CN110542675B - 细胞凋亡检测方法及细胞凋亡检测试剂盒 - Google Patents

细胞凋亡检测方法及细胞凋亡检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细胞凋亡检测方法及细胞凋亡检测试剂盒，包括以下步骤：使用第一荧光染料和第二荧光染料对待测细胞样本进行染色，得到染色后细胞样本，然后对染色后细胞样本进行荧光检测分析，得到待测细胞样本的细胞凋亡结果；其中，第一荧光染料为R‑C6‑D(OMe)E(OMe)VD(OMe)‑FMK，R为荧光基团；第二荧光染料能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色；第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。该检测方法可快速区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞和正常活细胞，而且对细胞亚群的区分灵敏度更高，能够用于高通量筛选分析，图像目标物分割方式的难度较低。

Description

细胞凋亡检测方法及细胞凋亡检测试剂盒
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，特别是涉及一种细胞凋亡检测方法及细胞凋亡检测试剂盒。
背景技术
细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。
目前，检测细胞凋亡的手段有很多，包括Annexin V/PI复合分析法、TUNEL法、DNAladder法、线粒体膜电位分析法等诸多方法。例如，将谷胱甘肽硫转移酶(GST)与人膜联蛋白V(Annexin V)偶联形成一种重组融合蛋白GPPAN-V，GPPAN-V重组融合蛋白与荧光素异硫氰酸酯(FITC)进行化学偶联后形成可用于细胞凋亡检测的检测试剂FITC-GPPAN-V。GPPAN-V的制备相对于人膜联蛋白V的制备更容易，成本更低，且FITC-GPPAN-V和PI的双标也可区分早期凋亡(early apoptosis)和晚期凋亡(late apoptosis)的状态，达到和双标人膜联蛋白V-FITC和PI相同的效果。但是，该方法无法区分细胞晚期凋亡和坏死(necrosis)的状态，灵敏度不高，也仅适用于流式细胞仪，不适用于大规模的高通量筛选。而TUNEL及DNAladder法仅能分析处于晚期凋亡的细胞亚群，线粒体膜电位分析法则无法区分早期凋亡和晚期凋亡的细胞。
发明内容
基于此，有必要提供一种能区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞和正常活细胞、灵敏度高且适用于高通量筛选的细胞凋亡检测方法。
一种细胞凋亡检测方法，包括以下步骤：
使用第一荧光染料和第二荧光染料对待测细胞样本进行染色，得到染色后细胞样本，然后对所述染色后细胞样本进行荧光检测分析，得到所述待测细胞样本的细胞凋亡结果；
其中，所述第一荧光染料能够对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，所述第一荧光染料为R-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，R为荧光基团；所述第二荧光染料能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色；所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的发射波长互不相同。
Caspase为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specificproteinase)，是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，Caspase与真核细胞凋亡密切相关，参与细胞的生长、分化与凋亡调节。本发明的细胞凋亡检测方法中，第一荧光染料对于凋亡细胞具有通透性，作为底物类似物能够不可逆地结合激活的caspase-3/7，从而对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，且第一荧光染料具有三个位点的甲酯化修饰，疏水性较强，使其更容易跨过膜双分子层，从而可提高检测的信噪比和灵敏度。通过将第一荧光染料与能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色的第二荧光染料配合使用对待测细胞样本进行染色，然后通过荧光检测分析即可快速区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞和正常活细胞，而且对细胞亚群的区分灵敏度更高，能够用于高通量筛选分析，图像目标物分割方式的难度较低，扩大了适用平台。
