CN112813133A

CN112813133A - 一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用

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Publication number: CN112813133A
Application number: CN202110127301.0A
Authority: CN
Inventors: 姜晶
Original assignee: Shanghai Ruiyu Biotech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Ruiyu Biotech Co Ltd
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112813133B

Abstract

本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用。所述检测方法包括如下步骤：获取细胞计数板上共培养样品的显微图像，所述共培养样品为靶细胞与效应细胞共培养得到的细胞样品，所述靶细胞携带第一荧光标记，所述共培养样品至少使用一种第二荧光标记进行染色标记，所得显微图像包括明场显微图像、第一荧光显微图像和至少一张第二荧光显微图像，而后，对所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像及所述至少一张第二荧光显微图像进行叠加合成分析并计数，得到细胞杀伤效力的检测结果。该检测方法能够同时得到待测细胞的图像信息和数据处理结果，所得结果更加直观，检测步骤少且检测效率高。

Description

一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用

技术领域

本发明属于细胞杀伤活性检测技术领域，具体涉及一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用。

背景技术

细胞杀伤效力的检测对于免疫细胞治疗产品的质量控制具有重要的意义。由于免疫细胞治疗产品具有起始个体差异大、制备工艺规模化程度低、制剂多为活细胞产品、作用机制不是很明确等，使得这类产品的一致性差、批量有限、效期短、同一类产品的可比性差等特点，所以免疫细胞治疗产品的质控研究较为复杂，其中杀伤效力质量控制便是难点之一。

目前，常用的细胞杀伤检测方法有镉51释放实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放法、BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法等。例如，镉51释放实验、LDH法、BATDA法和CytoTox-Glo法都属于间接法，即先用某一试剂对靶细胞进行标记，然后和不同浓度的免疫细胞进行孵育，当靶细胞受到免疫细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，这些物质会释放到上清中，通过测定释放物质的含量可以测定免疫细胞的活性。上述方法都是通过释放物质含量的测定而间接进行定量，反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。

其中经典的方法是镉51释放实验，该方法可重复性好，但是，因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，其他放射性同位素标记靶细胞如H3亦具有此类缺陷，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其它替代方法进行生物学效力检测。

传统的LDH法灵敏度及可重复性不稳定，且所需时间较长，批间变异较大，不能适应免疫细胞效期短的特点。CAM法及PKH法是通过流式细胞仪检测活细胞标记及死亡标记双信号来反映其杀伤效率，与前述方法相比，这两种方法所反映的信号还包括处于凋亡状态的细胞。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。鉴于其在单细胞水平上高效准确的定量分析优势，目前涌现出多种以流式细胞术为基础的NK细胞杀伤活性的测定方法，但仍然存在缺陷。由于效应细胞和靶细胞在共培养过程中，靶细胞对效应细胞可能会产生一定抑制和破坏作用，则共培养体系的死亡率可能是包括靶细胞和效应细胞的共同死亡率。其次，尽管流式细胞术能够特异性地检测靶细胞的凋亡率，流式细胞仪属于液流系统，无法采集到细胞图像，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察。

此外，在进行病人的免疫水平评价，肿瘤治疗愈后评价，以及细胞治疗过程中的免疫细胞的增殖能力评价等环节中，也都需要对免疫细胞的杀伤能力进行评估。

因此，开发一种直观地、准确地检测杀伤效力的检测方法，对于免疫细胞制品的研发或免疫细胞疗法的发展具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用。所述方法先通过对靶细胞和免疫细胞进行荧光染色，区分活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞，并结合荧光显微成像和图像合成分析方法，根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

获取细胞计数板上共培养样品的明场显微图像，所述明场显微图像使用明场通道拍摄得到，其中，

所述共培养样品为靶细胞与效应细胞共培养得到的细胞样品，

所述靶细胞携带第一荧光标记，

所述共培养样品至少使用一种第二荧光标记进行染色标记，

所述第一荧光标记与所述第二荧光标记对应的激发光波长不同；

获取所述共培养样品的第一荧光显微图像，所述第一荧光显微图像使用与所述第一荧光标记匹配的通道拍摄得到；

获取所述共培养样品的至少一张第二荧光显微图像，所述至少一张第二荧光显微图像使用与所述第二荧光标记匹配的通道拍摄得到；

对所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像及所述至少一张第二荧光显微图像进行叠加合成分析并计数，得到细胞杀伤效力的检测结果，所述检测结果包括靶细胞死亡率和效应细胞死亡率。

