CN114324274B - 特异性核酸荧光染色反应液及其在精子dna完整性检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性核酸荧光染色反应液，包括以下四者：精液稀释液，酸化液，荧光染料，染料稀释液。本发明还同时提供了利用上述特异性核酸荧光染色反应液进行的检测精子DNA碎片化的方法，包括：配制荧光染料；细胞的制备；细胞的裂解和染色；上机检测；结果判断：拍照结果显示发出绿色荧光的为正常精子细胞；发出橘黄色、红色荧光的为碎片化精子细胞。进一步，还可通过两种荧光细胞的个数比，从而计算该样本中的DNA损伤比例。本发明的方法操作步骤少，特异性好，对精子DNA碎片判断准确。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，尤其是一种精子DNA碎片化检测的荧光反应液及其在精子DNA完整性检测中的应用。
背景技术
精子DNA是精子遗传物质的载体，近年来的研究表明精子DNA的完整性能够影响精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎的发育。精子DNA完整性对自然受孕、人工授精、胚胎、胎儿、婴儿甚至成人的发育至关重要。研究表明精子DNA完整性是优于常规精液分析的独立参数，与辅助生殖技术结局有相关性。因此，对男性不育患者进行精子DNA完整性分析，有助于探讨或发现其不育的原因，为患者的预防和治疗提供咨询及诊断依据。
目前检测精子DNA完整性的方法主要有两种，精子染色质扩散(sperm chromatindispersion,SCD)，以及吖啶橙流式细胞术方法学(SCSA)。
SCD法的基本原理是：DNA完整性正常无损伤精子的DNA扩散产生大晕环或中晕环，而DNA损伤产生DNA碎片的精子不产生或产生很小的晕环，然而SCD法弱点也非常明显，这种方法只能适用于新鲜的精液样本，而对低温冻存过的精液样本，则会产生假阳性，即正常的精子的DNA，也无法扩散。这就对时效性有较高的要求；其次，SCD法的晕环并不是非常显著，非常依赖人工判断，受主观判断影响较大，因此不仅难以提高检测效率，同时还存在着较大的主观偏差。
而SCSA法的原理是通过染料吖啶橙进行染色，正常精子DNA为双链，吖啶橙可以插入到双链中，并在488nm处激发后呈绿色荧光，不成熟或损伤精子DNA为单链，吖啶橙通过静电吸附作用大量结合在单链DNA上，在488nm激发后，染成红色、橙色或黄色(于流式检测仪)。该方法的优点是通过流式细胞仪的方法检测，占用人工少，且检测通量高，但缺陷也非常明显。首先，SCSA法是通过荧光检测的方法，检测到的结果无法溯源，即检测到的阳性结果，无法用肉眼或者其他手段确认是否真的为阳性；其次，正常人的精液比较干净，而在少弱精或者有炎症的男性精液中，杂质较多，有细胞碎片、无机盐等。这些杂质也能够与吖啶橙发生静电吸附，从而导致流式法产生大量假阳性，且还无法通过人工发现这些假阳性。同时，吖啶橙还是一种致癌物质。
目前现有基于染料的检测方法，均基于流式细胞仪，例如包括如下：
1、202110308201.8的发明《一种精子DNA碎片化荧光检测方法、检测试剂盒及其应用》：应用精子DNA断裂位点个数作为评价精子DNA完整性的指标并引入PCR检测平台，开发了一种基于酶辅助的精子DNA断点个数荧光检测试剂盒及检测方法。该方法涉及的是荧光探针检测。在酸化处理后利用吖啶橙染料与双链DNA结合发绿色或黄色荧光，与单链DNA结合发红色荧光的特性，确定精子DNA碎片化程度。
2、202010145407.9的发明《一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法》：公开了一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，(1)将5～10万个精子加入500μL含有钼酸铵、曲拉通的盐酸缓冲液，混匀30秒后加入罗丹明6G和吖啶橙染色液；(2)流式细胞仪上机检测，收集绿、黄、红等三色发射荧光信号；(3)结合三种荧光情况分析，即首先在黄色荧光的基础上将活动精子与不动精子区分出来，再进一步分析活动精子中红色荧光精子占活动精子总数的比例，从而可以判定样本中活动精子DNA碎片化情况。
