
| JK | 200 | 91 % | 85% |
V tabulce a v přiložených obrázcích 1-1 a 1-2 je několik příkladů dvojího značení basofilů. Bylo sledováno, jako % basofilů, které je značeno protilátkou anti-IgE, nese i znak CD123 a obráceně, jaké % basofilů, které je značeno anti-CD123, je značeno i anti-IgE.
Z tabulky vyplývá, že značení basofilů protilátkou anti-IgE je vhodné pro hladiny IgE 100-400U/ml. Při nízké hladině IgE (pac. MH, 18535, 18455,18507, 12560) se basofily značené anti-IgE nedají gatovat, neboť se na ně protilátka neváže. Naopak, při vysoké hladině IgE (pac. 15931) dochází buď k nespecifické vazbě protilátky na monocyty nebo přidána protilátka je vyvázána sérovým IgE.
Tabulka 2 Společná exprese CD203c+/IgE+ na basofilech v závislosti na koncentraci celkového IgE v séru
| č. pacienta | IgEU/ml | CD203c+IgE+ | |
| gate IgE+ | gate CD203c+ | ||
| 19864 | 91 | 77,4% | 82,3% |
| 19397 | 42,9 | 77,9% | 67,7% |
| 20156 | 42,5 | 92,7% | 90,7% |
| MH | 48 | 91,5% | 45,4% |
| JK | 200 | 87,1% | 97,3% |
V tabulce a v přiložených je značeno protilátkou anti-IgE, nese i znak CD203c a obráceně, jaké % basofilů, které je značeno anti-CD203c, je značeno i anti-IgE.
Závislost aktivace basofilů na koncentraci přidaného IL-3.
-12CZ 292686 B6
Tabulka 3
| konc. IL-3 ng/ml | nulová kontrola K0 | nespec, kontr. KN | spec, stimulace směs 3 trav |
| 5 | 1,6 % | 37,5 % | 38,4% |
| 2,5 | 5,9 % | 34,1 % | 28,7 % |
| 1,25 | 1,6 % | 27,8 % | 29,2 % |
| 0,062 | 1,6 % | 30,6 % | 28,2 % |
| 0 (PBS) | 1,0 % | 15,2 % | 3,9 % |
Tabulka 4
| konc. 11-3 ng/ml | nulová kontrola K0 | spec, stimulace pes-epitel |
| 5 | 3,3 % | 56,9 % |
| 2,5 | 6,3 % | 53,4 % |
| 1,25 | - | 51,6% |
| 0,625 | - | 49,4 % |
| 0,312 | 3,1 % | 49,2 % |
| 0,156 | - | 51,8% |
| 0,078 | 2,8 % | 44,3 % |
| 0,039 | - | 42,5 % |
| 0 (PBS) | 6,4 % | 40,7 % |
Tabulka 5
| konc. IL-3 ng/ml | nulová kontrola K0 | spec, stimulace roztečDF | nespec, stimulace KN |
| 5 | 1,6 % | 82,1 % | 18,5 % |
| 2,5 | 2,5 % | 83,3 % | 16,4 % |
| 1,25 | 2,5 % | 83,2 % | 15,0% |
| 0,625 | 3,1 % | 85,5 % | 16,2 % |
| 0,312 | 3,7 % | 81,1 % | 17,1 % |
| 0,156 | 3,9 % | 81,1 % | 14,5 % |
| 0 (PBS) | 2,6 % | 17,0 % | 10,9 % |
Závislost na době inkubace
Tabulka 6
| doba inkubace min | nulová kontrola K0 | spec, stimulace roztečDF | nespec, stimulace KN |
| 15 | 5,8% | 85,0 % | 24,3 % |
| 30 | 3,1% | 86,4 % | 19,0 % |
| 45 | 2,5% | 77,9 % | 19,5% |
-13CZ 292686 B6
Tabulka 7
| doba inkubace min | nulová kontrola KO | spec, stimulace směs trav-ST | nespec, stimulace KN |
| 15 | 4,3 % | 32,4 % | 40,9 % |
| 30 | 6,7 % | 31,5 % | 41,6% |