本发明中，用不同激发光波段的第一荧光标记和第二荧光标记分别对靶细胞和死细胞进行染色标记(也可是要三种不同波段的荧光标记)，而后基于分析处理模块，实现荧光显微成像和图像合成分析，在同一位置(视野)分别用明场和至少两种荧光标记的显微荧光通道进行显微成像，然后将同一视场的显微图像进行叠加合成分析，得到检测结果。

进一步地，所述计数后得到的计数结果包括：靶细胞和效应细胞总数、靶细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、效应细胞总数、活效应细胞数或死效应细胞数中的任意一种或至少两种的组合。

进一步地，根据所述计数结果得到所述靶细胞死亡率和效应细胞死亡率；

所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：

靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％。

所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：

效应细胞死亡率＝死效应细胞数/(活效应细胞数+死效应细胞数)×100％。

进一步地，所述检测方法还包括获取对照组靶细胞的显微图像并计算对照组靶细胞死亡率，所述检测结果还包括细胞特异杀伤率；

其中，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：

细胞特异杀伤率＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率。

进一步地，所述检测方法还包括获取对照组效应细胞的显微图像并计算对照组效应细胞死亡率，所述检测结果还包括效应细胞自伤率；

其中，所述效应细胞自伤率采用如下公式进行计算：

效应细胞自伤率＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。

作为一种优选的技术方案，所述第二荧光标记为死细胞标记物，所述第二荧光显微图像为死细胞标记荧光显微图像，对所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像及所述死细胞标记荧光显微图像进行叠加合成分析并计数包括：

识别所述明场显微图像中的细胞，并将所述第一荧光显微图像中的细胞判定为靶细胞，所述死细胞标记荧光显微图像中的细胞判定为效应细胞；

而后，标示所述靶细胞和效应细胞的位置，其中，

标示所述明场显微图像中的所有细胞并统计数目，得到靶细胞和效应细胞总数；

标示所述明场显微图像和所述第一荧光显微图像中的细胞并统计数目，得到靶细胞总数，标示存在于所述明场显微图像和所述第一荧光显微图像中的细胞并统计数目，得到活靶细胞数，标示同时存在于所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像和所述死细胞标记荧光显微图像中的细胞并统计数目，得到死靶细胞数；

标示存在于所述明场显微图像且不存在于所述第一荧光显微图像并统计数目，得到效应细胞总数，标示仅存在于所述明场显微图像中的细胞并统计数目，得到活效应细胞数，标示存在于所述明场显微图像、所述死细胞标记荧光显微图像且不存在于第一荧光显微图像的细胞并统计数目，得到死效应细胞数。

作为另一种优选的技术方案，所述第二荧光标记为死细胞标记物和总细胞标记物，所述死细胞标记物和总细胞标记物对应的激发光波长不同，所述至少一张第二荧光显微图像包括死细胞标记荧光显微图像和总细胞标记显微图像；对所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像、所述死细胞标记荧光显微图像和所述总细胞标记显微图像进行叠加合成分析并计数包括：

识别所述明场显微图像和所述总细胞标记显微图像中的细胞，并将所述第一荧光显微图像中的细胞判定为靶细胞，所述死细胞标记荧光显微图像中的细胞判定为效应细胞；

而后，标示所述靶细胞和效应细胞的位置，其中，

标示所述明场显微图像和/或所述总细胞标记显微图像中的细胞并统计数目，得到靶细胞和效应细胞总数；

标示同时存在于所述第一荧光显微图像和所述总细胞标记显微图像中的细胞并统计数目，得到靶细胞总数，标示同时存在于所述第一荧光显微图像和所述总细胞标记显微图像且不存在于死细胞标记荧光显微图像中的细胞并统计数目，得到活靶细胞数，标示同时存在于所述第一荧光显微图像、所述死细胞标记荧光显微图像和所述总细胞标记显微图像中的细胞并统计数目，得到死靶细胞数；

标示存在于所述总细胞标记显微图像且不存在于所述第一荧光显微图像中的细胞并统计数目，得到效应细胞总数，标示存在于所述总细胞标记显微图像且不存在于所述第一荧光显微图像和所述第二荧光显微图像中的细胞并统计数目，得到活效应细胞数，标示存在于所述死细胞标记荧光显微图像和所述总细胞标记显微图像中且不存在于第一荧光显微图像的细胞并统计数目，得到死效应细胞数。

进一步地，所述检测方法还包括将活靶细胞数和死靶细胞数之和与靶细胞总数进行比对，将活效应细胞和死效应细胞之和与效应细胞总数进行比对，根据对比结果确认细胞计数结果是否一致。

