JP3090679B2 - 生物標本の複数の光学的特性を測定する方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は例えば血球などの細胞集団のような生物標本
の複数の光学的特性を、生物標本を走査するコンピュー
タ制御された計測器を用いて高速度で測定することに関
する。

従来技術 このようなコンピュータ制御された計測器の実施例
は、フローサイトメータ（flow cytometer）、自動血球
分析計（blood cell analyzer）および血球差動分類器
（blood cell differential classifier）を含む。

フローサイトメータは検査領域を通過する単一縦列流
となる細胞流体懸濁に焦点を合わせる計測器である。焦
点を合わせた光ビームはこの領域内の細胞を照明しかつ
計測器は、例えば複数波長の吸収、角度の関数としての
散乱および波長または偏光の何れかの関数としての蛍光
のような光と細胞との光学的相互作用を測定する。この
種の計測器は例えば染色によって化学処理された細胞以
外に活動細胞の研究をも可能にする。フローサイトメト
リ技術はある種の成分または組織で特に細胞表面に存在
するものを毎秒1000以上細胞数という細胞速度で定量的
に特徴付けすることを可能にする。

血球分析計は、代表例では、種々のタイプの白血球細
胞を自動的に分類しかつ標本内の異常細胞はすべて識別
しカウントするコンピュータ制御顕微鏡を備える。この
ような自動化計測器を用いても、オペレータは細胞を手
動でのぞいたり、目視の形態学観察をするために分析計
を一時的に停止したり、または異常細胞を再びより詳細
に調べたりすることができる。自動カウントの間、遭遇
したすべての異常血球のＸ−Ｙ座標が記憶される。従っ
てオペレータは、観察モードにして異常細胞を自動的に
または個々に拾い出して焦点を合わせてこれらの細胞を
テレビ画面に映し出したり、あるいは両眼顕微鏡で観察
したりすることができる。

血球差動分類器は、代表例では、ステップモータで駆
動されるステージ（載物台）を有するコンピュータ制御
顕微鏡を備える。キセノンアーク灯のような光源が細胞
を照明し、分類器はシリコンフォトダイオードアレイの
ような種々のセンサを用いて、細胞と光との間の光学的
相互作用を測定する。与えられた領域内のすべての細胞
は同時に照明される。

発明の概要 一般的に本発明は、細胞集団の各々の複数成分を正確
に推定しかつその多数の形態学的特性を特徴付ける光学
的データを発生する方法および装置を特色とする。この
方法は、 細胞集団内の異なる位置を表す異なるデジタルデータ
サンプルを形成するために細胞集団をビームで走査する
ステップおよび手段と、 デジタルデータを例えばコンピュータの記憶装置内に記
憶するステップおよび手段と、 集団内で１つの細胞を、例えば記憶されたデジタルデ
ータから取得されたデジタルデータを所定のしきい値と
比較することによって特定するステップおよび手段と、 その特定された細胞の周りに近傍を規定するステップ
および手段と、 近傍の外側の位置に対応する記憶デジタルデータを基
にしてその近傍内のすべてのサンプル点に対する１つの
バックグラウンドレベル又は個々のバックグラウンドレ
ベルを推定するステップおよび手段と、 光学的データを発生するために近傍に対応する前記デジ
タルデータサンプルの各々を、推定されたバックグラウ
ンドレベルで補正するステップおよび手段とを含む。本
発明で使用されるビームは、例えば、レーザ光線、Ｘ線
または赤外線などの電磁放射線である。

サンプル補正ステップは近傍内の記憶デジタルデータ
サンプルの各々から対応バックグラウンドを減算するこ
とによって行ってもよい。

用語「デジタルデータサンプル」は、コンピュータの
記憶装置内に記憶可能でありかつビームで走査されたと
きに標本内の細胞集団からのアナログ光信号からサンプ
リングされるデジタル情報を意味する。光学的データは
デジタルデータをバックグラウンドに対して補正して得
られる。光学的データを更に処理すると、細胞成分の正
確な測定に使用されかつ細胞形態学の代表値として使用
可能な細胞集団の対応の光学的および形態学的特性値が
発生される。

ここで使用される用語「成分」は、例えばDNAまたはR
NAのような細胞の特定の部分または成分を意味する。本
発明は細胞または細胞集団内の特定成分の量を実際量の
数％内の精度で求めることが可能である。

用語「近傍」は、デジタルデータを取り囲むようにオ
ペレータによって規定され、かつ単一の細胞に統計的に
対応するように設定されたサンプル点の特定領域を意味
する。すなわち平均的には、近傍内には１つの細胞のみ
が特定される。このような近傍のサイズは、標本内の細
胞のサイズに応じてオペレータが変更可能である。近傍
は、各近傍内の、即ち、各細胞に対して個々にバックグ
ラウンドを求めることによって、細胞成分の正確な推定
を可能にするのに使用される。バックグラウンドレベル
は顕微鏡スライドのような観察面の場所によって変わる
ので、多数の異なる細胞に対して１つのバックグラウン
ドレベルが使用されるよりはこの方法の方がより高い精
度を可能にする。

本発明はまた、 細胞集団内で異なる位置を表す異なるディジタルデー
タサンプルを形成するために細胞集団を細胞とサイズが
同等なスポットサイズを有するビームで走査するステッ
プおよび手段であって、サンプリング速度はスポットが
連続するサンプリング位置間を走査される時間当りの走
査距離がスポットサイズとほぼ等しくなるようにして細
胞集団をビームで走査するステップおよび手段と、 次に集団内の細胞を特徴付ける光学的データを発生する
ためにデジタルデータを処理するステップおよび手段と を含む細胞集団を特徴付ける光学的データを発生する方
法および装置を特色とする。ここで使用される用語「同
等な」は、走査される細胞のサイズと１桁内の大きさに
あることを意味する。

一般に、細胞を表すのに必要なサンプル点の数は１走
査に沿って採取されるサンプル数と走査数との積に等し
い。従来技術のように例えば0.5ミクロンという小スポ
ットが使用されるときは、10ミクロン×10ミクロンの細
胞領域内の成分を正確に表すのに約400サンプルが必要
となる。本発明によれば、スポットサンプルの直径は10
ミクロンのオーダーであり、かつサンプリングはスポッ
トが連続するサンプリング位置の間で走査されるときの
時間当りの走行距離が、スポットサイズとほぼ等しくな
るような速度で行われる。これは精度を落とすことな
く、小スポットサイズよりも約400倍の速さでサンプル
を処理するという有利性を与える。サイズを小さくしか
つサンプリング速度を上げると、それだけこの有利性は
少なくなる。

この方法はまた、走査速度の変化についての校正され
た光学的データを発生するために、近傍値を、ビームが
各位置を通過して走査されるときの速度に比例する速度
正規化係数を乗算するステップを含んでもよい。

他の態様において本発明は、 細胞集団を走査するのに使用される所定入射照度を有
するビームの結果的照度を、走査内の各サンプルの位置
の関数として、測定するステップおよび手段と、 細胞集団内の異なる位置を表す異なるデジタルデータ
サンプルを形成するために、細胞集団をビームで走査す
るステップおよび手段と、 デジタルデータを、例えば記憶装置に、記憶するステ
ップおよび手段と、 走査内の各サンプルの位置のビーム照度測定値を用い
て、記憶されたデジタルデータを正規化するステップお
よび手段と、 次に集団内の細胞を特徴づける校正された光学的デー
タを発生するために、正規化されたデジタルデータを処
理するステップおよび手段と を含む、細胞集団を特徴付ける校正された光学的データ
を発生する方法および装置を特色とする。結果的ビーム
照度は例えばフォトマルチプライヤ（光電子倍増管）の
ようなセンサで測定可能である。

本発明はまた、 細胞集団内の異なる位置を表す異なるデジタルデータ
サンプルを形成するために面上の細胞集団を与えられた
照度を有するビームで走査するステップおよび手段と、 デジタルデータを、例えば記憶装置に、記憶するステ
ップおよび手段と、 照度校正データを発生するために、細胞のない面の領
域を走査するステップおよび手段と、 照度校正データから照度正規化データを発生しかつ照
度正規化データを記憶装置内に記憶するステップおよび
手段と、 集団内で１つの細胞を、例えばデジタルデータを所定
のしきい値と比較することによって、特定するステップ
および手段と、 その特定された（位置付けされた）細胞の周りに近傍
を規定するステップおよび手段であって、その近傍が該
近傍内のデジタルデータサンプルから得られた光学的デ
ータを含む、近傍を規定するステップおよび手段と、 校正された光学的データを発生するために、近傍内の
光学的データを、例えば光学的データに照度正規化係数
を乗算することによって、補正するステップおよび手段
と を含む、細胞集団を特徴付ける校正された光学的データ
を発生する方法および装置を特色とする。

細胞のない面は、均一な蛍光染料面、染料充満キュベ
ットまたは均一散乱面を含む校正用スライドでよい。

他の実施態様において、処理ステップは、走査速度の
変化について校正された光学的データを発生するため
に、デジタルデータに、ビームが各位層によって走査さ
れるときの速度に比例する速度正規化係数を乗算するこ
とを含んでもよい。

この方法はまた更に、 近傍の外側の位置の各光学的パラメータに対応する記
憶されたデジタルデータを基にして、個々の近傍に対す
るバックグラウンドレベルを推定するステップと、 光学的データを発生するために、例えば、近傍内のサ
ンプルの各々から対応の近傍バックグラウンドレベルを
減算することによって、近傍に対応するデジタルデータ
サンプルの各々を補正するステップと を含む。上記方法の各々に対して、近傍バックグラウン
ドレベルは、近傍内の各サンプルの各光学的パラメータ
に対して近傍に隣接する実際の位置に対応する記憶装置
内の最小デジタルデータサンプル値を見出だすことによ
ってか、または記憶された近傍の外側の複数のデジタル
データサンプル値を平均することによって、決定するこ
とができる。典型的には、用語「隣接する」は、近傍の
境界から５走査内を意味する。

更に他の実施態様においては、デジタルデータが取得
された時刻にほぼ対応する時刻が同期デジタル時刻デー
タとして記録かつ記憶され、これにより各サンプルは対
応デジタル時刻点を有する。ここで使用される用語「デ
ジタルデータが取得された時刻にほぼ対応する時刻」は
所与のストリップ走査が完了した時刻を意味する。細胞
集団はまた可動面上に載置され、走査は可動面のステッ
プ運動に同期して行われもよく、且つ、１つのサンプル
に対応する位置を、発生されたデジタル位置データから
得るようにしてもよく、その結果として、各サンプルは
対応のデジタル時刻点および位置を有する。可動面は、
顕微鏡スライド、細胞が中に挿入されるキュベット、ま
たは細胞をその上またはその中に載置可能な他の任意の
可動面でよい。上記のすべての方法および装置の可動面
上の細胞は目視で観察することが可能である。

他の実施態様において、細胞集団を再走査するステッ
プと、新しいデジタルデータ、位置データおよび時刻デ
ータを発生するステップと、細胞集団内の変化を求める
ために新しいデータを前の走査から得られた対応のデー
タと比較するステップとを追加してもよい。

上記方法および装置の他の実施態様においては、１つ
の細胞は、ビームが最初に接触する細胞の縁部に対応す
るデジタルデータサンプルを検出することによって特定
（位置付け）することができる。他の実施態様において
は、近傍の中心がはじめは最初の縁サンプルのあたりに
置かれる。本方法は更に、近傍内の最大デジタルデータ
サンプルを求め、次に、近傍に対するバックグラウンド
レベルを推定（概算）する前に近傍の中心を最大サンプ
ルに移動するステップを含んでもよい。