| 45 | 11,4% | 35,1 % | 15,0% |
Tabulka 8
| doba inkubace min. | nulová kontrola K0 | spec. stim. vosa | spec. stim. včela | nespec, stim. NK |
| 15 | 6,6 % | 88,1 % | 8,4 % | 23,4 % |
| 30 | 4,7 % | 89,1 % | 11,9% | 37,3 % |
| 45 | 6,7 % | 78,5 % | 10,5 % | 28,5 % |
Tabulka 9
| doba inkubace min. | nulová kontrola K0 | spec. stim. roztoč-DF | spec. stim. bílek | nespec, stim. NK |
| 15 | 2,4 % | 7,6 % | 6,8 % | 41,6 % |
| 30 | 2,9 % | 4,5 % | 7,4 % | 42,1 % |
| 45 | 4,8 % | 13,0 % | 4,6 % | 22,4 % |
Závislost na předinkubaci krve s IL-3
Tabulka 10
| doba předinkubace min | nulová kontrola K0 | spec, stimulace směs trav-ST | nespec, stimulace KN |
| 0 | 5,3 % | 99,1 % | 28,5 % |
| 10 | 5,8 % | 96,8 % | 53,0 % |
Tabulka 11
| doba předink. min | nul. kontr. K0 | spec. stim. brizovité | spec. stim. celer | spec. stim. kiwi | spec. stim. směs trav | nesp. stim. KN |
| 0 | 2,7 % | 94% | 94,7 % | 11,9% | 98,4 % | 48% |
| 10 | 4,1 % | 94% | 94% | 12,5 % | 99% | 74,5 % |
Tabulka 12
| doba předinkubace min | nulová kontrola K0 | spec, stimulace směs trav-ST | nespec, stimulace KN |
| 0 | 5,7 % | 67,8 % | 22,8 % |
| 10 | 6,0 % | 61,8 % | 35,4 % |
- 14CZ 292686 B6
Závislost na ředěni alergenu
Tabulka 13
| alergen | ředění alergenu 100 U/m | ||
| 5x | lOx | 20x | |
| celer | 50,6 % | 80,3 % | 91% |
| bříza | 46,5 % | 46,2 % | 46,3 % |
| mouka pšeničná | 7,7 % | 13,5 % | 8,6 % |
Tabulka 14
| alergen | ředění alergenu 1001 | J/ml | |||
| lOx | 20x | 40x | 80x | lOOx | |
| vosa | 30,9 % | 13,2 % | 10,4% | - | — |
| včela | 29,7 % | 40,8 % | 50,0 % | 41,5 % | 36,8 % |
Tabulka 15
| alergen | ředění alergenu 100 U/m | ||
| lOx | lOOx | lOOOx | |
| jablko | 52,8 % | 7,5 % | 1,0% |
| ořech vlašský | 72,6 % | 57,2 % | 5,6 |
Tabulka 16
| alergen | ředění alergenu 100 U/m | ||
| lOx | lOOx | lOOOx | |
| jílek | 31 % | 25% | 21 % |
| bojínek | 32% | 32,5 % | 25% |
Tabulka 17
| alergen | ředění alergenu 100 U/m | ||
| lOx | lOOx | lOOOx | |
| směs trav | 42% | 43,5 % | 54,3 % |
Tabulka 18
| alergen | ředění alergenu 100 U/m | ||
| lOx | lOOx | lOOOx | |
| směs trav | 39 % | 10,7 % | 6,7 % |
-15CZ 292686 B6
Tabulka 19
Tabulka 22
| konc. IL-3 ng/ml | nul. kontr. K0 | spec. stim. včela lOx | spec. stim. včela lOOx | nesp. stim. KN |
| 2,5 | 6,9 % | 85,2 % | 94,7 % | 41,1 % |
| 1,25 | 3,4 % | 77,1 % | 75,2 % | 39,4 % |
| 0,625 | 2,2 % | 86,9 % | 80,2 % | 42,4 % |
Základní koncentrace alergenu je 100 U/ml.
Normální hodnoty: K0 < 8 % s alergenem <15%
Srovnání výsledků pacientů popsaným postupem a značením basofilů anti-IgE, cmti-CD123 nebo anti-203c s testem s názvem BASOTESTfirmy ORPEGEN.
