KR20150036583A

KR20150036583A - 생물학적 샘플에서 dna, rna 및 단백질의 검출 방법

Info

Publication number: KR20150036583A
Application number: KR20157003801A
Authority: KR
Inventors: 애넙 수드; 웨이 가오; 마이클 존 게르데스; 피오나 진티; 안티 엘자스 세포; 엘리자베스 메리 콜린스
Original assignee: 제너럴 일렉트릭 캄파니
Priority date: 2012-07-17
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2015-04-07
Also published as: KR102073117B1; WO2014014754A1; CN104620107A; CN104620107B; JP2015524267A; AU2013290532A1; AU2013290532B2; CA2879412C; EP2875353A1; EP2875353B1; RU2014153257A; US20140024024A1; CA2879412A1; SG11201500371VA; JP6499960B2

Abstract

생물학적 샘플에서 다중 표적을 프로빙하는 신규 방법이 제공되며, 여기서 표적은 DNA, RNA 및 단백질이다. 방법은 샘플을 RNA 표적에 결합하는 표지된 핵산 프로브를 사용하는 계내 혼성화 반응에 적용하는 것, 신호를 관찰하는 것, 및 임의로 신호를 제거하는 것을 포함한다. 방법은 항원 검색 프로토콜, 신호를 관찰하는 것, 신호를 제거하는 것, 및 임의로 프로테아제 처리를 적용하여 샘플을 표지된 핵산 프로브를 사용하는 계내 혼성화 반응에 적용함으로써 샘플의 DNA 표적에 접근하는 것, 표지된 DNA 표적으로부터의 신호를 관찰하는 것, 및 임의로 신호를 제거하는 것을 추가로 포함한다.

Description

생물학적 샘플에서 DNA, RNA 및 단백질의 검출 방법 {METHODS OF DETECTING DNA, RNA AND PROTEIN IN BIOLOGICAL SAMPLES}

생물학적 샘플에서 상이한 표적을 관찰하기 위해 다양한 방법이 생물학 및 의학에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직학적 절편 및 다른 세포학적 제제에서 단백질의 분석은 조직화학, 면역조직화학 (IHC), 또는 면역형광 기술을 이용하여 수행될 수 있다.

개별 샘플을 반복적으로 분석하는 방법은 미국 특허 번호 7,629,125 및 미국 특허 번호 7,741,046에 기재되어 있다. 특히, 미국 특허 번호 7,741,046은 신호 발생제를 불활성화시키기 위해 (예를 들어, 형광 염료를 표백하기 위해) 산화의 사용을 수반하는, 생물학적 샘플에서 다중 표적을 검출하는 방법을 제공한다.

단백질 및 DNA 표적의 계내 검출은 통상적으로 암 관리에서 진단 도구로 이용된다. 최근 몇 년 동안 이러한 마커의 서로에 대한 및 임상적 파라미터에 대한 상관관계를 결정하기 위해 동일한 조직 절편에서 이들 표적을 함께 찾는 방법이 개발되었다. 또 다른 중요한 세포 표적은 RNA이다. 다양한 상이한 RNA 유형이 확인되었으며, 이들은 단백질 합성을 위한 주형으로 작용할 뿐만 아니라, 이들 중 다수, 예를 들어 miRNA는 유전자 발현을 제어하여, 세포 기능 및/또는 질환 진행을 제어한다. RNA 안정성은 특유의 도전을 제시하고, 극단적인 예방조치는 일반적으로 RNase 오염의 방지를 필요로 한다. 따라서, 과정의 초기에 RNA의 검출을 수행하는 것이 권장할만하다. 그러나, 포르말린 고정된 파라핀 포매 조직에서 RNA 검출을 수행하는 최근의 방법은 일반적으로 광범위한 프로테아제 처리 후에 수행되었으며, 이는 단백질 표적의 하류 검출과 호환가능하지 않다.

프로테아제 처리없이 RNA 종을 검출하는 방법 및 동일한 샘플에서 3가지 유형의 표적; 단백질, DNA 및 RNA의 동시 검출이 본원에 개시된다. 각각의 표적은 정상적인 세포 기능 뿐만 아니라 질환 질행에서 중요한 역할을 수행하며, 반드시 모든 표적과 호환가능하지는 않은 특정 샘플 제제를 필요로 한다. 동일한 샘플에서의 계내 검출은 이러한 상이한 표적의 발현 사이에 보다 우수한 상관관계를 허용할 것이며, 질환에 대한 그의 관계의 보다 우수한 분석을 허용할 것이다.

생물학적 샘플에서 다중 표적을 프로빙하는 신규 방법이 본원에 개시되며, 여기서 표적은 DNA, RNA 및 단백질이다.

일부 실시양태에서, 다수의 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 다중 표적을 프로빙하는 방법이 개시된다. 단계는 샘플을 RNA 표적에 직접 또는 간접적으로 결합하는 표지된 핵산 프로브를 사용하는 계내 혼성화 반응에 적용하는 단계, RNA 표적에 결합된 표지된 프로브로부터의 신호를 관찰하는 단계, 및 임의로 표지된 프로브로부터의 신호를 제거하는 단계를 포함한다. 방법은 샘플을 항원 검색 프로토콜에 적용하여 샘플의 단백질 에피토프를 검색하는 단계, 샘플을 항체-기반 방법을 이용하는 계내 혼성화 반응에 적용하고 하나 이상의 항체 프로브를 샘플 상의 항원에 부착시키는 단계, 하나 이상의 항체 프로브로부터의 신호를 관찰하는 단계, 항체 프로브로부터의 신호를 제거하는 단계, 임의로 프로테아제 처리를 적용하여 샘플의 DNA 표적에 접근하는 단계, 샘플을 표지된 핵산 프로브를 사용하는 계내 혼성화 반응에 적용하여 샘플의 DNA 표적 중 하나 이상을 직접 또는 간접적으로 표지하는 단계, 표지된 DNA 표적으로부터의 신호를 관찰하는 단계, 및 임의로 하나 이상의 표지된 DNA 표적으로부터의 신호를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 방법은 샘플을 하나 이상의 대조 프로브로 염색하여 샘플의 다중 영상의 정합을 허용하는 단계 및 임의로 샘플의 다중 영상을 정합하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태는 다중 영상으로부터 단백질, RNA 및 DNA의 발현을 분석하는 방법을 포함한다.

도 1은 생물학적 샘플에서 다중 표적을 프로빙하는 방법의 개략적 표현이며, 여기서 표적은 RNA, DNA 및 단백질을 포함한다.
도 2a는 등급 II 폐 편형 세포 암종의 멀티플렉스 RNA, 단백질 및 DNA 염색을 보여준다. A: DAPI로 염색된 세포 핵, B: U6 RNA, C: EGFR, D: 시토케라틴 7, E: IGF1R, F: NaKATPase, G: cMET 및 H: EGFR.
도 2b, 패널 I & J는 도 2a의 패널 G & H와 동일한 영상 영역의 섹션을 확대한 것이고: 유의한 cMET 염색은 관찰되지 않았다.
도 3a는 폐 전이성 선암종의 멀티플렉스 RNA, 단백질 및 DNA 염색을 보여준다. A: DAPI로 염색된 세포 핵, B: U6 RNA, C: EGFR, D: 시토케라틴 7, E: IGF1R, F: NaKATPase, G: cMET 및 H: EGFR.
도 3b, 패널 I & J는 도 3a의 패널 G & H와 동일한 영상 영역의 섹션을 확대한 것이다.

특허청구된 본 발명의 대상을 보다 분명하고 간결하게 기재하고 나타내기 위해, 하기 정의가 특정 용어에 대해 제공되며, 이는 하기 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된다.

단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 본원에 사용된 근사치 언어는 관련된 기본 기능의 변화를 발생시키지 않으면서 허용가능하게 변할 수 있는 임의의 정량적 표현을 수식하는데 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수식된 값은 특정의 정확한 값에 제한되지 않아야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수치는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻어질 것으로 기대되는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 개수를 반영하여 통상적인 반올림 기술을 적용함으로써 고려되어야 한다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 또 다른 분자의 특정한 공간 및 극성 구조에 특이적으로 결합함으로써 그와 상보적인 것으로 정의되는 이뮤노글로불린을 지칭한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예컨대 숙주의 면역화 및 혈청 (폴리클로날)의 수집에 의해, 또는 연속 하이브리드 세포주를 제조하여 분비된 단백질 (모노클로날)을 수집함으로써, 또는 적어도 천연 항체의 특이적 결합에 요구되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 돌연변이된 버전을 클로닝하여 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 항체는 완전한 이뮤노글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 이뮤노글로불린은 다양한 부류 및 이소형, 예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM을 포함한다. 기능적 항체 단편은 전장 항체에 유사한 친화도로 결합을 유지할 수 있는 항체의 부분을 포함할 수 있다 (예를 들어, Fab, Fv 및 F(ab')₂, 또는 Fab'). 추가로, 한 특정한 분자에 대한 결합 친화도가 실질적으로 유지되기만 한다면, 적절한 경우에 이뮤노글로불린 또는 그의 단편의 응집체, 중합체, 및 접합체가 이용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "결합제"라는 용어는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 결합제는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합한 결합제는 천연 또는 변형 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 아피바디 또는 압타머), 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 압타머); 폴리사카라이드 (예를 들어, 렉틴, 당), 지질, 효소, 효소 기질 또는 억제제, 리간드, 수용체, 항원 또는 합텐 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적합한 결합제는 분석할 샘플 및 검출에 이용할 수 있는 표적에 의존하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 샘플 중의 표적이 리간드를 포함할 수 있고 결합제가 수용체를 포함할 수 있거나, 또는 표적이 수용체를 포함할 수 있고 결합제가 리간드를 포함할 수 있다. 유사하게, 표적이 항원을 포함할 수 있고 결합제가 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있거나, 또는 그 반대의 경우를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적이 핵산을 포함할 수 있고 결합제가 상보적 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 및 결합제 둘 다가 서로 결합할 수 있는 단백질을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 생체내 또는 시험관내로부터 수득한 생물학적 조직 또는 체액 기원의 샘플을 포함하는 생물학적 대상체로부터 수득한 샘플을 지칭한다. 이러한 샘플은 사람을 포함하는 포유동물로부터 단리된 체액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변), 기관, 조직, 분획, 및 세포일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 생물학적 샘플은 조직을 포함하는 생물학적 샘플의 절편 (예를 들어, 기관 또는 조직의 절편 부분)을 포함할 수 있다. 또한, 생물학적 샘플은 생물학적 샘플로부터의 추출물, 예를 들어, 생물학적 유체 (예를 들어, 혈액 또는 소변)으로부터의 항체를 포함할 수 있다.

생물학적 샘플은 원핵생물 또는 진핵생물 기원 (예를 들어, 곤충, 원충, 조류, 어류, 파충류)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 소, 개, 당나귀, 기니 피그 또는 토끼)이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 영장류 기원 (예를 들어, 침팬지 또는 인간)이다.