3、201710131866.X的发明《一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法》开了一种基于流式细胞术的精子DFI检测方法，包括以下步骤：(1)将液化的精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×106个/mL；(2)将500μL稀释过的精子加入到流式细胞仪上样管中，加入酸化处理缓冲液，30秒后加入AO染色液；(3)设定流式细胞仪的校准，将检测管上机，每管样本至少连续测定两次，每管样本至少记录5000个细胞并使用DFIView软件统计分析；(4)如何进行结果判断；(5)测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞碎片和荧光染料，优点是操作简单、检测结果准确、稳定可靠、重复性好、且易于临床推广。在酸化处理后利用吖啶橙染料与双链DNA结合发绿色或黄色荧光，与单链DNA结合发红色荧光的特性，确定精子DNA碎片化程度。
4、201010537770.1的发明《一种人类精子DNA碎片检测方法及检测试剂盒》提供一种人类精子DNA碎片检测方法，其步骤为：①液化的精液用4℃的缓冲液稀释精子；②加入稀释精子于流式细胞仪进样管中；③加入酸处理缓冲液；④30秒后，加入AO染色液；⑤设定流式细胞仪的校准和流动室，用AO平衡缓冲液平衡样品线；⑥每个标本至少连续测定两次，至少记录5000个细胞并统计分析；⑦测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞残片和荧光染料。
5、202010196442.3的发明《用于检测精子DNA碎片率的方法和试剂盒》提供了用于检测精子DNA碎片率的方法和试剂盒。基于流式细胞术，利用RNA酶消化精子试样中的RNA，从而消除精子RNA带来的混杂信号，检测结果更准确、稳定可靠、重复性好、且易于临床推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性核酸荧光染色反应液及其在精子DNA完整性检测中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种特异性核酸荧光染色反应液，包括以下四者：精液稀释液(试剂A)，酸化液(试剂B)，荧光染料(试剂C)，染料稀释液(试剂D)；
精液稀释液(试剂A)：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15mol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸二钠；余量为水；pH为7.3；
酸处理液(试剂B)：0.08mol/L盐酸、0.15mol/L氯化钠、0.1％(体积％)曲拉通X-100，余量为水；
荧光染料(试剂C)为SGGV荧光染料，由SYBR GreenI与GoldView这两种染料组成，使用前按比例混合而成；
说明：将1000X的两种染料(SYBR GreenI与GoldView)分别各自用染色稀释液，稀释成2X的工作液，然后等体积量混合，摇匀，配制成SGGV荧光染料；
染色稀释液(试剂D)：40mmol/L Tris-乙酸；2mmol/L EDTA，余量为水；pH 8.0。
本发明还同时提供了一种检测精子DNA碎片化的方法，利用上述特异性核酸荧光染色反应液，依次进行如下步骤：
1)、配制荧光染料：
将SYBR GreenI(1000X)与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得SYBR GreenI稀释液(2X)；
