CN116908078B - 一种检测精子dfi的方法、装置、存储介质及设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测精子DFI的方法、装置、存储介质及设备。所述方法包括制作荧光分布图、去除死亡区、划定高染色区域、确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线单元和计算精子DNA碎片化指数。本发明在流式细胞仪分析的基础上，开发了一种基于数学模型的检测算法，通过该算法可计算出最终经流式细胞仪分群细胞的DNA碎片化精子具体占比，得到准确的DFI数值，完全可替代人工分析，且可以消除人工分析主观性因素的影响。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测精子DFI的方法、装置、存储介质及设备。
背景技术
目前诊断男性不育的方法主要为检测精液量、精子浓度、精子存活率、精子活动力和精子形态等实验室指标，虽然这些指标可以在一定程度上初步反应基本的精液质量，但不能明确区分可育和不可育人群。为了精准分析精子使卵子受精的潜力及对男性生育力进行全面评估，精子功能性分析逐渐在临床上推广和应用。
精子DNA完整性是保证精子受精能力、受精卵分裂和胚胎正常发育的必要条件。精子DNA碎片化是指精子在形成过程中受到有害因素（如氧化应激、吸烟、高温、药物等）影响，使完整的精子DNA受到损伤，解链成单链或断裂，产生DNA碎片。有研究指出无论男性不育症患者精液常规检查结果是否正常，都可能存在精子DNA异常，所以从分子水平上反应精子DNA完整性的精子DNA碎片化指数（DNA fragmentation index，DFI）的检测被各大医院或生殖医学中心作为精液常规分析的重要补充。
目前，最常用的DFI检查方法是精子染色质扩散实验(SCD)和精子染色质结构分析法(SCSA)。精子染色质扩散实验(SCD)利用的原理是没有DNA碎片的精子在经过酸变性和去掉核蛋白后，DNA扩散形成特征性的晕环，而带有DNA碎片化的精子不会产生这种晕环。这种方法首先要人为地在显微镜下采集图像，然后在图像中根据精子是否晕环判断精子DNA碎片化，耗时长且易受人为主观因素影响。虽然CN 110363740A公开了一种DNA图像中的精子碎片识别方法，也仅能针对在精子图像中判断精子是否DNA碎片化中减少人为因素的干扰，无法减轻人工的图像采集工作。随着流式细胞仪的普及和成本的下降，基于流式细胞术的精子染色质结构分析(SCSA)法由于高通量的优势得到了广泛应用。SCSA是根据染料吖啶橙与双链DNA结合发绿色荧光，与单链DNA结合发红色荧光的特性，结合流式细胞仪可以实现对荧光信号进行快速定量，从而得到待测样本中发生DNA断裂的精子比例，如CN106932330A公开基于流式细胞术的精子DFI检测方法，但在流式分析中门控设置过程存在主观性误差，尤其是细胞分群不够明显时，门控设置的偏差严重影响分析结果。
综上所述，开发高效、准确检测精子DNA碎片化指数的检测方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测精子DFI的方法、装置、存储介质及设备，以期实现高效、准确检测精子DNA碎片化指数。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测精子DNA碎片化指数的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）获取待测样本经流式细胞术处理的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，制作荧光分布图；
（2）基于所述荧光分布图取区域中的散点数，得到区域个数分布折线图，计算分布的波峰个数，当波峰数大于1，则第一个波峰为死亡的细胞的波峰，去除这一波段的散点，每个散点代表一个精子，剩余的所有散点为有效统计的总个数；当波峰数个数不高于1，则不存在死亡区，不进行去除处理，所有散点为有效统计的总个数；
（3）基于步骤（2）获得的所有散点，统计半径内的散点个数，以散点个数作为该点的密度，得到所有点的密度分布图，取密度最大值的1/12~1/10与X轴平行画线，作为高染色区分界线，高染色区分界线以上区域为高染色区域（High DNA Stainability，HDS）；
划定包含密度为密度最大值的1/2的所有点的矩形框，和包含密度为密度最大值的1/4的所有点的矩形框，然后分别从两个矩形框的左下角至右上角画线确定两个斜率，两个斜率取平均作为正常精子集群和碎片化精子集群分界线的斜率K1，取密度最大值的1/5~95/100中的一个密度值M1，在密度值大于等于M1的所有散点以K1为斜率做线，取与y轴截距最小的线作为最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线，划定所述高染色区分界线以下、最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线的右侧为碎片化精子区域；