본원에 사용된 용어 "프로브"는 결합제 및 표지, 예컨대 신호 발생제 또는 효소를 갖는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 결합제 및 표지 (신호 발생제 또는 효소)가 단일 엔티티로 구현된다. 결합제 및 표지는 직접적으로 (예를 들어, 결합제에 함입된 형광 분자에 의해) 또는 간접적으로 (예를 들어, 절단 부위를 포함할 수 있는 링커를 통해) 부착되어 단일 단계로 생물학적 샘플에 적용될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 결합제 및 표지가 개별 엔티티 (예를 들어, 표적에 결합할 수 있는 일차 항체 및 일차 항체에 결합할 수 있는 효소 또는 신호 발생제로 표지된 이차 항체)로 구현된다. 결합제 및 표지 (신호 발생제 또는 효소)가 개별 엔티티인 경우에, 이는 생물학적 샘플에 단일 단계로 또는 다중 단계로 적용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "형광 프로브"는 형광 신호 발생제에 커플링되는 결합제를 갖는 작용제를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "신호 발생제"는 하나 이상의 검출 기술 (예를 들어, 분광측정접, 열량측정법, 분광분석법 또는 육안 검사)을 이용하여 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 분자를 지칭한다. 검출가능한 신호의 적합한 예는 광학 신호 및 전기 신호, 또는 방사성 신호를 포함할 수 있다. 신호 발생제의 예는 발색단, 형광단, 라만-활성 태그, 또는 방사성 표지 중 하나 이상을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 프로브와 관련하여, 일부 실시양태에서는 신호 발생제 및 결합제가 단일 엔티티 (예를 들어, 형광 표지를 갖는 표적 결합 단백질)로 존재할 수 있다. 대안적으로, 결합제 및 신호 발생제는 샘플에 도입되기 전에 또는 샘플에 도입될 때 서로 회합하는 개별 엔티티 (예를 들어, 수용체 단백질 및 그 특정한 수용체 단백질에 대한 표지된 항체)일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "대조 프로브"는 신호 발생제에 커플링된 결합제 또는 직접 염색가능한 신호 발생제를 갖는 작용제를 지칭하며, 이에 따라 신호 발생제는 형광 프로브를 불활성화시키는데 사용되는 신호 불활성화제의 용액과의 접촉 후에 적어도 80 퍼센트 신호를 유지한다. 대조 프로브에서 적합한 신호 발생제는 신호 불활성화제와 접촉시에 실질적으로 불활성화되지 않는다. 신호 발생제의 적합한 예는 방사성 표지 또는 비-산화가능한 형광단 (예를 들어, DAPI)을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "효소"는 기질의 화학 반응을 촉매할 수 있는 단백질 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 적합한 효소는 샘플 내에 존재하는 수용체 (예를 들어, 페놀 기) 또는 샘플이 결합하는 고체 지지체에 결합할 수 있는 반응 생성물을 형성하기 위해 기질의 화학 반응을 촉매한다. 수용체는 외인성 (즉, 샘플 또는 고체 지지체에 외부에서 부착된 수용체) 또는 내인성 (샘플 또는 고체 지지체의 내부에 존재하는 수용체)일 수 있다. 적합한 효소의 예는 퍼옥시다제, 옥시다제, 포스파타제, 에스테라제, 및 글리코시다제를 포함한다. 적합한 효소의 구체적 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 리파제, 및 글루코스 옥시다제를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "효소 기질"은 반응 생성물을 형성하기 위해 효소에 의해 화학적으로 촉매되는 화학적 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 반응 생성물은 샘플 내에 존재하는 수용체 또는 샘플이 결합하는 고체 지지체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법에 사용되는 효소 기질은 비-발색 또는 비-화학발광 기질을 포함할 수 있다. 신호 발생제는 표지로서 효소 기질에 부착될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "발색단"은 2개의 상이한 분자 오비탈 사이의 에너지 차이가 가시 스펙트럼의 범위에 포함되는 분자의 부분를 지칭한다. 발색단은 가시 광선의 특정 파장의 흡광도 및 다른 파장의 투과도 또는 반사도에 의해 영향을 받는 분자의 색을 담당할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "형광단" 또는 "형광 신호 발생제"는 광의 특정한 파장에 노출되어 여기되는 경우에 상이한 파장의 광을 방출하는 화학적 화합물을 지칭한다. 형광단은 그의 방출 프로파일, 또는 "색"의 측면에서 설명될 수 있다. 녹색 형광단 (예를 들어 Cy3, FITC, 및 오레곤 그린)은 일반적으로 515-540 나노미터 범위의 파장에서의 방출을 특징으로 할 수 있다. 적색 형광단 (예를 들어 텍사스 레드, Cy5, 및 테트라메틸로다민)은 일반적으로 590-690 나노미터 범위의 파장에서의 방출을 특징으로 할 수 있다. 형광단의 예는 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디술폰산, 아크리딘, 아크리딘의 유도체 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디술포네이트 (루시퍼 옐로우 VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우, 쿠마린, 쿠마린 유도체, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-트리플루오로메틸쿠루아린 (쿠마란 151), 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-술포네프탈레인 (브로모피로갈롤 레드), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)4-메틸쿠마린, 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산, 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디술폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드 (DNS, 단실 클로라이드), 에오신, 에오신의 유도체, 예컨대 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신, 에리트로신의 유도체, 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체, 예컨대 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일) 아미노플루오레세인 (DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), QFITC (XRITC); 플루오레사민 유도체 (아민과 반응시 형광성); IR144; IR1446; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르토크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드, B-피코에리트린; o-프탈디알데히드 유도체 (아민과 반응시 형광성); 피렌 및 유도체, 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리엑티브 레드 4 (시바크론(Cibacron).RTM. 브릴리언트 레드 3B-A), 로다민 및 유도체, 예컨대 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체 (텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA); 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC); 리보플라빈; 로솔산 및 란타나이드 킬레이트 유도체, 양자 점, 시아닌, 피렐리움 염료 및 스쿠아레인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "계내"는 일반적으로 어떤 사건이 원래 위치에서, 예를 들어 무손상 기관 또는 조직에서 또는 기관 또는 조직의 대표적 절편에서 일어나는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적의 계내 분석은 유기체, 기관, 조직 샘플 또는 세포 배양물을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래된 세포에 대해 수행할 수 있다. 계내 분석은 표적이 그의 원래 위치로부터 제거되는 경우에 잃을 수 있는 전후상황에 관한 정보를 제공한다. 따라서, 표적의 계내 분석은 표적-결합된 프로브가 세포 내에서 유지되는 곳에서 세포막이 완전히 무손상이든 또는 부분적으로 무손상이든 관계없이 전세포 또는 조직 샘플 내에 위치하는 표적 결합 프로브의 분석을 기술한다. 또한, 본원에 개시된 방법은 고정된 또는 고정되지 않은 세포 또는 조직 샘플에서 계내에서 표적을 분석하는데 이용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 신호 불활성화제는 신호를 직접적으로 불활성화시키거나 또는 불활성화제의 존재 하에 샘플의 조사 후에 신호를 불활성화시킬 수 있는 화학물질을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "조사" 또는 "조사하다"는 샘플 또는 용액을 비-이온화 방사선에 노출시키는 활동 또는 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비-이온화 조사의 파장은 350 nm 내지 1.3 um이다. 바람직한 실시양태에서, 비-이온화 방사선은 파장이 400-700 nm인 가시광선이다. 조사는 샘플 또는 용액을 특정 파장 또는 일정 범위의 파장의 방사선을 방출할 수 있는 방사선원, 예를 들어, 램프에 노출시킴으로써 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광여기를 겪을 수 있는 분자는 조사의 결과로서 광여기된다. 일부 실시양태에서, 광여기를 겪을 수 있는 분자는 신호 발생제, 예를 들어, 형광 신호 발생제이다. 일부 실시양태에서, 형광 신호 발생제의 조사는 형광 신호 발생제와 신호 불활성화제 사이의 광반응을 개시시킨다. 일부 실시양태에서, 조사는 광활성화된 화학적 표백에 의해 신호 발생제를 실질적으로 불활성화시키는 광반응을 개시한다. 다른 실시양태에서 신호 불활성화제는 신호를 불활성화시키기 위해 신호 발생제와 반응하는 반응성 모이어티를 생성하기 위해 광여기를 겪는다. 광학 필터는 특정한 파장 또는 소정 범위의 파장에 대한 샘플 또는 용액의 조사를 제한하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 광학 필터는 광여기를 겪을 수 있는 하나 이상의 분자의 선택적 광여기를 위해 조사를 좁은 범위의 파장으로 제한하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "선택적 광여기"는 광여기를 겪을 수 있는 하나 이상의 분자가, 조사 후에 기저 전자 상태를 유지하는, 광여기를 겪을 수 있는 하나 이상의 다른 분자의 존재 하에 광여기되는 활동 또는 과정을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 광여기를 겪을 수 있는 분자는 형광 염료, 예를 들어 시아닌 염료이다. 추가의 한 실시양태에서, 620-680 nm의 소정 범위의 파장으로 제한된 조사는 Cy5 염료의 선택적 광여기를 위해 사용된다. 대안적 실시양태에서, 특정 파장에서 샘플의 조사는 또한 레이저를 사용함으로써 달성할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "퍼옥시다제"는 전자 공여자와 함께 효소 기질의 산화 반응을 촉매하는 효소 부류를 지칭한다. 퍼옥시다제 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 시토크롬 C 퍼옥시다제, 글루타티온 퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제 또는 대두 퍼옥시다제를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "퍼옥시다제 기질"은 반응 생성물을 형성하기 위해 퍼옥시다제에 의해 화학적으로 촉매화되는 화학적 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법에서 사용되는 퍼옥시다제 기질은 비-발색 또는 비-화학발광 기질을 포함할 수 있다. 형광 신호 발생제는 표지로서 퍼옥시다제 기질에 부착될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "표백", "화학적 표백", "광활성화된 화학적 표백" 또는 "광유도된 화학적 표백"은 신호 발생제에 의해 생성된 신호가 반응의 과정 동안 변형되는 활동 또는 과정을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 신호 발생제는 비가역적으로 변형된다.

일부 실시양태에서, 신호는 광활성화된 화학적 표백의 결과로서 감소되거나 제거된다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 완전히 표백되고, 즉 신호 강도는 약 100% 감소한다. 일부 실시양태에서, 신호는 광학 신호이고, 신호 발생제는 광학 신호 발생제이다. 본원에 사용된 용어 "광여기"는 분자가 방사선 에너지의 흡수시에, 예를 들어 조사시에 기저 전자 상태로부터 여기된 전자 상태로 전이되는 활동 또는 과정을 지칭한다. 광여기된 분자는 화학 반응, 예를 들어 전자 전달 반응에 참여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광여기를 겪을 수 있는 분자는 신호 발생제, 예를 들어, 형광 신호 발생제이다.

본원에 사용된 용어 "광반응" 또는 "광유도된 반응"은 적어도 하나의 반응물의 광여기의 결과로서 개시 및/또는 진행되는 화학 반응을 지칭한다. 광반응에서 반응물은 전자 전달 시약 및 광여기를 겪을 수 있는 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 광반응은 전자 전달 시약으로부터 광여기를 겪은 분자, 즉, 광여기된 분자로의 전자 전달을 수반할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 광반응은 또한 광여기를 겪은 분자로부터 전자 전달 시약으로의 전자 전달을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광여기를 겪을 수 있는 분자는 형광 신호 발생제, 예를 들어, 형광단이다. 일부 실시양태에서, 광반응은 하나 이상의 광반응 성분의 비가역적인 변형을 야기한다. 일부 실시양태에서, 광반응은 광활성화된 화학적 표백에 의해 신호 발생제를 실질적으로 불활성화시킨다.

일부 실시양태에서, 광반응은 전자 전달 시약과 광여기된 분자 사이의 분자간 전자 전달을 수반할 수 있고, 예를 들어, 전자 전달은 전자 전달 시약과 광여기된 분자 사이의 연결이 일시적으로, 전자 전달 직전에 형성되고 전자 전달 후에 단절되는 경우에 발생한다.

일부 실시양태에서, 광반응은 전자 전달 시약과 광여기된 분자 사이의 분자내 전자 전달을 수반할 수 있고, 예를 들어 전자 전달은 전자 전달 시약 및 광여기된 분자가 전자 전달 과정의 개시 전에, 예를 들어 공유 또는 정전기적 상호작용에 의해 함께 연결될 때 발생한다. 분자내 전자 전달을 수반하는 광반응은 예를 들어 광여기를 겪을 수 있는 분자 및 전자 전달 시약이 반대 전하를 보유하고 정전기적 상호작용에 의해 유지되는 복합체를 형성하는 경우에 발생할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 염료, 예를 들어 양이온성 시아닌 염료 및 트리페닐부틸 보레이트 음이온은 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 조사시에 분자내 전자 전달이 시아닌과 보레이트 모이어티 사이에 형성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전자 전달 과정은 분자간 과정일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "고체 지지체"는 생물학적 샘플에 존재하는 표적이 고정될 수 있고 이어서 본원에 개시된 방법으로 검출될 수 있는 물품을 지칭한다. 표적은 물리적 흡착, 공유 결합 형성 또는 그의 조합에 의해 고체 지지체에 고정될 수 있다. 고체 지지체는 중합체, 유리 또는 금속 물질을 포함할 수 있다. 고체 지지체의 예는 막, 마이크로타이터 플레이트, 비드, 필터, 시험 스트립, 슬라이드, 커버 슬립 및 시험 튜브를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 다른 분자를 실질적으로 덜 인식하는 것에 비해 상이한 두 분자 중 하나가 다른 하나를 특이적으로 인식하는 것을 지칭한다. 분자들은 정전기적 상호작용, 수소 결합, 또는 소수성 상호작용 중 하나 이상으로부터 생기는 두 분자 사이의 특이적 인식을 발생시키는 영역을 그의 표면에 또는 캐비티 내에 가질 수 있다. 특이적 결합의 예는 항체-항원 상호작용, 효소-기질 상호작용, 폴리뉴클레오티드 상호작용 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 결합제 분자의 표적에 대한 고유한 평형 회합 상수 (KA)는 주위 조건, 예컨대 약 6 내지 약 8의 pH 및 약 0℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 약 105 M-1보다 낮지 않다.

본원에 사용된 용어 "표적"은 생물학적 샘플에 존재할 때 검출될 수 있는 생물학적 샘플의 성분을 지칭한다. 표적은 자연 발생하는 특이적 결합제 (예를 들어, 항체)가 존재하거나 또는 특이적 결합제가 제조될 수 있는 (예를 들어, 소분자 결합제 또는 압타머) 임의의 물질이 될 수 있다. 일반적으로, 결합제는 표적의 하나 이상의 개별 화학적 모이어티 또는 표적의 삼차원 구조적 성분 (예를 들어, 펩티드 폴딩으로부터 얻어지는 3D 구조)을 통해 표적에 결합할 수 있다. 표적은 천연 또는 변형 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 아피바디, 또는 압타머), 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 압타머), 폴리사카라이드 (예를 들어, 렉틴 또는 당), 지질, 효소, 효소 기질, 리간드, 수용체, 항원 또는 햅텐 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명은 일반적으로 분석, 진단 또는 예후 적용, 예컨대 분석물 검출, 조직화학, 면역조직화학, 면역형광, 발색 계내 혼성화, 형광 계내 혼성화 (FISH)에 적용가능한 방법에 대한 실시양태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 조직화학, 면역염색, 면역조직화학, 면역검정 또는 면역형광에 특히 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 이뮤노블롯팅 기술, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 면역검정, 예컨대 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 특히 적용가능할 수 있다.

개시된 방법은 일반적으로 단일 생물학적 샘플 내의 다중 표적의 검출에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 동일한 검출 채널을 사용하여 단일 생물학적 샘플 내의 다중 표적을 검출하는 방법이 개시된다. 표적은 현탁액 내의 세포의 표면 상에, 세포 도말 표본의 표면 상에, 조직학적 절편의 표면 상에, 세포 어레이 또는 세포 용해물 어레이의 표면 상에, 또는 고체 지지체 (예컨대 겔, 블롯, 유리 슬라이드, 비드, 또는 ELISA 플레이트)의 표면 상에 제시될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 생물학적 샘플의 완전성에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않으면서 동일한 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출을 허용할 수 있다. 동일한 생물학적 샘플 내의 표적의 검출은 생물학적 샘플 내의 표적에 대한 공간적 정보를 추가로 제공할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 또한 제한된 양의 생물학적 샘플이 분석을 위해 이용가능하고 동일한 샘플이 다중 분석을 위해 처리되어야하는 분석 용도에 적용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 또한 실질적으로 표적을 제거하지 않으면서 고체-상태 샘플 (예를 들어, 조직 절편) 또는 고체 지지체 (예를 들어, 블롯)에 부착된 샘플의 다수의 분석을 용이하게 할 수 있다. 또한, 동일한 검출 채널이 샘플 내의 상이한 표적의 검출을 위해 사용될 수 있고, 이것은 다중 표적의 분석을 위한 화학적 요건을 감소시킬 수 있다. 방법은 또한 분석가능한 신호의 제한 때문에 동시에 검출가능한 표적의 수가 제한될 수 있는 검출 방법을 기초로 한 분석을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 형광-기반 검출을 이용하여, 동시에 검출될 수 있는 표적의 수는 오직 약 4개의 형광 신호가 그의 여기 및 방출 파장 특성에 기초하여 분할할 수 있기 때문에 약 4개로 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 형광-기반 검출 시스템을 이용하여 4개 초과의 표적의 검출을 허용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 DNA, RNA, 및 단백질 표적을 검출하는 방법은 생물학적 샘플에서 표적의 순차적인 검출을 포함한다. 방법은 일반적으로 생물학적 샘플에서 제1 표적을 검출하는 단계, 화학적 작용제를 사용하여 제1 표적으로부터의 신호를 변형하는 단계, 및 생물학적 샘플에서 제2 표적을 검출하는 단계를 포함한다. 방법은 제2 표적으로부터의 신호를 변형한 후에 생물학적 샘플에서 제3 표적을 검출하는 단계 등을 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고체 지지체에 부착되거나 또는 현탁액 중에 있을 수 있으며, 예컨대 비제한적으로 혈액 샘플을 포함하는 생물학적 유체 중의 조혈성 세포 또는 순환 종양 세포일 수 있다. 이와 같이 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 DNA, RNA 및 단백질 표적을 검출하는 것은 생물학적 샘플에서 표적의 순차적 검출을 포함하며, 여기서 생물학적 샘플은 현탁액; 예를 들어 용액 중 계내 혼성화 반응 중에 있다.