在其中一个实施例中，所述第一荧光染料为FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK或TF3-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，所述第二荧光染料为PI、7-AAD、TO-PRO-3或PO-PRO-1。
在其中一个实施例中，所述第一荧光染料为FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，所述第二荧光染料为PI。
在其中一个实施例中，所述染色的步骤包括：分别使用所述第一荧光染料和所述第二荧光染料配制得到第一染色液和第二染色液，分别使用所述第一染色液和所述第二染色液孵育所述待测细胞样本。
在其中一个实施例中，所述第一荧光染料的工作浓度为2μg/mL～6μg/mL，所述第二荧光染料的工作浓度为1.5μg/mL～3.5μg/mL。
在其中一个实施例中，使用所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和第三荧光染料对待测细胞样本进行染色，得到染色后细胞样本；所述第三荧光染料能够对正常活细胞进行染色，所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和所述第三荧光染料的发射波长互不相同。
在其中一个实施例中，所述染色的步骤包括：混合所述第一荧光染料和所述第三荧光染料以制备混合染色液，使用所述第二荧光染料以制备第二染色液，分别使用所述混合染色液和所述第二染色液孵育所述待测细胞样本。
在其中一个实施例中，所述第三荧光染料为Hoechst 33342或者DRAQ5，所述第三荧光染料的工作浓度为1μg/mL～3μg/mL。
在其中一个实施例中，所述荧光检测分析使用荧光显微镜进行，所述荧光检测分析包括以下步骤：分别在对应的荧光通道检测所述染色后细胞样本中所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和所述第三荧光染料的信号，并对观察到的图像进行采集保存；或
所述荧光检测分析使用高内涵成像分析系统进行，所述荧光检测分析包括以下步骤：分别在对应的激发光通道检测所述染色后细胞样本中所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和所述第三荧光染料的信号，并对观察到的图像进行采集保存。
本发明还提供了一种细胞凋亡检测试剂盒，至少包括第一荧光染料和第二荧光染料；所述第一荧光染料能够对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，所述第一荧光染料为R-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，R为荧光基团；所述第二荧光染料能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色；所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的发射波长互不相同。
当所述细胞凋亡检测试剂盒应用于流式细胞仪中时，包括有第一荧光染料和第二荧光染料，所述细胞凋亡检测试剂盒至少包括有如下荧光染料的组合之一：FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/PI、FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/7-AAD、FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/TO-PRO-3、TF3-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/TO-PRO-3、FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/PO-PRO-1、TF3-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/PO-PRO-1和TF3-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/PI；同一组合中，各荧光染料的发射波长各不相同。