将GoldView(1000X)与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得GoldView稀释液(2X)；
然后，将SYBR GreenI稀释液(2X)与GoldView稀释液(2X)等体积比混合，得SGGV荧光染料；
注：上述配好的SGGV荧光染料于2～8℃下可以避光保存一周。
2)、细胞的制备：
当为新鲜精液样本时，在室温液化30±2分钟；当为冷冻后精液样本时，于冰上，将解冻后的精液样本充分混匀；得待测精液样本；
于冰上，在待测精液样本中加入精液稀释液充分混匀，得稀释后精液；
所述待测精液样本：精液稀释液＝1:9的体积比；
3)、细胞的裂解和染色：
继续于冰上，向步骤2)所得的稀释后精液加入酸处理液(试剂B)于振荡条件下进行酸裂解处理30±2秒，从而增加细胞的通透性；再加入SGGV荧光染料，先振荡10±1秒钟，从而中止酸化反应，而后静置避光染色5±0.5分钟，得染色后反应液；
稀释后精液：酸处理液＝1:1的体积比；
稀释后精液：SGGV荧光染料＝1:6的体积比；
4)、上机检测(利用显微镜)：
于2～8℃，将步骤3)所得的染色后反应液离心(800g离心5分钟)，去除上清(用移液枪吸走上清)，将底液震荡混匀(约10s，于漩涡混匀仪上进行，从而实现重悬细胞，底液一般约30～50μl)；
然后涂片，盖片后于荧光显微镜下，于280nm(紫外光)、480nm(蓝光)中的至少一个激发条件下拍照；
5)、结果判断：
拍照结果显示发出绿色荧光的为正常精子细胞；发出橘黄色、红色荧光的为碎片化精子细胞。
通过两种荧光细胞的个数比，从而计算该样本中的DNA损伤比例。
上述结果对应280nm的紫外光、480nm的蓝光均适用。
作为本发明的检测精子DNA碎片化的方法的改进：
步骤4)为：先用280nm的紫外光激发后拍一次照，然后用480nm的蓝光激发后再拍一次照片；
还包括步骤6)：计算样本中的DNA损伤比例。
作为本发明的检测精子DNA碎片化的方法的进一步改进，所述步骤6)为：
以色调(H)、饱和度(S)、亮度(V)构建HSV颜色模型；利用图像识别软件(ColorPicker，Colors Pro等)对图片中的精子进行HSV颜色的识别。
作为本发明的检测精子DNA碎片化的方法的进一步改进，步骤6)包括如下步骤：
①、对于280nm和480nm两个激发光拍的照片，结果一致的精子细胞纳入统计分析；
②对步骤①所得的纳入统计分析的精子细胞进行纯度S值的判定，对S值大于43的精子细胞进行下述步骤③；
③对步骤②所得的精子细胞进行色彩明亮程度V值判定，对V值大于46的精子细胞进行下述步骤④；
④对步骤③所得的精子细胞进行色彩H值的判定：
在[35，77]区间的定义为绿色，为低DFI的精子；
H值在[0,34]以及[156,180]区间的为中高DFI的精子；
注：其他区域的均不纳入分析；
⑤、DFI指数＝高DFI的精子数量/纳入统计的精子数量X 100％。
即，本发明中，要求纯度S值大于43，纳入考虑范围；要求色彩明亮程度V值大于46纳入考虑范围。
作为本发明的检测精子DNA碎片化的方法的进一步改进，步骤①：
同时满足以下2个条件的绿色荧光点纳入统计分析(即，进行计数，为纳入统计的精子数量)：在280nm波长和在480nm波长下均成像为绿色荧光点，且在480nm波长下显示带有精子尾巴。
本发明首先设计了一种只能特异性染核酸，而不会与蛋白质、无机盐发生静电吸附的染料，还提供了配套的洗液和中止液。从而能够对冻存的精子以及含有杂质的精子DNA碎片化进行准确的检测。该反应体系，后续可以用显微镜镜检，也可以用流式细胞仪自动化检测。
本发明的有益效果主要体现在：解决了现有技术中存在的对冻存过的精子效果较差，以及流式荧光法检测无法溯源和杂质干扰的技术问题。本发明的方法操作步骤少，特异性好，对精子DNA碎片判断准确。
本发明的创新之处主要在于：