本発明はまた、 細胞集団内の異なる位置を表す異なるデジタルデータ
サンプルのセットを形成するために細胞集団をビームで
走査するステップおよび手段と、 デジタルデータを、例えば記憶装置内に、記憶するス
テップおよび手段と、 集団内で１つの細胞を、例えばデジタルデータを１セ
ットの所定のしきい値と比較することによって、特定す
るステップおよび手段と、 その特定された細胞の周りに近傍を規定するステップ
および手段と、 近傍内のデジタルデータのセットから得られるすべて
の光学的データのサンプルを合計して、その近傍に対す
るパラメータに対しての光学的近傍値を発生するステッ
プおよび手段と、 各パラメータに対するしきい値の上または下の何れか
を示すサンプルの２進近傍パターンを発生するために、
近傍内の各パラメータサンプルを所定しきい値のセット
と比較するステップおよび手段と、 光学的近傍値および２進近傍パターンを記憶装置内に
記憶するステップおよび手段と、 各細胞に対し、光学的近傍値に対応する光学的特性お
よび２進近傍パターンに対応する形態学的特性を発生す
るステップおよび手段と を含む複数の細胞特性を測定する方法および装置を特色
とする。

光学的特性は、近傍に対応する細胞の光学的特性値を
発生するために１つ以上の光学的近傍値に対して数学関
数を適用することによって発生してもよい。形態学的特
性は、近傍に対応する細胞の形態学的特性値を発生する
ために１つ以上の光学的近傍値に対してブール関数を適
用することによって発生してもよい。

用語「光学的近傍値」はあるパラメータに対しての所
与の近傍内のすべての光学的データの合計を意味する。
次に、この光学的近傍値はそのまま使用しても又は集団
の細胞に対応する特定の細胞成分に比例する光学的特性
値を発生するために更に処理してもよい。用語「２進近
傍パターン」は、単一の近傍、即ち、細胞と、１つの近
傍内の各サンプル点をしきい値と比較して発生される特
定のパラメータとに対応する記憶装置内のワードパター
ンを示し、もしその点が所与のしきい値を超えていれば
「１」を、また、そうでなければ「０」を記録する。各
点をテストすることによって、「１」または「０」のメ
モリワードが発生され、これが２進近傍パターンであ
る。このパターンは、細胞の形態学的特性値を発生する
ように更に処理することができる。

これらの方法の各々は更に、 その近傍の外側の位置に対応するデジタルデータを基
にしてその近傍に対する１セットのバックグラウンドレ
ベルを推定（概算）するステップと、 光学的データを発生するために、その近傍に対応する
デジタルデータサンプルの各々からこの近傍バックグラ
ウンドレベルを減算するステップと を含むことができる。

本発明はまた、 走査プロセス中に、コンピュータによって制御され得
る例えば光、Ｘ線又は赤外放射のような電磁放射線ビー
ムを発生するビーム源であり、該ビームは、細胞を、走
査される細胞のサイズと同等なビームスポットで照明
し、そのスポットが細胞を照明した結果として光学的信
号が発生される、ビーム源と、 細胞がその上に載せられる面と、 スポットをビーム源から面上の細胞へ導くための光路
と、 スポットが面上の複数の細胞上を通過するようにスポ
ットを面上で走査させるための、ビーム源と細胞との間
の光路内に挿入されたスキャナと、 光信号を測定する１つ以上のセンサと、 光信号を特定速度でサンプリングし、デジタルデータ
を形成するように配置されたアナログ−デジタル変換器
であって、スポットが連続するサンプリング位置間を走
査したときの単位時間当りの走行距離がスポットサイズ
とほぼ等しくなるようなサンプリング速度が設定され
る、アナログ−デジタル変換器と、 記憶装置内のデジタルデータを補正し、個々の細胞の
複数の成分に対応する補正されたデータ点から光学的特
性値を発生し、複数の細胞形態学的特性を求めるために
光学的特性値を処理するデータプロセッサと、 変換器によって形成されたデジタルデータを記憶する
記憶装置と を含む、複数の細胞特性を測定する装置を特色とする。

他の実施態様において、本発明による装置およびすべ
ての方法において使用されるスポットサイズは３ないし
50ミクロンであり、かつスポットサイズは走査される細
胞のサイズと同等になるように調節可能である。更に、
ビームの波長分布はデータプロセッサによって制御可能
である。

本発明による装置のスキャナは共振検流計スキャナで
よい。更に、細胞がその上に載せられる面は、顕微鏡ス
ライド、細胞が中に挿入されるキュベット、または細胞
をその上またはその中に載置可能な任意の面でよい。

上記装置および方法の他の実施機様において、細胞集
団は可動面に載置され、走査は可動面のステップ運動に
同期して行われ、１つのサンプルに対応する位置をそこ
から取得することができるデジタル位置データが発生さ
れてもよい。

上記方法および装置の何れかにおいて、細胞およびビ
ームによって形成されるデジタルデータはアナログ光信
号のセットから取得してもよい。更に、これらの光信号
は、蛍光、前方角光散乱、消光または広角光散乱でもよ
い。

他の実施態様において、本発明はまた、細胞集団であ
って、該細胞集団の多数の細胞が所与のパラメータに対
して一定の光学値を有する細胞集団を特徴付ける校正さ
れた光学的データを発生する方法を特色とする。この方
法は、各走査線に沿ってビーム照度差および集光差に対
して補正をする。この方法は、 細胞集団内の走査線に沿った異なる位置を表す異なる
デジタルデータサンプルを形成するために走査線に沿っ
て細胞集団をビームで走査するステップと、 デジタルデータを記憶するステップと、 この集団内で１つの細胞を特定（位置付け）するステ
ップと、 その特定された細胞の周りに近傍を規定するステップ
であって、その近傍が近傍内の記憶されたデジタルデー
タサンプルから得られる光学的データを含む、近傍を規
定するステップと、 その近傍内で最大デジタルデータサンプルの位置を求
め、近傍をこの最大デジタルデータサンプルに対して中
心合わせするステップと、 この中心が移動された近傍に対する光学的近傍値を発
生するために、この中心が移動された近傍内のすべての
光学的データ値の合計を求めるステップと、 モード光学値を形成するために発生頻度が最も大きい
光学的近傍値を求めるステップと、 モード光学値のあたりの所定範囲内の光学的近傍値を
有する細胞のサブ集団を選択するステップと、 走査線に沿った細胞位置の関数として、サブ集団内の
細胞の平均光学的近傍値のセットを求めるステップと、 照度正規化係数を発生するために、走査線に沿った各
位置の平均光学値に対するモード光学値の比に等しい補
正係数のアレイ（配列）を計算するステップと、 走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する光学
的データを、その細胞に対する光学的近傍値に対応の照
度正規化係数を乗算することによって、補正するステッ
プと を含む。用語「モード光学値」は完全なサンプルラン
（実行）において最も頻繁に発生した光学的近傍値を示
す。用語「照度正規化係数」は走査線に沿った各位置の
全細胞の平均光学的近傍値に対するモード光学値の比に
等しい補正係数のアレイを示す。

他の実施態様において、本発明はまた、細胞集団を特
徴づける補正された光学的データを発生する方法を特色
とする。この方法は、 走査線に沿った異なる位置を表す異なるデジタル校正
データサンプルを形成するために走査線に沿って既知の
一定のパラメータを含む校正粒子の集団をビームで走査
するステップと、 デジタル校正データを記憶するステップと、 集団内の１つの校正粒子を特定（位置付け）するステ
ップと、 その特定された粒子の周りに近傍を規定するステップ
であって、その近傍が近傍内の記憶されたデジタル校正
データサンプルから得られる光学的補正データを含む、
近傍を規定するステップと、 その近傍内で最大デジタル校正データサンプルを求
め、近傍をこの最大デジタル校正データサンプルに対し
て再度中心合わせするステップと、 この中心合わせされた近傍に対する光学的近傍校正値
を発生するために、その近傍内のすべての光学的校正デ
ータ値の合計を求めるステップと、 モード光学的校正値を定めるために発生頻度が最も高
い光学的校正近傍値を求めるステップと、 走査線に沿った粒子位置の関数として、平均光学的校
正近傍値のセットを求めるステップと、 照度正規化係数を発生するために、走査線に沿った各
位置の平均光学的校正値に対するモード光学的校正値の
比に等しい補正係数のアレイを計算するステップと、 細胞集団内の走査線に沿った異なる位置を表す異なる
デジタルデータサンプルを形成するために走査線に沿っ
て細胞集団をビームで走査するステップと、 デジタルデータを記憶するステップと、 記憶デジタルデータから光学的データを得るステップ
と、 走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する光学
的データに対応の照度正規化係数を乗算することによっ
てその細胞に対する光学的データを補正するステップと を含む。

本発明のその他の特徴および利点は、好ましい実施例
に関する以下の説明から明らかになろう。

実施例 機械系および光学系 第１図を参照すると、測定器10は、光源12、共振検流
計のようなミラースキャナ14、外照明顕微鏡16、ステッ
プモータ制御ステージ18、光センサ20、22、24、26およ
び以下に説明する種々の付属光学部品を含む。光源12は
光12aを出し、光ビーム12aはスキャナ14で反射されて走
査ビーム12bを形成し、これにより最終的に光源12は標
本平面または面28上に一定直径またはサイズの走査スポ
ット12cを照射する。標本平面または面28はステージ18
上に配置される。光源12は用途に応じて、例えばヘリウ
ムネオン、アルゴンイオン、ヘリウムカドミウムまたは
固体レーザなどの種類のレーザである。ある用途に対し
ては２種類以上のレーザを使用してもよい。この場合に
は複数ビームは同軸となるようにダイクロイックミラー
を使用して結合される。場合によってはコンピュータ制
御のもとで、レーザビームの強さを制御したり、または
それらのシャッタを制御したりすることが好ましいこと
がある。複数の波長を有するレーザを用いてもよく、こ
の場合には特定波長を選択するためにコンピュータ制御
されたフィルタ、プリズムまたはブラッグセル（Bragg
cell）を使用するのが好ましい。

ダイクロイックミラー30を通過後、レーザビームは２
枚のレンズ32および34によって顕微鏡16の外照明視野絞
り36上に結像される。共振スキャナ14がレンズ32および
34の間に配置されかつ電気駆動によりビームを視野絞り
上で走査させる。レンズ32および34の焦点距離および検
流計駆動電圧に比例するスキャナ14の偏向角は視野絞り
36にしたがって標本面28上のスポットサイズおよび走査
長さを制御する。スキャナは800Hzで駆動され、標本面
上のスポットサイズは10ミクロンであり、また標本面上
の走査長さは120ミクロンである。これらは公称値であ
って、この値は対物レンズ39を支持する顕微鏡ノーズピ
ース38をユーザが回すことによって変更することがで
き、もし倍率を公称倍率20×から他の高い倍率へ上げれ
ばスポットサイズおよび走査長さは減少し、一方倍率を
下げればそれらは増大する。

標本を照明しかつ蛍光または散乱光をのぞき接眼レン
ズ40またはフィルムあるいはビデオカメラ42に伝達する
のに外照明が使用される。光伝達組立体44は、のぞき通
路内にダイクロイックミラーまたは部分銀メッキあるい
は全銀メッキミラーならびに光学フィルタを含んでもよ
い。これらの組立体は交換式であって、本実施例に使用
される顕微鏡はこれらの組立体を交換するための可動ロ
ッドを含んでいる。

標本面28は組織または細胞標本がその上に載せられる
スライドか、または細胞標本がその中に注入されるキュ
ベットでよい。更に顕微鏡16は倒立顕微鏡でもよく、ま
た標本面28は活動細胞を含む容器または皿でもよい。光
学式測定器は標準または倒立顕微鏡の何れをも受け入れ
るように設計されている。

標本の細胞は、それらの光散乱特性を変えたり、また
はそれらに蛍光を発光させたりするために染色してもよ
い。各細胞の散乱または蛍光は、１）DNAまたは蛋白質
のような特定細胞成分、あるいは２）特定細胞抗原にの
み結合する１つ以上の蛍光化抗体の量の何れかに関係す
る。