当所述细胞凋亡检测试剂盒应用于荧光显微镜或者高内涵成像分析系统中时，还包括有第三荧光染料，所述第三荧光染料能对正常活细胞进行染色。所述细胞凋亡检测试剂盒至少包括有如下荧光染料的组合之一：FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/PI/Hoechst33342、FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/7-AAD/Hoechst33342、FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/TO-PRO-3/Hoechst33342、TF3-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/TO-PRO-3/Hoechst33342、FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/PO-PRO-1/DRAQ5和TF3-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK/PO-PRO-1/DRAQ5；同一组合中，各荧光染料的发射波长各不相同。
附图说明
图1为实施例1通过高内涵成像分析系统对经过不同染色操作的细胞样本进行检测分析的示意图；
图2为实施例2中两种染色方式的流式细胞仪检测结果图；
图3为实施例3中Hela细胞的凋亡分析结果；
图4为实施例4中Hela细胞的凋亡分析结果，纵坐标为细胞频率(cellfrequency)；
图5为实施例3中A549细胞的凋亡分析结果；
图6为实施例4中A549细胞的凋亡分析结果，纵坐标为细胞频率(cellfrequency)，N.S.表示无显著差异；
图7为实施例4中A549、MDA231、MHCC97H、HepG2、HOS细胞样本的流式细胞仪检测结果图；
图8为实施例4中MDA231细胞样本的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道、细胞核(Nucleus)和合并图(Merge)；
图9为实施例4中Hela细胞样本的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道、细胞核(Nucleus)和合并图(Merge)；
图10为实施例4中Hela细胞样本在放大40倍后的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道、细胞核(Nucleus)和合并图(Merge)；
图11为实施例4中A549细胞样本的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道、细胞核(Nucleus)和合并图(Merge)；
图12为实施例4中HepG2细胞样本的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道、细胞核(Nucleus)和合并图(Merge)；
图13为实施例4中MHCC97H细胞样本的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道、细胞核(Nucleus)和合并图(Merge)；
图14为实施例5中染色后分别放置0h、0.5h、1h和1.5h的细胞样本的流式细胞仪检测结果图；
图15为实施例6中本发明试剂盒与普通试剂盒分别贮存0日和90日后的凋亡检测效果对比图；
图16为对比例1中针对Hela细胞样本的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道和Hoechst33342通道；
图17为对比例1中针对HepG2细胞样本的高内涵成像系统分析结果图，包括FITC通道、PI通道和Hoechst33342通道；
图18为对比例2中针对A549、Hela、HepG2细胞样本的流式细胞仪检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的一种细胞凋亡检测方法，包括以下步骤：
使用第一荧光染料和第二荧光染料对待测细胞样本进行染色，得到染色后细胞样本，然后对染色后细胞样本进行荧光检测分析，得到待测细胞样本的细胞凋亡结果。
其中，第一荧光染料能够对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，第一荧光染料为R-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，R为荧光基团；第二荧光染料能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色；第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。