도 1은 방법의 한 실시양태의 개략적 표현이고, 여기서 생물학적 샘플은 생물학적 샘플의 파라핀 또는 동결 절편으로부터 제조되고, RNA 표적에 대한 하나 이상의 특이적으로 표지된 핵산 프로브를 이용하여 계내 혼성화에 적용된다 (단계 A). 이는 단계 B, 프로브에 직접 또는 간접적으로 부착된 표지로부터의 신호의 관찰, 및 임의로 단계 C, 다중 종의 RNA가 단계 A-C를 반복함으로써 다중 사이클에서 검출되는 경우에 RNA 프로브로부터의 신호의 제거로 이어진다.

도 1에서 추가로 나타난 바와 같이, 샘플은 이어서 항원 검색 및 검출에 적용될 수 있다. 이는 단계 D에 도시되며, 이에 의해 샘플을 항원 검색 프로토콜에 적용하여 단백질을 검색할 수 있다. 단백질 에피토프항원 검색은 열-유도된 방법 또는 단백질분해적 소화를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 이는 단계 E, 항체-기반 방법을 이용하는 표적과의 혼성화 및 항체 프로브의 항원으로의 부착으로 이어진다. 이는 또한 RNA 프로브로부터의 신호를 제거할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표준 면역조직화학 (IHC) 또는 면역형광 (IF) 기술이 이용될 수 있다. 혼성화가 완료되면, 혼성화된 항체의 검출은 직접 또는 간접 방법에 의해 일어나며 (단계 F), 이는 항체 프로브로부터의 신호의 제거로 이어진다 (단계 G). 단계 E-G는 다중 단백질을 검출하기 위해 여러번 반복될 수 있다.

이어서, 프로테아제 처리가 적용되어 (단계 H) DNA 표적을 밝히거나 또는 이에 접근하며, 이어서 계내 혼성화 방법 (ISH)에 적용되어 DNA에 부착되어 이를 표적화하고 (단계 I), 프로브에 직접 또는 간접적으로 부착된 표지를 검출한다 (단계 J). 특정 실시양태에서, 신호 불활성화 또는 프로브 스트리핑에 의한 신호의 추가의 (단계 K) 제거는 추가의 DNA 표적이 검출되는 경우에 수행할 수 있다. 특정 실시양태에서, 발색 검출이 이용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 프로테아제 처리 후에, 조직 형태의 보존 단계, 예비혼성화 또는 유사한 처리 단계가 적용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 하나 이상의 대조 프로브, 예컨대 형태학적 염색, 예를 들어 DAPI를 사용하여 샘플을 염색하는 단계가 부가될 수 있다. 대조 프로브는 샘플에 한번 또는 여러번 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이는 형태학적 마커에 기초한 다중 영상의 정합을 허용할 수 있어 검출된 바이오마커를 갖는 샘플의 하나 이상의 합성 영상을 수득할 수 있다.

특정 실시양태에서, 단계 A, B, 및 C, 단계 E, F 및 G, 및 단계 I, J 및 K는 여러번 반복될 수 있다.

특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고체 지지체에 부착된 다중 표적을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 전세포, 세포 구성성분, 세포 원심분리물, 또는 세포 도말을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 본질적으로 조직 샘플 또는 조직 구성성분을 포함한다. 조직 샘플은 유사한 기능을 가질 수 있는 한 생물학적 대상체의 한 조직으로부터 얻은 유사 세포들의 집합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 인간의 조직으로부터 수득한 유사한 세포들의 집합을 포함할 수 있다. 인간 조직의 적합한 예는 (1) 상피, (2) 혈관, 골 및 연골을 포함하는 결합 조직, (3) 근육 조직, 및 (4) 신경 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 조직 샘플의 공급원은 신선한, 냉동된 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인으로부터 얻은 고체 조직; 혈액 또는 혈액 구성성분; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 간질액; 또는 대상체의 수정 또는 발생 중 어느 시점으로부터의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 일차 또는 배양된 세포, 순환성 질환 또는 정상 세포, 예를 들어 순환 종양 세포, 감염원에 반응하여 활성화된 백혈구, 또는 세포주를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 건강한 또는 이환된 조직 샘플로부터의 조직 절편 (예를 들어, 결장, 유방 조직, 전립선으로부터의 조직 절편)을 포함한다. 조직 절편은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 잘라낸 얇은 조직 또는 세포 슬라이스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 다중 절편을 예를 들어 조직 마이크로어레이를 위해 채취하고, 분석에 적용할 수 있으며, 단 본원에 개시된 방법이 적어도 3종의 상이한 유형의 표적에 대해 (분자 수준, 예를 들어 RNA, 단백질 및 DNA에서) 조직 샘플의 동일한 절편의 분석을 위해 사용될 수 있어야 한다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일한 절편은 적어도 4종의 상이한 표적에 대해 (형태학적 또는 분자 수준에서) 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일 부분은 4개 초과의 상이한 표적에 대해 (형태학적 또는 분자 수준에서) 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플의 동일한 절편은 형태적 및 분자적 수준 둘 다에서 분석될 수 있다.

생물학적 샘플로서 이용될 경우 조직 절편의 두께는 약 100 마이크로미터 미만 범위, 약 50 마이크로미터 미만 범위, 약 25 마이크로미터 미만 범위, 또는 약 10 마이크로미터 미만 범위일 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플 내의 표적은 고체 지지체에 부착될 수 있다. 고체 지지체는 마이크로어레이 (예를 들어, DNA 또는 RNA 마이크로어레이), 겔, 블롯, 유리 슬라이드, 비드 또는 ELISA 플레이트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플 내의 표적은 나일론, 니트로셀룰로스, 및 폴리비닐리덴 디플루오라이드로부터 선택된 막에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 및 폴리프로필렌으로부터 선택된 플라스틱 표면을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에 따른 생물학적 샘플은 고체 또는 유체일 수 있다. 생물학적 샘플의 적합한 예는 배양액, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇌 척수액, 흉막액, 유액, 림프, 객담, 정액, 소변, 대변, 누액, 타액, 바늘 흡인물, 피부 외부 절편, 호흡관, 장, 및 비뇨생식관, 종양, 기관, 세포 배양액 또는 세포 배양액 구성성분, 또는 고체 조직 절편을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 그 자체로, 즉 관심 표적의 수거 및/또는 단리 없이 분석될 수 있다.

생물학적 샘플은 그의 물리적 상태, 예컨대 동결 또는 염색 또는 달리 처리된 상태 (이로 제한되지 않음)와 무관하게 임의의 상기 언급한 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 자연에서 샘플과 천연적으로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대, 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 포함할 수 있다.

샘플은 동결된 조직 절편 또는 파라핀 포매된 샘플일 수 있다. 파라핀 샘플은 생물학적 샘플이 이전에 예를 들어 왁스에서 포매시킴으로써 파라포름알데히드 고정된 샘플을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 먼저 고정되고, 그 후 상승 계열의 알콜을 통하여 탈수되고, 파라핀 또는 기타 절편화 매질로 침투 및 매립될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 조직 샘플은 절편화되고 후속적으로 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 파라핀 내에 매립되어 프로세싱될 수 있다. 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일단 조직 샘플이 포매된 후에, 샘플은 두께가 약 3 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터 범위인 절편으로 마이크로톰에 의해 절편화될 수 있다. 일단 절편화되면, 절편은 접착제를 이용하여 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 실시양태에서, 파라핀이 매립 물질로서 사용될 경우, 조직 절편은 파라핀 제거되고 물에서 재수화될 수 있다. 조직 절편은 예를 들어 유기 작용제, 예컨대 크실렌 또는 점진적으로 하강 계열의 알콜, 또는 세제를 사용함으로써 탈파라핀화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 논의된 샘플 제조 절차 이외에, 조직 절편은 계내 혼성화 및/또는 면역조직화학 이전, 그 동안 또는 이후에 추가의 처리에 적용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조직 절편은 에피토프 검색 방법, 예컨대 시트레이트 완충제 내에서 조직 샘플의 가열에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 절편은 임의의 비-특이적 결합을 최소화하기 위해 차단 단계에 임의로 적용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플의 일부, 또는 생물학적 샘플 (예컨대, 세포 용해물) 내에 존재하는 표적은 고체 지지체 (예컨대, 겔, 블롯, 유리 슬라이드, 비드, 또는 ELISA 플레이트)의 표면 상에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적은 고체 지지체의 표면 상에 부착될 수 있다. 생물학적 샘플 내의 표적은 물리적 결합 형성에 의해, 공유 결합 형성에 의해, 또는 둘 다에 의해 고체 지지체 상에 부착될 수 있다.

분석할 표적의 적합성은 생물학적 샘플에 필요한 분석의 유형 및 특성에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 생물학적 샘플 내의 분석물의 존재 또는 부재에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 생물학적 샘플의 상태에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 조직 샘플을 포함하는 경우에, 본원에 개시된 방법은 상이한 유형의 세포 또는 조직의 비교, 상이한 발생 단계의 비교, 질환 또는 이상의 존재 검출, 또는 질환 또는 이상 유형의 결정을 도울 수 있는 표적을 검출하기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 생물학적 샘플의 표적은 하나 이상의 펩티드, 단백질 (예를 들어, 항체, 아피바디, 또는 압타머), 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 또는 압타머); 폴리사카라이드 (예를 들어, 렉틴 또는 당), 지질, 효소, 효소 기질, 리간드, 수용체, 항원, 또는 합텐을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 본질적으로 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다. 하나 이상의 상기 언급된 표적은 특정한 세포를 특징으로 할 수 있는 반면, 다른 표적은 특정한 질환 또는 상태와 상관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 검출 및 분석될 수 있는 표적은 예후 표적, 호르몬 또는 호르몬 수용체 표적, 림프양 표적, 종양 표적, 세포 주기 연관 표적, 신경 조직 및 종양 표적, 또는 클러스터 분화 표적을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

예후 표적의 적합한 예는 효소 표적, 예컨대 갈락토실 트랜스퍼라제 II, 뉴런 특이적 엔올라제, 양성자 ATPase-2 또는 산 포스파타제를 포함할 수 있다.

호르몬 또는 호르몬 수용체 표적의 적합한 예는 인간 융모성 고나도트로핀 (HCG), 부신피질자극 호르몬, 암배아성 항원 (CEA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, gC1q-R/p33 보체 수용체, IL-2 수용체, p75 뉴로트로핀 수용체, PTH 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 또는 인슐린 수용체를 포함할 수 있다.

림프양 표적의 적합한 예는 알파-1-항키모트립신, 알파-1-항트립신, B 세포 표적, bcl-2, bcl-6, B 림프구 항원 36 kD, BM1 (골수성 표적), BM2 (골수성 표적), 갈렉틴-3, 그란자임 B, HLA 클래스 I 항원, HLA 클래스 II (DP) 항원, HLA 클래스 II (DQ) 항원, HLA 클래스 II (DR) 항원, 인간 호중구 데펜신, 이뮤노글로불린 A, 이뮤노글로불린 D, 이뮤노글로불린 G, 이뮤노글로불린 M, 카파 경쇄, 카파 경쇄, 람다 경쇄, 림프구/조직구 항원, 대식세포 표적, 뮤라미다제 (리소자임), p80 역형성 림프종 키나제, 혈장 세포 표적, 분비 백혈구 프로테아제 억제제, T 세포 항원 수용체 (JOVI 1), T 세포 항원 수용체 (JOVI 3), 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제, 또는 비군집된 B 세포 표적을 포함할 수 있다.

종양 표적의 적합한 예는 알파 태아단백질, 아포지단백질 D, BAG-1 (RAP46 단백질), CA19-9 (시알릴 루이사(sialyl lewisa)), CA50 (암종 연관 뮤신 항원), CA125 (난소암 항원), CA242 (종양 연관 뮤신 항원), 크로모그라닌 A, 클루스테린 (아포지단백질 J), 상피막 항원, 상피-관련 항원, 상피 특이적 항원, 총 낭포성 질환 유체 단백질-15, 간세포 특이적 항원, 헤레귤린, 인간 위 뮤신, 인간 유액 지방구, MAGE-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 멜란 A, 흑색종 표적 (HMB45), 메소텔린, 메탈로티오네인, 소안구증 전사 인자 (MITF), Muc-1 코어 당단백질, Muc-1 당단백질, Muc-2 당단백질, Muc-5AC 당단백질, Muc-6 당단백질, 미엘로퍼옥시다제, Myf-3 (횡문근육종 표적), Myf-4 (횡문근육종 표적), MyoD1 (횡문근육종 표적), 미오글로빈, nm23 단백질, 태반 알칼리성 포스파타제, 프리알부민, 전립선 특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 전립선 인히빈 펩티드, PTEN, 신세포 암종 표적, 소장 뮤신성 항원, 테트라넥틴, 갑상선 전사 인자-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 2의 조직 억제제, 티로시나제, 티로시나제-연관 단백질-1, 빌린, 또는 폰 빌레브란트 인자를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

세포 주기 연관 표적의 적합한 예는 아폽토시스 프로테아제 활성화 인자-1, bcl-w, bcl-x, 브로모데옥시우리딘, CAK (cdk-활성화 키나제), 세포 아폽토시스 감수성 단백질 (CAS), 카스파제 2, 카스파제 8, CPP32 (카스파제-3), CPP32 (카스파제-3), 시클린 의존성 키나제, 시클린 A, 시클린 B1, 시클린 D1, 시클린 D2, 시클린 D3, 시클린 E, 시클린 G, DNA 단편화 인자 (N-말단), Fas (CD95), Fas-연관 사망 도메인 단백질, Fas 리간드, Fen-1, IPO-38, Mcl-1, 미니염색체 유지 단백질, 미스매치 복구 단백질 (MSH2), 폴리 (ADP-리보스) 중합효소, 증식 세포 핵 항원, p16 단백질, p27 단백질, p34cdc2, p57 단백질 (Kip2), p105 단백질, Stat 1 알파, 토포이소머라제 I, 토포이소머라제 II 알파, 토포이소머라제 III 알파, 또는 토포이소머라제 II 베타를 포함할 수 있다.

신경 조직 및 종양 표적의 적합한 예는 알파 B 크리스탈린, 알파-인터넥신, 알파 시누클레인, 아밀로이드 전구체 단백질, 베타 아밀로이드, 칼빈딘, 콜린 아세틸트랜스퍼라제, 흥분성 아미노산 수송체 1, GAP43, 신경교 원섬유 산성 단백질, 글루타메이트 수용체 2, 미엘린 염기성 단백질, 신경 성장 인자 수용체 (gp75), 신경모세포종 표적, 신경필라멘트 68 kD, 신경필라멘트 160 kD, 신경필라멘트 200 kD, 뉴런 특이적 엔올라제, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 알파4, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 베타2, 페리페린, 단백질 유전자 산물 9, S-100 단백질, 세로토닌, SNAP-25, 시냅신 I, 시냅토피신, 타우, 트립토판 히드록실라제, 티로신 히드록실라제, 또는 유비퀴틴을 포함할 수 있다.

