CN105671126B - 检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法 - Google Patents

检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法。具体步骤如下：A、收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；B、向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度；D、测定精子唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。通过精子中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。

Description

检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法
技术领域
本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法。
背景技术
随着社会工业的不断发展，不育夫妇的总发病率明显升高。2004年欧洲生殖学会统计：育龄夫妇1年内不能怀孕者占25%，其中15%寻求治疗，男方因素引起不育占50%。男性不育的病因有性功能障碍(1.7% )，精索静脉曲张(12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性发育异常(2.1%)后天获得性疾病(2.6% )，内分泌紊乱(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他异常(3%)，但是高达60%~75%的患者找不到原因，称为特发性男性不育，他们只表现为少精、弱精或畸形精子症等精子质量异常。不明原因的男性不育可能由于多种因素造成，如长期应激环境因素引起内分泌紊乱、活性氧和基因缺陷等。
多年来，传统的精液常规分析一直是用于判断男性生育力的最基本临床指标。临床上对绝大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是临床上大约有三分之一不育患者，男性的常规精液分析结果均正常和接近正常。临床上把这类患者划为不明原因不育症。因此，长期以来，临床对男性不育的诊断存在很大的困难。最主要的原因是常规精液分析只测定精子的数量，存活力，活动率和形态。这些指标只能反映最基本的精液质量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA损伤，精子与人卵透明带结合反应与穿透，顶体状况和反应及与卵黄膜结合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能试验才能测定以上这些功能。精子获能是精卵结合形成受精卵的必要条件，虽然精子获能的相关研究已有一些进展, 但仍然存在很多尚未阐明的问题。
临床工作中，一部分原发或继发的不育男性病人利用现有的常规精液质量检查项目提示精子及精液质量无异常。目前常用的精子检测手段为CASA(计算机辅助精子分析Computer aided of semen analysis)，以及抗精子抗体等。当今最为广泛使用的CASA技术和一些形态学的相关检测，主要能评价精子的活动能力和活精子比率，从而推测其进入女性生殖道的受精能力，而依赖目前的精子功能评价体系，对精子质量及功能的评价存在一定的缺陷，以及难于给病人提供相应的临床咨询。事实上，这仅仅是评价精子功能的一个方面，我们应该考虑到可能还有影响精子生殖能力的更多没有被揭示的因素。
在先专利201310431847.0，提出了一种影响精子功能的唾液酸酶检测方法。第一步，通过单精子荧光强度分析直观的量化唾液酸酶在精子中的表达，或者利用显微镜下荧光成像直观的观察唾液酸酶在精子中的表达；若唾液酸酶在精子中高表达，则进行第二步，利用体外获能液使精子影响精子功能的唾液酸酶检测方法获能，并用荧光法检测唾液酸酶活性。该专利虽然公开了唾液酸酶蛋白分子在精子中的表达和基本活性的检测。但在检测对象上，是对获能液进行的酶活测定，检测的是对精子进行获能处理后，精子向获能液中脱落的唾液酸酶，目的是评估获能后的精子质量。由于精子本身的唾液酸酶活性与获能液的酶活不存在必然关联，该方法无法检测精子本身所含的唾液酸酶，无法对精子本身质量进行评估。同时，在方法上还存在以下缺点：1）技术流程复杂；2）对实验设备和操作人员技能和经验要求高；3）不适于应用于临床实验室和常规技术人员使用；4）使用abcam公司的试剂盒，价格昂贵。
发明内容：
针对上述技术问题，本发明提供了检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法。对精子提取蛋白的精子功能进行测定，采用新鲜及时的精液测定精子唾液酸酶的总活性，用于评价男性不育的可能潜在原因，尤其是针对临床上不明原因性不育是否与唾液酸酶活性有关的情况。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：试剂盒包括细胞裂解液，磷酸缓冲液或者BWW培养液，蛋白酶抑制剂Cocktail，试剂A液，试剂B液，牛血清白蛋白，荧光试剂，唾液酸酶标准原液和检测缓冲液；所述细胞裂解液不含酶活抑制剂；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠；所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml；试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、精子的洗涤
收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子。
本发明先向精液标本中加入磷酸缓冲液或者BWW培养液进行洗涤，再离心分离得到精子沉淀。这是由于精浆本身黏稠，直接对其离心不能使精液中所有精子充分沉淀，加入磷酸缓冲液或者BWW培养液对其进行稀释后，离心操作效果更好。
优选地，对精液进行3次离心，保证检测没有精浆干扰的情况下，尽可能减少离心精子的次数，保证精子活力。
B、提取精子蛋白