Caspase为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specificproteinase)，是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，Caspase与真核细胞凋亡密切相关，参与细胞的生长、分化与凋亡调节。本实施例的细胞凋亡检测方法中，第一荧光染料对于凋亡细胞具有通透性，作为底物类似物能够不可逆地结合激活的caspase-3/7，从而对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，且第一荧光染料具有三个位点的甲酯化修饰，疏水性较强，使其更容易跨过膜双分子层，从而可提高检测的信噪比和灵敏度。通过将第一荧光染料与能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色的第二荧光染料配合使用对待测细胞样本进行染色，然后通过荧光检测分析即可快速区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞和正常活细胞，而且对细胞亚群的区分灵敏度更高，能够用于高通量筛选分析，图像目标物分割方式的难度较低，扩大了适用平台。
在一个具体示例中，第一荧光染料为FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK或TF3-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，第二荧光染料为PI、7-AAD、TO-PRO-3或PO-PRO-1。其中，FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FM由488nm激发，检测范围为500nm～530nm；TF3-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK由561nm激发，检测范围为580nm～630nm；PI由488nm或535nm激发，检测范围为600nm～650nm；7-AAD由561nm激发，检测范围为610nm～680nm；TO-PRO-3由642nm激发，检测范围为650nm～680nm；PO-PRO-1由405nm激发，检测范围为430nm～480nm。
在一个具体示例中，第一荧光染料为FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，第二荧光染料为PI，检测效果最佳。
在一个具体示例中，染色的步骤包括：分别使用第一荧光染料和第二荧光染料配制得到第一染色液和第二染色液，分别使用第一染色液和第二染色液孵育待测细胞样本。
在一个具体示例中，第一荧光染料的工作浓度为2μg/mL～6μg/mL，第二荧光染料的工作浓度为1.5μg/mL～3.5μg/mL。
在一个具体示例中，使用三种荧光染料即第一荧光染料、第二荧光染料和第三荧光染料对待测细胞样本进行染色，得到染色后细胞样本。第三荧光染料能够对正常活细胞进行染色，且第一荧光染料、第二荧光染料和第三荧光染料的发射波长互不相同。在一个具体示例中，第三荧光染料为Hoechst 33342或DRAQ5，工作浓度为1μg/mL～3μg/mL，Hoechst33342由405nm激发，检测范围为430nm～480nm，DRAQ5由642nm激发，检测范围为650～710nm。如此，通过第三荧光染料将正常活细胞也染色，可适用于普通荧光显微镜和高内涵成像分析系统，而使用流式细胞仪时则不需要使用第三荧光染料。
在一个具体示例中，荧光检测分析使用荧光显微镜进行，荧光检测分析包括以下步骤：针对不同类型的第一荧光染料在绿色通道或橙黄色通道中检测染色后细胞样本中该荧光染料的信号；针对不同类型的第二荧光染料在红色通道或蓝色通道中检测染色后细胞样本中该荧光染料的信号；针对不同类型的第三荧光染料在蓝色通道或远红外通道中检测染色后细胞样本中该荧光染料的信号，并对观察到的图像进行采集保存。
在一个具体示例中，荧光检测分析使用高内涵成像分析系统进行，荧光检测分析包括以下步骤：在488nm或561nm激发光通道检测染色后细胞样本中不同类型的第一荧光染料的信号，在488nm、405nm、561nm或642nm激发光通道检测染色后细胞样本中不同类型的第二荧光染料的信号，以及在405nm或642nm激发光通道检测染色后细胞样本中不同类型的第三荧光染料的信号，并对观察到的图像进行采集保存。可以理解，荧光检测平台不限于此，可根据需要进行选择，并可根据荧光检测平台和荧光染料调整荧光检测分析的步骤。
在一个具体示例中，待测细胞样本为Hela、A549、MDA231、MHCC97H、HepG2、HOS细胞系中的一种或多种。
本发明一实施例的细胞凋亡检测试剂盒，包括上述第一荧光染料和第二荧光染料。
在一个具体示例中，还可以包括上述第三荧光染料、DMSO(二甲基亚砜)和PBS缓冲液中的一种或多种。
在一个具体示例中，细胞凋亡检测试剂盒中第一荧光染料为粉剂，使用前需要先通过缓冲液进行溶解，第二荧光染料和第三荧光染料以溶液的方式贮存，第一荧光染料溶解后的浓度为1μg/μL～4μg/μL、第二荧光染料和第三荧光染料的贮存浓度为0.1μg/μL～1μg/μL和0.1μg/μL～0.3μg/μL。