1、本发明的SGGV荧光染料，具有DNA特异性，只会染单链或双链DNA，不会染其他蛋白或无机物，因此不会由于杂质的混入而造成假阳性；且有多个激发波长，包括可见光和紫外，方便波长的选择，并且通过同一视野两种波长的激发成像，对于判断会更为准确；
2、本发明的SGGV荧光染料的效率高，其中主要成份SYBR Green I与双链DNA结合发出的绿色荧光信号会增强800-1000倍，与单链结合则为橘黄色荧光。而主要成份GoldView则与单链DNA结合后发出红色荧光，与双链DNA结合后也是发出绿色荧光。因此在强对比之下，背景信号就会显著下降，非常容易通过镜检等方式检出；
3.有更多的波长选择，SGGV染料中的GoldView荧光与DNA结合后，有三个激发波长，分别是268nm、294nm和491nm，前两个为紫外波长可用280nm波长的光激发，后一个为可见光波长，可用480nm波长的光激发。在同一视野下，用280nm和480nm两个不同波长进行激发并分别进行拍照，非常容易发现非精子细胞。
4.两种染料均被认为是无毒无致癌作用，进一步降低了操作人员致癌风险。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为实验1的低DFI的精子荧光法两个波长下，在同一视野拍的图片，呈现绿色荧光(彩色图中，白色箭头指示的光点为绿色)；
图1上图箭头处，280nm波长拍摄到的，将会被统计为一个正常的精子细胞；但图1下图480nm波长成像，由于该点缺少精子尾巴更有可能是白细胞，而非正式的精子细胞，与上图不一致，在计数时就会被排除。
图2为实验1的高DFI的荧光法成像图片，呈现红色与橘黄色荧光(彩色图中，白色箭头指示的是红色及橘黄色的点)。
图3为对比实验1的样本5的SCD图，箭头指向处，光晕都较小，将会被判断为高DFI。
图4为对比实验1的样本9中的杂质，SCD成像后可以通过人工肉眼识别并排除掉。
图5对比实验2的样本9的SCSA法图，显示为高DFI。
图6为3种不同方法，对于10个样本的比较结果。
图7为单独用SYBR green I染料拍出的高DFI的照片。
图8为单独用goldview染料拍出的低DFI的照片。
图9为单独用goldview染料拍出的高DFI的照片。
图10为HSV颜色模型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
室温一般指15～25℃。
实施例1、一种特异性核酸荧光染色反应液，包括以下四者：精液稀释液(试剂A)，酸化液(试剂B)，荧光染料(试剂C)，染料稀释液(试剂D)；
精液稀释液(试剂A)：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15mol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸二钠；余量为水；调节pH为7.3；
酸处理液(试剂B)：0.08mol/L盐酸、0.15mol/L氯化钠、0.1％(体积％)曲拉通X-100，余量为水；
荧光染料(试剂C)为SGGV荧光染料，由SYBR GreenI与GoldView这两种染料组成，使用前按一定比例混合而成；
说明：将1000X的两种染料(SYBR GreenI与GoldView)分别各自用染色稀释液稀释成2X的工作液，然后等体积量混合，摇匀，配制成SGGV荧光染料。
染色稀释液(试剂D)：40mmol/L Tris-乙酸；2mmol/L EDTA，余量为水；调节pH8.0。
实施例2、一种检测精子DNA碎片化的方法，利用如实施例1所述的特异性核酸荧光染色反应液，依次进行如下步骤：
1)、配制荧光染料：
将SYBR GreenI(1000X)与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得SYBR GreenI稀释液(2X)；
将GoldView(1000X)与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得GoldView稀释液(2X)；