Srovnání anti-IgE/CD63, Besotest
Pacl
| nulová kontr. K0 | spec. stim. bříza | spec. stim. celer | spec. stim. směs trav | |
| IgE/CD63 | 6,0 % | 93% | 95,8 % | 12,9 |
| Basotest | 5,5 % | 87,8 % | 90% | 13,5 % |
- 16CZ 292686 B6
Pac 2
| nulová kontr. K0 | spec. stim. včela | spec. stim. vosa | spec. stim. směs bříza | spec. stim. směs trav | |
| IgE/CD63 | 1,6% | 0,9 % | 63,6 % | 2,0 % | 1,0 % |
| Basotest | 3,6 % | 1,0 % | 68,1 % | 1,6 % | 1,3 % |
Srovnáni anti-CD123, Basotest
Pac 3
| nulová kontr. K0 | spec. stim. DFroztoč | spec. stim. DProztoč | spec. stim. směs trav | |
| CD123/CD63 | 6,4 % | 11,8% | 11,7% | 12,3 % |
| Basotest | 2,4 % | 2,9 % | 4,2 % | 11,7% |
Pac 4
| nulová kontr. K0 | spec. stim. vosa | spec. stim. včela | nespec, stim. KN | |
| CD123/CD63 | 2,3 % | 8,5 % | 5,2 % | 46,1 % |
| Basotest | 1,0% | 5,2 % | 1,5 % | 42,3 % |
Srovnání Besotest, anti CD123/CD63, anti-CD203c/CD63
Pac 5
| nulová kontr. K0 | nesp. kontr. KN | spec. stim. epitel psa | |
| Basotest | 3,5 % | 78,8 % | 5,1 % |
| CD123/CD63 | 5,8 % | 68,6 % | 10,7 % |
| CD203/CD63 | 4,2 % | 84,8 % | 6,7 % |
Srovnání anti-IgE/CD63, Basotest, anti-CD123/CD63, anti-CD203c/CD63
Pac 6
| CD 123 event. CD203/IgE | nulová kontr. K0 | nespec, kontr. KN | spec. stim. roztoč-DF | |
| IgE/CD63 | - | 3,1 % | 19,0 % | 86,4 % |
| Basotest | - | 5,4 % | 22,7 % | 85,9 % |
| CD123PCD63 | 85% | 2,4 % | 32,0 % | 85,3 % |
| CD203/CD63 | 96,7 % | 5,9 % | 36,5 % | 92,8 % |
Srovnání anti-IgE/FITC-CD63/PE, anti-CD123/PE-CD63/FITC a anti-CD203c/PE-CD63/F1TC.
Byla sledována přecitlivělost na alergeny vosy a včely. Výsledky jsou ilustrovány na obr. 3-1 až 3-4 a vyjádřeny jako % pozitivní basofilů tj. těch, které jsou citlivé na alergeny (v obrázcích kvadrant 2- buňky, které nesou jak znak basofilů, tak aktivační znak CD63), K0-vzorek bez stimulace.
| značení buněk | K0% | vosa % | včela % |
| IgE/CD63 | 5,1 | 5,0 | 61,8 |
| CD123/CD63 | 1,5 | 3,4 | 56,6 |
| CD203c/CD63 | 3,5 | 6,2 | 50,3 |
-17CZ 292686 B6
Normální hodnoty: K0 < 8 % a alergenem <15%
U pacienta byly pro srovnání stanoveny specifické protilátky proti vose 0,35 U/ml včele 1,4 U/ml pozitivní jsou hodnoty > 0,3 5 U/ml
Vzhledem k hladině celkového IgE (asi 90 IU/ml), všechna 3 značení basofilů jsou vhodná, se srovnatelnými výsledky.
Značení buněk protilátkou proti IgE (anti-IgE/FITC) a proti aktivačnímu znaku CD63 (CD63/PE).
Srovnání výsledků anti-IgE/FITC-CD63/PE a cmti-CD123/PE-CD63/FITC.
Byla sledována přecitlivělost na alergeny vaječného bílku, kravského mléka a pšeničné mouky.