第二方面，本发明还提供一种细胞杀伤效力的检测系统，所述检测系统包括如下模块：

显微成像模块，用于获取共培养样品的显微图像，所述共培养样品为靶细胞与效应细胞共培养得到的细胞样品，所述靶细胞携带第一荧光标记，所述共培养样品至少使用一种第二荧光标记进行染色标记，所述第一荧光标记与所述第二荧光标记对应的激发光波长不同；所述共培养样品的显微图像包括经明场通道拍摄得到的明场显微图像、与所述第一荧光标记匹配的通道拍摄得到的第一荧光显微图像和与所述第二荧光标记匹配的通道拍摄得到的至少一张第二荧光显微图像；

分析处理模块，用于叠加合成分析所述显微图像并计数，得到所述共培养样品的图像分析处理结果及基于所述共培养样品的图像分析处理结果确定细胞杀伤效力。

进一步地，所述系统还包括：样品台模块，用于承载细胞培养板，所述细胞培养板有多个样品孔，用于承载至少两种效靶比的效应细胞和靶细胞，所述显微成像模块对所述细胞培养板上各孔中的共培养样品分别进行拍摄，得到各共培养样品的显微图像。

进一步地，所述系统还包括：样品自动更换模块，用于更新细胞培养板，再由显微成像模块对更新后的细胞培养板上的共培养样品进行拍摄，得到所述更新后的细胞培养板上的共培养样品的显微图像。

第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的检测方法或如第二方面所述的系统在检测细胞杀伤力和/或制备免疫细胞制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明的检测方法通过对靶细胞和效应细胞进行双荧光染色或三荧光染色，采用明场和适合荧光标记的显微荧光通道对同一视野下的细胞进行显微成像，将所得图像叠加合成分析，区分活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞，并结合荧光显微成像和图像合成分析方法，根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率；

(2)本发明提供的检测方法能够同时得到待测细胞的图像信息和数据处理结果，相比流式细胞仪提供的检测结果而言，所得结果更加直观，能在一台仪器上同时实现聚类分析和高内涵分析，得到细胞死亡率、细胞自伤率以及细胞特异杀伤率等多项数据，减少了检测步骤，提高了检测效率；且检测方法简单，适用范围较广。

附图说明

图1为实施例中使用的高通量细胞分析系统的结构示意图。

图2为本发明中所述细胞杀伤效力的检测方法的流程示意图。

图3为第一荧光标记匹配的通道FL1拍摄得到的荧光显微图像。

图4为第二荧光标记中死细胞染料匹配的通道FL2拍摄得到的荧光显微图像。

图5为第二荧光标记中总细胞染料匹配的通道FL3拍摄得到的荧光显微图像。

图6为通道FL1、通道FL2和通道FL3叠加后得到的荧光显微图像。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

本发明中，所使用的高通量细胞分析系统的结构如图1所示，具体包括：光源模块、显微成像模块、样品台模块、控制模块、分析处理模块及样品自动更换模块；

(1)所述分析处理模块与所述显微成像模块相连，用于分析处理显微成像装置采集的显微图像并进行计数，获取计数结果，计数结果包括但不仅限于：靶细胞和效应细胞总数、靶细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、效应细胞总数、活效应细胞数或死效应细胞数；

(2)所述控制模块分别与光源模块、样品台模块、显微成像模块及样品自动更换模块相连，分别控制光源通道、样品位置移动、显微成像设置及自动更换样品；

(3)所述光源模块包括明场光源和/或荧光光源，所述光源模块提供荧光激发光经样品台模块中的样品形成图像信息；

具体地，所述光源模块包括荧光光源组件以及用于支撑和移动荧光光源的荧光光源座；所述荧光光源组件包括滤光立方体和荧光发生单元；所述光源模块还包括与荧光光源相连的用于调节荧光光源位置的荧光光源电机；所述荧光光源电机与控制模块相连；

(4)所述显微成像模块采集样品台模块中样品的光学信息形成显微图像；所述显微成像模块包括物镜、管镜和相机；

(5)所述样品自动更换模块可以自动更换样品载板，对多块样品载板上的样品进行批量检测，可以24小时不间断工作，高效实现对样品的高通量检测。

若无特殊说明，本发明中所用反应试剂和实验耗材均可购自本领域常规生产厂商；同样的，若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域技术领域人员熟知的方法和手段。