然后，将SYBR GreenI稀释液(2X)与GoldView稀释液(2X)等体积比混合，得SGGV荧光染料；
注：上述配好的SGGV荧光染料于2～8℃下可以避光保存一周。
2)、细胞的制备：
当为新鲜精液样本时，于室温液化30分钟；当为冷冻后精液样本时，于冰上(使用冰盒)，将解冻后的精液样本充分混匀；得待测精液样本；
于冰上，在待测精液样本中加入精液稀释液充分混匀，得稀释后精液；
所述待测精液样本：精液稀释液＝1:9的体积比；
3)、细胞的裂解和染色：
继续于冰上，向步骤2)所得的稀释后精液加入酸处理液(试剂B)于振荡条件下进行酸裂解处理30秒，从而增加细胞的通透性；再加入SGGV荧光染料，先振荡均匀10秒钟，从而中止酸化反应，而后静置避光染色5分钟，得染色后反应液；
稀释后精液：酸处理液＝1:1的体积比；
稀释后精液：SGGV荧光染料＝1:6的体积比；
即，整个步骤3)均是于冰上进行；
4)、上机检测(利用显微镜)：
于2～8℃，将步骤3)所得的染色后反应液置于离心机800g离心5分钟，用移液枪吸走上清，将底液震荡混匀10s(于漩涡混匀仪上进行，从而实现重悬细胞)；
然后涂片，盖片后于荧光显微镜下，先用280nm的紫外光激发后拍一次照，然后用480nm的蓝光激发后再拍一次照片；
即，整个步骤4)均是在2～8℃进行；
5)、结果判断：
选用280nm的紫外光下所得照片或者选用480nm的蓝光下所得照片进行判断：
拍照结果显示发出绿色荧光的为正常精子细胞；发出橘黄色、红色荧光的为碎片化精子细胞。
说明：上述280nm的紫外光下所得照片、480nm的蓝光下所得照片的所得结果一致，即，均适用上述判断准则。
6)、通过两种荧光细胞的个数比，从而计算该样本中的DNA损伤比例；
本发明的原理如下：
构建HSV颜色模型，HSV(Hue，Saturation，Value)是根据颜色的直观特性由A.R.Smith在1978年创建的一种颜色空间，也称六角锥体模型(Hexcone Model)。这个模型中颜色的参数分别是：色调(H)，饱和度(S)，亮度(V)；
色调H：用角度度量，从红色开始按逆时针方向计算，红色为0°，绿色为120°，蓝色为240°。它们的补色是：黄色为60°，青色为180°；如图10所示。H参数表示色彩信息，即所处的光谱颜色的位置。S＝0时，只有灰度，相隔120度。互补色分别相差180度。V表示色彩的明亮程度。
定义颜色范围如下表1：
表1
因此，本发明可用Color Picker，Colors Pro等图像识别软件，对图片中的精子进行HSV颜色的识别。
具体方法如下：
①、对于280nm和480nm两个激发光拍的照片，结果一致的精子细胞照片纳入统计分析；
即，具体为：
利用图像识别软件，同时满足以下2个条件的绿色荧光点进行计数(即，为纳入统计的精子数量)：在280nm波长下和在480nm波长下均成像为绿色荧光点，且在480nm波长下显示带有精子尾巴。
说明如下：280nm是紫外波长，对比非常强(特别是绿色荧光)，因此很多杂质也会显示为绿色；而480nm相对缓和。280nm波长下的每个绿色荧光点先被统计为一个正常的精子细胞；而后如果其在480nm波长下没有成像为绿色荧光点、或者在480nm波长下虽然成像为绿色荧光点但是缺少精子尾巴(缺少精子尾巴更有可能是白细胞，而非正式的精子细胞)，在计数时则被排除；最终获得获得纳入统计的精子数量。
②利用图像识别软件，对步骤①所得的纳入统计分析的精子细胞进行纯度S值的判定，对S值大于43的精子细胞进行下述步骤③；
③利用图像识别软件，对步骤②所得的精子细胞进行色彩明亮程度V值判定，对V值大于46的精子细胞进行下述步骤④；
④利用图像识别软件，对步骤③所得的精子细胞进行色彩H值的判定：
在[35，77]区间的定义为绿色，为低DFI的精子；
而H值在[0,34]以及[156,180]区间的为中高DFI的精子；
其他区域的均不纳入分析；
⑤、DFI指数＝高DFI的精子数量/纳入统计的精子数量X 100％。