Výsledky jsou ilustrovány na obr. 4-1 až 4-8 a vyjádřeny jako % pozitivních basofilů tj. těch, které jsou citlivé na alergeny (v obrázcích kvadrant 2 - buňky, které nesou jak znak basofilů, tak aktivační znak CD63), K0-vzorek bez stimulace.
| značení basofilů | K0% | vaj.bílek% | krav .mléko % | pšen. mouka % |
| IgE/CD63 | 6,0 | 57,2 | 62,6 | 5,8 |
| CD123/CD63 | 6,0 | 57 | 70,7 | n,i |
Normální hodnoty: K 0 < 8 % s alergenem <15%
U pacienta byly pro srovnání stanoveny specifické protilátky proti vaječnému bílku > kravskému mléku pšeničné mouce
U/ml > 25 U/ml
1,71 U/ml pozitivní jsou hodnoty >35 U/ml
Vzhledem k vysoké hladině celkového IgE (>17 800 IU/ml) je výhodnější značení basofilů pomocí CD123 než anti-IgE protilátkou (zřejmě dochází k jejímu navázání na IgE).
Rozpor mezi výsledkem spec. IgE proti pšen. mouce (1,7-pozitivní) a námi zjištěné nepřecitlivělosti potvrzuje naše zjištění, že při stanovení slgE dochází i ke stanovování křížově reagujících protilátek, které mají nižší afinitu a nejsou často příčinou klinických reakcí.
Srovnání výsledků aktivace basofilů, slgE a klinických projevů
- 18CZ 292686 B6
Alergen: včela
| Pacient | % aktivovaných basofilů | specifické IgE proti včele | klinické projevy |
| Če-I | 51,8% | 14,6 | reakce na bodnutí |
| Če-D | 56,3 % | 1,4 | reakce na bodnutí |
| Bo | 20% | <0,35 | v dětství otok |
| Ho | 5,2 % | <0,35 | ? |
| En | 6,2 % | <0,35 | ? |
| Ben | 82% | 1,33 | otok po vpíchnutí |
| Hav | 5,7 % | <0,35 | ? |
| Šev | 5,6 % | <0,35 | ? |
| Sch | 77% | > 17,5 | ? |
| Fru | 68,5 % | >17,5 | ? |
| Bo | 40,8 % | > 17,5 | ? |
| Via | 1,8 % | <0,35 | ? |
| VI | 1,7 % | <0,35 | ? |
| Ja | 5,9 % | 0,35 | ? |
| Kr | 2,5 % | 0,75 | ? |
| Pru | 78,9 % | 0,52 | ? |
| Tu | 2,0 % | 0,67 | ? |
| He | 8,2 % | <0,35 | ? |
| Ha | 11,9% | <0,35 | ? |
| Ba | 57,4 % | 1,4 | otoky kloubů |
| Sko | 10,3 % | 0,36 | ? |
pozitivní výsledky: slgE > 0,35 U/ml aktiv, basofily > 15 %
-19CZ 292686 B6
Alergen: vosa
| Pacient | % aktivovaných basofilů | specifické IgE proti vose | klinické projevy |
| Va | 88% | >17,5 | reakce na bodnutí |
| Če-I | 58% | >0,35 | reakce na bodnutí |
| Če-D | 59,9 % | 5,9 | reakce na bodnutí |
| Bo | 30% | <0,35 | reakce na bodnutí |
| Ho | 7% | <0,35 | ? |
| En | 24,8 % | 0,51 | ? |
| Ben | 8,5 % | <0,35 | ? |
| Hav | 57,8 % | 7,33 | reakce na bodnutí |
| Šev | 58% | <0,35 | anaf. reakce |
| Sch | 86% | >17,5 | anaf. reakce |
| Fru | 74,3 % | 1,04 | ? |
| Bo | 30,9 % | 1,33 | ? |
| Via | 3,2 % | <0,35 | ? |
| VI | 2,1 % | <0,35 | ? |
| Ja | 27,6 % | 0,59 | ? |
| Kr | 71,5 % | 0,75 | po bodnutí dušnost |
| Pru | 78% | 0,35 | ? |
| Tu | 7,1 % | 0,42 | ? |
| He | 76,1 % | <0,35 | reakce na bodnutí |
| Ha | 89% | 0,87 | reakce na bodnutí |
| Ba | 8,1 % | <0,35 | ? |
| Sko | 49,7 | <0,35 | otoky po bodnutí |
Pozitivní výsledky: slgE > 0,35 U/ml aktiv, bosafily > 15 %
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen, vyznačující se tím, že se krevní vzorek spřídavkem interleukinu-3 v množství 0,05 až 50ng/ml, vztaženo na objem vzorku, a příslušně ředěného alergenu v množství 0,5 až 100 jednotek/ml vzorku inkubuje po dobu 15 až 45 minut při teplotě odpovídající fyziologickému prostředí, načež se při teplotě 0 až +10 °C přidá značená protilátka anti-CD63 v množství 3 až 30 μ1/100 μΐ krve a značená protilátka proti povrchovému znaku basofilů v množství 3 až 30 μ1/100 μΐ krve a vzorek se po promíchání inkubuje po dobu 15 až 30 minut v ledové lázni, načež se zlyzuje a podrobí průtokové cytometrii.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako protilátka proti povrchovému znaku basofilů použije protilátku anti-CD123.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako protilátka proti povrchovému znaku basofilů použije protilátka anti-CD203c.