클러스터 분화 표적의 적합한 예는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3델타, CD3엡실론, CD3감마, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8알파, CD8베타, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CDw93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CDw125, CD126, CD127, CDw128a, CDw128b, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CDw150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, 및 TCR-제타를 포함할 수 있다.

다른 적합한 예후 표적은 동원체 단백질-F (CENP-F), 기안틴, 인볼루크린, 라민 A&C (XB 10), LAP-70, 뮤신, 핵공 복합체 단백질, p180 라멜라체 단백질, ran, r, 카텝신 D, Ps2 단백질, Her2-neu, P53, S100, 상피 표적 항원 (EMA), TdT, MB2, MB3, PCNA, 또는 Ki67을 포함할 수 있다.

단계 A, B, 및 C에서 RNA의 검출은 일반적으로 차단을 위해 통상적으로 연어 정자 DNA 또는 tRNA를 사용하는 임의의 예비혼성화 단계에 이어 승온에서 관심 표적에 대한 서열-특이적 프로브를 사용하는 혼성화 단계를 포함한다. 예비혼성화 단계의 부재 하에, 차단제는 혼성화 단계 동안 프로브 그 자체로 사용된다. 최적의 프로브 농도 및 온도는 일반적으로 최고의 신호 대 잡음 비에 대해 경험적으로 결정되지만, 프로브 Tm, 완충제 조성물 및 프로브 유형, 예를 들어 LNA 대 DNA 백본의 함수이다. 혼성화 시간은 또한 약 30분 이하 내지 밤샘 혼성화로 유의하게 달라질 수 있으며, 프로브 농도에 의해 제어될 수 있다. 혼성화 후 샘플을 1회 이상의 엄격한 세척에 적용하여 잉여량의 및 비-특이적으로 결합된 프로브를 제거하였다. 최종적으로, 프로브는 신호 발생제가 프로브에 직접적으로 부착된 경우에는 직접적으로 또는 신호 증폭의 존재 또는 부재 하에 간접적으로 검출된다. 검출은 수동 관찰, 필름 또는 다른 기록 장치, 카메라, 비디오 녹화 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호는 화학적 불활성화에 의해 상기 논의된 방법에 의해 제거될 수 있고, 샘플은 추가의 RNA 종에 대해 프로빙될 수 있다. 대안적으로, 다음 단계가 단백질 검출인 다른 실시양태에서, 신호는 결합된 프로브의 변성 또는 산 및/또는 염기에서의 고온 가열을 포함하는 항원 검색 과정으로 인한 신호의 불활성화에 의해 항원 검색 단계 동안 제거될 수 있다.

특정 실시양태에서, 상기 언급된 생물학적 샘플은 이어서 항원 검색 및 검출에 적용될 수 있다. 항원 표적은 생물학적 샘플 (예를 들어, 조직 절편의 표면 상의 항원)의 표면 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 표적은 본질적으로 생물학적 샘플의 표면 상에 존재하지 않을 수 있고, 생물학적 샘플은 표적을 표면 상에서 이용가능하도록 만들기 위해 처리되어야 할 수 있다 (예를 들어, 항원 회수, 효소적 소화 또는 에피토프 검색).

일반적으로, 단계 D 내지 G에 나타난 바와 같이, 특정 실시양태에서 항원 검색 후에 항원이 이전에 정의된 바와 같은 결합제를 사용하는 혼성화에 적용된다. 특정 실시양태에서, 결합제에 항원에 결합하는 항체가 포함된다. 적합한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체, 또는 이들이 표적 항원에 특이적으로 결합하는 한 항체 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 면역조직화학 (IHC)에 이용될 수 있다. 면역화학은 조직 또는 세포 (예를 들어, 이환된 세포 대 정상 세포)에 대한 정보를 제공하기 위해 항체-기반 결합제에 대한 표적 항원의 결합을 수반할 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 결합제로서 적합한 항체 (및 상응하는 질환/질환 세포)의 예는 항에스트로겐 수용체 항체 (유방암), 항프로게스테론 수용체 항체 (유방암), 항-p53 항체 (다발성 암), 항-Her-2/neu 항체 (다발성 암), 항-EGFR 항체 (표피 성장 인자, 다발성 암), 항-카텝신 D 항체 (유방암 및 다른 암), 항-Bcl-2 항체 (아폽토시스 세포), 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체 (난소암 및 다른 암), 항-CA15-3 항체 (유방암), 항-CA19-9 항체 (결장암), 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체 (MDR, 다중-약물 내성), 항-CEA 항체 (암배아성 항원), 항-망막모세포종 단백질 (Rb) 항체, 항-ras 종양단백질 (p21) 항체, 항-루이스(Lewis) X (CD15로도 언급됨) 항체, 항-Ki-67 항체 (세포 증식), 항-PCNA (다발성 암) 항체, 항-CD3 항체 (T-세포), 항-CD4 항체 (헬퍼 T 세포), 항-CD5 항체 (T 세포), 항-CD7 항체 (흉선세포, 미성숙 T 세포, NK 킬러 세포), 항-CD8 항체 (억제제 T 세포), 항-CD9/p24 항체 (ALL), 항-CD10 (CALLA로도 언급됨) 항체 (통상적인 급성 림프구성 백혈병), 항-CD11c 항체 (단핵구, 과립구, AML), 항-CD13 항체 (골수단핵구성 세포, AML), 항-CD14 항체 (성숙 단핵구, 과립구), 항-CD15 항체 (호지킨병), 항-CD19 항체 (B 세포), 항-CD20 항체 (B 세포), 항-CD22 항체 (B 세포), 항-CD23 항체 (활성화된 B 세포, CLL), 항-CD30 항체 (활성화된 T 및 B 세포, 호지킨병), 항-CD31 항체 (혈관신생 마커), 항-CD33 항체 (골수성 세포, AML), 항-CD34 항체 (내피 줄기 세포, 기질 종양), 항-CD35 항체 (수지상 세포), 항-CD38 항체 (혈장 세포, 활성화된 T, B, 및 골수성 세포), 항-CD41 항체 (혈소판, 거핵구), 항-LCA/CD45 항체 (백혈구 공통 항원), 항-CD45RO 항체 (헬퍼, 유도제 T 세포), 항-CD45RA 항체 (B 세포), 항-CD39, CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체 (아폽토시스), 항-CD99 항체 (유잉 육종 마커, MIC2 유전자 산물), 항-CD106 항체 (VCAM-1; 활성화된 내피 세포), 항-유비퀴틴 항체 (알츠하이머병), 항-CD71 (트랜스페린 수용체) 항체, 항-c-myc (종양단백질 및 합텐) 항체, 항-시토케라틴 (트랜스페린 수용체) 항체, 항-비멘틴 (내피 세포) 항체 (B 및 T 세포), 항-HPV 단백질 (인간 유두종 바이러스) 항체, 항-카파 경쇄 항체 (B 세포), 항-람다 경쇄 항체 (B 세포), 항-멜라노솜 (HMB45) 항체 (흑색종), 항-전립선 특이적 항원 (PSA) 항체 (전립선암), 항-S-100 항체 (흑색종, 타액 분비, 신경교 세포), 항-타우 항원 항체 (알츠하이머병), 항-피브린 항체 (상피 세포), 항-케라틴 항체, 항-시토케라틴 항체 (종양), 항-알파-카테닌 (세포 막), 또는 항-Tn-항원 항체 (결장 암종, 선암종, 및 췌장암)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

적합한 항체의 다른 구체적 예는 항 증식성 세포 핵 항원, 클론 pc10 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), P8825); 항 평활근 알파 액틴 (SmA), 클론 1A4 (시그마, A2547); 토끼 항 베타 카테닌 (시그마, C 2206); 마우스 항 pan 시토케라틴, 클론 PCK-26 (시그마, C1801); 마우스 항 에스트로겐 수용체 알파, 클론 1D5 (다코(DAKO), M 7047); 베타 카테닌 항체, 클론 15B8 (시그마, C 7738); 염소 항 비멘틴 (시그마, V4630); 안드로겐 수용체 클론 AR441 (다코, M3562); 폰 빌레브란트 인자 7, 케라틴 5, 케라틴 8/18, e-카드헤린, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, p53, 프로게스테론 수용체, 베타 카테닌; 당나귀 항-마우스 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch), 715-166-150); 또는 당나귀 항 토끼 (잭슨 이뮤노리서치, 711-166-152)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 항원 검출 과정은 표적 (예를 들어, 항원)에 대한 결합제의 결합에 충분한 시간 동안 및 이에 적합한 조건 하에 프로브 용액 (예를 들어, 표지된-항체 용액)을 생물학적 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 2가지 검출 방법이 이용될 수 있다: 직접 또는 간접. 직접 검출에서, 신호 발생제-표지된 일차 항체 (예를 들어, 형광단-표지된 일차 항체 또는 효소-표지된 일차 항체)는 추가의 항체 상호작용 없이 시각화될 수 있는 조직 샘플 또는 막 내의 항원과 함께 인큐베이션될 수 있다. 간접 검출에서, 접합되지 않은 일차 항체는 항원과 함께 인큐베이션될 수 있으며, 이어서 표지된 이차 항체는 일차 항체에 결합할 수 있다. 일부 이차 항체가 일차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 (최대 5개의) 일차 항체 (상이한 종으로부터, 표지 또는 비표지된 항체)가 조직 샘플과 접촉될 수 있다. 표지되지 않은 항체는 그 후 상응하는 표지된 이차 항체와 접촉시킬 수 있다. 대안적 실시양태에서, 일차 항체 및 특이적 결합 리간드-수용체 쌍 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘)을 사용할 수 있다. 일차 항체는 쌍의 하나의 구성원 (예를 들어, 비오틴)에 부착될 수 있고, 다른 구성원 (예를 들어, 스트렙타비딘)은 신호 발생제 또는 효소로 표지될 수 있다. 이차 항체, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 비오틴은 신호 발생제 또는 효소로 각각 독립적으로 표지될 수 있다.

일차 항체 또는 이차 항체가 효소적 표지에 접합될 수 있는 실시양태에서, 형광 신호 발생제-커플링된 기질이 항원의 시각화를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기질 및 형광 신호 발생제는 단일 분자 내에 포함될 수 있고, 단일 단계로 적용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 기질 및 형광 신호 발생제는 개별 엔티티일 수 있고, 단일 단계 또는 다중 단계로 적용될 수 있다.

결합제에 커플링된 효소는 형광 신호 발생제-커플링된 기질을 생물학적 샘플과 공유 결합시키기 위해 기질의 화학적 반응을 촉매하도록 기질과 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함할 수 있고, 기질은 티라민을 포함할 수 있다. 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 티라민 기질과의 반응은 티라민 기질을 샘플 내에 존재하는 페놀 기에 공유 결합시킬 수 있다. 효소-기질 접합체를 사용하는 실시양태에서, 신호 증폭은 하나의 효소가 다중 기질 분자를 촉매할 수 있기 때문에 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 간접적인 검출 방법 (예를 들어, 일차-이차 항체 사용), HRP-티라미드 신호 증폭 방법, 또는 이 둘의 조합 (예를 들어, 간접적인 HRP-티라미드 신호 증폭 방법)을 사용하여 낮은 풍부도의 표적을 검출하기 위해 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 기재된 방법에 신호 증폭 기술을 도입하고, 이에 대응하여 상응하는 신호 증폭 기술을 도입하는 것은 특정한 표적에 요구되는 감수성 및 프로토콜에 포함되는 단계의 수에 따라 달라질 수 있다.

신호 발생제로부터의 신호는 다양한 관찰 또는 검출 시스템을 이용하여 검출될 수 있다. 사용되는 검출 시스템의 특성은 사용되는 신호 발생제의 특성에 의존할 수 있다. 검출 시스템은 전하 결합 소자 (CCD) 검출 시스템, 형광 검출 시스템, 전기 검출 시스템, 사진 필름 검출 시스템, 화학발광 검출 시스템, 효소 검출 시스템, 광학 검출 시스템, 근접장 검출 시스템, 또는 내부 전반사 (TIR) 검출 시스템을 포함할 수 있다.

하나 이상의 상기 언급된 기술은 신호 발생제 (결합제와 커플링된 또는 효소 기질과 커플링된)로부터의 신호의 하나 이상의 특징을 관찰하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 강도, 신호 파장, 신호 위치, 신호 주파수 또는 신호 이동은 상기 언급된 기술 중 하나 이상을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호의 하나 이상의 상기 언급된 특징이 관찰, 측정 및 기록될 수 있다.

일부 실시양태에서, 관찰된 신호는 형광 신호이고, 생물학적 샘플 내의 표적에 결합된 프로브는 형광단인 신호 발생제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광 신호는 형광 검출 시스템을 사용하여 형광 파장 또는 형광 강도를 결정함으로써 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호는 계내에서 관찰될 수 있고, 즉 신호는 생물학적 샘플 내의 표적에 결합제를 통해 회합된 신호 발생제로부터 직접 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제로부터 신호는 생물학적 샘플 내에서 분석될 수 있고, 이것은 개별 어레이-기반 검출 시스템의 필요성을 배제한다.

일부 실시양태에서, 신호의 관찰은 생물학적 샘플의 영상의 포착을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 영상화 장치에 연결된 현미경을 본원에 개시된 방법에 따라 검출 시스템으로 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제 (예컨대, 형광단)는 여기될 수 있고, 얻어진 신호 (예컨대, 형광 신호)는 관찰되고, 디지털 신호 (예를 들어, 디지털화 영상)의 형태로 기록될 수 있다. 적절한 형광 필터를 이용하여 샘플 중 결합된 신호 발생제 (존재할 경우)에 대해 동일한 절차가 반복될 수 있다.

일부 실시양태에서, 다중 상이한 종류의 신호가 동일한 샘플 내에서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 하나의 표적은 형광 프로브를 사용하여 검출할 수 있고, 동일한 샘플 내의 제2 표적은 발색 프로브를 사용하여 검출할 수 있다.

특정 실시양태에서, 항체 프로브로부터의 신호의 제거 (단계 G)는 하나 이상의 신호 발생제를 선택적으로 변형시킬 수 있는 화학적 작용제와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학적 작용제는 형광 신호 발생제 및 효소를 둘 다 실질적으로 불활성화시키는 산화제이다. 일부 실시양태에서, 화학적 작용제는 본질적으로 산화제의 염기성 용액을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서 화학적 작용제에 대한 상이한 신호 발생제의 감수성은 부분적으로 신호 발생제의 농도, 온도 또는 pH에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 2종의 상이한 형광단은 산화제의 농도에 따라 산화제에 대해 상이한 감수성을 가질 수 있다.