实验1、10份精液样本，包括3份健康人的新鲜精液样本，2份健康人的-80℃冻存了1周的精液样本，2份经临床验证具有高DFI的精液-80℃冻存样本(冻存时间约为1个月)，3份健康人的新鲜精液样本并手动掺入了裂解的白细胞等杂质，以模拟有杂质的精液(白细胞的含量约为精子总数的10-20％左右)。
表2
将上述10份精液样本按照实施例2所述方法进行检测，所得结果如下：
表3
红色或黄色所占比例，即为DFI指数。
以“样本1”低DFI样本为例：
采用SGGV染色后显微镜法，在设定区域内，280nm波长下成像的绿色荧光点为200个，这200个绿色荧光点对应的在480nm波长下成像为绿色荧光点、且为带有精子尾巴的为160个；因此，纳入统计的精子数量为160个精子细胞。
即，480nm波长下与280nm波长下相对应的成像绿色荧光点，如果缺少精子尾巴(如图1箭头所示)，此属于不一致的光点，需要排除。
该160个纳入统计的绿色荧光点，S值在[43，255]之间，V值在[46，255]之间，色彩H值在[35，77]区间的定义为绿色，如图1所示，总共有157个，多数低DFI的H值在60-77之间。而S值在[43，255]之间，V值在[46，255]之间，色彩H值在[0，34]及[156，180]之间的，有3个，显示为红色或橙色。根据公式，DFI＝3/160*100％＝1.87％。即得到该样本DFI的值为“1.87”。
以“样本6”高DFI样本为例：
采用SGGV染色后显微镜法，在设定区域内，280nm波长下成像的绿色荧光点为200个，这200个绿色荧光点对应的在480nm波长下成像为绿色荧光点、且为带有精子尾巴的为194个；因此，纳入统计的精子数量为194个精子细胞。
该194个纳入统计的绿色荧光点，S值在[43，255]之间，V值在[46，255]之间，色彩H值在[35，77]区间的定义为绿色，总共有162个，多数低DFI的H值在60-77之间。而S值在[43，255]之间，V值在[46，255]之间，色彩H值在[0，34]及[156，180]之间的，有32个，如图2箭头所显示，显示为红色或橙色。根据公式，32/194*100％＝16.48％。即得到该样本DFI的值为“16.48”。
因此，最终结果显示，10个样本，用本SGGV荧光染色体反应液体系，后期通过显微镜检，一致性都比较好。与样本原始结果预期一致，即健康人的精子的DFI检测结果均小于9％，按WHO标准，判断为低DFI，而几个明确阳性的样本，分别检出了16.48％、15.51％的值，按WHO标准，判断为中高DFI。
同时，如图1所示，荧光背景非常低，HSV值中的V值小于10，与精子细胞(无论是高DFI或是低DFI，V值都大于50)相比，精子细胞的荧光与背景的的V值相差5倍以上，反差很大，易于判断。
根据图1～图2，可获得以下总结性结论：本发明能非常好的对健康的精子染上绿色荧光，高DFI的染上红色或橘黄色荧光，并且在280nm和480nm两个激发波下正确成像，同时对加了杂质的样本也能很好的区分。背景与细胞的荧光值相差很大，容易通过肉眼或软件识别。
对比实验1
通过SCD法检测实验1所述的10个样本，方法参考《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第五版标准，判断标准为：精子头部直径小于1/3光晕厚度，则为高DFI的精子细胞，结果如下表4：
DFI＝高DFI的精子细胞/精子细胞。
表4
结果显示，对所有新鲜样本，都能较好的辨认出，但对于冻存样本，光晕显著减少，其中一个低DFI的样本(即样本5)，也被判断为高DFI，如图3箭头处所示，且总体光晕要小于新鲜样本。
然而对于故意添加了杂质的健康人DFI，由于是人工识别，见图4，SCD法能够轻易识别，从而证明样本8，样本9，与样本10，是低DFI样本。
按照此现有方法与本发明对比，可得知：对新鲜的样本，SCD传统方法与本发明准确率类似，但对于冷冻保存的健康人的精液样本，会由于精子的活性降低，从而使SCD法的光晕偏小，误判为高DFI。