（4）以碎片化精子区域的散点个数除以步骤（2）中有效统计的总个数，得到精子DNA碎片化指数。
本发明中，在流式细胞仪分析的基础上，开发了一种基于数学模型的检测算法，通过该算法可计算出最终经流式细胞仪分群细胞的DNA碎片化精子具体占比，得到准确的DFI数值，完全可替代人工分析，且可以消除人工分析主观性因素的影响。
可以理解，本领域通用的流式细胞术方法均适用于本发明。
优选地，高染色区域精子总个数除以有效统计的总个数即可得到HDS的比例。
优选地，步骤（1）具体包括：根据流式细胞术分析得到的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，选择精子集群分布区，获取对应的精子的荧光值，制作荧光分布图。
优选地，所述荧光值包括绿色荧光值和红色荧光值。
优选地，步骤（2）中所述区域个数分布折线图的制作方法包括：
以-1为斜率的线在荧光分布图上从左下角至右上角移动，统计在该线上散点的个数，以-1斜率的线与X轴的交点（截距）为横坐标，线上点的个数为纵坐标，绘制区域个数分布折线图。
优选地，步骤（3）中所述半径为3~10，包括但不限于4、5、6、7、8或9。
可以理解，本发明检测精子DNA碎片化指数的的方法不仅可应用于临床诊断，还可应用于非疾病诊断为目的的基础科学研究等应用中。
第二方面，本发明提供一种检测精子DNA碎片化指数的装置，所述装置用于执行第一方面所述检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤，包括制作荧光分布图单元、去除死亡区单元、划定高染色区域单元、确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线单元和计算单元。
所述制作荧光分布图单元用于执行包括：
获取待测样本经流式细胞术处理的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，制作荧光分布图。
所述去除死亡区单元用于执行包括：
基于所述荧光分布图取区域中的散点数，得到区域个数分布折线图，计算分布的波峰个数，当波峰数大于1，则第一个波峰为死亡的细胞的波峰，去除这一波段的散点，每个散点代表一个精子，剩余的所有散点为有效统计的总个数；当波峰数个数不高于1，则不存在死亡区，不进行去除处理，所有散点为有效统计的总个数。
所述划定高染色区域单元用于执行包括：
基于去除死亡区单元获得的所有散点，统计半径内的散点个数，以散点个数作为该点的密度，得到所有点的密度分布图，取密度最大值的1/12~1/10与X轴平行画线，作为高染色区分界线，高染色区分界线以上区域为高染色区域。
所述确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线单元用于执行包括：
划定包含密度为密度最大值的1/2的所有点的矩形框，和包含密度为密度最大值的1/4的所有点的矩形框，然后分别从两个矩形框的左下角至右上角画线确定两个斜率，两个斜率取平均作为正常精子集群和碎片化精子集群分界线的斜率K1，取密度最大值的1/5~95/100中的一个密度值M1，在密度值大于等于M1的所有散点以K1为斜率做线，取与y轴截距最小的线作为最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线，划定所述高染色区分界线以下、最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线的右侧为碎片化精子区域。
所述计算单元用于执行包括：
以所述碎片化精子区域的散点个数除以去除死亡区单元中有效统计的总个数，得到精子DNA碎片化指数。
优选地，所述制作荧光分布图单元具体根据流式细胞术分析得到的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，选择精子集群分布区，获取对应的精子的荧光值，制作荧光分布图。
优选地，所述荧光值包括绿色荧光值和红色荧光值。
优选地，去除死亡区单元中所述区域个数分布折线图的制作方法包括：
以-1为斜率的线在荧光分布图上从左下角至右上角移动，统计在该线上散点的个数，以-1斜率的线与X轴的交点（截距）为横坐标，线上点的个数为纵坐标，绘制区域个数分布折线图。
优选地，高染色区域单元中所述半径为3~10，包括但不限于4、5、6、7、8或9。