本实施例的细胞凋亡检测试剂盒中，第一荧光染料对于凋亡细胞具有通透性，作为底物类似物能够不可逆地结合激活的caspase-3/7，从而对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，且第一荧光染料具有三个位点的甲酯化修饰，疏水性较强，使其更容易跨过膜双分子层，从而可提高检测的信噪比和灵敏度。通过将第一荧光染料与能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色的第二荧光染料配合使用对待测细胞样本进行染色，然后通过荧光检测分析即可快速区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞和正常活细胞，而且对细胞亚群的区分灵敏度更高，能够用于高通量筛选分析，图像目标物分割方式的难度较低，扩大了适用平台。
以下为具体实施例，其中第一荧光染料使用上海楚肽生物科技有限公司生产的FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，是一种结构简单、性质稳定的四肽，相对分子质量为1036.35g/mol，第二荧光染料使用Sigma-Aldrich生产的PI(碘化丙啶)，第三荧光染料使用Sigma-Aldrich生产的Hoechst 33342(烟酸己可碱33342)。FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK的结构如下所示：
Figure BDA0002223046930000101
实施例1：本发明的细胞凋亡检测方法和依赖Annexin/PI共染方法基于成像效果角度的对比
本实施例使用A549细胞进行，但本发明的细胞凋亡检测方法不仅仅适用于A549细胞，仅在此以A549细胞为例以作说明。
细胞培养：取对数生长期的细胞，以每孔一定的细胞数目接种于96孔板中(4×103～1×105/孔，根据不同细胞类型)，每孔体积150μL，在37℃培养箱中培养24h，待第二天细胞汇集度达到50％左右进行细胞处理。
细胞处理：将细胞分为4组，其中2组为对照组，2组为凋亡诱导组。对对照组不做任何处理，对凋亡诱导组采用凋亡诱导剂十字孢碱(staurosporine，STS)进行凋亡诱导，即用含2μM STS的细胞培养基处理细胞20h。
细胞染色：使用DMSO溶解稀释第一荧光染料配制成2μg/μL的第一荧光染料溶液，第二荧光染料溶液的浓度为500μg/mL，第三荧光染料溶液的浓度为200μg/mL。然后用细胞培养基分别按照1:500、1:100稀释第一荧光染料溶液和第三荧光染料溶液并混合以得到第一染色液，用细胞培养基按照1:200稀释第二荧光染料溶液以得到第二染色液。将第一染色液加入其中1组对照组细胞样本避光孵育30min～60min，之后离心弃掉第一染色液。然后加入50μL第二染色液，进行避光孵育3min，之后弃掉第二染色液并用PBS清洗细胞，更换为新鲜培养基。对其中1组凋亡诱导组细胞样本进行同样的细胞染色操作。
对另外1组对照组细胞样本和另外1组凋亡诱导组细胞样本分别使用传统的依赖于Annexin V的染色方式进行细胞染色操作。步骤如下：将细胞样本小心地用结合缓冲液清洗一遍后，用50μL结合缓冲液稀释的Annexin V-FITC(1:80)及Hoechst 33342(1:100)染色液在室温避光条件下孵育细胞20min，再按照1:200使用结合缓冲液稀释PI染色液并在室温下孵育3min，之后弃掉PI染色液并用PBS清洗细胞，更换为新鲜培养基。
荧光检测分析：使用高内涵分析系统对以上4组经染色处理后的细胞样本分别进行检测分析。以In Cell Analyzer 6500HS为例，打开In Cell Analyzer 6500HS程序，载入操作界面，建立图像采集的protocol，选择配套的细胞板，根据实验需求选择合适的物镜后根据实验需求设置激发光及相应检测通道，激发光和检测通道设置为：405nm激发的蓝色激发光通道、488nm激发的橙色激发光通道以及488nm激发的远红激发光通道，并通过硬件和软件聚焦找到用于拍照分析的视野，进而根据图像像素设置合适的曝光时间及激光器功率确保图像value值小于20000。最后根据实验需求设置待扫描的视野个数及扫描方式，完成自动聚焦后即可进行全部样品的图像收集工作。两种染色方式图像及其目标物分割方式如图1所示，其中仅显示蓝色的为正常活细胞，显示绿色的为早期凋亡或晚期凋亡细胞，显示红色的为坏死或晚期凋亡细胞。根据图1可知，在同样的成像视野中，由于Annexin V只能对细胞膜进行染色，故细胞显示的颗粒度不够高，而FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK为全细胞染色，其染色信号可以与细胞核通道重叠，故通过本发明检测方法得到的图像其目标物分割法可以采用全细胞分析，相对于依赖Annexin V的膜分析方法更精确简便，背景干扰更低，且适合于较低倍镜下细胞数目较多的实验数据分析。