因此，对于不能在医院内部完成，需要外送检验所，或者无法及时处理的样本，本发明的方法有着非常大的优势。
同时，本发明的方法可以通过软件来识别，将来结合人工智能，可以提高效率。做到1分钟检查200个精子细胞。而SCD法需要人工肉眼识别，识别200个精子细胞，需要20分钟以上。
对比实验2
通过吖啶橙染色+流式细胞仪检测(SCSA)法检测实验1所述的10个样本，方法参考专利201810071175.X。
结果如下表5：
表5
结果显示，不管是新鲜样本还是存冻样本，流式都能较好的识别，但对于掺入了杂质的样本8，样本9，样本10，流式均判断为高DFI。而实际这三个样本是低DFI，只是多了一些糖、无机盐、细胞碎片等杂质，这就导致传统SCSA法就误判为高DFI。
样本9的SCSA法图如图5，显示为高DFI。
按照此现有方法与本发明对比，可得知：SCSA流式法，除了节省人工，不需要肉眼识别之外，其他方面，均逊色很多；对于含了杂质的健康人的精子，比如样本8,9,10均判断为高DFI，且无法溯源，即无法像显微镜成像那样，可以通过人工，肉眼去双重鉴定。。
上述实验1、对比实验1、对比实验2的实验结果的对比如图6所示，可得到以下结论：本发明的荧光反应液配合后期的流式检测以及显微镜检查，结果与预期非常一致，且通过两个波长的拍照成像，可以人工踢除一些非精子细胞，增加准确性。通过HSV三色标准，可以将颜色做到量化，避免了人工识别图片的主观误差。同时也为后续人工智能，提供判断依据。结果可以以照片方式长期保存，并且留底后，有异议的可以人工再次审核，做到可溯源。
传统SCD法对于新鲜样本效果较高，但对于冻存样本，光晕减少，DFI值会显著升高。导致误判，且一张片子需要计数200个精子细胞，人工多，效率低。
传统SCSA法，对于无杂质的样本效果都不错，但对于混了杂质的样本会明显出错，且出错之后，从结果上还无法溯源，只能通过其他方法佐证。
因此，相比较于传统的SCD法和SCSA法，本发明检测精子DFI准确率、特异性都有明显的提高，可溯源、可长期保存。本发明对于长期冻存样本、含有杂质的样本，都具有良好的识别。
对比例1、将实施例2中的染料由“SYBR Green I+GoldView”改成仅仅使用“SYBRGreen I”，即，将SYBR GreenI稀释液(2X)加等体积的染色稀释液作为SGGV荧光染料，其余等同于实施例2。
结果显示，对于低DFI的，区别不大，但对于样本6，7原本为高DFI的，如图7所示，白色箭头所示，肉眼可以看到是显示红色的高DFI精子细胞，但由于SYBR Green I对单链DNA的染色效果欠佳，而对绿色荧光非常强的对比下，使得白色箭头处的红色精子细胞的HSV中的V值，即亮度，低于46，难以被软件识别出来，而人工肉眼，也很难在这个高对比度下，将红色的细胞清晰的数出来。造成能计数的都是低DFI的值。
10个样品的所得结果为下表6。
表6
所得结果，均为低DFI，与预期不符。需要重新调整对比度，或者识别阈值才能识别这些低亮度的红色细胞。从而对样本6，7，产生假阴性。
对比例2、将实施例1中的染料由“SYBR Green I+GoldView”改成仅仅使用“GoldView”，即，将GoldView稀释液(2X)加等体积的染色稀释液作为SGGV荧光染料，其余等同于实施例2。
在原低DFI的样本1-3中，如图8所示，由于绿色荧光值不强，在软件增加对比度后，使白色箭头处的细胞，偏黄色，HSV中的H值在30-40之间，会有大量低DFI被认为是黄色信号值，从而被认为是高DFI的细胞。而对于原本就高DFI的样本，如样本6，7，如图9所示，满屏都变成是红色或黄色的点，白色箭头处理应低DFI的精子细胞，也被判断为高DFI，导致数据失真，总体假阳性升高。
10个样品的所得结果为下表7：
表7
结果显示，只用单一染料，使得绿色荧光强度下降，造成总体DFI升高，形成假阳性。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于依次进行如下步骤：