- 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se použijí monoklonální protilátky.-20CZ 292686 B6
- 5. Kit pro stanovení přecitlivělosti na alergeny na základě měření aktivace basofilů způsobem podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že na 100 testů obsahuje 1 ng až 1 pg interleukinu-3, 200 ml pufru, 0,3 až 3 ml značené protilátky anti-CD63 a 0,3 až 3 ml 5 značené protilátky proti povrchovému znaku basofilů, 4,33 pg N-formyl-L-methionyl-Lleucyl-L-fenylalaninu a popřípadě běžná vehikula.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20013356A CZ292686B6 (cs) | 2001-09-17 | 2001-09-17 | Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit |
| CA002460629A CA2460629A1 (en) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | A method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity |
| EP02798672A EP1430305A2 (en) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | A method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity |
| JP2003529145A JP2005509845A (ja) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | ある物質に対する過敏症を判定するための、アレルゲンによって誘起された好塩基球の賦活化の測定のための方法およびキット |
| RU2004109985/15A RU2273029C2 (ru) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | Способ и набор для определения индуцированной аллергеном активации базофилов для определения гиперчувствительности к некоторым веществам |
| PCT/CZ2002/000049 WO2003025566A2 (en) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | A method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity |
| US10/489,884 US20040265925A1 (en) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | Method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity to some substances |
| MXPA04002430A MXPA04002430A (es) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | Metodo y estuche para la medicion de la activacion de basofilos inducida por alergeno para determinar la hipersensibilidad a ciertas substancias. |
| AU2002362316A AU2002362316A1 (en) | 2001-09-17 | 2002-09-10 | A method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20013356A CZ292686B6 (cs) | 2001-09-17 | 2001-09-17 | Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20013356A3 CZ20013356A3 (cs) | 2003-08-13 |
| CZ292686B6 true CZ292686B6 (cs) | 2003-11-12 |
Family
ID=5473556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20013356A CZ292686B6 (cs) | 2001-09-17 | 2001-09-17 | Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040265925A1 (cs) |
| EP (1) | EP1430305A2 (cs) |
| JP (1) | JP2005509845A (cs) |
| AU (1) | AU2002362316A1 (cs) |
| CA (1) | CA2460629A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ292686B6 (cs) |
| MX (1) | MXPA04002430A (cs) |
| RU (1) | RU2273029C2 (cs) |
| WO (1) | WO2003025566A2 (cs) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005007695A2 (en) * | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Anti-cd63 antibodies and methods of use thereof |
| US7772011B2 (en) | 2005-03-21 | 2010-08-10 | Ronald Joseph Harbeck | Method and kit for detection of autoimmune chronic urticaria |
| CA2630840A1 (en) * | 2005-11-23 | 2007-05-31 | Universitaet Zuerich | Allergy treatment by epicutaneous allergen administration |
| EP1991868B1 (en) * | 2006-02-16 | 2010-09-15 | Bracco Suisse SA | Method to determine pseudo-allergic reactions |
| JP2009236798A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-15 | Sysmex Corp | 好塩基球の分類計数方法 |
| US10114012B2 (en) * | 2008-10-31 | 2018-10-30 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and assays for detecting and quantifying pure subpopulations of white blood cells in immune system disorders |
| CN103823069B (zh) * | 2014-03-07 | 2016-06-08 | 天津医科大学 | 血清特异性IgE生物学活性检测方法及其所使用的试剂盒 |
| CN104677810B (zh) * | 2015-01-30 | 2017-08-22 | 广东医学院附属医院 | 嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法 |
| RU2609839C1 (ru) * | 2016-03-30 | 2017-02-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Способ дифференциальной диагностики гиперчувствительности к яду пчелы (apis mellifera) |