实施例2：本发明的细胞凋亡检测方法和依赖Annexin V/PI共染方法基于亚群分析灵敏度角度的对比
本实施例使用Hela细胞进行，但本发明的细胞凋亡检测方法不仅仅适用于Hela细胞，仅在此以Hela细胞为例以作说明。
细胞培养：以每孔一定的细胞数目接种于24孔板中(5×104～2×105/孔，根据不同细胞类型)，每孔体积500μL。
细胞处理：将细胞分为6组，其中2组为对照组，2组为饥饿处理组，2组为凋亡诱导组。对对照组不做任何处理，对饥饿处理组采用PBS替代细胞培养基培养细胞20h，对凋亡诱导组采用凋亡诱导剂十字孢碱(staurosporine，STS)进行凋亡诱导，即用含2μM STS的细胞培养基处理细胞20h。
细胞染色：使用DMSO溶解稀释第一荧光染料配制成2μg/μL的第一荧光染料溶液，用细胞培养基按照1:100稀释得到第一染色液，不需要添加第三荧光染料，用细胞培养基按照1:200稀释第二荧光染料溶液以得到第二染色液。将第一染色液直接加入其中1组对照组细胞样本避光孵育约30min～60min，之后离心弃掉第一染色液，再往该细胞样本中加入400μL第二染色液，进行避光孵育约3min，孵育结束后直接上机。对其中1组饥饿处理组、1组凋亡诱导组的细胞样本均分别采取同样的细胞染色方式。
对另1组对照组、另1组饥饿处理组、另1组凋亡诱导组的细胞均分别采用传统的依赖Annexin V的染色方式进行细胞染色操作。步骤如下：将细胞样本小心用结合缓冲液清洗一遍后，用400μL结合缓冲液按照1:80稀释Annexin V-FITC染色液后在冰上避光条件下孵育该细胞样本15min，孵育结束后每个样本加入2μL的第二荧光染料溶液避光孵育3min，孵育结束后直接上机。
荧光检测分析：使用流式细胞仪对以上6组经染色后的细胞样本分别进行检测分析，具体而言，通过对实验数据的FITC(FL1)和PI(FL3)通道信号进行分析，将每组细胞样本划分为4种群，其中FITC阳性/PI阴性群为早期凋亡群，FITC阳性/PI阳性群为晚期凋亡群，FITC阴性/PI阳性群为坏死群，而FITC阴性/PI阴性则为健康活细胞群。两种染色方式的流式细胞仪分析结果如图2所示，其中UL区为细胞坏死，LL区为细胞存活，LR区早期凋亡，UR区为晚期凋亡，control为对照组，STS为凋亡诱导组，Starvation为饥饿处理组。可见本发明的方法相对于依赖Annexin V/PI共染的方法对细胞亚群分析的灵敏度更好，界限更显著，尤其是对早期凋亡和坏死的细胞群的区分。
实施例3：本发明细胞凋亡检测方法的数据有效性的研究
本实施例作用于Hela细胞和A549细胞。每种细胞均分为16组，其中8组为对照组，8组为饥饿处理组，对饥饿处理组使用HBSS替代细胞培养基孵育细胞20h，然后采用实施例2中本发明的染色方式进行染色。使用流式细胞仪对经细胞染色操作的16组细胞样本分别检测分析，以用于计算mean±3SD区间以及Z’factor。其中Hela细胞及A549细胞的数据有效性试验相关结果如图3～6所示，结果均未出现离群值。对于Hela细胞，mean±3SD(对照组早期凋亡)为[3.53,4.71]，mean±3SD(饥饿处理组早期凋亡)为[35.16,40.95]，mean±3SD(对照组晚期凋亡)为[0.01,0.64]，mean±3SD(饥饿处理组晚期凋亡)为[9.61,10.90]，mean±3SD(对照组坏死)为[0.47,1.51]，mean±3SD(饥饿处理组坏死)为[2.00,3.65]，Z’factor(早期凋亡)＝0.897，Z’factor(晚期凋亡)＝0.904，Z’factor(坏死)＝0.270；从Bonferroni事后检测中可知，P值＜0.001，说明具有极显著的统计学差异，具有统计学意义。对于A549细胞，mean±3SD(对照组早期凋亡)为[1.05,2.62]，mean±3SD(饥饿处理组早期凋亡)为[8.54,11.03]，mean±3SD(对照组晚期凋亡)为[0.17,0.85]，mean±3SD(饥饿处理组晚期凋亡)为[9.62,12.25]，mean±3SD(对照组坏死)为[0,2.35]，mean±3SD(饥饿处理组坏死)为[0.81,1.71]，Z’factor(早期凋亡)＝0.745，Z’factor(晚期凋亡)＝0.842，Z’factor(坏死)＜0.5，这是由于饥饿处理组的处理条件不足以诱导A549细胞发生坏死，不足以作为坏死的阳性诱导条件；从Bonferroni事后检测中可知，早期凋亡组和晚期凋亡组的P值＜0.001，说明具有极显著的统计学差异，具有统计学意义，坏死组的P值＞0.05，这是由于饥饿处理组的处理条件不足以诱导A549细胞发生坏死，故对于A549细胞而言此处不具有统计学意义。可见关于细胞凋亡的Z’factor值均＞0.5，说明可对细胞凋亡状态做出准确的判断，表明该检测方法能够用于高通量筛选分析。虽然Z’factor(坏死)＝0.270＜0.5，但是由于前期是使用HBSS诱导细胞凋亡而非坏死，因此该值小于0.5属于正常情况，且在实际操作中，一般更关注的为是否能够准确判断细胞凋亡状态。