1)、配制荧光染料：
将SYBR GreenI与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得SYBR GreenI稀释液；
将GoldView与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得GoldView稀释液；
染色稀释液：40mmol/L Tris-乙酸，2mmol/L EDTA，余量为水；pH 8.0；
然后，将SYBR GreenI稀释液与GoldView稀释液等体积比混合，得SGGV荧光染料；
2)、细胞的制备：
当为新鲜精液样本时，在室温液化30±2分钟；当为冷冻后精液样本时，于冰上，将解冻后的精液样本充分混匀；得待测精液样本；
于冰上，在待测精液样本中加入精液稀释液充分混匀，得稀释后精液；
所述待测精液样本：精液稀释液＝1:9的体积比；
精液稀释液：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15mol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸二钠；余量为水；pH为7.3；
3)、细胞的裂解和染色：
继续于冰上，向步骤2)所得的稀释后精液加入酸处理液于振荡条件下进行酸裂解处理30±2秒，从而增加细胞的通透性；再加入SGGV荧光染料，先振荡10±1秒钟，而后静置避光染色5±0.5分钟，得染色后反应液；
稀释后精液：酸处理液＝1:1的体积比；
稀释后精液：SGGV荧光染料＝1:6的体积比；
酸处理液：0.08mol/L盐酸、0.15mol/L氯化钠、0.1％(体积％)曲拉通X-100，余量为水；
4)、上机检测：
于2～8℃，将步骤3)所得的染色后反应液离心，去除上清，将底液震荡混匀；
然后涂片，盖片后于荧光显微镜下，于280nm、480nm中的至少一个激发条件下拍照；
5)、结果判断：
拍照结果显示发出绿色荧光的为正常精子细胞；发出橘黄色、红色荧光的为碎片化精子细胞。
2.根据权利要求1所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于：
步骤4)为：先用280nm的紫外光激发后拍一次照，然后用480nm的蓝光激发后再拍一次照片；
还包括步骤6)：计算样本中的DNA损伤比例。
3.根据权利要求2所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于所述步骤6)为：以色调H、饱和度S、亮度V构建HSV颜色模型；利用图像识别软件对图片中的精子进行HSV颜色的识别。
4.根据权利要求3所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于所述步骤6)包括如下步骤：
①、对于280nm和480nm两个激发光拍的照片，结果一致的精子细胞纳入统计分析；
②对步骤①所得的纳入统计分析的精子细胞进行纯度S值的判定，对S值≥43的精子细胞进行下述步骤③；
③对步骤②所得的精子细胞进行色彩明亮程度V值判定，对V值≥46的精子细胞进行下述步骤④；
④对步骤③所得的精子细胞进行色彩H值的判定：
在[35，77]区间的定义为绿色，为低DFI的精子；
H值在[0,34]以及[156,180]区间的为中高DFI的精子；
⑤、DFI指数＝高DFI的精子数量/纳入统计的精子数量X 100％。
5.根据权利要求4所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于所述步骤①：
同时满足以下2个条件的绿色荧光点纳入统计分析：在280nm波长和在480nm波长下均成像为绿色荧光点，且在480nm波长下显示带有精子尾巴。
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