標本の走査ビームに対する相対位置はＸおよびＹ方向
ステップモータ46、47によって制御される。これらのモ
ータは、スポットサイズの何分の１からスポットサイズ
までの範囲のサイズでステップ状に駆動される。このス
テップサイズはコンピュータプログラムで制御される。
ステージにはセンサも設けられ、センサはコンピュータ
にステージの「ホーム」位置すなわち基準位置を指示し
かつステージの走行を制限するための信号を提供する。
各ラン（即ち、走査ストリップのグループ）の最初に又
はランの途中で定期的にステージをホーム位置に移動す
ることにより、標本面上の与えられた細胞の絶対位置を
得ることが可能であり、これによりそれらの細胞を手動
で再びのぞいたり再測定したりすることができる。通常
使用ではステージはモータに付属のノブにより手動で動
かすことができる。ステージはまた、特別にプログラム
されたディスプレイで、ボタン、ジョイスティックまた
はマウスにより手動で制御することも可能である。顕微
鏡16の焦点はノブ62により手動で合わせることができ
る。

標本から前方方向に散乱された光は主として細胞サイ
ズに関係するが、これは細胞を染色することによって変
更できる。この散乱光は顕微鏡の集光レンズ48とダイク
ロイックミラーまたは部分銀メッキミラー50とを通過し
て２つのセンサ20上に結像されるが、２つのセンサ20は
電気的に接続されているが入射走査ビーム画像をそれら
の間で通過させるように相互に間隔をなしている。従っ
て軸方向光路から前方方向に標本によって散乱された光
のみがセンサ20によって集められる。部分銀メッキミラ
ーまたはダイクロイックミラー50はもしそれらが適切に
選択されると照度を著しく低下させることはないので、
顕微鏡の標本の照明に通常は標本照明器52が使用可能で
ある。ミラー50は顕微鏡のサブステージ照明器に直接装
着されている組立体内に組み込んでもよく、この場合ミ
ラー50は十分に小さいのでコンデンサの焦点合わせを妨
害することはない。センサ20からの信号は増幅されて以
下に詳細に説明するデータ取得回路の１つの入力とな
る。図示されていないが、消光を測定するために入射走
査ビームから光を集めるようにセンサ20の後部または下
部に追加のセンサを置いてもよい。

細粒をもつ細胞は光を斜向角度に散乱するので、血液
顆粒球のようなあるタイプの細胞を識別するのに細胞か
ら90度方向に散乱される光が使用される。斜向散乱光は
ライトパイプとして作用する標本スライドまたはキュベ
ットにより捕えられ、またスライドあるいはキュベット
の縁に置かれたセンサ22によって検知される。このセン
サはステージ上でスライドまたはキュベットに接して装
着され、その増幅信号はデータ取得回路の二次入力とし
て利用される。このセンサも同様に通常の顕微鏡の使用
を妨害することはない。

後方即ち180度方向に散乱された光および蛍光は開口
数の大きい対物レンズ38によって集められ、レンズ35、
34および32を逆に通過してダイクロイックミラー54に結
像されるが、ダイクロイックミラー54はもし後方散乱が
測定されないならば長波長の蛍光を反射し、またもし後
方散乱が測定されるならばレーザ波長のある部分を反射
するように設計されている。ダイクロイックミラー30は
殆どすべてのレーザ波長を通過する。ダイクロイックミ
ラー54は、レーザ波長の後方散乱と長波長の蛍光とを測
定するように光を２つの部分に分割するか、または光を
２つの異なる波長の蛍光に分割する。ミラー54は部分銀
メッキして、もし用途が蛍光の偏光解消を測定すること
を必要とするならば偏光に基づいて反射させたり透過さ
せたりすることができる。ミラー54は入射エネルギの一
部を反射し、適切な帯域波長を有するフィルタ56を通過
させてフォトマルチプライヤ24に導く。ミラー58も同様
に残りのエネルギを反射し、フィルタ60を通過させてフ
ォトマルチプライヤ26に導く。２つのフォトマルチプラ
イヤからの信号は増幅されてデータ取得回路の追加の入
力となる。図にはアパーチャ（開口）が示されていない
が、レンズおよびミラーの面から反射される迷光を減少
するために実際には種々の場所にアパーチャが使用され
ている。

電気−機械系 第２図を参照すると、電気−機械系は、光センサ20、
22、24および26、スキャナドライバ70および顕微鏡ステ
ージ18からコンピュータ81へ信号を入力する手段と、コ
ンピュータから顕微鏡ステージ18を動かすＸ方向ステッ
プモータ46およびＹ方向ステップモータ47へ信号を出力
する手段とを提供する。これは、４つのアナログ電圧を
受け取り、アナログ−デジタル変換器80aで100000Hz以
下の速度でそれらをデジタル化し、これによって得られ
た出力コンピュータワードを直接メモリアクセス（dm
a）制御のもとでコンピュータ記憶装置に記憶させる市
販の回路基板80で達成される。回路基板80はまた、ステ
ージから制限値を提供するデジタル値を入力82−90から
受け取り、ステージを制御するデジタル出力値をライン
92−104上に提供する。回路基板80はまた、フォトマル
チプライヤ（光検知器）24および26への供給電圧を制御
するのに使用される２つのアナログ電圧値をも制御す
る。詳細は以下に説明する。

一実施例において、回路基板80は80286IBMコンパチブ
ルのコンピュータのスロットの１つに差し込まれるData
Translation（ニューヨーク州マルボロ）のモデル2828
である。コンピュータは第２図においてブロック81で示
されている。

更に、フォトマルチプライヤ24および26は蛍光または
後方散乱を検知するのに使用され、光センサ20および22
は標本からの前方および斜向散乱放射を検知するのに使
用されるが、各々はそれぞれの増幅器76、72、78および
74に接続されている。これらの増幅器は、アナログ信号
入力106、108、110および112において回路基板80に−10
ないし＋10ボルトの信号レベルを提供するように適切な
ゲインを有する。回路72ないし76は−10ボルト付近にD.
C.「無信号」レベルを有するD.C.演算増幅器または計器
増幅器である。以下に説明するように、走査ミラー14の
位置を、センサによって取得されかつデジタルデータの
流れに変換されたデータと同期させることが必要であ
る。デジタルデータの流れは各々が64000ワードの２ブ
ロックとして記憶可能である。同期化過程のために回路
78のD.C.レベルは最初０ボルトに設定されているので、
負の同期パルスは容易に検知される。

同期は、スキャナ72を介して走査ミラー14の運動を制
御するスキャナミラードライバ70によって発生される方
形波パルス同期信号によって達成される。この信号は回
路114によってパルスに変形され、また一実施例ではこ
れがセンサ20からのセンサ信号に加えられる。これはこ
のセンサ入力のデジタル化分解能を２だけ低下される
が、同期のために別々のデータチャネルが必要ではな
い。もちろん、この同期信号は別個の入力信号として使
用してもよい。入力112における信号はセンサ20の前方
散乱信号であり、パルス信号は（第６図に示すように）
１走査端部付近で負の方向に加えられる。以下の説明か
らわかるように、この負のパルスはプログラムによって
検知されかつコンピュータの記憶装置内に記憶されたデ
ジタルデータを適切に同期させるのに使用される。サン
プリング速度は、各テストに対してユーザがプロトコル
を定義できるようにする初期設定プログラムを介してユ
ーザにより設定される。プロトコルはモニタ画面であ
り、オペレータはこれを用いて、サンプリング速度及び
多種のテストパラメータ、走査領域、しきい値設定など
を設定する。デジタル化されたパラメータの数もまた予
め設定され、増幅器ゲイン設定および入力と出力との関
係、即ち、リニアであるか対数関係であるか、を追加の
パラメータとして使用可能である。

回路基板80のデジタル出力92、94、96、98、100、102
および104のレベルはコンピュータプログラムの制御を
受ける。デジタル入力82、84、86、88および90は、同様
にプログラム制御によって決定される特定時刻に読み取
られる。これらの出力および入力は、Ｘ方向ステップモ
ータ46およびＹ方向ステップモータ47を介して顕微鏡ス
テージの運動を制御するのに使用され、これらのステッ
プモータ46および47の各々はそれぞれトランスレータ回
路116および117によって駆動される。顕微鏡ステージに
はリミットスイッチが設けられていて、これらのリミッ
トスイッチはステージがＸ方向およびＹ方向のステージ
の走行限界に到達したときにリミットを指示する。これ
らのスイッチはライン18a−18dに信号を発生し、これら
の信号はそれぞれ回路基板80の入力82ないし88として使
用される。入力90はスキャナドライバ70からパルスを検
知する。ここには図示されていないが、特定の光源、シ
ャッタまたはフィルタ位置を制御することによって光源
の波長を制御するために追加のデジタル出力を使用して
もよい。

プログラム制御ステージ運動は第３図のフローチャー
トに示すような以下に記載のシーケンスを実行するよう
に設計されている。まずユーザがテストを開始すると、
両方のステップモータは特定の「ホーム」位置に移動さ
れる。これは、ステージがホーム位置に到達したことを
入力82および88が指示するまでライン94および100にオ
ン−オフパルスを与えるというプログラムサブルーチン
を呼び出すことによって達成される。ORゲート118は信
号を出力94から入力116aへ直接通過させる。プログラム
制御を受けて出力96および102は、入力116bおよび117b
において受け取られる信号を形成することによって適当
なステージ方向を形成するように設定される。ステージ
がホーム位置に到達するとただちにＹ方向ステップモー
タにパルスが送られ、これによりステージ18を最初のＹ
位置に移動し、次にサブルーチンが呼び出されて信号を
出力96に切り換えることによってステージをＸ方向右に
移動させる。一実施例において、出力94のパルス速度
は、典型的には100パルス（またはステップ）という固
定された合計パルス数（または距離）に対して約100pps
（パルス／秒）から800ppsまでランプアップ（傾斜上
昇）される。これがランプアップ数である。この固定の
ランプアップはプログラムによりまたは市販のランプア
ップ制御器回路（マサチューセッツ州タウントンのメト
ロバイト（Metro−byte）によって調節可能でもある。

プログラムはランプアップの終了時にスキャナ周波数
である800ppsの速度を形成し、従ってこのときにはステ
ップモータは全速のステッピング速度で運動する。ステ
ップサイズは、モータ46の全または半ステップを形成す
るように入力116cを介してトランスレータ回路116を制
御する出力98におけるレベルに応じて５または10ミクロ
ンの何れかあるいはその他のサイズであってよい。その
後出力92は、ANDゲート120に入力を与えてこれによりス
テップモータがミラースキャナドライバ70の同期出力に
よって直接駆動され、この結果ステージ18を例えば各走
査サイクルに対して１ステップという800ステップ／秒
の速度でＸ方向右にステップさせる。スキャナドライバ
70によって発生される、ステッピング運動に垂直な走査
運動と結合されたステッピング運動は第４図に示す走査
パターンを形成する。第４図において、走査は左のホー
ム位置からスタートし、１走査ストリップの終端に到達
するまで長さ「Ｌ」の前方および逆走査が形成される。
このようなストリップは典型的には2500の前方走査と25
00の逆走査とを含む。プロトコルを介したユーザの制御
のもとで、スキャナ速度のステップモータ速度に対する
比率を別の比率とすることを可能にする追加の回路を、
ドライバ70とトランスレータ回路116との間に設けても
よい。

プロトコルの追加のパラメータはＸ方向走査距離であ
る。この距離は１走査距離を決定する。この長さは、測
定されたパラメータ数に走査ストリップ当りのデータ値
の全数を乗算することによってデータバッファに必要な
サイズを計算するのに使用可能である。回路基板80は入
力をデジタル化し、それらをバッファに記憶し、そして
バッファが充満したときフラッグを戻す。このとき出力
92は、Ｘ方向ステップモータの制御をミラードライバ70
からゲート120および118を介してプログラム制御出力91
へ渡すように設定される。次にＸ方向ステップモータは
例えば100ステップという固定ランプアップ数に等しい
パルスまたはステップ数の間において停止に至るまで速
度がランプダウン（傾斜下降）される。２つのバッファ
内のデジタルデータは以下の説明のように全走査の終端
において処理してもよいし、またはデジタル化されつつ
あるときに処理してもよい。この走査ストリップの終了
時に、ステップモータ47はステージをＹ方向に動かし、
これにより新しい走査ストリップのランが可能である。
出力100は入力117aへパルスを送ってモータをステッピ
ングさせるのに使用され、出力102は運動がＹ方向の正
であるか負であるかを決定し、また出力104はステップ
のサイズ（５または10ミクロン）を決定して信号を入力
117cに送る。同様にして、より小さい運動またはより大
きい運動がプロトコル制御のもとで使用可能である。