적합한 산화제는 퍼옥시드, 과아이오딘산나트륨 또는 오존으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 산화제는 퍼옥시드 또는 퍼옥시드 공급원을 포함할 수 있고, 염기성 용액은 과산화수소를 포함할 수 있다. 염기성 용액 중 과산화수소의 농도는 소정의 기간에 형광 신호 발생제를 실질적으로 산화시키도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기성 용액 중 과산화수소의 농도는 주어진 기간에 형광 신호 발생제 및 효소를 둘 다 실질적으로 불활성화시키도록 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 염기성 용액은 약 0.5 부피 퍼센트 내지 약 5 부피 퍼센트 범위, 약 1 부피 퍼센트 내지 약 4 부피 퍼센트 범위, 또는 약 1.5 부피 퍼센트 내지 약 3.5 부피 퍼센트 범위의 양으로 과산화수소를 포함할 수 있다. 일부 구체적 실시양태에서, 염기성 용액은 약 3 부피 퍼센트 범위의 양으로 과산화수소를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 단계 E, F 및 G는 여러번 반복될 수 있다; 후속 (예를 들어, 제2, 제3 등) 프로브와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 신호를 관찰하는 단계, 및과 신호 발생제를 표백하는 단계. 다양한 프로브 및/또는 신호 발생제를 이용하여 사용자에게 다양한 표적에 대한 정보를 제공하기 위해, 추가의 표적에 결합할 수 있는 n번째 프로브를 사용하여 결합, 관찰, 및 표백 단계가 여러번 반복적으로 반복될 수 있다. 효소에 커플링된 결합제를 프로브로서 사용할 수 있는 실시양태에서, 결합 단계는 효소와 형광 신호 발생제에 커플링된 효소 기질과의 반응을 수반하는 반응 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태, 단계 E, F 및 G는 1-150회, 바람직하게는 5-100회 또는 보다 바람직하게는 5-60회 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일련의 단계가 25-30회, 보다 바람직하게는 2-10회 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 멀티플렉스화 분석을 수득하기 위해 일련의 프로브를 생물학적 샘플과 순차적인 방식으로 접촉시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브 세트가 단일 유형의 표적 (예를 들어, 상이한 RNA 표적 또는 상이한 단백질 또는 상이한 DNA 표적)을 표적으로 하는 1개 초과의 프로브의 혼합물을 포함할 수 있는 일련의 프로브 세트는 생물학적 샘플의 멀티플렉스화 분석을 수득하기 위해 생물학적 샘플과 순차적 방식으로 접촉될 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 혼합물은 2 내지 10개의 프로브, 바람직하게는 2-5개의 프로브를 포함한다. 멀티플렉스화 분석은 일반적으로 동일한 검출 메카니즘을 이용한 생물학적 샘플 내의 다중 표적의 분석을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 성분은 표백, 결합, 반응 (적용가능한 경우), 및 신호 관찰 단계의 반복된 주기 후에 유의하게 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플의 성분은 표백 단계 동안 유의하게 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 신호 제거 단계 동안 유의하게 변형되지 않는 생물학적 샘플의 성분은 표적이다. 일부 실시양태에서, 표적의 80% 초과가 신호 제거 단계의 과정에서 유의하게 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 표적의 95% 초과가 유의하게 변형되지 않는다.

항원-검출 과정 후에, 특정 실시양태에서 단계 H, I, J는 DNA의 검출을 허용한다. 일반적으로, 방법은 샘플의 프로테아제로의 처리를 포함한다. 처리 시간은 샘플에 따라, 샘플이 어떻게 제조되었는지, 예를 들어 고정제의 유형, 고정의 길이 등, 프로테아제 소화의 온도 및 프로테아제 그 자체의 농도에 따라 달라질 수 있다. 프로테아제 처리 후에 혼성화 완충제 중의 양쪽 프로브, 및 샘플 내의 표적은 가열에 의해 변성될 수 있고, 프로브는 샘플에 적용된다. 대안적으로, 프로브 및 표적은 프로브가 샘플에 적용된 후에 함께 변성될 수 있다. 혼성화는 보다 짧은 혼성화 시간이 요구되는 프로브가 개발되었고 혼성화 시간을 약 1시간 이하로 감소시킬 수 있으나 일반적으로는 밤새 처리되도록 허용된다. 혼성화 후에, 엄격한 세척이 잉여량의 프로브 뿐만 아니라 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위해 적용될 수 있다. 샘플은 핵을 염색하기 위해 형태학적 염색으로 처리된 후에 프로브 및 형태학적 염색 신호를 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예비혼성화 단계가 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로테아제 처리후 샘플은 고정 단계에 적용되어 조직 형태를 보존할 수 있다. 계내 DNA 검출의 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 그의 다양한 변형이 문헌 [Volpi & Bridger in Biotechniques, 45:385-409, 2008]에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다.

특정 실시양태에서 핵산 기재 결합제는 DNA 표적과의 결합에 사용될 수 있다. 핵산 기재 결합제는 핵산 표적과 왓슨-크릭(Watson-Crick) 결합을 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 결합제는 핵산 표적과 후그스틴(Hoogsteen) 결합을 형성하여 삼중체를 형성할 수 있다. 후그스틴 결합에 의해 결합하는 핵산 결합제는 핵산 표적의 주요 그루브에 들어가고, 여기에 위치하는 염기와 혼성화한다. 상기 결합제의 적합한 예는 핵산 (예를 들어, 항생제의 일부 형태)의 소수 및 주요 그루브를 인식하여 결합하는 분자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 결합제는 핵산 표적과 왓슨-크릭 및 후그스틴 결합을 둘 다 형성할 수 있다 (예를 들어, 비스 PNA 프로브는 핵산 분자에 대해 왓슨-크릭 및 후그스틴 결합을 둘 다 형성할 수 있음).

핵산 결합제의 길이는 또한 결합의 특이성을 결정할 수 있다. 결합제와 핵산 표적 사이의 단일 미스매치의 큰 비용은 보다 긴 서열보다 보다 짧은 서열에서 비교적 더 많을 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 긴 프로브가 미스매치를 보다 잘 수용할 수 있고 조건에 따라 핵산에 계속 결합할 수 있기 때문에, 보다 작은 핵산 결합제의 혼성화는 보다 긴 핵산 프로브의 혼성화보다 더 특이적일 수 있다. 특정 실시양태에서, 보다 짧은 결합제는 제시된 온도 및 염 농도에서 보다 낮은 결합 안정성을 보일 수 있다.

짧은 서열을 결합하기 위해 보다 큰 안정성을 나타낼 수 있는 결합제가 사용될 수 있다. 예를 들어 특정 실시양태에서 비스 PNA가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 결합제는 약 4개 뉴클레오티드 내지 수킬로베이스의 범위, 바람직하게는 12-1000개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 12 내지 400개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 결합제는 약 1000개 초과 뉴클레오티드 범위의 길이를 가질 수 있다. 핵산 결합제의 길이에도 불구하고, 결합제의 모든 뉴클레오티드 잔기가 핵산 표적 내의 상보성 뉴클레오티드에 혼성화하지 않을 수도 있다. 예를 들어, 결합제는 50개 뉴클레오티드 잔기의 길이를 포함할 수 있고, 이 뉴클레오티드 잔기 중 25개만이 핵산 표적에 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 잔기는 서로 연속적일 수 있다. 핵산 결합제는 단일 가닥일 수 있거나 또는 이차 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 샘플을 포함할 수 있고, 생물학적 샘플은 핵산 결합제를 사용한 계내 혼성화 (ISH)에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 샘플로부터 목적하는 정보를 얻기 위해 면역조직화학 (IHC) 뿐만 아니라 계내 혼성화에 적용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 대조 프로브를 샘플 내의 하나 이상의 표적에 결합시키는 것을 추가로 포함한다. 방법은 결합된 형광 프로브로부터의 신호 및 대조 프로브로부터의 대조 신호를 관찰하는 것을 추가로 포함한다. 결합된 형광 프로브는 형광 프로브를 실질적으로 불활성화시키지만 대조 프로브를 불활성화시키지 않는 불활성화제에 노출된다. 방법은 적어도 하나의 후속 형광 프로브를 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 표적에 결합시킨 후에 후속 결합된 형광 프로브로부터의 신호를 관찰하는 것을 추가로 포함한다.

대조 프로브는 불활성화제에 대해 안정한 신호 발생제를 포함할 수 있거나, 신호 발생제의 신호 생성 특성은 불활성화제와 접촉시에 실질적으로 영향을 받지 않는다. 신호 발생제는 불활성화제에 안정한 방사성동위원소 또는 형광단을 포함할 수 있다. 적합한 방사성동위원소는 P³², H³, ¹⁴C, ¹²⁵I 또는 ¹³¹I를 포함할 수 있다. 적합한 형광단은 DAPI를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 마지막 프로브 혼성화 및 검출 단계에서, 신호 발생제는 다양한 유형의 질량 검출기, 예컨대 적합한 금속 동위원소 또는 비-표백성 발색체에 의해 검출될 수 있는 하나 이상의 적합한 신호 발생제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 적합한 신호 발생제는 결합제에 커플링되어 대조 프로브를 형성할 수 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 항체에 커플링되어 대조 프로브를 형성할 수 있고, 항체는 생물학적 샘플 내에 존재하는 하나 이상의 표적 항원에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 적합한 신호 발생제는 샘플 내의 하나 이상의 표적에 결합할 수 있고, 또한 불활성화제의 존재 하에 안정한 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 적합한 대조 프로브는 DAPI일 수 있으며, 이는 샘플에서 핵산에 결합할 수 있고, 또한 불활성화제에 안정한 형광 신호를 제공할 수 있다.

일부 실시양태에서, 반복적 염색 단계에 대한 표적의 안정성의 지표를 제공하기 위해 본원에 개시된 방법에 대조 프로브가 사용될 수 있다. 예를 들어, 대조 프로브는 샘플 내의 기지의 표적에 결합될 수 있고, 대조군으로부터의 신호를 관찰하고 정량할 수 있다. 이어서, 불활성화제에 대한 표적 또는 결합제의 안정성의 지표를 제공하기 위해 반복적 염색 단계 동안 대조 신호가 모니터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복적 프로빙 단계 후에 샘플 내에 존재하는 표적의 양을 정량하기 위해 대조 신호의 정량적 측정치 (예를 들어, 신호 강도)가 모니터링될 수 있다.

특정 실시양태에서, 관심 샘플의 정량적 정보, 예를 들어 샘플 내의 표적의 농도 또는 샘플 내의 표적의 분자량을 얻기 위해 대조 프로브가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 대조 표적 (기지의 농도 또는 기지의 분자량을 가짐)은 블롯팅 기술로 관심 샘플과 함께 부하될 수 있다. 대조 프로브는 대조 표적에 결합될 수 있고, 대조 신호를 관찰할 수 있다. 이어서, 대조 신호는 관심 샘플로부터 관찰된 신호와 상관될 수 있다.

특정 실시양태에서, 대조 프로브는 반복적 프로빙 단계를 통해 수득된 다중 분자 정보, 및 예를 들어 형택학적 염색, 예컨대 DAPI를 사용하여 수득된 형태학적 정보의 공동-정합을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 방법은 수득한 명시야 형태학적 영상, 예를 들어 H&E를 이용하여 수득한 형상과 다중 형광 영상의 공동-정합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반복적 프로빙 단계에 사용되는 프로브는 H&E 영상과 함께 정합하기 위해 사용될 수 있는 공통적인 구획 정보를 갖지 않을 수 있다. 대조 프로브, 에컨대 DAPI 핵 염색제가 형광 영상과 함께 명시야 영상에서 헤마톡실린으로 염색된 핵을 공동-정합하기 위해 사용될 수 있다. 형광 영상 및 명시야 영상은 2개의 카테고리로 분류될 수 있는 영상 정합 알고리즘을 이용하여 공동-정합될 수 있다: 강도-기반 및 특징-기반 기술.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 제1 프로브 또는 후속 프로브와 접촉 단계 이전, 그 동안 또는 이후에 형태학적 염색제와 접촉될 수 있다. 형태학적 염색제는 세포 유형 또는 질환 상태의 확인을 용이하게 하기 위해 상이한 세포 성분을 염색시킬 수 있는 염료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형태학적 염색제는 프로브 내의 신호 발생제와 용이하게 구분될 수 있고, 즉 염색제는 프로브로부터의 신호와 중첩될 수 있는 신호를 방출할 수 없다. 예를 들어, 형광 형태학적 염색제에 대해, 형태학적 염색제로부터의 신호는 프로브에서 사용된 형광단과 동일한 파장에서 자가형광을 낼 수 없다.

형태학적 염색제는 상기 언급된 단계 중 어느 하나 이전, 그 동안 또는 이후에 생물학적 샘플과 접촉될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형태학적 염색제는 제1 프로브 접촉 단계와 함께 생물학적 샘플과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형태학적 염색제는 샘플을 화학적 작용제와 접촉시키기 전에 및 제1 프로브를 표적에 결합시킨 후에 생물학적 샘플과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형태학적 염색제는 샘플을 화학적 작용제와 접촉시키고 신호를 변형시킨 후에 신호 생물학적 샘플과 접촉될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 형태학적 염색제는 제2 프로브 접촉 단계와 함께 생물학적 샘플과 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 제2 프로브를 표적에 결합시킨 후에 형태학적 염색제와 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형태학적 염색제가 신호 발생제로부터의 형광 신호에 대한 배경 소음을 생성시킬 수 있는 경우에, 형태학적 염색제는 프로빙, 불활성화 및 재프로빙 단계 후에 생물학적 샘플과 접촉될 수 있다. 예를 들어, H&E와 같은 형태학적 염색제는 본원에 개시된 방법 후에 순차적으로 영상화되고 정합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 발색단, 형광단, 효소 또는 효소 기질이 형태학적 염색제로서 사용될 수 있다. 형태학적 염색제 (및 그의 표적 세포, 세포내 구획 또는 세포 성분)로서 사용할 수 있는 발색단의 적합한 예는 에오신 (알칼리성 세포 구성성분, 세포질), 헤마톡실린 (핵산), 오렌지 G (적혈구, 췌장, 및 뇌하수체 세포), 라이트 그린 SF (콜라겐), 로마노브스키-김자 (전체 세포 형태), 메이-그룬발트 (혈액 세포), 블루 카운터스테인 (트레비젠), 에틸 그린 (CAS) (아밀로이드), 포일겐-나프톨 옐로우 S (DNA), 김자 (다양한 세포 구획을 차별적으로 염색함), 메틸 그린 (아밀로이드), 피로닌 (핵산), 나프톨-옐로우 (적혈구), 뉴트럴 레드 (핵), 파파니콜로 염색제 (헤마톡실린, 에오신 Y, 오렌지 G 및 비스마르크 브라운 혼합물의 혼합물 (전체 세포 형태)), 레드 카운터스테인 B (트레비젠), 레드 카운터스테인 C (트레비젠), 시리우스 레드 (아밀로이드), 포일겐 시약 (파라로스아닐린) (DNA), 갈로시아닌 크롬-알룸 (DNA), 갈로시아닌 크롬-알룸 및 나프톨 옐로우 S (DNA), 메틸 그린-피로닌 Y (DNA), 티오닌-포일겐 시약 (DNA), 아크리딘 오렌지 (DNA), 메틸렌 블루 (RNA 및 DNA), 톨루이딘 블루 (RNA 및 DNA), 알시안 블루 (탄수화물), 루테늄 레드 (탄수화물), 수단 블랙 (지질), 수단 IV (지질), 오일 레드-O (지질), 반 기슨 트리크롬 염색제 (애시드 푸크신 및 피크르산 혼합물) (근육 세포), 마송 트리크롬 염색제 (헤마톡실린, 애시드 푸크신, 및 라이트 그린 혼합물) (콜라겐, 세포질, 핵소체를 상이하게 염색시킴), 알데히드 푸크신 (엘라스틴 섬유), 또는 바이게르트 염색제 (망상 및 교원 섬유를 구별함)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