实施例4：本发明细胞凋亡检测方法的再现性的研究
本实施例作用于Hela、A549、MHCC97H、HepG2、HOS、MDA231多种细胞系。本实施例分别采用不同细胞系以每孔一定的细胞数目接种于96孔板(高内涵分析平台)或24孔板(流式细胞仪分析平台)中，每种细胞均分为4组，其中1组为对照组，1组为饥饿处理组，1组为凋亡诱导组(4h)，1组为凋亡诱导组(20h)，凋亡诱导组(4h)即采用含STS的细胞培养基处理细胞4h。后续细胞处理、染色及分析均与上述实施例1或2类似。其中，流式细胞仪分析结果如图7所示，In Cell Analyzer 6500HS高内涵平台分析结果如图8～13所示。可见，本发明的细胞凋亡检测方法能够显著区分细胞的凋亡状态、适用于多种细胞系的研究，具有一定的再现性。
实施例5：关于第一荧光染料细胞标记后稳定性的研究
将培养的Hela细胞分为8组，其中4组为对照组，4组为饥饿处理组。经过细胞染色操作(与实施例2中本发明的染色方式相同)并放置0h、0.5h、1h、1.5h后再通过流式细胞仪进行检测分析。结果如图14所示，染料PI随着放置时间的延长信号会有所衰减，但是依然可以显著分群，而FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK检测通道基本没有变化，因此本发明的细胞凋亡检测方法及细胞凋亡检测试剂盒的检测结果更加稳定，检测信号可以稳定地持续一定时间。
实施例6：关于第一荧光染料的储存稳定性研究
将培养的Hela细胞分为8组，其中4组为对照组，4组为饥饿处理组。使用DMSO溶解第一荧光染料得到第一荧光染料溶液，之后分别静置贮存0日及90日后，再参照实施例2对其中2组对照组和2组饥饿处理组的细胞进行染色操作，对另2组对照组和另2组饥饿处理组的细胞不作染色操作，然后通过流式细胞仪分别对细胞进行检测分析，可得到如图15所示的对比图，横坐标为在第一荧光通道下的荧光强度，纵坐标为细胞总数，在V1-L区域的为阴性峰，在V1-R区域的为阳性峰。可以看出，尽管FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK经过一段时间的贮存，但是检测到经其处理的细胞信号强度基本未衰减，相对于对照组仍能够明显检测到阳性峰，阳性峰与阴性峰之间分隔较开，且比率基本保持不变，能够明显地区分凋亡细胞和正常细胞，而依赖于Annexin V的普通试剂盒一般储存时间为90天。因此，本发明的细胞凋亡检测试剂盒具有一定的贮存稳定性。
对比例1
本对比例中分别采用不具有三个位点甲酯化修饰的FITC-DEVD-FMK和经甲酯化修饰的FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK作为第一荧光染料，配合第二荧光染料和第三荧光染料分别对不同细胞进行染色；本对比例作用于A549、Hela、HepG2细胞；细胞均分为经STS诱导凋亡处理的凋亡诱导组和未经任何处理的对照组。
如图16、17所示，对不同细胞采用高内涵分析平台进行检测分析，可以看出，FITC-DEVD-FMK实验组在质膜上会存在较强的干扰，不利于图像数据的分析，相比之下，经过甲酯化修饰的FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，其信号完全分布在胞内，其目标物分割方式较简单，便于对图像数据的精确定量分析。
对比例2
本对比例中分别采用不具有三个位点甲酯化修饰的FITC-DEVD-FMK和经甲酯化修饰的FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK作为第一荧光染料，配合第二荧光染料分别对不同细胞进行染色；本对比例作用于A549、Hela、HepG2细胞；细胞均分为经STS诱导凋亡处理的凋亡诱导组、经长春新碱(Vincristine,VCR)处理的另一诱导凋亡组和未经任何处理的对照组。采用2种凋亡诱导凋亡试剂对不同细胞进行诱导凋亡并检测分析，这样更可充分证明经甲酯化修饰的第一荧光染料更能明显区分凋亡细胞。
如图18所示，对不同细胞采用流式细胞仪进行检测分析，可以看出，FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK相比FITC-DEVD-FMK，在FITC通道(FL1)阴性群与阳性群的区分度更加明显。因此，采用三个位点甲酯化修饰的FITC-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK时的凋亡检测效果显著优越于未经甲酯化修饰的FITC-DEVD-FMK。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种细胞凋亡检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用第一荧光染料和第二荧光染料对待测细胞样本进行染色，得到染色后细胞样本，然后对所述染色后细胞样本进行荧光检测分析，得到所述待测细胞样本的细胞凋亡结果；