Ｙ方向ステップモータ47をステッピングさせて第４図
に示すように標本をＹ方向に「上」または「下」へ走査
長さＬの60％に等しい距離だけ移動した後に、Ｘ方向ス
テップモータ46がある速度でランプアップされてＸの距
離だけ移動され、そしてランプダウンされて停止すると
いう上記の手順が反復されるが、ステージは逆にＸ方向
左へ移動される。Ｙ方向ステップの数Ｍはプログラムに
よってカウントされ、適切なプロトコルパラメータを介
してユーザによって決定されたＹの距離（所与のＭ）に
到達したときテストは終了される。

系の設定および校正 プログラムをスタートするときにユーザは、プロトコ
ルを、ディスク記憶装置上に記録された、そのときに修
正可能な１セットの名前付プロトコルから選ぶか、また
は新しいプロトコルを発生するかの何れかであるかを問
い合わせされる。プロトコルはサンプルに対して実行さ
れるべきテストに関する１セットのパラメータでありか
つ人口統計的情報である。人口統計的情報は、サンプル
のタイプ、サンプルの数または名前およびサンプルに関
する任意のコメントを示す。テストに関する細胞カウン
トとともにプロトコルは、データおよびテスト条件を適
切に識別するためにテスト結果の各セットとともに記憶
される。プロトコルパラメータは、 １）走査領域の４つのスタートおよび終点の座標および
Ｘ方向およびＹ方向のステップサイズ、 ２）アナログデータ取得速度、 ３）各走査線に沿って処理されるサンプル点の数、 ４）各パラメータに対して、その名前、そのゲイン、細
胞検出のためのしきい値レベル、各細胞の形態学的ワー
ド（２進近傍パターン）を発生するのに使用される形態
学的しきい値、細胞の中心を見出すのにどのパラメータ
が使用されるかを示すフラッグおよびパラメータの値が
テスト中にモニタ上のどこに表示されるか、 ５）近傍のサイズ（近傍は以下に説明する概念であ
る）、 ６）テストが終了されるときの最大細胞カウント、 ７）完全走査の数、および ８）テストデータが記憶されているファイルの接頭名 である。

テストの任意のシーケンスを始める前に、ユーザは以
下に更に詳細に説明される方法によって１セットの校正
データを作り出すことを要求されよう。ユーザは前に行
われた校正用のラン（実行）から記憶された校正データ
を選択することができるし、または新しい校正データを
発生することもできる。もし新しい校正データが希望さ
れるならば、ユーザは細胞のないテスト標本の一部分を
選択するかまたは細胞のない標本を使用してそれを顕微
鏡ステージ上に置き、走査されるべきその領域が細胞ま
たは細胞の残骸を含まないことを観察する。走査長さの
上での各パラメータの出力は時間の関数として連続的に
校正の間にモニタ画面上に表示されかつステージ位置は
手動で制御可能である。これらのバックグラウンド値を
求めるために、バックグラウンド校正走査の開始点を基
点とし、100のオーダーの固定された走査数に対してＹ
方向ステップモータの１つの位置およびＸ方向ステップ
モータの１つ以上の位置におけるパラメータの値がデジ
タル化される。一実施例において、これは、ステージが
Ｘ方向に数ステップだけ移動しその間に同様に全体的に
ブランクの（サンプルがない）領域の上を連続的に上下
に走査することによって達成される。走査サンプル点位
置の各々のパラメータ値はすべての走査上にわたり平均
される。平均値およびそれらの変動係数はモニタ画面上
に表示されてこれによりオペレータは機械が適切な値の
範囲で作動しているがどうかを判定するためのチェック
ができる。変動係数は測定値をその測定値の平均で割り
算した標準偏差である。これらの値は列として記憶装置
内に記憶され、必要なときに細胞パラメータ値を計算す
るのに使用される。

ユーザは同様に２回目の校正ランを開始することがで
き、この場合にテスト標本は蛍光または散乱のような光
信号を提供する。例えば、染色された研磨面スライドを
使用してもよい。これは上記のように独立的に走査され
てサンプル点の各々に対し１つ以上のパラメータの１セ
ットの正規化係数が取得される。校正用スライドは２回
走査され、２回目はビーム源がブロックされているの
で、正規化係数は照明ビームがある場合と照明ビームが
ない場合との光信号の差に等しい。これは照明がないと
きでさえも存在する系内のD.C.およびその他の信号ノイ
ズを消去する。所与のパラメータが正規化されないなら
ばその係数は１である。これらの正規化係数は、例えば
スライド上の細胞の位置、入射レーザ光線の変動または
細胞成分に関係しないその他の変動による細胞から受け
取られた光信号の変動に対してデータ値を補正するのに
使用される。次にこれらの係数がデータ点に乗算されて
最終測定値からこれらの変動の影響を除去する。

使用されるたいていの走査の場合、各走査長さＬの端
部付近ではビームの速度が低下し、停止しおよび次の走
査長さＬを開始する前に反対方向に向きを変えるので、
その付近の細胞に対しては多くのサンプルがデジタル化
されるために、各走査に沿った異なる速度を考慮して同
様に正規化係数に速度正規化係数を乗算してもよい。速
度校正係数は、走査長さの中心からサンプル点までの距
離のコサイン（cos）であり、この速度校正係数に各サ
ンプル点に対する正規化係数が乗算され且つアレイとし
て記憶され、後に各細胞パラメータ走査値を計算すると
きに各サンプル点の値を正規化するのに使用される。

他の実施例において、最初の装置の校正はサンプルラ
ンの間に作動する自己校正の方法によって省略できる。
この方法は細胞のないテスト標本の一部分を走査する必
要性または任意の特定の校正用スライドの使用を回避す
る。この方法はサンプルを横切る各走査線（長さＬ）に
沿ってビーム照度差および集光差に対して補正すべき光
学的データを校正するのに使用される照度正規化係数を
発生する。正規化係数を発生するためにサンプルの細胞
が使用されるときは、この方法は自己校正的である。し
かしながら代替態様においては、この方法では最初のラ
ンにおいて校正粒子を使用することができ、この場合に
照度正規化係数を発生するために、サイズまたは蛍光の
ような多数の既知の一定パラメータの１つの一定光学値
に対して校正粒子が走査される。

この方法は例えば静止期にある細胞のDNA値または細
胞のサイズのようなあるパラメータ又は細胞のサイズに
対してサンプルの細胞集団が一定の光学値を有する多数
の細胞を含むときに使用可能である。校正されるデータ
において約３％の精神を達成するには、この一定パラメ
ータ値を有する集団の約1000細胞が走査されカウントさ
れなければならない。

例えば典型的な細胞集団においては、これらの細胞の
大部分は静止期（Go）にあり、この場合にすべての細胞
は同じDNA値を有する。理想的な集団測定においては、
この特定のパラメータに対して実質的に多数の細胞がす
べて同じ値を有するであろう。この理想状態を目標とし
て、できるだけこの理想的な結果に近い分布を有するデ
ータの新しいセットを得るために光学的データは照度正
規化係数によって校正される。正規化係数が形成されて
それが現在のサンプルおよび後続のサンプルに適用され
るか、またはそれまでのすべてのランから形成された正
規化係数を基にして各々新しいサンプルランが補正可能
である。

特にこの校正方法は、以下に示すように（第９図に示
すように）行われる。サンプルの細胞が走査されると
き、各細胞に対して特に光学的近傍値（ステップ300）
および選定されたパラメータに対する最大値の位置を含
むデータリストが発生され（ステップ302）、これは、
１つ以上の選定パラメータに対して走査線に沿った細胞
の中心を表す。次に近傍がこの最大値に対して中心合わ
せされる（ステップ304）。この実施例においては、照
度正規化ファクタを乗算する前に光学的近傍値は他の係
数に対しては校正されていない。次に完全なサンプルラ
ンに対して発生頻度が最も大きい光学的近傍値が求めら
れ、これが「モード光学値」として指定される（ステッ
プ306）。次に光学的近傍値が検査され、選択された細
胞のサブ集団を発生するためにモード光学値のプラス／
マイナス「Ｄ」の所定の範囲内に光学的近傍値を有する
すべての細胞が選択される（ステップ308）。次にこの
細胞のサブ集団は、走査線に沿った各細胞の最大値また
は中心の位置または画素位置の関数として分類される
（ステップ310）。Ｄの値はユーザによって規定され、
典型的にはモード光学値の２ないし６％の範囲に設定さ
れる。この範囲があまりにも広く選択されると、一定値
を有しない細胞を選択することになり、もしこの範囲が
あまりにも小さすぎると、正確な平均値を形成するのに
十分な細胞が選択されないであろう。均一であることが
わかっている校正粒子が使用されるとき、すべての粒子
は同一であるのでモード光学補正値のあたりの所定範囲
内の粒子のサブ集団を選択する必要はない。

次に走査線に沿った各画素位置に対する選択された細
胞のサブ集団の平均光学値が求められる（ステップ31
2）。その後各走査線に対して、走査線に沿った各位置
または画素位置に対する１つの補正係数を含む照度補正
係数のアレイが計算される（例えば30サンプルの走査長
さＬに沿って18画素を使用することが好ましいときは18
の係数が存在するであろう）（ステップ314）。アレイ
内の補正係数は、付属パラメータの平均光学値に対する
対応するモード光学値の比に等しい。このアレイが照度
正規化係数である。

補正係数のアレイは一次元であって、その中ではアレ
イは走査線に沿った光励起または集光の変動に対して補
正する。しかしながら二次元系に対するアレイを発生す
るためにも同様にこの方法が使用できる。例えば現在の
走査ビームに垂直な方向のある範囲にわたる各走査が行
われた後には、顕微鏡のステージを動かさないでレーザ
ビームを増分的に移動してもよい。この範囲の終端にお
いて、ビーム運動は０にリセットされかつステージはあ
る増分だけ移動されているであろう。この場合に、得ら
れた光学的データは、ピーク位置すなわち二次元の細胞
の中心によって決定されるように補正されるであろう。

各パラメータに対するすべての合計値すなわち光学的
近傍値は次に、各細胞に対するピーク画素位置を見出す
ことによっておよび光学的近傍値に各パラメータに対す
るその走査線位置に対する正規化係数を乗算することに
よって、各走査線に沿った照度差に対して校正される
（ステップ316）。これは光学的データの校正されたセ
ットを発生する。

この過程はデータが安定するまで複数回繰り返すこと
が好ましい。これは最初のランによって発生された校正
光学的データを２回目およびそれ以降の校正のためのベ
ースとして使用することによって達成される。言い換え
ると、校正方法は新しくかつより正確な照度正規化係数
を発生するために、コンピュータの記憶装置内に記憶さ
れている最初の校正光学的データに適用され、次に第２
のより正確な校正光学的データセットを発生するために
最初の校正光学的データが乗算される。この過程を多数
回繰り返すことができるが、データは約３回の繰り返し
後に安定するはずである。照度正規化係数は次のサンプ
ルランの光学的データに直接適用でき、あるいはこの係
数は、この方法を各ランに適用し、前のランの係数から
の補正係数の最新のセットを平均化し、そしてこの平均
化されたセットを次のランに適用することによってこの
ファクタは更新することができる。