적합한 형광 형태학적 염색제 (및 적용가능한 경우에 그의 표적 세포, 세포내 소기관 구획 또는 세포 구성성분)의 예는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (핵산), 에오신 (알칼리성 세포 구성성분, 세포질), 훽스트 33258 및 훽스트 33342 (2가지 비스벤즈이미드) (핵산), 아이오딘화프로피듐 (핵산), 스펙트럼 오렌지 (핵산), 스펙트럼 그린 (핵산), 퀴나크린 (핵산), 플루오레세인-팔로이딘 (액틴 섬유), 크로모마이신 A 3 (핵산), 아크리플라빈-포일겐 반응 (핵산), 아우라민 O-포일겐 반응 (핵산), 브로민화에티듐 (핵산), 니슬 염색제 (뉴런), 고친화도 DNA 형광단, 예컨대 POPO, BOBO, YOYO 및 TOTO 및 기타, 및 DNA 결합 단백질에 융합된 녹색 형광 단백질, 예컨대 히스톤, ACMA, 퀴나크린 및 아크리딘 오렌지를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

적합한 효소 (및 그의 일차 세포 위치 또는 활성)의 예는 ATPase (근섬유), 숙시네이트 데히드로게나제 (미토콘드리아), 시토크롬 c 옥시다제 (미토콘드리아), 포스포릴라제 (미토콘드리아), 포스포프룩토키나제 (미토콘드리아), 아세틸 콜린에스테라제 (신경 세포), 락타제 (소장), 산 포스파타제 (리소솜), 류신 아미노펩티다제 (간 세포), 데히드로게나제 (미토콘드리아), 미오데닐레이트 데아미나제 (근육 세포), NADH 디아포라제 (적혈구), 및 수크라제 (소장)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 형태학적 염색제는 불활성화제에 대해 안정할 수 있고, 즉 형태학적 염색제의 신호 발생 특성은 불활성화제에 의해 실질적으로 영향을 받지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플이 프로브 및 형태학적 염색제로 동시에 염색될 수 있는 경우에, 프로브로부터의 신호를 변경시키는 불활성화제의 적용은 형태학적 염색제로부터의 신호를 변형시키지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 형태학적 염색제가 반복적 프로빙 단계를 통해 수득한 분자 정보 및 형태학적 염색제를 통해 수득한 형태학적 정보를 공동-정합하기 위해 대조군으로서 사용될 수 있다.

단백질, RNA 및 DNA의 검출을 포함하는 본원에 개시된 방법은 일반적으로 특정한 방식으로 표적에 물리적으로 결합하는 결합제의 사용을 포함한다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 결합제는 표적에 충분한 특이성으로 결합할 수 있고, 즉 결합제는 임의의 다른 분자에 결합하는 것보다 큰 친화도로 표적에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 다른 분자에 결합할 수 있지만, 결합은 비-특이적 결합이 배경 수준이거나 배경 수준 근처일 수 있도록 하는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 표적에 대한 결합제의 친화도는 다른 분자에 대한 그의 친화도의 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 최대 차별적 친화도를 갖는 결합제가 사용될 수 있지만, 이들은 표적에 대해 최대 친화도를 갖는 것이 아닐 수 있다.

일부 실시양태에서, 표적 및 결합제 사이의 결합은 물리적 결합에 의해 달성될 수 있다. 물질적 결합은 비공유 상호작용에 의한 결합을 포함할 수 있다. 비공유 상호작용은 소수성 상호작용, 이온 상호작용, 수소 결합 상호작용, 또는 친화도 상호작용 (예컨대, 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 복합체화)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 표적 및 결합제는 2개 사이의 특이적 인식을 유도하여 물리적 결합을 생성하는 영역을 그 표면 상에 또는 공동 내에 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 그 분자 형태의 일부에 대한 상호 맞춤에 기초하여 생물학적 표적에 결합할 수 있다.

결합제 및 그의 상응하는 표적은 결합 쌍으로 간주될 수 있고, 그의 비-제한적인 예는 면역형 결합 쌍, 예컨대, 항원/항체, 항원/항체 단편, 또는 합텐/항-합텐; 비면역형 결합 쌍, 예컨대, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 폴산/폴레이트 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/특이적 탄수화물, 효소/효소, 효소/기질, 효소/기질 유사체, 효소/위-기질 (효소 활성에 의해 촉매될 수 없는 기질 유사체), 효소/보조 인자, 효소/조정제, 효소/억제제, 또는 비타민 B12/내인성 인자를 포함한다. 결합 쌍의 다른 적합한 예는 상보적 핵산 단편 (DNA 서열, RNA 서열, LNA 서열, 및 PNA 서열 포함); 단백질 A/항체; 단백질 G/항체; 핵산/핵산 결합 단백질; 또는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 결합제는 서열- 또는 구조-특이적 결합제일 수 있고, 여기서 결합제에 의해 인식되고 결합되는 표적의 서열 또는 구조는 그 표적에 충분히 특유할 수 있다.

일부 실시양태에서, 결합제는 구조-특이적일 수 있고, 표적의 일차, 이차, 또는 삼차 구조를 인식할 수 있다. 표적의 일차 구조는 그의 원자 조성 및 이 원자를 연결하는 화학 결합의 내용 (입체화학 포함), 예를 들어 단백질 내의 아미노산의 선형 배열의 유형 및 특성을 포함할 수 있다. 표적의 이차 구조는 생체분자의 절편의 전체적인 삼차원 형태를 의미할 수 있고, 예를 들어 단백질의 경우 이차 구조는 먼 아미노산을 서로 근접하게 만들 수 있는 다양한 입체형태로의 펩티드 "백본" 쇄의 폴딩을 의미할 수 있다. 이차 구조의 적합한 예는 알파 나선, 베타 병풍형 시트, 또는 랜덤 코일을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 표적의 삼차 구조는 그의 전체적인 삼차원 구조일 수 있다. 표적의 사차 구조는 하나 이상의 다른 표적 또는 거대분자와의 그의 비공유 상호작용 (예컨대, 단백질 상호작용)에 의해 형성된 구조일 수 있다. 사차 구조의 예는 헤모글로빈을 형성하는 4-글로빈 단백질 서브유닛에 의해 형성된 구조일 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따른 결합제는 임의의 상기 언급한 구조에 특이적일 수 있다.

구조-특이적 결합제의 예는 단백질 표적에 결합할 수 있는 단백질-특이적 분자를 포함할 수 있다. 적합한 단백질-특이적 분자의 예는 항체 및 항체 단편, 핵산 (예를 들어, 단백질 표적을 인식하는 압타머), 또는 단백질 기질 (비-촉매가능한)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 결합제는 서열-특이적일 수 있다. 서열-특이적 결합제는 핵산을 포함할 수 있고, 결합제는 표적 내의 뉴클레오티드 또는 그의 유도체의 특정한 선형 배열을 인식할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선형 배열은 각각 결합제 내의 상응하는 상보성 뉴클레오티드에 결합할 수 있는 연속적인 뉴클레오티드 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 서열은 프로브 상의 상응하는 상보성 잔기를 갖지 않을 수 있는 1, 2개 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 존재할 수 있기 때문에 연속적이지 않을 수 있다. 핵산-기재 결합제의 적합한 예는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 적합한 핵산은 핵산 유사체, 예컨대 디옥시게닌 dCTP, 비오틴 dcTP 7-아자구아노신, 아지도티미딘, 이노신, 또는 우리딘을 포함할 수 있다.

결합제의 유형 및 표적과 관계없이, 단백질, DNA, 및 RNA 검출에서, 결합제와 표적 사이의 결합 특이성은 또한 결합 조건 (예를 들어, 상보성 핵산의 경우에 혼성화 조건)에 따라 영향받을 수 있다. 적합한 결합 조건은 pH, 온도, 또는 염 농도 중 하나 이상을 조정함으로써 달성될 수 있다.

결합제는 내부에 표지 (결합제의 합성 동안 부착된 신호 발생제 또는 효소) 또는 외부에 표지 (보다 추후 단계 동안 부착된 신호 발생제 또는 효소)될 수 있다. 예를 들어, 단백질-기재 결합제의 경우, 내부에 표지된 결합제는 표지된 아미노산을 사용하여 제조될 수 있다. 유사하게, 내부에 표지된 핵산은 신호 발생제-표지된 뉴클레오티드를 성장하는 핵산으로 직접 도입하는 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 신호 발생제 또는 효소가 보다 추후 단계에서 도입될 수 있는 방식으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 상기 후자의 표지는 활성 아미노 또는 티올 기의 핵산 또는 펩티드 쇄 내로의 도입에 의해 화학적 수단에 의해 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제, 예컨대 단백질 (예를 들어, 항체) 또는 핵산 (예를 들어, DNA)은 적절한 화학적 방법을 이용하여 직접 화학적으로 표지될 수 있다.

일부 실시양태에서, 보다 큰 특이성 또는 특정 실시양태에서 신호의 증폭을 제공할 수 있는 결합제의 조합이 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 결합제의 샌드위치가 사용될 수 있고, 여기서 제1 결합제는 표적에 결합하여 이차 결합을 제공하는 기능을 수행할 수 있고, 이차 결합제는 표지를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 삼차 결합 (필요한 경우)을 추가로 제공할 수 있고, 삼차 결합 구성원은 표지를 포함할 수 있다.

결합제 조합의 적합한 예는 일차 항체-이차 항체, 상보적 핵산, 또는 다른 리간드-수용체 쌍 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘)을 포함할 수 있다. 적합한 결합제 쌍의 일부 구체적 예는 c-myc 에피토프를 갖는 재조합 발현된 단백질에 대한 마우스 항-myc; His-태그 에피토프를 갖는 재조합 단백질에 대한 마우스 항-HisG, 에피토프-태그를 갖는 재조합 단백질에 대한 마우스 항-엑스프레스, 염소 IgG 일차 분자에 대한 토끼 항-염소, 핵산에 대한 상보적 핵산 서열; 티오레독신 융합 단백질에 대한 마우스 항-티오, 융합 단백질에 대한 토끼 항-GFP, α-D-갈락토스에 대한 자칼린; 및 탄수화물-결합 단백질, 당, 니켈 커플링된 매트릭스 또는 헤파린에 대한 멜리비오스를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 일차 항체 및 이차 항체의 조합은 결합제로서 사용될 수 있다. 일차 항체는 표적의 특정 영역에 결합할 수 있고, 이차 항체는 일차 항체에 결합할 수 있다. 이차 항체는 일차 항체에 대한 결합 전에 신호 발생제 또는 효소에 부착될 수 있거나 또는 보다 추후 단계에서 신호 발생제 또는 효소에 결합될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 일차 항체 및 특이적 결합 리간드-수용체 쌍 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘)이 사용될 수 있다. 일차 항체는 쌍의 하나의 구성원 (예를 들어, 비오틴)에 부착될 수 있고, 다른 구성원 (예를 들어, 스트렙타비딘)은 신호 발생제 또는 효소로 표지될 수 있다. 이차 항체, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 비오틴은 신호 발생제 또는 효소로 각각 독립적으로 표지될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 면역염색 절차에서 사용될 수 있고, 일차 항체는 표적 단백질에 특이적으로 결합하기 위해 사용될 수 있다. 이차 항체는 일차 항체에 특이적으로 결합하여, 존재하는 경우에 일차 항체 및 후속 시약 (예를 들어, 신호 발생제 또는 효소) 사이에 브릿지를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일차 항체는 마우스 IgG (마우스에서 생성된 항체)일 수 있고, 상응하는 이차 항체는 마우스 IgG 내의 영역에 결합할 수 있는 영역을 갖는 염소 항-마우스 (염소에서 생성된 항체)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 증폭은 일부 이차 항체가 일차 항체 상의 에피토프에 결합할 수 있을 때 얻을 수 있다. 면역염색 절차에서, 일차 항체는 절차에 사용되는 제1 항체일 수 있고, 이차 항체는 절차에 사용되는 제2 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 일차 항체는 면역 염색 절차에 사용되는 유일한 항체일 수 있다.

본원에 개시된 방법에 적합한 신호 발생제의 유형은 수행되는 분석의 특성, 사용되는 에너지원 및 검출기의 유형, 사용되는 불활성화제의 유형, 결합제의 유형, 표적의 유형, 또는 결합제와 신호 발생제 사이의 부착 방식 (예를 들어, 절단가능함 또는 비-절단가능함)을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.

적합한 신호 발생제는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 분자 또는 화합물을 포함할 수 있다. 신호 발생제는 에너지원 또는 전류와의 상호작용 후에 특징적 신호를 제공할 수 있다. 에너지원은 전자기 방사선 공급원 및 형광 여기원을 포함할 수 있다. 전자기 방사선 공급원은 가시광선, 적외선 및 자외선을 비롯한 임의의 파장의 전자기 에너지를 제공할 수 있다. 전자기 방사선은 직접적인 광원의 형태일 수 있거나 또는 발광 화합물, 예컨대 공여자 형광단에 의해 방출될 수 있다. 형광 여기원은 공급원이 형광을 내도록 만들 수 있거나 또는 광자 방출 (즉, 전자기 방사선, 유도 전기장, 온도, 물리적 접촉, 또는 기계적 붕괴)을 야기할 수 있다. 적합한 신호 발생제는 광학 측정 (예를 들어, 형광), 전기 전도성, 또는 방사성을 비롯하여 다양한 방법에 의해 검출될 수 있는 신호를 제공할 수 있다. 적합한 신호 발생제는 예를 들어 발광, 에너지 수용, 형광, 방사성, 또는 켄칭일 수 있다.