其中，所述第一荧光染料能够对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，所述第一荧光染料为R-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，R为荧光基团；所述第二荧光染料能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色；所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的发射波长互不相同。
2.根据权利要求1所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，所述第一荧光染料为FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK或TF3-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，所述第二荧光染料为PI、7-AAD、TO-PRO-3或PO-PRO-1。
3.根据权利要求1所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，所述第一荧光染料为FITC-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，所述第二荧光染料为PI。
4.根据权利要求1所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，所述染色的步骤包括：分别使用所述第一荧光染料和所述第二荧光染料配制得到第一染色液和第二染色液，分别使用所述第一染色液和所述第二染色液孵育所述待测细胞样本。
5.根据权利要求4所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，所述第一荧光染料的工作浓度为2μg/mL～6μg/mL，所述第二荧光染料的工作浓度为1.5μg/mL～3.5μg/mL。
6.根据权利要求1～5任一项所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，使用所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和第三荧光染料对待测细胞样本进行染色，得到染色后细胞样本；所述第三荧光染料能够对正常活细胞进行染色，所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和所述第三荧光染料的发射波长互不相同。
7.根据权利要求6所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，所述染色的步骤包括：混合所述第一荧光染料和所述第三荧光染料以制备混合染色液，使用所述第二荧光染料以制备第二染色液，分别使用所述混合染色液和所述第二染色液孵育所述待测细胞样本。
8.根据权利要求6所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，所述第三荧光染料为Hoechst 33342或DRAQ5，所述第三荧光染料的工作浓度为1μg/mL～3μg/mL。
9.根据权利要求6所述的细胞凋亡检测方法，其特征在于，所述荧光检测分析使用荧光显微镜进行，所述荧光检测分析包括以下步骤：分别在对应的荧光通道检测所述染色后细胞样本中所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和所述第三荧光染料的信号，并对观察到的图像进行采集保存；或
所述荧光检测分析使用高内涵成像分析系统进行，所述荧光检测分析包括以下步骤：分别在对应的激发光通道检测所述染色后细胞样本中所述第一荧光染料、所述第二荧光染料和所述第三荧光染料的信号，并对观察到的图像进行采集保存。
10.一种细胞凋亡检测试剂盒，其特征在于，至少包括第一荧光染料和第二荧光染料；所述第一荧光染料能够对早期凋亡和晚期凋亡的细胞进行染色，所述第一荧光染料为R-C6-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK，R为荧光基团；所述第二荧光染料能够对晚期凋亡和坏死的细胞进行染色；所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的发射波长互不相同。
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