光信号データの取得 プロトコルを選択しかつ測定器を校正したのちに、オ
ペレータは１つ以上のデータ取得ランを開始することが
できる。これらのランの目的は、プロトコル内に定義さ
れたテストスライドの領域を走査すること、スライド上
の細胞のうちオペレータによってプロトコル内に設定さ
れた与えられたパラメータに対するしきい値基準に適合
するすべての細胞を見出すこと、およびプロトコルの各
パラメータ、測定時刻およびホーム位置に対する各細胞
のＸおよびＹ方向位置に対する補正された光学的および
形態学的値を含むところの、見出された各細胞に対する
リストを発生することである。ユーザはテスト標本をス
テージ上に置きかつコンピュータキーボード上のキーを
たたくことによってランを始動する。第３図のフローチ
ャートは上記のような一般的な機械的光信号データ取得
ループを示す。

プログラムはステージをホーム位置に駆動させ次にス
テージをテスト領域上に移動させる。ステージが動くと
き、ビームが前後に走査されて第４図に示すような走査
経路を形成する。各Ｘ方向走査ストリップに対しては、
一連のデジタルデータサンプル値を形成するために、標
本によって提供される各パラメータの光信号値は、アナ
ログ−デジタル（A/D）変換器により、プロトコルによ
って設定されたサンプリング速度でデジタル化される。
典型的には120000のこのような光学的信号値が３秒以内
にデジタル化されバッファメモリ内に記憶される。典型
的には各走査は20サンプルを含み、従って５ないし10ミ
クロンのステップを有する２ないし４のパラメータに対
応する2000ないし6000の前方および逆の走査は、スライ
ドカバーガラスと同じオーダーの大きさの長さをカバー
する。データの取得と処理とは順次にまたは同時に行っ
てよい。

スポットサイズとサンプリング速度との間の関係 記載の実施例においては、光学系は、標本面28におけ
る走査レーザビームスポット12cのスポットサイズが回
転ノーズピース内に20×の顕微鏡対物レンズが使用され
るときに約10ミクロンとなるように設計されている。ス
ポットサイズは、５ミクロンのスポットを形成するため
にはノーズピースを40×に回転することによりまた20ミ
クロンのスポットを形成するには10×に回転することに
よって変化可能である。

ビーム12bは面28の上を走査するときに、測定器の光
センサ20、22、24、26の各々によって連続する光学的ア
ナログデータの流れが形成される。第5a図ないし第5d図
は蛍光センサからのアナログ光学データがA/D変換器に
よってどのようにサンプリングされるかを図で示す。第
5a図は成分のベースレベルを表すレベルＣおよび成分変
動C₁およびC₂を表すレベルを有する細胞からの蛍光信号
の仮定的なプロフィールを示す。第5b図は走査スポット
照度プロフィールを示す。スポットの「サイズ」は正規
分布曲線の半値点で測定される。第5c図は不適切なサン
プリングを有する蛍光信号のデジタル表示を示し、第5d
図は本発明によるサンプリングを有する蛍光信号のデジ
タル表示を示す。矢印はサンプリング間隔を示す。

ユーザは、これらの連続な光学的アナログデータの流
れの各々がサンプリングされ、A/D変換器によって変換
されかつデジタルデータ値としてコンピュータ記憶装置
内に記憶される速度を定義することができる。この速度
はハードウエアプロトコルを用いて100000サンプル／秒
の最大速度まで設定可能である。典型的な実験では、毎
秒32000の二重パラメータサンプルの速度が使用され、
即ち２つのアナログデータストリームが各々31.25マイ
クロ秒でサンプリングされる。走査ビーム12bの速度は
共振スキャナ70の共振周波数によって固定される。この
ようなスキャナは2400Hzまでの周波数のものが市販され
ている。一実施例は800Hzのスキャナを使用し、即ち走
査ビーム12bは各々、距離「Ｌ」の走査長さを有して１
秒間に800回前方および逆方向に移動し、ビームが走査
長さＬの一方の端部から他方の端部へcos速度プロフィ
ールをもって625マイクロ秒かかって移動する（625マイ
クロ秒/31.25マイクロ秒＝20走査点数／走査長さ）。レ
ーザビームの走査経路を第４図に示す。

第5b図に示すように、標本面28上の走査スポット12b
の照度プロフィールは正規分布（ガウス分布）をなして
いる。標本からの光信号を連続走査することによって任
意のセンサから発生されたアナログデータは正規分布照
度曲線のコンボリューションであり、所望の細胞成分信
号の分布、即ち２つの分布は１つが時間的にシフトされ
てかけ合わされる。

蛍光染色細胞が走査される場合を考えてみよう。蛍光
の仮定的プロフィールが第5a図に示され、第5a図は細胞
成分のベースレベルによる蛍光レベルをＣで示し成分変
動による蛍光レベルをC₁およびC₂で示す。もしサンプリ
ング速度が小さくてビームがアナログデータの流れがサ
ンプリングされる位置の間のスポット幅よりも大きく動
くならば、蛍光信号の情報のいくつかは失われるであろ
う。線セグメントに沿った染料の量を求めようとするた
めには、デジタルサンプルがあとで付け加えられるであ
ろう。サンプリングが少ないとき即ちサンプリングの頻
度が小さすぎる場合には、小さすぎるサンプリング速度
のために第5c図に示すようにアナログデータに対応する
デジタルデータ内に「隙間」を形成することから、得ら
れた値のセットはビーム照度プロフィールの分布と染料
の分布とのコンボリューションを表していないであろ
う。これらのサンプルの合計値はベースレベルＣの部分
を十分に示しておらずまた更に成分変動C₂に基づく実際
の増加を示す情報がベースレベル蛍光Ｃを示す２つのピ
ークの間で失われている。標本平面内の連続するサンプ
ルの間隔がスポットサイズ以下であるようにサンプリン
グ速度が決められた場合には、１スポットサイズ離れた
正規分布スポットが加え合わせられたときそれらは走査
線に沿って均等な分布を形成するので、第5d図に示すよ
うに標本のすべての部分は均等に表わされるであろう。
これは、１つの「スポットサイズ」だけ離れているとき
は正規分布曲線は十分に重なるので、スポットが加え合
わせられたとき全体は正規分布曲線の最大値すなわちピ
ーク値と等しくなるからである。細胞標本はスポット間
隔に十分近くサンプリングされるので蛍光センサからの
サンプルが加え合わせられたとき、適切な校正を行えば
それは細胞内のその成分の分布またはスライド上の細胞
の位置にかかわらず細胞成分の正確な量を与えるであろ
う。

記載の実施例はアナログデータをデジタル値に変換す
るためにデータ・トランスレーション（Data Translati
on、DT）から市販されている回路カードを使用する。こ
の回路カードは直接メモリアクセス（dma）を利用し、
この直接メモリアクセスにおいてDTカードは４つまでの
アナログ信号の各々を所定速度で連続的にサンプリング
するようにプログラムによって設定されている。このDT
カードは同様にこれらのアナログサンプルの各々を同等
なデジタルデータ値に変換しかつ信号サンプルの各セッ
トを所定のスタート記憶位置を有する連続的な記憶位置
に記憶し、所定数の記憶位置（バッファ）がデジタル値
でいっぱいになったときに作業を完了する。

プログラムは、サンプリングされるべき信号、サンプ
リング速度、最初の記憶位置およびバッファサイズを規
定することによってこのアナログ−デジタル変換作業を
設定する。１つの完全なＸ方向ストリップは、生データ
から１つのバッチのリストデータに処理されるので、バ
ッファサイズはストリップ内の走査数（典型例では250
0）に走査内のサンプル数（典型例では20）を乗じそれ
に実験において使用される光信号の数（典型例では２な
いし４）を掛けた値に等しくなければならない。即ちバ
ッファサイズは約100000となる。バッファがいっぱいに
なると、プログラム制御は、細胞を見出し、それらのピ
ーク値を見出し、それらの光学的および形態学的特性値
を求めるという機能に引き渡される。この時点におい
て、その中に典型的には100000のオーダーの連続的な値
を有するバッファが存在する。また、dma動作およびリ
スト値決定動作をオーバーラップさせることができる。

デジタルデータ処理 デジタルデータサンプル値がいったんコンピュータ記
憶装置（バッファ）内に記憶されると、データは、例え
ばバックグラウンドに対して補正して校正して希望の光
学的および形態学的特性値を発生するために、種々のプ
ロトコル制御された機能によって処理される。これらの
機能ステップを第７図のフローチャートに示す。

最初のデータ処理プログラム機能ステップ、第７図の
200は、ストリップ内の各前方走査（典型的にはストリ
ップ当り2500）の始点を位置決めする。第６図に示すよ
うに、信号の１つ、代表的には前方散乱信号、はそれに
対して、十分な振幅、期間および負の極性を有する同期
パルスを加えているので、それはすべての正常信号から
区別することができる。同期パルスはミラー走査ドライ
バ70から直接取得され、各前方走査に対し１回、各走査
に対して同じ時刻にかつその始点付近に発生するので、
このパルスは実際のデータを妨害することはない。記載
の実施例において、20サンプル走査（即ち走査長さＬ当
り20のサンプルが存在する）の中間（約12）のサンプル
点のみが使用され、これらを「ポイント」と呼ぶことに
しよう。30サンプル走査長さは約18ポイントを有するで
あろう。プログラムは最初、バッファの連続する記憶位
置を探索して同期信号の形状にマッチする３つの値のシ
ーケンスを求め、これらの位置のすべてに対するポイン
タの表を作成する。各データポイント値のスタート位置
が、バッファ内におけるこれらのポインタ位置の各々か
らの既知の変位に固定される。同期信号と走査位置との
関係が固定されるので、各走査のスタート位置はマーク
することができ、データバッファの値は各々プログラム
内に保持されている適当な記録によって特定の走査位置
と関連させることができる。

各パラメータに対する隣接点のグループは同期信号か
らのそれらの距離に応じて記憶装置内に位置付けされ
る。もしパラメータサンプルが連続的に、即ちパラメー
タＡに対してポイント１、パラメータＢに対してポイン
ト１、パラメータＡに対してポイント２というように、
採取されるならば、隣接点のこれらのグループは記憶装
置内にすべての他のサンプルを含むであろう（２つのパ
ラメータに対して）。

プログラムによって呼び出される次の機能ステップ、
第７図の202、は細胞を見出だすためのものである。個
々の細胞を位置付けするこの事象は「細胞見出し」と呼
ばれる。この機能は各走査のポイントの各々の探索によ
って、あるパラメータに対するプロトコルしきい値を超
えるところのそのパラメータに対する値（それのバック
グラウンド値が減算されている）を見出させる。従って
任意の１つのパラメータは、その細胞によって引き起こ
されるその所与のパラメータの信号値の増加によって細
胞を見出だすのに使用することができる。

バックグラウンド値は上記の校正領域から求めること
ができ、またはバックグラウンド値は１つ以上の前また
は後の近傍内の走査の同じ位置内におけるサンプルを平
均するかまたはその最小値を求めるかの何れかによって
発生することができる。最初、プログラムは、走査スト
リップの一部すなわち最初の約50走査のポイントに対す
る最初のバックグラウンド値のテーブル（表）を計算
し、これにより各パラメータ信号に対するすべてのポイ
ントの最小値を求めることができる。これらのポイント
に対する最初のバックグラウンド値は表の中に記憶され
る。

本発明のプロトコルパラメータの１つは近傍のサイズ
である。近傍は値Ｎを有し、Ｎは典型的には５ポイント
付近にあるがユーザによってテスト内の細胞のサイズお
よび濃度に調節される。近傍は統計的にただ１つの細胞
のみを有するように設定される。