적합한 신호 발생제는 그것이 결합하는 구성성분, 예를 들어 결합제와 입체적으로 및 화학적으로 상용성일 수 있다. 추가로, 적합한 신호 발생제는 표적에 대한 결합제의 결합을 방해하지 않을 수 있고, 결합제의 결합 특이성에 영향을 주지 않을 수 있다. 적합한 신호 발생제는 사실상 유기 또는 무기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 화학물질, 펩티드 또는 핵산 특성을 갖는 것일 수 있다.

적합한 신호 발생제는 직접 검출가능할 수 있다. 직접 검출가능한 모이어티는 또 다른 보다 낮은 특징적인 파장의 광에 의해 여기된 후 특정한 파장의 광을 방출하는 형광 표지와 같이, 신호를 방출하고/하거나 특정한 파장의 광을 흡수하는 그의 능력에 의해 직접 검출될 수 있는 것이다.

본원에 개시된 방법에 따라 적합한 신호 발생제는 화학적 작용제의 적용에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 불활성화제에 대한 노출시에 화학적으로 파괴될 수 있다. 화학적 파괴는 신호 발생제의 완전한 붕괴 또는 신호 발생제의 신호-생성 성분의 변형을 포함할 수 있다. 신호-생성 성분의 변형은 신호 생성 특성의 변형을 일으킬 수 있는 임의의 화학적 변형 (예컨대, 부가, 치환, 또는 제거)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 접합된 신호 발생제의 비접합화는 신호 발생제의 발색 특성의 파괴를 유발할 수 있다. 유사하게, 형광 신호 발생제 상의 형광-억제 관능기의 치환은 그의 형광 특성의 변형을 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 화학 제제에 의한 불활성화에 실질적으로 저항성인 하나 이상의 신호 발생제가 제시되는 방법에서 대조 프로브로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생제는 발광 분자, 방사성동위원소 (예를 들어, P³² 또는 H³, ¹⁴C, ¹²⁵I 및 ¹³¹I), 광 또는 전자 밀도 마커, 라만-활성 태그, 전자 스핀 공명 분자 (예컨대 예를 들어 니트록실 라디칼), 전하 전달 분자 (즉, 전하 도입 분자), 반도체 나노결정, 반도체 나노입자, 콜로이드 금 나노결정, 마이크로비드, 자기 비드, 상자성 입자 또는 양자 점으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생제는 발광 분자를 포함할 수 있다. 발광 분자는 특정한 파장의 광을 사용한 조사에 반응하여 광을 방출할 수 있다. 발광 분자는 광을 흡수하고 발광 (여기시에 물질에 의한 전자기 방사선의 비-열 방출), 인광 (방사선 흡수의 결과로서의 지연된 발광), 화학발광 (화학 반응에 의한 발광), 형광, 또는 편광 형광을 통해 광을 방출할 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생제는 본질적으로 형광단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 본질적으로, 예를 들어 면역조직화학 분석에서 항체에 부착된 형광단을 포함할 수 있다. 일차 항체에 접합될 수 있는 적합한 형광단은 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드, 벡터 레드, ELF (효소-표지된 형광), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, 플루오르X, 칼세인, 칼세인-AM, 크립토플루오르, 오렌지 (42 kDa), 탄제린 (35 kDa), 골드 (31 kDa), 레드 (42 kDa), 크림슨 (40 kDa), BHMP, BHDMAP, Br-오레곤, 루시퍼 옐로우, 알렉사 염료 패밀리, N-[6-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노]카프로일] (NBD), 바디피, 붕소 디피로메텐 디플루오라이드, 오레곤 그린, 미토트랙커 레드, 피코에리트린, 피코빌리단백질 BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa), 스펙트럼 블루, 스펙트럼 아쿠아, 스펙트럼 그린, 스펙트럼 골드, 스펙트럼 오렌지, 스펙트럼 레드, 적외선 (IR) 염료, 시클릭 GDP-리보스 (cGDPR), 칼코플루오르 화이트, 리사민, 움벨리페론, 티로신 또는 트립토판을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 본질적으로 시아닌 염료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 본질적으로 Cy3 염료, Cy5 염료, 또는 Cy7 염료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생제는 FRET 쌍의 일부일 수 있다. FRET 쌍은 서로 근접하여 위치하는 경우에 검출가능한 신호를 생성하거나 제거하기 위해 FRET를 겪을 수 있는 2개의 형광단을 포함한다. 공여자의 일부 예는 알렉사 488, 알렉사 546, 바디피 493, 오이스터 556, 플루오르 (FAM), Cy3, 또는 TTR (탐라)을 포함할 수 있다. 수용자의 일부 예는 Cy5, 알렉사 594, 알렉사 647, 또는 오이스터 656을 포함할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 하나 이상의 상기 언급된 분자는 신호 발생제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제 중 하나 이상은 화학적 파괴에 적용되지 않을 수 있고, 절단가능한 링커는 신호 발생제 및 결합제를 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제 중 하나 이상은 신호 파괴에 적용될 수 있고, 신호 발생제는 본질적으로 화학적으로 파괴될 수 있는 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 산화제에 의해 화학적으로 파괴될 수 있는 형광단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 본질적으로 산화제에 의해 화학적으로 파괴될 수 있는 시아닌, 쿠마린, 바디피, 아토 658, 양자 점 또는 아토 634를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생제는 파괴되거나 또는 켄칭될 수 있는 Cy3 염료, Cy5 염료, 또는 Cy7 염료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 프로브는 효소에 커플링된 결합제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 효소는 샘플 내에 존재하는 수용체 (예를 들어, 페놀 기) 또는 샘플이 결합하는 고체 지지체에 결합할 수 있는 반응 생성물을 형성하기 위해 기질의 화학적 반응을 촉매한다. 수용체는 외인성 (즉, 샘플 또는 고체 지지체에 외부에서 부착된 수용체) 또는 내인성 (샘플 또는 고체 지지체의 내부에 존재하는 수용체)일 수 있다. 신호 증폭은 단일 효소가 기질의 화학적 반응을 촉매하여 표적 근처의 다수의 신호 발생제에 공유 결합할 수 있기 때문에 달성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 적합한 효소는 또한 산화제에 의해 불활성화될 수 있다. 적합한 효소의 예는 퍼옥시다제, 옥시다제, 포스파타제, 에스테라제, 및 글리코시다제를 포함한다. 적합한 효소의 구체적 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 리파제, 및 글루코스 옥시다제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 시토크롬 C 퍼옥시다제, 글루타티온 퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 및 대두 퍼옥시다제로부터 선택된 퍼옥시다제이다.

일부 실시양태에서, 결합제 및 효소는 단일 엔티티, 예를 들어 표적에 결합할 수 있고 또한 기질의 화학 반응을 촉매할 수 있는 단백질 분자 내에 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 결합제 및 효소는 개별 엔티티 내에 포함되고, 공유 결합 형성에 의해 또는 리간드-수용체 접합체 쌍 (예를 들어, 비오틴 스트렙타비딘)의 사용에 의해 커플링될 수 있다.

효소 기질은 사용되는 효소 및 샘플 내의 또는 고체 지지체 상의 결합에 이용가능한 표적에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, HRP를 효소로서 포함하는 실시양태에서, 기질은 치환된 페놀 (예를 들어, 티라민)을 포함할 수 있다. 티라민에 대한 HRP의 반응은 전자-풍부 모이어티 (예컨대 티로신 또는 트립토판) 또는 생물학적 샘플의 표면 단백질에 존재하는 페놀기와 같은 내인성 수용체에 결합할 수 있는 활성화된 페놀 기질을 생산할 수 있다. 3-메틸-2-벤조티아졸리논 히드로클로라이드 (MBTH)가 HRP 효소와 함께 기질로서 사용될 수 있는 대안적 실시양태에서, p-디메틸아미노벤즈알데히드 (DMAB)와 같은 외인성 수용체는 기질과의 반응 전에 고체 지지체 또는 생물학적 샘플에 부착될 수 있다.

일부 실시양태에서, 효소 기질은 효소와의 반응 후에 탈인산화될 수 있다. 탈인산화된 반응 생성물은 샘플 또는 고체 지지체 내의 내인성 또는 외인성 수용체 (예를 들어, 항체)에 결합할 수 있다. 예를 들어, 효소는 알칼리성 포스파타제 (AP)를 포함할 수 있고, 기질은 NADP, 치환된 포스페이트 (예를 들어, 니트로페닐 포스페이트), 또는 인산화 비오틴을 포함할 수 있다. 수용체는 따라서 NAD 결합 단백질, 탈인산화된 반응 생성물에 대한 항체 (예를 들어, 항 니트로-페놀), 아비딘, 또는 스트렙타비딘을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 효소는 β-갈락토시다제를 포함할 수 있고, 기질은 플루오레세인 또는 쿠마린의 β-갈락토피라노실-글리코시드를 포함할 수 있다. 수용체는 탈글리코실화된 모이어티에 대한 항체 (예를 들어, 항-플루오레세인 또는 항-쿠마린)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HRP/AP와 같은 다수의 효소 조합이 효소로서 사용될 수 있다. 기질은 페놀 기 또는 전자 풍부 모이어티-기반 수용체에 결합할 수 있는 반응 생성물을 형성하기 위해 HRP와 반응하기 전에 AP에 의해 탈인산화될 수 있는 인산화된 치환된 페놀, 예를 들어 티로신 포스페이트를 포함할 수 있다.

효소 기질의 반응 생성물은 또한 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용되는 효소 기질은 비-발색 또는 비-화학발광 기질을 포함할 수 있고, 즉 효소 및 효소 기질의 반응은 그 자체가 검출가능한 신호를 생성할 수 없다. 본원에 개시된 방법에 사용되는 효소 기질은 표지로서 외부의 신호 발생제 (예를 들어, 형광단)를 포함할 수 있다. 신호 발생제 및 효소 기질은 직접 (예를 들어, 형광 표지를 갖는 효소 기질) 또는 간접적으로 (예를 들어, 리간드-수용체 접합체 쌍을 통해) 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기질은 보호된 관능기 (예를 들어, 술프히드릴 기)를 포함할 수 있다. 수용체에 대한 활성화된 기질의 결합 후에, 관능기는 탈보호될 수 있고, 신호 발생제에 대한 접합은 티올 반응성 기 (예를 들어, 말레이미드 또는 아이오도아세틸)를 갖는 신호 발생제를 사용하여 달성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 프로브는 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함할 수 있고, 기질은 치환된 페놀 (예를 들어, 티라민)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 양고추냉이 퍼옥시다제는 샘플에 존재하는 페놀 기 또는 샘플이 결합하는 고체 지지체에 공유 결합하기 위해 활성화된 페놀계 기질을 유발한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 HRP에 커플링된 결합제를 포함할 수 있고, 기질은 형광단에 커플링된 티라민을 포함할 수 있다.

화학적 작용제는 신호 발생제, 효소, 또는 신호 발생제 및 결합제 또는 효소 기질 사이의 절단가능한 링커 (존재하는 경우에)를 변형시킬 수 있는 것 또는 이러한 화학물질을 포함할 수 있다. 화학적 작용제는 고체, 용액, 겔, 또는 현탁액의 형태로 샘플과 접촉될 수 있다.

일부 실시양태에서, 화학적 작용제는 산화제, 예를 들어 활성 산소 종, 히드록실 라디칼, 일중항 산소, 과산화수소, 또는 오존을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학적 작용제는 과산화수소, 과망가니즈산칼륨, 중크로뮴산나트륨, 수성 브로민, 아이오딘-칼륨 아이오다이드 또는 t-부틸 히드로퍼옥시드를 포함할 수 있다.

하나 이상의 상기 언급된 화학적 작용제는 화학적 작용제에 대한 신호 발생제, 효소, 결합제, 표적, 또는 생물학적 샘플의 감수성에 따라 본원에 개시된 방법에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본질적으로 결합제, 표적, 및 생물학적 샘플의 일체성에 영향을 주지 않는 화학 작용제가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제와 표적 사이의 결합 특이성에 영향을 주지 않는 화학 작용제가 사용될 수 있다. 특이적 RNA, 단백질, 또는 DNA 표적이 검출 또는 관찰되는 단계 B, F, 및 J와 관련하여, 일부 실시양태에서, 단계는 샘플에서 적어도 하나의 표적의 정량적 측정을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호의 강도 값 (예를 들어, 형광 강도)를 측정할 수 있고, 생물학적 샘플 내의 표적의 양에 상관될 수 있다. 표적의 양과 신호 강도 간의 상관관계를 검정 표준물을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 신호의 강도 값을 측정하고, 각각의 표적 양에 상호관련시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 신호 강도를 비교함으로써, 제1 표적 및 제2 표적의 상대적인 양 (서로에 관한 또는 대조군에 관한)을 확인할 수 있다. 이와 유사하게, 다중 프로브를 사용하여 다중 표적을 분석할 수 있는 경우에, 생물학적 샘플 내의 상이한 표적의 상대적인 양은 상이한 신호 강도를 측정함으로써 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 설명한 바와 같이 하나 이상의 대조 샘플을 사용할 수 있다. 샘플 (관심 생물학적 샘플 대 대조군)내의 신호의 존재 또는 부재를 관찰함으로써, 생물학적 샘플에 관한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들어, 이환된 조직 샘플 대 정상 조직 샘플을 비교함으로써, 이환된 조직 샘플에 존재하는 표적에 대한 정보를 얻을 수 있다. 유사하게, 샘플 (즉, 관심 샘플 및 하나 이상의 대조군) 사이의 신호 강도를 비교함으로써, 샘플 내의 표적의 발현에 대한 정보를 얻을 수 있다.

일부 실시양태에서, 검출 단계는 샘플에서 적어도 2개의 표적을 공동-국재화를 포함한다. 샘플에서 표적을 공동-국재화시키는 방법은 2007년 3월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제11/686,649호(발명의 명칭: "System and Methods for Analyzing Images of Tissue Samples"); 2006년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 제11/500028호(발명의 명칭: "System and Method for Co-Registering Multi-Channel Images of a Tissue Micro Array"); 2006년 11월 30일에 출원된 미국 특허 출원 제11/606582호(발명의 명칭: "System and Methods for Scoring Images of a Tissue Micro Array"); 및 2007년 2월 28일에 출원된 미국 특허 출원 제11/680063호(발명의 명칭: "Automated Segmentation of Image Structures")에 기재되어 있고, 이들 각각 문헌은 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 신호의 위치를 관찰할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 신호의 국재화는 형태학적 염색제를 사용하여 관찰할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 신호의 상대적인 위치를 관찰할 수 있다. 신호의 위치는 생물학적 샘플 내의 표적의 위치에 상관될 수 있어서, 생물학적 샘플 내의 상이한 표적의 국재화에 관한 정보를 제공한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 상이한 표적의 국재화에 관한 정보를 얻기 위해, 신호의 강도 값과 신호의 위치를 상관시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 표적은 핵에 비해 세포질 내에서 더 많이 또는 그 반대의 경우에 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 신호의 위치와 강도 값을 비교함으로써 표적의 상대적인 국재화에 관한 정보를 얻을 수 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 관찰 또는 상관 단계는 컴퓨터-지원 수단을 이용하여 수행할 수 있다. 신호 발생제로부터의 신호(들)이 디지털 영상(들)의 형태로 저장될 수 있는 실시양태에서, 영상(들)의 컴퓨터-지원 분석을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 영상 (예를 들어, 프로브(들) 및 형태학적 염색제로부터의 신호)은 생물학적 샘플의 완전한 정보, 예를 들어 위상 및 상관관계 정보를 얻기 위해 컴퓨터-지원 중첩법을 이용하여 오버레이될 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 언급된 공정 단계 중 하나 이상은 자동화될 수 있고, 자동화 시스템을 이용하여 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모든 단계는 자동화 시스템을 이용하여 수행할 수 있다.