第三方面，本发明提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序/指令，所述计算机程序/指令被处理器执行时实现第一方面所述检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤。
第四方面，本发明提供一种计算机设备，包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序/指令，所述计算机程序/指令被处理器执行时实现第一方面所述的检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在流式细胞术分析的基础上，开发了一种基于数学模型的检测算法，可得到准确的DFI和HDS结果，与多名有经验的专业人员共同分析的结果相比，误差在2%以内，该算法可代替人工进行临床DFI检测，亦可开发对应自动化检测方法，可以显著降低人工成本，减少人工工作量，同时提高检测的效率和准确性，避免了人工检测中可能存在的主观性、疲劳性和误差性等问题。
附图说明
图1为侧向散射高度和前向散射高度分布图；
图2为BL3-H和BL1-H分布图；
图3为区域个数分布折线图；
图4为去除死亡精子后的BL3-H和BL1-H分布图；
图5为密度分布图；
图6为划定高染色区域结果图；
图7为确定正常精子集群和碎片化精子集群的分界线结果图；
图8为划定碎片化精子区域结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例进行精子DNA碎片化指数的检测。
取待检测精液样本（如临床DFI检测精液样本），进行流式细胞术检测，具体包括：（1）使用染色剂对精子进行染色；（2）使用细胞核溶解剂溶解细胞膜和胞质，将染色质暴露；（3）调整流式细胞仪的设置，选择合适的激发波长和检测通道；（4）将经过染色和细胞核溶解的样本置于流式细胞仪中，完成数据采集，包括多个精子的侧向散射高度、前向散射高度、绿色荧光值、红色荧光值等。
1.基于SSC-H(侧向散射高度)和FSC-H(前向散射高度)的分布找到BL3-H和BL1-H分布
根据流式分析得到的侧向散射高度（SSC-H）、前向散射高度的分布（FSC-H）选择精子集群分布区（图1），找到对应的精子的BL3-H（绿色荧光）和BL1-H（红色荧光）的值，并画出BL3-H和BL1-H的分布图（图2）。
2.去除死亡区
由于死亡的细胞对绿色荧光和红色荧光的反应都很差，故在BL3-H与BL1-H的散点分布图上都分布在左下角，通过以-1为斜率的线在荧光分布图上从左下角至右上角移动，统计在该线上散点的个数，以-1斜率的线与X轴的交点为横坐标，线上点的个数为纵坐标，可以得到一个区域个数分布折线图（图3），然后求出这段分布的波峰个数，波峰数大于1，则第一个波峰为死亡的细胞的波峰，则去掉这一波段的散点（一个散点就是一个精子），去除后BL3-H和BL1-H的分布图如图4所示，剩余的所有散点为有效统计的总个数。
3.找到高染色区域（High DNA Stainability，HDS）
用去除凋亡区的所有点，每个点以3为半径统计该半径内的散点个数，以个数作为该点的密度，即可得到所有点的密度分布图（图5），根据密度分布求出HDS区域，自适应取密度最大值的1/12~1/10与X轴平行画线（图6），作为高染色区分界线，线以上区域为HDS区域。
4.确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线
高染色区域确定后，剩下的点再通过密度分布确定正常精子集群和碎片化精子集群的分界线，取密度最大值的1/2和密度最大值的1/4分别确定一个矩形框（图7），然后两个矩形框分别从左下角至右上角画线确定两个斜率，两个斜率取平均作为正常精子集群和碎片化精子集群分界线的斜率K1，自适应地取密度最大值的1/5至95/100中的一个密度值0.27，密度值大于等于0.27的所有散点以K1为斜率做线，取与y轴截距最小的线作为该样本最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线（图8），高染色区分界线以下、正常精子集群和碎片化精子集群分界线的右侧即为碎片化精子区域。
5.占比统计
HDS区域精子总个数除以有效统计的总个数即可得到HDS的比例，碎片化精子区域的个数除以有效统计的总个数即可得到DFI的比例，图8所示样例DFI为12.24%，HDS为6.43%。
6.准确性验证
所示样例算法计算结果DFI为12.24%，HDS为6.43%，人工计算结果DFI为10.57%，HDS为5.43%。另外，验证了100例临床样本，本案例算法检测结果与人工检测结果的误差都在2%以内。
本发明具体实施例中基于上述方法可进一步开发一种检测精子DNA碎片化指数的装置，所述装置用于所述检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤，包括制作荧光分布图单元、去除死亡区单元、划定高染色区域单元、确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线单元和计算单元。