| BR102018015288A2 (pt) * | 2017-08-08 | 2021-11-09 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Método para comprovar uma ativação de basófilos |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0974050B1 (de) * | 1997-01-20 | 2002-09-25 | ORPEGEN Pharma GmbH | Basophilen-degranulationstest |
-
2001
- 2001-09-17 CZ CZ20013356A patent/CZ292686B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-09-10 US US10/489,884 patent/US20040265925A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-10 EP EP02798672A patent/EP1430305A2/en not_active Withdrawn
- 2002-09-10 RU RU2004109985/15A patent/RU2273029C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-09-10 JP JP2003529145A patent/JP2005509845A/ja not_active Withdrawn
- 2002-09-10 MX MXPA04002430A patent/MXPA04002430A/es unknown
- 2002-09-10 WO PCT/CZ2002/000049 patent/WO2003025566A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-09-10 AU AU2002362316A patent/AU2002362316A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-10 CA CA002460629A patent/CA2460629A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003025566A2 (en) | 2003-03-27 |
| EP1430305A2 (en) | 2004-06-23 |
| WO2003025566A3 (en) | 2004-02-26 |
| CZ20013356A3 (cs) | 2003-08-13 |
| CA2460629A1 (en) | 2003-03-27 |
| AU2002362316A1 (en) | 2003-04-01 |
| JP2005509845A (ja) | 2005-04-14 |
| US20040265925A1 (en) | 2004-12-30 |
| MXPA04002430A (es) | 2005-06-03 |
| RU2004109985A (ru) | 2005-05-10 |
| RU2273029C2 (ru) | 2006-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2037269B1 (en) | Allergy test based on flow cytometric analysis | |
| Hamilton | Assessment of human allergic diseases | |
| Marzocchi-Machado et al. | Fcgamma and complement receptors: expression, role and co-operation in mediating the oxidative burst and degranulation of neutrophils of Brazilian systemic lupus erythematosus patients | |
| CZ292686B6 (cs) | Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit | |
| Davis et al. | Stability of immunophenotypic markers in fixed peripheral blood for extended analysis using flow cytometry | |
| US20200011865A1 (en) | Methods and kits for detecting basophil activation | |
| DE69731982T2 (de) | Verfahren zur messung der lymphozytenfunktion | |
| Aljadi et al. | A novel tool for clinical diagnosis of allergy operating a microfluidic immunoaffinity basophil activation test technique | |
| US11119109B2 (en) | Method for detecting basophil activation | |
| Mehic et al. | Platelet function and soluble P-selectin in patients with primary immune thrombocytopenia | |
| US8609432B2 (en) | Method and kit for detection of autoimmune chronic urticaria | |
| WO2018046522A1 (en) | Methods for predicting the survival time in a subject | |
| Alves et al. | Application of the chemiluminescence systems to evaluate the role of Fcγ and complement receptors in stimulating the oxidative burst in neutrophils | |
| EP1991868B1 (en) | Method to determine pseudo-allergic reactions | |
| RU2289138C2 (ru) | Способ аллергодиагностики по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов | |
| Zhu et al. | Immunophenotyping of canine T cell activation and proliferation by combined protein and RNA flow cytometry | |
| Liang et al. | A simple method for measuring human cell-bound IgE levels in whole blood | |
| CA2521486A1 (en) | Method of analysing the cytoskeletal protein of cells | |
| CN113238058B (zh) | 一种测评car-t治疗起始t细胞的方法 | |
| Marsella et al. | Sulphido‐leukotriene production from peripheral leukocytes and skin in clinically normal dogs and house dust mite positive atopic dogs | |
| Hoffmann et al. | Lysis with Saponin improves detection of the response through CD203c and CD63 in the basophil activation test after crosslinking of the high affinity IgE receptor FcεRI | |
| Alhamdany et al. | Seroprevalence of Neospora caninum and some hematological and biochemical parameters in sheep, Mosul-Iraq | |
| US20230349890A1 (en) | Method for determination of basophil activation and kits therefore | |
| Drawy et al. | T-cell markers in systemic lupus erythromatosus patients | |
| EP2506011A2 (en) | Method and kit for detecting and quantifying intracellular histamine and histamine release |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180917 |