細胞見出だし機能において、第７図における別個のス
テップ204は見出された各細胞の周りの近傍を規定す
る。近傍値Ｎは見出された細胞の周りの領域（ポイント
×走査）を規定し、見出された他の細胞は拒否され、即
ち所与の近傍内に単一の細胞が見出されると次の細胞の
見出しは近傍の外側になければならない。近傍の終端後
にスキップ（飛び越し）される走査の数は典型的には３
である。同様に、データ値は近傍内でのみ加算されるの
で、細胞見出しは完全な近傍よりも少ないものからなる
走査縁におけるサンプルの領域内では可能ではない。デ
ータを含む現在のリアルタイムはコンピュータクロック
からとられ、細胞リスト内に記憶される。近傍のサンプ
ルポイント数に等しくかつ近傍の後続の走査の数にも等
しいＮの値はプロトコル内に規定される。Ｎは近傍の中
心を規定しやすくするために奇数であることが好まし
い。

次の機能ステップ206はＮ前方走査のＮポイントに沿
ったすべての値、即ち細胞見出しの位置に中心が置かれ
た１つの近傍内のすべての値を比較して、そのポイント
の最大値から、プロトコルに規定された信号パラメータ
の１つに対するその対応ポイントバックグラウンド値を
減算した値を求める。最大値は細胞の中心および細胞見
出しの新しい位置を規定する。ステップ207において近
傍の中心合わせが再び行われる。走査数、ポイント数お
よびストリップ数はすべてメインの細胞リストファイル
内に記憶され、コンピュータのシステムタイムとともに
この新しい細胞位置を規定する。

次のステップ208において現在の近傍の始点の直前の
近傍の外側で終わっている走査のセット数（典型的には
５）を用いることによって各パラメータ信号に対するサ
ンプルの最小値を求めることにより、各近傍に対するポ
イントバックグラウンド値の新しい組が計算される。デ
ジタルデータポイントからこのバックグラウンド値を差
し引くことによってコンピュータ記憶装置内に光学的デ
ータポイントが発生される。

校正ランおよびプログラムによって求められる照度、
速度およびバックグラウンドはすべて、次のステップ21
0において各パラメータに対する各ポイント値にポイン
ト照度補正係数および速度補正係数のアレイを乗算する
ことによって考慮されている。第７図の次の機能ステッ
プ212はその細胞に対するピーク値の位置に中心が置か
れた規定された近傍の各サンプルに対する各パラメータ
のすべての補正光学的データ値を合計する。この合計値
が光学的近傍値である。上記の自己校正法においては、
この光学的近傍値は最初は照度または速度に対して校正
されていないが、次のステップで補正される。

この実施例においては、各方向において採取される細
胞のサンプル数は細胞のその方向の投影長さをその方向
のスポットサイズで割った値より大きいので、これらの
サンプルが合計されたときその結果は正確にその細胞パ
ラメータの積分値を表しかつ所与の細胞成分の絶対量に
直接関係付けることができる。これは、入射光ビームの
スポットサイズに等しい又はそれ以下の距離だけ離れて
サンプルが採取されるという原理に基づいている。スポ
ットサイズは顕微鏡の対物レンズの倍率選択によって選
ばれるが、サンプリング速度、ステップサイズおよび近
傍のサイズは、すべて、プロトコルにおいて特定のテス
トでテストされる細胞の速度、精度およびサイズに対す
るテストを調節するように選択される。

プログラムは次のステップ214において、デジタル化
２進近傍パターン即ちその形状を示す各細胞に対する形
態学的ワードを発生する。近傍内の各ポイントは各パラ
メータに関してプロトコル内に設定されたそのパラメー
タの「形態学的しきい値」と比較される。その値が形態
学的しきい値を超える各ポイントに対しては、記憶装置
内の形態学的ワードの特定位置が０から１にセットさ
れ、そのワードは１だけシフトされる。もししきい値を
超えていなければ、その位置は０のままでありかつワー
ドは１だけシフトされる。従って各細胞の各パラメータ
は細胞のデジタルイメージを含む近傍の領域（ポイント
×走査）に長さが等しいワードを発生するのに使用され
る。実際には、このワードのサイズは記憶スペースを節
約するためにポイント数より小さくすることができる。
最後のステップ216においてこれらのワードは、ステッ
プ210において発生された近傍値に対するデータ、走査
の時刻および細胞の位置データとともに各細胞に対する
リスト内に記憶される。

光学的および形態学的パラメータの表示 上記の機能セットは１つのＸ方向ストリップを表すバ
ッファ内の各細胞見出しに対して繰り返される。２つの
パラメータの光学的特性値（光学的近傍値から発生され
る）または形態学的特性値（２進近傍パラメータから発
生される）はドットとしてモニタ画面上に表示され、ド
ットのＸ方向位置は１つのパラメータに比例し、またド
ットのＹ方向位置は２番目のパラメータに比例する。特
定数Ｋ（典型的には500）の細胞が見出されるかまたは
特定数のＹステップ（Ｍ）に到達されたとき、「ラン」
は完了されかつ各細胞に対する値のリストがコンピュー
タの固定ディスクのファイル内に書き込まれる。この装
置は同様に任意の数Ｐのパス（経路）に対してランを繰
り返し、即ち再走査するようにプログラムされ得る。

ランを繰り返すために、顕微鏡ステージは最初のＸ方
向ストリップの走査を開始するように移動され、上記ス
テップのすべてが繰り返される。同時に、他のプログラ
ム機能がステージの位置を制御する。最初のパスにおけ
ると同様に、ステージは上記のように、まずホーム位置
に移動され、次に最初のスタート位置に移動されて位置
を追跡しながら走査速度にランプアップされ、Ｘ方向の
ストリップを横切りながら同期化ステップに移動され、
停止まで速度がランプダウンされそしてＹ方向にステッ
プされる。このように細胞の同じ標本の走査を繰り返す
ことによって、オペレータは個々の細胞内の動的変化を
観察できる。

上記のように発生されたデータのリストは後にまたは
上記データ取得プログラムのストリップの間でランする
ことができるデータ表示プログラムによって処理するこ
とができる。このプログラムの主な特色は以下のとおり
である。

「データプロトコル」を用いることによって、ユーザ
は、１つまたは２つの光学的近傍値、形態学的ワードま
たはタイムパラメータに数学関数を適用することによっ
て計算される特性のリストを規定することができる。光
学的特性は、例えば、１つのパラメータに対する光学的
近傍値（例えばDNAのピコグラム数に変換可能な値）、
２つのこのような値の比、タイム、または形態学的ワー
ドすなわち２進近傍パターンの１ビットのすべての合計
（細胞領域）とすることができる。これらの特性は細胞
サブ集団をカウントしそれらをモニタ画面上に表示する
ための細胞選択のシーケンスのためのベースとして使用
される。

画面は２つの選択特性の各々に対応する軸を有するモ
ニタ上に発生される。各細胞は画面上にドットとして表
示され、軸上のドットの位置は特性に比例し、ドットの
色はその画面位置に発生する細胞数に比例する。例えば
ユーザ制御マウスを使用すれば、ユーザは画面の特定領
域を多角形で囲むことができる（これは更なる領域に拡
張できる）。最初の画面の特性と同じでもまたは異なっ
てもよい２つの追加の特性がデータプロトコル内に指示
される。その特性が第１の画面の多角形領域内にある細
胞はカウントされて、その座標が第２の特性のセットで
ある第２の画面上に表示される。多数、例えば６個、の
多角形が第２の画面上に描かれ、これらの領域の各々内
の細胞がカウントされる。第８図に示すように、カウン
ト数が画面上でそれらの対応領域のそばに表示される。

取得された特性の連続したカウントに基づいて細胞の
サブ集団をカウントするほかに、ユーザは特定したデー
タを任意のセットの等角投影または等高線図を含む種々
の他のフォーマットで表示することができる。第８図に
示すような本発明による測定器の他の態様においては、
このプログラムはパラメータ値の特定位置またはセット
を表すモニタ画面上の多角形を発生することができる。
このプログラムは次に、その特性が多角形領域内に入る
ところの各細胞を特定するように測定器に指示をするこ
とができる。即ち各多角形は、その多角形内の細胞の各
々に共通な特定の特性を示すサンプル内の細胞のサブ集
団を含む。各細胞は目視観察用の顕微鏡対物レンズ39の
下へ自動的に位置決めされるので、集団内のその細胞に
対応する画面上のドットは（第８図の右下側の多角形に
示すように）そこに中心を置く点滅サークルによってマ
ークされる。

各Ｘ方向ストリップを完了したのちに、各細胞のパラ
メータに対する値が合計されてモニタ画面上に表示され
る。各テストの間、ユーザは２つのパラメータの値によ
って規定される位置におけるスクリーン上のドットとし
てまたはもし２つより多いパラメータが使用されるなら
ば２つのこのようなパターンとして表示される各細胞を
観察する。これらのグラフの軸にはプロトコルパラメー
タ名が記入されている。本発明によれば、見出された細
胞の位置は同様に画面上の追加グラフ上にドットで表示
することができる。固定数の細胞、典型的には約500、
が見出されたのちに、これらの細胞に対するデータリス
トがプロトコルとともにヘッダを含むディスクファイル
内に記憶される。全領域が走査されるかまたはプロトコ
ルの最大細胞カウント数に到達するかの何れかが起きた
のちには、残りの細胞データは全細胞カウントに先行す
るリストファイル内に記憶される。

ユーザは走査を１回以上繰り返すためにプログラムを
呼び出すことができる。これらの後続のパスにおいて、
上記機能のすべての細胞見出しの作業例外とともに反復
される。第１のパスから見出されたすべての細胞の位置
は記憶装置の表の中に読み込まれ、これらの位置はピー
ク値見出しルーチンのスタート位置を指示するのに適当
な時に使用される。新しい時刻は新しいリスト内に記憶
され、すべての他の機能は最初のパスと同一である。

データ解析 本発明のプログラムによって得られた結果は典型的に
は1000ないし10000の細胞に対するデータのセットを含
むファイルである。これらのデータ値はフローサイトメ
トリの文献に記載の任意のプログラムと同一の解析およ
び表示プログラムへのインプットとして使用される。こ
れらのプログラムは、次のテキスト、メラメッド（Mela
med）その他の「フローサイトメトリおよび分類（Flow
Cytometry and Sorting）」（John Wiley ＆ Sons、197
9年、第20章）、またはH.シャピロ（Shapiro、H.）の
「実用フローサイトメトリ（Practical Flow Cytometr
y）」（A.K.Liss、1985年、第５章）に記載されてい
る。

しかしながら、形態学的特性、時刻および位置を示す
本発明のモニタ画面表示は、本発明の他の特色である。
例えば、時刻は散乱あるいは蛍光パラメータとともに１
つの追加のパラメータとしてグラフ上に表示することも
できるし、またはパラメータの特定の機能を時間変動し
きい値に対してテストしあるいは実験またはテストを実
行するための時間関数として表示することもできる。時
間は同様に時間の経過をマークするために画面上のドッ
トまたは輪郭カラーを修正することによって表示するこ
とができる。そのパラメータの領域を表示する合計１ビ
ットカウントのような形態学的ワードの機能は任意のパ
ラメータのように使用することができる。形態学的値お
よびデータから得られる多数の合計パラメータは、スラ
イド上の特定の細胞タイプまたは病理学的細胞を識別す
るという最終目標を達成するために、パターン認識また
は人工知能の文献に記載の技術を用いれば最適に分析す
ることができることを意図している。

分析プログラムによって固有のパラメータ値に有する
細胞値がいったん見出されると、テスト標本は顕微鏡ス
テージ上に置かれ、次にプログラムが呼び出されて検査
されるべき細胞のＸ方向およびＹ方向の値のリストを読
み込むことによって順次にこれらの固有の細胞の各々
に、ステージは目動的に中心を合わせることができる。
これらの細胞の特性はモニタ画面上に表示される。ユー
ザはこの画面を用いて、自動データ解析を検査し、細胞
を調べて更にそれらの病理学的特性を決定し、臨床実験
室における手作業手順の良否をチェックしまたはクッキ
ーカッターのような装置を用いて注目する細胞を物理的
に分離または分類することができよう。