본원에 개시된 방법은 생물학 및 의학에서의 분석, 진단 및 치료 적용에서 적용법을 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 조직화학, 특히 면역조직화학에서 적용법을 찾을 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따르면, 환자로부터 수득한 세포 또는 조직 샘플의 분석은 진단 (예를 들어, 특정한 질환을 갖거나, 특정한 독소에 노출되었거나 또는 특정한 치료 또는 기관 이식에 잘 반응하고 있는 환자를 확인하기 위해) 및 예후 (예를 들어, 특정한 질환이 발병할 가능성이 있거나, 특정한 치료에 잘 반응할 가능성이 있거나, 또는 특정한 기관 이식을 받아들일 가능성이 있는 환자를 확인하기 위해)에 이용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 동일한 생물학적 샘플로부터의 다수의 (예를 들어, 잠재적으로 무한한 수의) 표적 (예를 들어, 질환 마커)의 정확하고 신뢰성 있는 분석을 촉진할 수 있다.

실험

조직 샘플의 제조

인간 폐 조직 샘플을 파라핀 포매 조직 슬라이드로서 수득하였다. 샘플은 정상 조직, 전암성 조직, 및 진행 등급 (판토믹스(Pantomics), LUC961)을 갖는 암 조직의 하나의 마이크로어레이, 및 4개의 전체 조직 폐암 샘플 (우드 허드슨 캔서 리처시 센터(Wood Hudson Cancer Research Center))을 포함하였다.

파라핀 포매 슬라이드를 오븐 랙에 조직이 위를 향하고 평행하도록 넣어 1시간 동안 60℃에서 구웠다. 구운 후에, 슬라이드를 10분 동안 부드럽게 교반하면서 크실렌에서 세척함으로써 탈파라핀화시켰다. 이어서, 샘플을 100%, 95%, 70% 및 50%의 순서로 감소하는 농도를 갖는 4개의 에탄올 용액에서 세척함으로써 재수화시킨 후에, 1x 포스페이트 완충 염수 (PBS, pH 7.4)로 세척하였다. 재수화 후에, 슬라이드를 1x PBS로 세척하였다. 조직의 막 투과를 위해 PBS 중 0.3% 트리톤 X-100에서 10분 세척을 수행하고, 이후에 1x PBS로 세척하였다.

U6 snRNA 염색

투과 후에, 슬라이드를 예비혼성화 완충제 (1x 엑시콘(Exiqon) 완충제, 엑시콘, miRCURY LNA™ 마이크로RNA ISH 최적화 키트)와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 엑시콘 완충제 중 50mM TYE665 표지된 U6 프로브 (엑시콘, 인크.(Exiqon, Inc.)로부터의 맞춤형 U6 프로브) 100ul로 50℃에서 밤새 서모브라이트(Thermobrite)에서 혼성화시켰다. 슬라이드를 0.5xSSC 및 0.2x SSC로 50℃에서 10분 동안 세척하고, 이어서 0.1x SSC로 잠시 세정하였다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 DAPI 염색하고, 마운팅 배지를 사용하여 올렸다. 영상을 올림푸스(Olympus) 현미경 상에서 20x 배율로 촬영하였다. 영상은 도 2 및 3에 제시된다 - 패널 A: DAPI로 염색된 핵, 패널 B: TYE665로 염색된 U6 snRNA.

항원 검색

RNA 검출 과정 후에, 슬라이드를 이중-완충제 열-유도된 에피토프 검색으로 처리하였다. 압력 쿠커를 사용하여 슬라이드를 시트레이트 완충제 pH 6.0 (벡터 언매스킹 솔루션(Vector Unmasking Solution))에 압력하에 20분 동안 노출시키고, 이어서 고온의 트리스-EDTA 완충제 pH 9.0으로 전달하고, 대기압에서 20분 동안 쿠커에서 유지시켰다. 이후에, 이를 실온에서 10분 동안 냉각시키고, 1xPBS에서 일련의 세척을 수행하였다.

차단

항원 검색 후에, 슬라이드를 10% 당나귀 혈청, 3% 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션함으로써 비특이적 결합을 차단하였다.

단백질 염색

슬라이드를 DAPI로 염색하고, 커버슬립으로 덮었다. 영상을 RNA 검출에 사용된 것과 동일한 영상 영역을 이용하여 단백질 염색 전에 20x에서 촬영하여 Cy3 및 Cy5 채널로부터의 자가형광의 기준선을 결정하였다. 슬라이드의 커버슬립을 1xPBS에서 열고, 1X PBS 중 3% BSA에 희석된 Cy3-직접 접합된 시토케라틴-7 (다코(Dako) M7018, 20μg/mL) 및 Cy5-직접 접합된 EGFR (셀 시그널링(Cell Signaling) 4267, 20μg/mL)의 칵테일로 염색하였다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 1xPBS에서의 일련의 세척으로 잉여량의 항체를 제거하고, 슬라이드를 커버슬립으로 덮었다. 샘플을 영상화하고 (도 2 및 3, 패널 C: Cy5로 염색된 EGFR 및 패널 D: Cy3으로 염색된 시토케라틴 7), 이어서 염기성 H₂O₂ 용액으로 15분 동안 처리하여 직접 접합된 염료를 표백하였다. 15분 후에, 슬라이드를 PBS로 세척하고, 커버슬립을 덮었다. 다시 영상을 촬영하여 표백 후의 자가형광의 기준선을 결정하였다. 슬라이드를 Cy3-직접 접합된 NaKATPase (에피토믹스(Epitomics) 2047, 5μg/mL) 및 Cy5-접합된 IGF1R (라이프스팬 바이오사이언시스(Lifespan Biosciences) LS-C82136, 20μg/mL)의 제2 칵테일로 염색하고, 커버슬립을 덮고, 다시 영상화하였다 (도 2 및 3, 패널 E: Cy5로 염색된 IGF1R 및 패널 F: Cy3으로 염색된 NaKATPase). 샘플을 FISH 처리 전에 두번째로 표백하였다.

DNA FISH

후속적 FISH 염색을 허용하기 위해 커버슬립을 2xSSC 완충제에서 인큐베이션함으로써 제거하고, 슬라이드를 핵 DNA에 대한 접근을 허용하기 위해 단백질 구조를 부분적으로 제거하는 0.05% 펩신을 사용하는 10분 처리에 적용하였다. 이어서, 슬라이드를 수성 4% 포름알데히드 용액을 사용하여 10분 동안 고정하고, 세척하고, EGFR (플래티늄브라이트415, 청록색 형광단), cMet (플래티늄브라이트550, 적색 형광단) 및 염색체 7 동원체 (플래티늄브라이트495, 녹색 형광단)에 대한 FISH 프로브를 사용하는 혼성화에 적용하고, DAPI로 대조염색하였다. 혼성화는 에탄올의 증가하는 농도의 일련의 수용액에 이어 100% 에탄올을 통해 통과시켜 슬라이드를 탈수시킴으로써 수행한 후에 잠시 건조시켰다. 프로브 혼합물을 조직 절편을 함유하는 슬라이드의 영역에 적용한 후, 커버 슬립으로 덮고, 슬라이드를 가열하고 냉각할 수 있는 슬라이드 인큐베이터에 두었다. 프로브 혼합물을 함유하는 슬라이드를 10분 동안 80℃로 가열하여 DNA 하이브리드를 변성시키고, 37℃로 냉각시켰다. 이어서, 슬라이드를 그 온도에서 16시간 동안 유지하였다. 이어서, 슬라이드를 0.3%의 세제 NP-40을 함유하는 2xSSC 완충제에서 세척하고, 72℃에서 0.3% NP-40을 함유하는 0.4xSSC에서 2분 동안 세척한 후에, DAPI로 대조염색하였다. 다음에, 침습성 종양을 갖는 조직 절편의 영역을 면역형광 단계에서 기록된 좌표를 사용하여 영상화하였다. 영상 세트를 청색, 녹색 및 적색 형광단 및 DAPI에 특이적인 필터세트를 사용하여 40x에서 기록하였다 (도 2 및 3, 패널 G: 플래티늄브라이트550으로 염색된 cMET 및 패널 H: 플래티늄브라이트415로 염색된 EGFR 유전자).

본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특성으로부터 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구체화될 수 있다. 따라서, 상기 실시형태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 제한하는 것이라기보다는 오히려 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 기재에 의해서라기보다는 오히려 첨부된 특허청구범위에 의해 나타내어지며, 이에 따라 특허청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 본 발명에서 구체화되도록 의도된다. 본 발명은 그의 취지 또는 본질적 특성으로부터 벗어나지 않고 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시형태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 제한하는 것이라기보다는 오히려 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 기재에 의해서라기보다는 오히려 첨부된 특허청구범위에 의해 나타내어지고, 이에 따라 특허청구범위의 등가의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 본 발명에서 구체화되도록 의도된다.

Claims

(a) 생물학적 샘플을 RNA 표적에 직접 또는 간접적으로 결합하는 표지된 핵산 프로브를 사용하는 계내 혼성화 반응에 적용하는 단계;
(b) RNA 표적에 결합된 표지된 프로브로부터의 신호를 관찰하는 단계;
(c) 임의로 표지된 프로브로부터의 신호를 제거하는 단계;
(d) 샘플을 항원 검색 프로토콜에 적용하여 샘플의 단백질 에피토프를 검색하는 단계;
(e) 샘플을 항체-기반 방법을 이용하는 계내 혼성화 반응에 적용하고, 하나 이상의 항체 프로브를 샘플 상의 항원에 부착시키는 단계;
(f) 하나 이상의 항체 프로브로부터의 신호를 관찰하는 단계;
(g) 항체 프로브로부터의 신호를 제거하는 단계;
(h) 임의로 프로테아제 처리를 적용하여 샘플의 DNA 표적에 접근하는 단계;
(i) 샘플을 표지된 핵산 프로브를 사용하는 계내 혼성화 반응에 적용하여 샘플의 DNA 표적 중 하나 이상을 직접 또는 간접적으로 표지하는 단계;
(j) 표지된 DNA 표적으로부터의 신호를 관찰하는 단계;
(k) 임의로 하나 이상의 표지된 DNA 표적으로부터의 신호를 제거하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플에서 다중 표적을 프로빙하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)에서 표지된 핵산 프로브를 사용하는 계내 혼성화 반응이 동일한 RNA 표적을 표적으로 하는 다중 프로브와의 혼성화를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 a가 DNA를 차단하기 위한 예비혼성화 단계, 혼성화 반응에서의 차단제의 사용, 또는 그의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, RNA 표적에 결합된 표지된 프로브로부터의 신호를 관찰한 후에 샘플을 단계 c에 적용하고, 단계 a, b 및 c를 상이한 RNA 표적에 대한 다른 표지된 핵산 프로브를 사용하여 1회 이상 반복하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체-기반 방법을 이용하는 계내 혼성화 반응이 면역조직화학 (IHC) 또는 면역형광 (IF) 기술을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 항체 프로브가 1개 초과의 프로브의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 혼합물이 2 내지 10개의 프로브를 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 적어도 하나의 항체 프로브가 효소적 표지, 형광 신호 발생제, 또는 그의 조합에 접합된 것인 방법.
제5항에 있어서, 하나 이상의 항체 프로브로부터의 신호를 관찰하고 제거한 후에, 단계 e, f 및 g를 상이한 항원에 대한 또 다른 항체 프로브를 사용하여 1회 이상 반복하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 프로테아제 처리 후에, 조직 형태의 보존 단계, 예비혼성화, 또는 그의 조합을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (i)에서의 계내 혼성화가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 결합, 후그스틴(Hoogsteen) 결합, 또는 그의 조합을 형성하기 위한 핵산 기재 결합제를 사용하는 처리를 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 핵산 결합제의 길이가 약 4개 뉴클레오티드 내지 약 1000개 뉴클레오티드의 범위인 방법.
제12항에 있어서, 핵산 결합제의 길이가 약 12개 뉴클레오티드 내지 약 400개 뉴클레오티드의 범위인 방법.
제1항에 있어서, DNA 표적에 결합된 표지된 프로브로부터의 신호를 관찰한 후에, 단계 I, j 및 k를 상이한 DNA 표적에 대한 또 다른 표지된 핵산 프로브를 사용하여 1회 이상 반복하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 c, g 및 i에서 신호를 제거하는 것이 신호 불활성화제, 광반응, 광활성화된 화학물질 표백, 프로브 스트리핑, 산화, 전자 전달, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 샘플을 하나 이상의 대조 프로브로 염색하여 샘플의 다중 영상의 정합을 허용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 대조 프로브가 형태학적 염료인 방법.
제16항에 있어서, 샘플의 다중 영상을 정합하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 정합은
단계 b, f, j, 또는 그의 조합으로부터의 샘플의 다중 영상을 수득하는 것;
대조 프로브로부터 검출된 신호에 따라 다중 영상을 정렬하고 오버레이시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 오버레이된 영상으로부터 단백질, RNA 및 DNA의 발현을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 관찰 단계 b, f, j, 또는 그의 조합에서 관찰된 신호의 하나 이상의 강도 값을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 신호의 하나 이상의 강도 값을 측정하는 것이 신호 증폭 기술을 포함하는 것인 방법.
제21항에 있어서, 신호가 형광 신호, 발색 프로브, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 강도 값을 샘플에 존재하는 표적의 양과 상관시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플이 세포 또는 조직 샘플을 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 샘플이 포르말린-고정된 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플을 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 파라핀 포매 조직 샘플을 단계 a 전에 탈왁스시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플이 조혈 세포 또는 순환 종양 세포와 같은 세포 현탁액을 포함하는 것인 방법.
제27항에 있어서, 단계 a가 현탁액 중의 샘플을 용액 중에서의 계내 혼성화 반응에 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단일 조직 절편에서 3개 이상의 표적을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 상기 표적은 적어도 하나의 DNA, 하나의 RNA 및 하나의 단백질 표적을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 형태학적 표적의 검출을 추가로 포함하는 방법.