本发明提供的细胞杀伤效力的检测方法的流程图如图2所示，具体如下：

S1、获取共培养样品的显微图像

高通量细胞分析系统获取样品台模块上细胞培养板中待测样品的显微图像，所述细胞培养板用于承载共培养样品，可以是单孔或多孔(如96孔、384孔等)的。该步骤具体包括：

S11、获取共培养样品的明场显微图像；

S12、获取共培养样品的第一荧光显微图像；

S13、获取共培养样品的第二荧光显微图像；

需要说明的是，S11、S12与S13之间的步骤可以按照实际操作顺序进行调整。

所述共培养样品为靶细胞与效应细胞混合共培养后得到的细胞样品，所述靶细胞携带第一荧光标记，所述共培养样品至少使用一种第二荧光标记进行染色标记。其中靶细胞与效应细胞可以按照不同的效靶比进行设置。

在一些实施例中，所述靶细胞为病毒感染的细胞，在另一些实施例中，所述靶细胞为肿瘤细胞(如K562细胞、Daudi细胞、Jurkat细胞、MCF-7细胞、A549细胞或HepG2细胞等)。所述第一荧光标记包括荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或荧光素酶(Luc))或荧光染料(如CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)或钙黄绿素AM(CalceinAM)等活性染料或核染料)。在使用荧光染料标记靶细胞的过程中，如果所选第一荧光标记容易产生背景荧光，需要在靶细胞与荧光标记共孵育后进行洗涤，如果所选试剂没有背景荧光或背景荧光不影响分析，可免除此步骤；

在一些实施例中，所述效应细胞为具有细胞杀伤效力的细胞，例如免疫细胞和免疫工程化细胞，包括但不限于PBMC细胞、NK细胞、T细胞、CTL细胞、LAK细胞、CIK细胞、TIL细胞、DC细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞或NK92MI-CD16a细胞。

在一些实施例中，所述第二荧光标记仅为死细胞染料(例如碘化丙啶(PI))，仅对共培养样品中的死细胞进行染色；在另一些实施例中，所述第二荧光标记包括死细胞染料和总细胞染料，所述总细胞染料能够对细胞培养板上的每一个细胞进行染色(例如Hoechst33342等核染料)；

在明场通道、与所述第一荧光标记匹配的通道和所述第二荧光标记匹配的通道下拍摄得到明场显微图像、第一荧光显微图像及至少一张第二荧光显微图像。

在一具体的实施例中，所述靶细胞为肿瘤细胞，携带染料CFSE，所述效应细胞为免疫细胞PBMC细胞，效靶比设置为1:1，所述第二荧光标记为PI染料；其对应的第一荧光标记匹配的通道为FL1：Ex 480nm，Em 535nm，对应的第二荧光标记匹配的通道为FL2：Ex 525nm，Em 600nm；

在一具体的实施例中，所述靶细胞为肿瘤细胞，携带染料CFSE，所述效应细胞为免疫细胞PBMC细胞，效靶比设置为1:1，所述第二荧光标记包括PI染料(死细胞染料)和Hoechst33342(总细胞染料)；其对应的第一荧光标记匹配的通道为FL1：Ex 480nm，Em535nm，在该通道下拍摄得到的图片如图3所示，对应的第二荧光标记中死细胞染料匹配的通道为FL2：525nm，Em 600nm，在该通道下拍摄得到的图片如图4所示；对应的第二荧光标记中总细胞染料匹配的通道为FL3：Ex 375nm，Em 460nm，在该通道下拍摄得到的图片如图5所示；

S2、叠加合成分析所得显微图像并计数

对所得共培养样品的显微图像进行叠加合成分析并计数，得到包括靶细胞和效应细胞总数、靶细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、效应细胞总数、活效应细胞数或死效应细胞数在内的图像处理结果。

在一具体的实施例中，所述第一荧光标记为染料CFSE，所述第二荧光标记为死细胞染料PI，该方法中使用两种染料进行染色，因此称为“双染法”；在明场通道、与染料CFSE匹配的荧光通道和与染料PI匹配的荧光通道下获得显微图像后，对上述显微图像进行叠加合成分析并计数。具体包括：