主として血液リンパ細胞のような活動細胞がテスト中
にある抗原と反応したときに示す動的挙動は自己免疫疾
患またはがんのような系統的な病理学に対するテストの
重要かつ新しい方法であろう。上記のようにして、特定
の特性を有する細胞が識別されそれらの位置が記憶装置
内に記憶可能である。キュベットまたはチャンバ内の標
本を再走査し、そしてこれらの特定細胞の新しい値を再
計算しリスト化することもできる。

本発明による装置は同様に分析の速度を上げるための
連続的な分析技術を意図している。最初のパスの間に見
出される注目する細胞は分析のためにより多くの複雑さ
と時間とを必要とする特性を決定するために、他のパラ
メータに対してまたはより大きな分解能で検査されよ
う。

他の実施態様は特許請求の範囲内に記載されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は生物標本の複数の光学的特性の高速度測定装置
の概略図である。 第２図は第１図に示す測定器に使用される電気機械回路
のブロック図である。 第３図は一般的な光信号データ取得ループのフローチャ
ートである。 第４図はレーザビームの走査パターンの概略図である。 第5a図ないし第5d図は本発明による適正なサンプリング
速度を示す図である。 第６図はアナログ光学的データと対応のデジタルデータ
とを示す一連の図である。 第７図は記憶装置内に記憶されているデータを処理する
のに使用されるデータ処理機能ステップのフローチャー
トである。 第８図は前方角散乱値（ｙ軸）に対しての赤色蛍光値
（ｘ軸）を図示する実際のテストランのためのモニタ画
面表示である。 第９図は補正方法のデータ処理ステップのフローチャー
トである。 10……装置、12……ビーム源、12a、12b……ビーム、12
c……ビームスポット、14……スキャナ、16……顕微
鏡、18……可動面、20、22、24、26……センサ、28……
細胞が載せられる面、30、32、34、35、36、39、44……
光路、80a……アナログ−デジタル変換器、81……デー
タプロセッサ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルイス・エイ・カメントスキー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02116，ボストン，ビーコン・ストリー ト 180 (56)参考文献 特開 昭63−53447（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−201332（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−212088（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 15/14