所述制作荧光分布图单元用于执行包括：获取待测样本经流式细胞术处理的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，制作荧光分布图；所述去除死亡区单元用于执行包括：基于所述荧光分布图取区域中的散点数，得到区域个数分布折线图，计算分布的波峰个数，当波峰数大于1，则第一个波峰为死亡的细胞的波峰，去除这一波段的散点，每个散点代表一个精子，剩余的所有散点为有效统计的总个数；当波峰数个数不高于1，则不存在死亡区，不进行去除处理，所有散点为有效统计的总个数；所述划定高染色区域单元用于执行包括：基于去除死亡区单元获得的所有散点，统计半径内的散点个数，以散点个数作为该点的密度，得到所有点的密度分布图，取密度最大值的1/12~1/10与X轴平行画线，作为高染色区分界线，高染色区分界线以上区域为高染色区域；所述确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线单元用于执行包括：划定包含密度为密度最大值的1/2的所有点的矩形框，和包含密度为密度最大值的1/4的所有点的矩形框，然后分别从两个矩形框的左下角至右上角画线确定两个斜率，两个斜率取平均作为正常精子集群和碎片化精子集群分界线的斜率K1，取密度最大值的1/5~95/100中的一个密度值M1，在密度值大于等于M1的所有散点以K1为斜率做线，取与y轴截距最小的线作为最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线，划定所述高染色区分界线以下、最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线的右侧为碎片化精子区域；所述计算单元用于执行包括：以所述碎片化精子区域的散点个数除以去除死亡区单元中有效统计的总个数，得到精子DNA碎片化指数。
本发明具体实施例中可进一步开发一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序/指令，所述计算机程序/指令被处理器执行时实现所述检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤。
本发明具体实施例中可进一步开发一种计算机设备，包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序/指令，所述计算机程序/指令被处理器执行时实现所述的检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤。
综上所述，本发明在流式细胞术分析的基础上，开发了一种基于数学模型的检测算法，可得到准确的DFI和HDS结果，与多名有经验的专业人员共同分析的结果相比，误差在2%以内，该算法可代替人工进行临床DFI检测，亦可开发对应自动化检测方法，可以显著降低人工成本，减少人工工作量，同时提高检测的效率和准确性，避免了人工检测中可能存在的主观性、疲劳性和误差性等问题。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种检测精子DNA碎片化指数的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）获取待测样本经流式细胞术处理的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，制作荧光分布图；
（2）基于所述荧光分布图取区域中的散点数，得到区域个数分布折线图，计算分布的波峰个数，当波峰数大于1，则第一个波峰为死亡的细胞的波峰，去除这一波段的散点，每个散点代表一个精子，剩余的所有散点为有效统计的总个数；当波峰数个数不高于1，则不存在死亡区，不进行去除处理，所有散点为有效统计的总个数；
（3）基于步骤（2）获得的去除死亡细胞散点后的荧光分布图上所有散点，以每个散点为中心，以3~10任取一个固定值为半径，统计半径内的散点个数作为该点的密度，得到所有点的密度分布图，取密度最大值的1/12~1/10与X轴平行画线，作为高染色区分界线，高染色区分界线以上区域为高染色区域；
划定包含密度为密度最大值的1/2的所有点的矩形框，和包含密度为密度最大值的1/4的所有点的矩形框，然后分别从两个矩形框的左下角至右上角画线确定两个斜率，两个斜率取平均作为正常精子集群和碎片化精子集群分界线的斜率K1，取密度最大值的1/5~95/100中的一个密度值M1，在密度值大于等于M1的所有散点以K1为斜率做线，取与y轴截距最小的线作为最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线，划定所述高染色区分界线以下、最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线的右侧为碎片化精子区域；