(I)明场显微图像中的细胞为靶细胞与效应细胞，在所述明场显微图像下，能够区分细胞和杂质，并对靶细胞与效应细胞的总数进行计数；

(II)染料CFSE通道下的第一荧光显微图像中的细胞为靶细胞(包含活的与死的靶细胞)；

(III)染料PI匹配的第二荧光显微图像中的细胞为死细胞(包含死靶标细胞和死效应细胞；

(IV)叠加合成分析后，对细胞所在的位置进行标示；

对存在于第一荧光显微图像和明场显微图像且胞不存在于第二荧光显微图像中的细胞(仅有染料CFSE信号)进行标示并统计数目为a，a为活靶细胞数；对同时存在于第一荧光显微图像、第二荧光显微图像和明场显微图像中的细胞(有染料CFSE和染料PI信号)进行标示并统计数目为b，b为死靶细胞数；

对仅存在于明场显微图像中的细胞(无荧光信号)所在的位置进行标示，并统计数目为c，c为活效应细胞数；对存在于第二荧光显微图像和明场显微图像但不存在于第一荧光显微图像中的细胞(仅有染料PI信号)进行标示并统计数目为d，d为死效应细胞数。

此外，在一些实施例中，靶细胞总数可以通过图像叠加合成分析得知，即存在于所述第一荧光显微图像中和所述明场显微图像中的细胞判定为靶细胞并计数得到靶细胞总数；在另一些实施例中，也可以通过活靶细胞数和死靶细胞数相加得到；或者通过两种方式得到靶细胞总数并比较两种方式得到的结果是否一致，进而对图像分析结果的准确性进行判断；同样的，对于效应细胞总数而言，可以通过对存在于所述明场显微图像且不存在于所述第一荧光显微图像中的细胞判定为效应细胞并计数得到效应细胞总数，或者通过活效应细胞数和死效应细胞数相加得到，或者两者方式结合得到。

在另一具体的实施例中，所述第一荧光标记为染料CFSE，所述第二荧光标记包括死细胞染料PI和总细胞染料Hoechst33342，该方法中使用三种染料进行染色，因此称为“双染法”；在明场通道、与染料CFSE匹配的荧光通道、与染料PI匹配的荧光通道和与染料Hoechst33342匹配的荧光通道下获得显微图像后，对上述显微图像进行叠加合成分析并计数。具体包括：

(I)明场显微图像和染料Hoechst33342通道下的第二荧光显微图像中的细胞为靶细胞与效应细胞，在明场显微图像下，能够区分细胞和杂质，并对靶细胞与效应细胞的总数进行计数；使用总细胞染料Hoechst33342对所有细胞进行染色，相比较双染法，具有更高的精确度，能够避免与细胞较为相像的杂质的干扰；

(IV)叠加合成上述显微图像后得到混合图像(如图6)并进行分析，对细胞所在的位置进行标示；

对存在于明场显微图像、第一荧光显微图像、染料Hoechst33342匹配的第二荧光显微图像但不存在于染料PI匹配的第二荧光显微图像中的细胞(含有染料CFSE和染料Hoechst33342的信号)进行标示，并统计数目为a，a为活靶细胞数；

对同时存在于第一荧光显微图像、染料PI匹配的第二荧光显微图像、染料Hoechst33342匹配的第二荧光显微图像和明场显微图像中的细胞(含有染料CFSE、染料PI和染料Hoechst33342的信号)进行标示并统计数目为b，b为死靶细胞数；

对仅存在于明场显微图像和染料Hoechst33342匹配的第二荧光显微图像中的细胞(含有染料Hoechst33342的信号)所在的位置进行标示，并统计数目为c，c为活效应细胞数；

对存在于染料PI匹配的第二荧光显微图像、染料Hoechst33342匹配第二荧光显微图像和明场显微图像但不存在于第一荧光显微图像中的细胞(含有染料PI和染料Hoechst33342的信号)进行标示并统计数目为d，d为死效应细胞数。

与双染法相同的，在一些实施例中，靶细胞总数可以通过图像叠加合成分析得知，即将存在于所述明场显微图像、第一荧光显微图像中和染料Hoechst33342匹配第二荧光显微图像中的细胞判定为靶细胞，并计数得到靶细胞总数；在另一些实施例中，也可以通过活靶细胞数和死靶细胞数相加得到；或者通过两种方式得到靶细胞总数并比较两种方式得到的结果是否一致，进而对图像分析结果的准确性进行判断；同样的，对于效应细胞总数而言，可以通过对存在于明场显微图像、染料PI匹配第二荧光显微图像、染料Hoechst33342匹配第二荧光显微图像且不存在于所述第一荧光显微图像中的细胞判定为效应细胞并计数得到效应细胞总数，或者通过活效应细胞数和死效应细胞数相加得到，或者两者方式结合得到。