Claims (46)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞集団を特徴付ける光学的データを発生
   する方法において、 （ａ）デジタルデータサンプルを生成するために細胞集
   団をレーザビームで走査するステップであって、異なる
   前記サンプルは前記細胞集団内の異なる位置を表す、ス
   テップと、 （ｂ）前記デジタルデータを記憶するステップと、 （ｃ）前記集団内で細胞を位置付けするステップと、 （ｄ）その位置付けされた細胞に対応するデジタルデー
   タサンプルを含む、デジタルデータサンプルの近傍を定
   めるステップと、 （ｅ）前記近傍の各デジタルデータサンプルに対して、
   前の又は後続する近傍における対応する走査位置からの
   記憶されたデジタルデータを基にして、バックグラウン
   ドレベルを概算するステップと、 （ｆ）前記近傍に対応する前記デジタルデータサンプル
   の各々を、概算された前記バックグラウンドレベルを用
   いて補正するステップと、 （ｇ）前記近傍における前記の補正されたデジタルデー
   タサンプルの和をとって光学的データを発生するステッ
   プと を備える方法。
2. 【請求項２】請求項１記載の方法において、前記のサン
   プルを補正するステップが、近傍における前記の記憶さ
   れたデジタルデータサンプルの各々から対応するバック
   グラウンドレベルを減算するステップを備える、方法。
3. 【請求項３】請求項１記載の方法において、前記デジタ
   ルデータサンプルは前記集団内の各細胞の複数の光学的
   特性を表す、方法。
4. 【請求項４】請求項１記載の方法において、前記の細胞
   集団がステップ運動で動く可動面上にあり、該ステップ
   運動はスキャナに同期し、デジタル位置データが生成さ
   れてそこから細胞に対応するステップ及び走査の位置が
   導出される、方法。
5. 【請求項５】請求項４記載の方法において、前記可動面
   上の前記細胞を目視で観察することが可能である、方
   法。
6. 【請求項６】請求項１記載の方法において、前記近傍の
   バックグラウンドレベルが、前記近傍内の各サンプルに
   ついての近傍に隣接する実際の位置に対応するメモリ位
   置における最小デジタルデータサンプル値を見つけるこ
   とによって決定される、方法。
7. 【請求項７】請求項１記載の方法において、前記近傍の
   バックグラウンドレベルが、前記近傍の外側のメモリに
   おける複数のデジタルデータサンプル値の平均を求める
   ことによって決定される、方法。
8. 【請求項８】請求項１記載の方法において、前記細胞集
   団が可動面上にあり、前記の走査が前記可動面のステッ
   プ運動に同期して行われ、デジタルデータが取得された
   時間にほぼ対応する時間が同期デジタル時間データとし
   て記録かつ記憶され、サンプルに対応する位置をそこか
   ら取得することができるデジタル位置データが発生さ
   れ、その結果、各サンプルが、対応するデジタル時間点
   および位置を有する、方法。
9. 【請求項９】請求項８記載の方法において、前記細胞集
   団を再走査するステップと、新しいデジタルデータ、位
   置データおよび時間データを発生するステップと、前記
   細胞集団内の変化を求めるために前記の新しいデータを
   前の走査から得られた対応するデータと比較するステッ
   プとを更に備える方法。
10. 【請求項１０】請求項１記載の方法において、前記近傍
    のサイズが一つの細胞を統計的に含むように設定され
    る、方法。
11. 【請求項１１】請求項１記載の方法において、前記の位
    置付けするステップは、前記ビームによって最初に接触
    された細胞の縁部に対応するデジタルデータサンプルを
    検出するステップを備える、方法。
12. 【請求項１２】請求項11記載の方法において、前記ビー
    ムが最初に接触した細胞の縁部に対応する前記デジタル
    データサンプルのまわりの前記近傍を最初に中心合わせ
    するステップと、前記近傍内の最大のデジタルデータサ
    ンプルを判定するステップと、次に、前記近傍のバック
    グラウンドレベルを概算する前に、前記の最大のサンプ
    ルに関して前記近傍を再び中心合わせするステップとを
    更に備える方法。
13. 【請求項１３】細胞集団を特徴付ける方法において、 （ａ）走査される細胞とサイズが同等なスポットサイズ
    を有するレーザビームを用いて走査線に沿った面上の細
    胞集団を走査して細胞から出される光を検出するセンサ
    からアナログ信号を生成し、前記アナログ信号をサンプ
    リングしてデジタルデータサンプルを生成するステップ
    であって、前記スポットが連続するサンプリング位置の
    間を走査されるときの時間当りの走行距離が前記スポッ
    トサイズとほぼ等しくなるように設定されたサンプリン
    グ速度で前記サンプルが取得されるようにする、ステッ
    プと、 （ｂ）別の前記サンプルが前記細胞集団内の別の位置を
    表すように、前記レーザの走査線を前記面に関して移動
    させるステップと、 （ｃ）前記集団内の細胞を特徴付ける光学的データを発
    生するために近傍における前記デジタルデータを処理す
    るステップと を備える方法。
14. 【請求項１４】請求項13記載の方法において、前記スポ
    ットサイズが３ないし50ミクロンである、方法。
15. 【請求項１５】請求項13記載の方法において、前記の処
    理するステップが、前記光学的データを発生するために
    バックグラウンドレベルを用いて前記デジタルデータサ
    ンプルを補正するステップを備える、方法。
16. 【請求項１６】請求項13記載の方法において、前記の処
    理するステップは、走査速度の変動に対して校正された
    光学的データを生成するために、レーザビームが各位置
    上を走査される速度に比例する速度正規化係数を用いて
    前記光学的データサンプルを校正するステップを更に備
    える、方法。
17. 【請求項１７】請求項16記載の方法において、前記の校
    正するステップは速度正規化係数で前記デジタルデータ
    を乗算するステップを備える、方法。
18. 【請求項１８】細胞集団を特徴付ける校正された光学的
    データを発生する方法において、 （ａ）デジタルデータサンプルを生成するために面上の
    細胞集団をレーザビームで走査するステップであって、
    前記ビームは所与の照度を有し、異なる前記サンプルが
    前記細胞集団内の異なる位置を表す、ステップと、 （ｂ）前記デジタルデータを記憶するステップと、 （ｃ）照度校正データを発生するために細胞のない前記
    面の領域を走査するステップと、 （ｄ）前記照度校正データから照度正規化係数を発生
    し、前記照度正規化係数をメモリに記憶するステップ
    と、 （ｅ）前記集団内の細胞を位置付けするステップと、 （ｆ）位置付けされた前記細胞に対応するデジタルデー
    タサンプルを含む、デジタルデータサンプルの近傍を定
    めるステップと、 （ｇ）校正された光学的データを生成する前に、前記近
    傍内のデジタルデータを前記照度正規化係数でを用いて
    校正するステップと、 を備える方法。
19. 【請求項１９】請求項18記載の方法において、前記の光
    学的データを校正するステップが、前記光学的データに
    前記照度正規化係数を乗算するステップを備える、方
    法。
20. 【請求項２０】請求項18記載の方法において、前記の細
    胞のない面が、均一な蛍光染料面を備える校正用スライ
    ドである、方法。
21. 【請求項２１】請求項18記載の方法において、前記の細
    胞のない面が、均一な散乱面を備える校正用スライドで
    ある、方法。
22. 【請求項２２】請求項18記載の方法において、前記近傍
    内に含まれる前記光学的データの導出が、 個々の近傍に対するバックグラウンドレベルを、前記近
    傍の外側の位置に対応する記憶されたデジタルデータを
    基にして概算するステップと、 前記光学的データを発生するために、各近傍内の前記デ
    ジタルデータサンプルの各々を、対応する概算された近
    傍のバックグラウンドレベルを用いて補正するステップ
    と、 を備える、方法。
23. 【請求項２３】細胞特徴付け特性を測定する方法におい
    て、 （ａ）デジタルデータサンプルを生成するために細胞集
    団をレーザビームで走査するステップであって、異なる
    前記サンプルは前記細胞集団内の異なる位置を表す、ス
    テップと、 （ｂ）前記デジタルデータを記憶するステップと、 （ｃ）前記集団内の細胞を位置付けするステップと、 （ｄ）前記の位置付けされた細胞に対応するデジタルデ
    ータサンプルを含む、デジタルデータサンプルの近傍を
    規定するステップと、 （ｅ）近傍におけるデジタルデータのすべてのサンプル
    の和をとり、その近傍に対する光学的近傍値を生成する
    ステップと、 （ｆ）近傍における各デジタルのサンプルと予め選択さ
    れた形態学的しきい値とを比較して、該しきい値の上ま
    たは下の何れかのサンプルの２進近傍パターンを発生す
    るステップと、 （ｇ）前記光学的近傍値および２進近傍パターンをメモ
    リに記憶するステップと、 （ｈ）各細胞に対して前記２進近傍パターンに対応する
    形態学的特性および前記光学的近傍値に対応する細胞特
    徴付け特性を生成するステップと を備える方法。
24. 【請求項２４】請求項23記載の方法において、前記光学
    的特性の生成が、 前記近傍に対応する細胞の光学的特性を発生するために
    １つ又はそれ以上の前記光学的近傍値に対して数学関数
    を適用することを含む、 方法。
25. 【請求項２５】請求項23記載の方法において、前記形態
    学的特性の生成が、 前記近傍に対応する細胞の形態学的特性を発生するため
    に１つ又はそれ以上の前記２進近傍パターンに対してブ
    ール関数を適用することを含む、 方法。
26. 【請求項２６】請求項23記載の方法において、前記近傍
    内に含まれている前記光学的データの導出が、 前記近傍に対するバックグラウンドレベルを、前記近傍
    の外側の位置に対応する記憶されたデジタルデータを基
    にして概算するステップと、 前記光学的データを発生するために、前記近傍に対応す
    る前記デジタルデータサンプルの各々を、概算された近
    傍のバックグラウンドレベルを用いて補正するステップ
    と を備える、方法。
27. 【請求項２７】請求項１、13、18または23の何れかに記
    載の方法において、細胞とビームとによって形成される
    前記デジタルデータサンプルは、アナログ光学的データ
    から導出される、方法。
28. 【請求項２８】請求項27記載の方法において、前記光学
    的データが、蛍光、前方角光散乱、消光または広角光散
    乱である、方法。
29. 【請求項２９】細胞集団の細胞特性を測定して表示する
    装置において、 走査される細胞とサイズが同等なビームスポットで測定
    すべき細胞を照明するための電磁放射線ビームを発生す
    るビーム源であり、前記スポットが前記細胞を照明した
    結果として光学的信号が出される、ビーム源と、 細胞がその上に載せられる面と、 前記スポットを前記ビーム源から前記面上の細胞へ導く
    光学的経路と、 前記ビーム源と前記細胞との間の前記光学的経路に配置
    され、走査線に沿って前記面を横切って前記スポットを
    走査するスキャナと、 前記光学的信号を測定するセンサと、 前記光学的信号を特定の速度でサンプリングしかつデジ
    タルデータを生成するように配置されたアナログ−デジ
    タル変換器であって、スポットが連続するサンプリング
    位置間を走査されるときの時間当りの走行距離が前記ス
    ポットサイズとほぼ等しくなるように前記サンプリング
    速度が設定される、アナログ−デジタル変換器と、 前記レーザのスポットが前記面上の複数の細胞上を連続
    的に走査するように、前記面に関して前記レーザの走査
    線を移動させる手段と、 個々の細胞に対応する前記デジタルデータの近傍から光
    学的データを導出し、前記細胞集団の細胞特性を表示す
    るために前記の細胞の光学的データを処理するデータプ
    ロセッサと、 前記変換器によって形成された前記デジタルデータを記
    憶するメモリと を備える装置。
30. 【請求項３０】請求項29記載の装置において、前記スポ
    ットのサイズが３ないし50ミクロンである、装置。
31. 【請求項３１】請求項29記載の装置において、前記スキ
    ャナが共振検流計スキャナである、装置。
32. 【請求項３２】請求項29記載の装置において、前記ビー
    ムの波長分布がデータプロセッサによって制御される、
    装置。
33. 【請求項３３】細胞集団を特徴付ける光学的データを生
    成する装置において、 （ａ）細胞集団をレーザビームで走査するスキャナ及び
    レーザの走査に対して或る角度で細胞集団を動かす動力
    設備付きステージであって、レーザの刺激により細胞か
    ら出される光からデジタルデータサンプルを生成し、異
    なる前記サンプルは前記細胞集団内の走査線に沿った異
    なる位置を表す、スキャナ及びステージと、 （ｂ）前記デジタルデータを記憶するメモリと、 （ｃ）前記集団内の細胞に対応するメモリにおけるデジ
    タルデータサンプルを位置付けする手段と、 （ｄ）前記の位置付けされた細胞の周りに近傍を定める
    手段と、 （ｅ）前記近傍の各デジタルデータサンプルに対するバ
    ックグラウンドレベルを、前又は後続の近傍における走
    査位置に対応する記憶されたデジタルデータを基にして
    概算する手段と、 （ｆ）光学的データを発生するために、前記近傍に対応
    する前記デジタルデータサンプルの各々を、前記の概算
    された近傍のバックグラウンドレベルを用いて補正する
    手段と を備える装置。
34. 【請求項３４】細胞集団を特徴づける校正された光学的
    データを生成する装置において、 （ａ）デジタルデータサンプルを生成するために面上の
    細胞集団をビームで走査するスキャナであって、該ビー
    ムは所与の照度を有し、異なる前記サンプルは前記細胞
    集団内の異なる位置を表すものであり、かつ、照度校正
    データを生成するために細胞のない前記面の領域を走査
    するスキャナと、 （ｂ）前記デジタルデータを記憶するメモリと、 （ｃ）前記照度校正データから照度正規化係数を発生す
    る手段と、 （ｄ）前記集団内の細胞に対応するメモリにおけるデジ
    タルデータサンプルを位置付けする手段と、 （ｅ）前記の位置付けされた細胞の周りに近傍を定める
    手段であって、前記近傍が、前記近傍内の前記の記憶さ
    れたデジタルデータサンプルから導出される光学的デー
    タを含む、近傍を定める手段と、 （ｆ）校正された光学的データを生成するために、前記
    近傍における光学的データを前記照度正規化係数で補正
    する手段と を備える装置。
35. 【請求項３５】細胞特性を測定する装置において、 （ａ）デジタルデータサンプルを生成するために細胞集
    団をビームで走査するスキャナであって、異なる前記サ
    ンプルは前記細胞集団内の異なる位置を表す、スキャナ
    と、 （ｂ）前記デジタルデータを記憶するステップと、 （ｃ）前記集団内の細胞に対応するメモリにおけるデジ
    タルデータサンプルを位置付けする手段と、 （ｄ）前記の位置付けされた細胞の周りに近傍を定める
    手段と、 （ｅ）近傍内のすべての光学的データサンプルの合計を
    求めてその近傍に対する光学的近傍値を生成する加算器
    と、 （ｆ）近傍内の各サンプルを予め選択された形態学的し
    きい値と比較して、該しきい値の上または下の何れかの
    サンプルの２進近傍パターンを生成する比較器と、 （ｇ）各細胞に対して前記２進近傍パターンに対応する
    形態学的特性及び前記光学的近傍値に対応する光学的特
    性を生成する手段と を備える装置。
36. 【請求項３６】多数の細胞が一定の光学値を有する細胞
    集団を特徴づける校正された光学的データを生成する方
    法において、 （ａ）デジタルデータサンプルを生成するために走査線
    に沿って細胞集団をレーザビームで走査するステップで
    あって、異なる前記サンプルは前記細胞集団内の前記走
    査線に沿った異なる位置を表す、ステップと、 （ｂ）前記デジタルデータを記憶するメモリと、 （ｃ）前記集団内の細胞を位置付けするステップと、 （ｄ）位置付けされた各細胞に対して、前記位置付けさ
    れた細胞に対応するデジタルデータサンプルを含むデジ
    タルデータサンプルの近傍を定めるステップであって、
    前記近傍は前記近傍内の前記の記憶されたデジタルデー
    タサンプルから導出された光学的データを含む、ステッ
    プと、 （ｅ）前記位置付けされた細胞の位置を定めるために、
    前記近傍内の最大のデジタルデータサンプルを判定する
    ステップと、 （ｆ）前記近傍におけるすべての光学的データの値を合
    計してその近傍に対する光学的近傍値を生成するステッ
    プと、 （ｇ）走査線に沿った細胞位置の関数として照度差に対
    して光学的データを補正するための照度正規化係数を発
    生するために個々の細胞を表す前記光学的データを処理
    するステップと、 （ｈ）走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する
    光学的データを、その細胞に対する光学的近傍値を対応
    の照度正規化係数で乗算することによって補正するステ
    ップと を備える方法。
37. 【請求項３７】請求項36記載の方法において、前記の光
    学的データを処理するステップが、 （ａ）モード光学値を規定するために、最も頻繁に現れ
    る光学的近傍値を決定するためにすべての光学的近傍値
    を試験するステップと、 （ｂ）前記モード光学値のあたりの所定範囲内の光学的
    近傍値を用いて細胞のサブ集団を選択するステップと、 （ｃ）走査線に沿った細胞位置の関数としてサブ集団の
    細胞の平均光学的近傍値のセットを求めるステップと、 （ｄ）照度正規化係数を生成するために走査線に沿った
    各位置に対しての平均光学値に対するモード光学値の比
    に等しい補正係数のアレイを計算するステップと を備える、方法。
38. 【請求項３８】請求項37記載の方法において、前記細胞
    のサブ集団を選択する光学近傍値の前記所定範囲は、前
    記モード光学値のプラス又はマイナス２ないし６％であ
    る、方法。
39. 【請求項３９】請求項37記載の方法において、前記細胞
    のサブ集団は静止期の細胞を含む、方法。
40. 【請求項４０】請求項37記載の方法において、前記細胞
    のサブ集団は実質的に同じサイズの細胞からなる、方
    法。
41. 【請求項４１】請求項37記載の方法において、 前記の照度正規化係数を生成するために走査線に沿った
    各位置に対しての平均光学値に対するモード光学値の比
    に等しい補正係数のアレイを計算するステップと、 走査線に沿った異なる位置にある各細胞に対する光学的
    データを、その細胞に対する光学的近傍値を対応の照度
    正規化係数で乗算することによって補正するステップと
    は、最初に校正された光学的データに対して、照度正規
    化係数が安定するまで新しい照度正規化係数を計算する
    ように反覆して繰り返される、方法。
42. 【請求項４２】細胞集団を特徴付ける校正された光学的
    データを生成する方法において、 （ａ）デジタル校正データサンプルを生成するために既
    知の一定のパラメータを備える校正粒子の集団を走査線
    に沿ってレーザビームで走査するステップであって、異
    なる前記校正サンプルは前記走査線に沿った異なる位置
    を表す、ステップと、 （ｂ）前記デジタル校正データを記憶するステップと、 （ｃ）前記集団内の校正粒子を位置付けするステップ
    と、 （ｄ）位置付けされた各粒子に対して、該位置付けされ
    た粒子に対応するデジタル校正データサンプルを含むデ
    ジタル校正データサンプルの近傍を定めるステップであ
    って、前記近傍は前記近傍内の前記の記憶されたデジタ
    ル校正データサンプルから導出される光学的校正データ
    を含む、ステップと、 （ｅ）前記の位置付けされた校正粒子の位置を定めるた
    めに、前記近傍内の最大のデジタルデータ校正サンプル
    の位置を判定するステップと、 （ｆ）前記近傍内のすべての光学的校正データ値を合計
    してその近傍に対する光学的近傍校正値を生成するステ
    ップと、 （ｇ）走査線に沿った粒子位置の関数として照度差に対
    して光学的データを補正するために照度正規化係数を生
    成するために前記光学的校正データを処理するステップ
    と、 （ｈ）デジタルデータサンプルを生成するために前記走
    査線に沿って細胞集団をレーザビームで走査するステッ
    プであって、異なる前記サンプルは前記細胞集団内の前
    記走査線に沿った異なる位置を表す、ステップと、 （ｉ）前記デジタルデータを記憶するステップと、 （ｊ）前記の記憶されたデジタルデータから光学的デー
    タを導出するステップと、 （ｋ）走査線に沿った異なる定められた位置にある各細
    胞に対する光学的データを、その細胞に対する光学的デ
    ータを対応の照度正規化係数で乗算することによって補
    正するステップと を備える方法。
43. 【請求項４３】請求項42記載の方法において、前記の光
    学的校正データを処理するステップは、 （ａ）モード光学的校正値を定めるために、最も頻繁に
    現れる光学的校正近傍値を決定するためにすべての光学
    的校正近傍値を試験するステップと、 （ｂ）走査線に沿った粒子位置の関数として、粒子の平
    均光学的校正近傍値のセットを求めるステップと、 （ｃ）照度正規化係数を生成するために、走査線に沿っ
    た各位置に対する平均光学的校正値に対するモード光学
    的校正値の比に等しい補正係数のアレイを計算するステ
    ップと を備える、方法。
44. 【請求項４４】請求項１、13、18、23、36または42の何
    れかに記載の方法において、見つけられた各細胞の位置
    が記録されかつ記憶される、方法。
45. 【請求項４５】請求項１、13、18、23、36または42の何
    れかに記載の方法において、デジタルデータが取得され
    た時間にほぼ対応する時間が同期デジタル時間データと
    して記録かつ記憶され、各サンプルが対応するデジタル
    時間点を有する、方法。
46. 【請求項４６】請求項１、13、18、23または36の何れか
    に記載の方法において、前記の細胞を位置付けするステ
    ップが、前記の記憶されたデジタルデータを所定のしき
    い値と比較するステップを備える、方法。