（4）以碎片化精子区域的散点个数除以步骤（2）中有效统计的总个数，得到精子DNA碎片化指数。
2.根据权利要求1所述检测精子DNA碎片化指数的方法，其特征在于，步骤（1）具体包括：根据流式细胞术分析得到的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，选择精子集群分布区，获取对应的精子的荧光值，制作荧光分布图。
3.根据权利要求2所述检测精子DNA碎片化指数的方法，其特征在于，所述荧光值包括绿色荧光值和红色荧光值。
4.根据权利要求1所述检测精子DNA碎片化指数的方法，其特征在于，步骤（2）中所述区域个数分布折线图的制作方法包括：
以-1为斜率的线在荧光分布图上从左下角至右上角移动，统计在该线上散点的个数，以-1斜率的线与X轴的交点为横坐标，线上点的个数为纵坐标，绘制区域个数分布折线图。
5.一种检测精子DNA碎片化指数的装置，其特征在于，所述装置用于执行权利要求1-4任一项所述检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤，包括制作荧光分布图单元、去除死亡区单元、划定高染色区域单元、确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线单元和计算单元；
所述制作荧光分布图单元用于执行包括：
获取待测样本经流式细胞术处理的侧向散射高度和前向散射高度分布结果，制作荧光分布图；
所述去除死亡区单元用于执行包括：
基于所述荧光分布图取区域中的散点数，得到区域个数分布折线图，计算分布的波峰个数，当波峰数大于1，则第一个波峰为死亡的细胞的波峰，去除这一波段的散点，每个散点代表一个精子，剩余的所有散点为有效统计的总个数；当波峰数个数不高于1，则不存在死亡区，不进行去除处理，所有散点为有效统计的总个数；
所述划定高染色区域单元用于执行包括：
基于去除死亡区单元获得的去除死亡细胞散点后的荧光分布图上所有散点，以每个散点为中心，以3~10任取一个固定值为半径，统计半径内的散点个数作为该点的密度，得到所有点的密度分布图，取密度最大值的1/12~1/10与X轴平行画线，作为高染色区分界线，高染色区分界线以上区域为高染色区域；
所述确定正常精子集群和碎片化精子集群分界线单元用于执行包括：
划定包含密度为密度最大值的1/2的所有点的矩形框，和包含密度为密度最大值的1/4的所有点的矩形框，然后分别从两个矩形框的左下角至右上角画线确定两个斜率，两个斜率取平均作为正常精子集群和碎片化精子集群分界线的斜率K1，取密度最大值的1/5~95/100中的一个密度值M1，在密度值大于等于M1的所有散点以K1为斜率做线，取与y轴截距最小的线作为最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线，划定所述高染色区分界线以下、最终正常精子集群和碎片化精子集群的分界线的右侧为碎片化精子区域；
所述计算单元用于执行包括：
以所述碎片化精子区域的散点个数除以去除死亡区单元中有效统计的总个数，得到精子DNA碎片化指数。
6.根据权利要求5所述的检测精子DNA碎片化指数的装置，其特征在于，所述制作荧光分布图单元具体根据流式细胞术分析得到的侧向散射高度和前向散射高度的分布结果，选择精子集群分布区，获取对应的精子的荧光值，制作荧光分布图。
7.根据权利要求6所述的检测精子DNA碎片化指数的装置，其特征在于，所述荧光值包括绿色荧光值和红色荧光值；
去除死亡区单元中所述区域个数分布折线图的制作方法包括：
以-1为斜率的线在荧光分布图上从左下角至右上角移动，统计在该线上散点的个数，以-1斜率的线与X轴的交点为横坐标，线上点的个数为纵坐标，绘制区域个数分布折线图；
高染色区域单元中所述半径为3~10。
8.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序或指令，其特征在于，所述计算机程序或指令被处理器执行时实现权利要求1-4任一项所述检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤。
9.一种计算机设备，包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序或指令，其特征在于，所述计算机程序或指令被处理器执行时实现权利要求1-4任一项所述的检测精子DNA碎片化指数的方法的步骤。
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