S3、确定细胞杀伤效力

基于图像叠加合成分析的结果确定效应细胞的杀伤效力。具体地，包括计算靶细胞死亡率和效应细胞死亡率；

所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：

靶细胞死亡率＝死靶细胞数/(活靶细胞数+死靶细胞数)×100％；

所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：

在一些的实施例中，a为活靶细胞数，b为死靶细胞数，靶标细胞死亡率(％)＝b/(a+b)×100；c为活效应细胞数，d为死效应细胞数，效应细胞死亡率(％)＝c/(c+d)×100；

此外，在一些实施例中，还设置了对照靶细胞组和对照效应细胞组，采用同样的方式得到显微图像并进行叠加合成分析，得到对照组靶细胞死亡率和对照组效应细胞死亡率；根据所述对照组靶细胞死亡率和对照组效应细胞死亡率得到细胞特异杀伤率和效应细胞自伤率；在设置对照的情况下，排除细胞自然死亡等情况对细胞杀伤效力检测结果的影响，提高检测精确度。

其中，细胞特异杀伤率＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率；

效应细胞自伤率＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。

综上所述，本发明的检测方法通过对靶细胞和效应细胞进行双荧光染色或三荧光染色，采用明场和适合荧光标记的显微荧光通道对同一视野下的细胞进行显微成像，将所得图像叠加合成分析，区分活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞，并结合荧光显微成像和图像合成分析方法，根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率；所得结果更加直观准确。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种细胞杀伤效力的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

所述靶细胞携带第一荧光标记，

所述共培养样品至少使用一种第二荧光标记进行染色标记，

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述计数后得到的计数结果包括：靶细胞和效应细胞总数、靶细胞总数、活靶细胞数、死靶细胞数、效应细胞总数、活效应细胞数或死效应细胞数中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，还包括：根据所述计数结果得到所述靶细胞死亡率和效应细胞死亡率；

所述靶细胞死亡率采用如下公式进行计算：

所述效应细胞死亡率采用如下公式进行计算：

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括获取对照组靶细胞的显微图像并计算对照组靶细胞死亡率，所述检测结果还包括细胞特异杀伤率，

其中，所述细胞特异杀伤率采用如下公式进行计算：

细胞特异杀伤率＝靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括获取对照组效应细胞的显微图像并计算对照组效应细胞死亡率，所述检测结果还包括效应细胞自伤率，

其中，所述效应细胞自伤率采用如下公式进行计算：

效应细胞自伤率＝效应细胞死亡率-对照组效应细胞死亡率。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二荧光标记为死细胞标记物，所述第二荧光显微图像为死细胞标记荧光显微图像，对所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像及所述死细胞标记荧光显微图像进行叠加合成分析并计数包括：

而后，标示所述靶细胞和效应细胞的位置，其中，

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二荧光标记为死细胞标记物和总细胞标记物，所述死细胞标记物和总细胞标记物对应的激发光波长不同，所述至少一张第二荧光显微图像包括死细胞标记荧光显微图像和总细胞标记显微图像，对所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像、所述死细胞标记荧光显微图像和所述总细胞标记显微图像进行叠加合成分析并计数包括：

识别所述明场显微图像和/或所述总细胞标记显微图像中的细胞，并将所述第一荧光显微图像中的细胞判定为靶细胞，所述死细胞标记荧光显微图像中的细胞判定为效应细胞；

而后，标示所述靶细胞和效应细胞的位置，其中，

8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：

将所述活靶细胞数和所述死靶细胞数之和与所述靶细胞总数进行比对，将所述活效应细胞和所述死效应细胞之和与所述效应细胞总数进行比对，根据对比结果确认细胞计数结果是否一致。

9.一种细胞杀伤效力的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括如下模块：

分析处理模块，用于叠加合成分析所述显微图像并计数，得到所述共培养样品的计数结果及基于所述共培养样品的计数结果确定细胞杀伤效力。

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述系统还包括：

样品台模块，用于承载细胞培养板，所述细胞培养板有多个样品孔，用于承载至少两种效靶比的效应细胞和靶细胞，所述显微成像模块对所述细胞培养板上各孔中的共培养样品分别进行拍摄，得到各共培养样品的显微图像。

11.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，所述系统还包括：

样品自动更换模块，用于更新所述细胞培养板，再由所述显微成像模块对更新后的细胞培养板上的共培养样品进行拍摄，得到所述更新后的细胞培养板上的共培养样品的显微图像。

12.如权利要求1～8任一项所述的检测方法或如权利要求9～11所述的系统在检测细胞杀伤力和/或制备免疫细胞制剂中的应用。