向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物。
蛋白酶抑制剂cocktail的加入是用来抑制蛋白酶的作用，蛋白酶的作用是降解蛋白质，而本发明的待检物唾液酸酶就是一种蛋白质，加入蛋白酶抑制剂可以防止唾液酸酶被降解。
优选地，所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，加入体积为精子体积的2-3倍。抑制剂会破坏唾液酸酶的活性，会影响后面的酶活测定。2-3倍的加入量可保证检测的灵敏度。
优选地，所述的高速离心是指以12000r/min的速度离心5min，尽可能去掉细胞（精子）碎片，否则这些碎片会影响检测的特异性。
C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度
（1）用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋白标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释。
优选地，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml，可于-20℃长期储存，便于后面2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml这些蛋白浓度梯度的配制。蛋白标准溶液梯度根据精子提取物的蛋白浓度的表达量和本方法所能检测到的灵敏度而设定的。
（2）按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37℃反应30min，然后用酶标仪读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。
优选地，所述的检测板为96孔透明板。
优选地，所述的酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。
检测的孔内样本蛋白浓度应在0.1-2mg/ml范围内，如果超出，则应将孔内待测样本的蛋白浓度调整在此线性范围之内。
D、测定精子唾液酸酶活性
（1）用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入检测缓冲液稀释。
唾液酸酶标准溶液梯度根据精子唾液酸酶的表达量和本方法所能检测到的灵敏度而设定的。
优选地，所述的检测板为96孔黑板，本发明采用荧光法来测定唾液酸酶的活性，黑色的检测板对灵敏度和特异性是最佳的，可以保护荧光染料不被光线淬灭，明显降低光线对荧光试剂淬灭的负面影响，从而使检测的灵敏度、稳定性和准确性得到大大提高。
（2）用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。
优选地，用检测缓冲液稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM，为最佳的工作浓度。
优选地，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。365nm为最佳激发波长，450nm为最佳发射波长。
唾液酸酶活性/蛋白浓度的单位酶活值（U AUS/g protein）反映单位精子蛋白的唾液酸酶活性定量值，根据单位酶活值的数据可作出人群表达唾液酸酶活性的临界值。
根据该临界值，可在临床上通过单位酶活值初步判断精子的功能质量，据目前已有的数据，对于正常生育男性和不育患者，此临界值约为0.2；对于运动能力良好的精子和运动能力较差的精子，此临界值约为0.24；对于活率正常的精子和活率低下的精子，此临界值约为0.3。
优选地，用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。
所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜。
试剂A液用于提供反应原料BCA（即二喹啉甲酸）和碱性环境，试剂B液提供反应原料二价铜离子。具体而言，B液颜色为天蓝色，当与A液混合后，颜色显示为苹果绿色，在这种碱性条件下，加入的蛋白质可将原先的二价铜离子还原为一价铜离子，而一个一价铜离子可螯合两个BCA分子，由此溶液颜色由苹果绿色转变为紫色。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶（AUS），浓度为5U/ml，能方便的稀释为5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml这些浓度梯度。采用产气荚膜梭菌唾液酸酶适用于本发明少量精子的检测方法。
所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠，具有较高的灵敏度。
所述2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠的具体结构如下：
。
所述的检测缓冲液为含0.05 mmoL/L乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的PBS。检测缓冲液的缓冲体系，是针对唾液酸酶活性检测特定配制的。
优选地，所述乙酸钠的pH值为5-6，是针对唾液酶活性最佳的工作环境。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的评估方法中均选择常规试验试剂，并结合对精子检测的特殊性，降低了实验成本，所需的仪器设备、耗材种类少，仅为离心机、酶标仪、EP管、枪头和检测板等，均为常规实验室配置；并且操作方法简单，仅为离心、加样等，不存在需多次练习才能获得操作技巧的情况，适于应用于临床实验室和常规技术人员使用。
2、本发明的评估方法用于评估精子本身质量，筛查不孕不育的原因。根据单位酶活值的数据可作出人群表达唾液酸酶活性的临界值，根据该临界值，可在临床上通过单位酶活值初步判断精子的功能质量，用于评价男性不育的可能潜在原因，尤其是针对临床上不明原因性不育是否与唾液酸酶活性有关的情况。
3、本发明对精子进行充分的洗涤，充分除去残留的精浆成分，使精浆中残留的蛋白及唾液酸酶不会影响检测结果的准确性；优化了测精子蛋白浓度时设置的标准品蛋白浓度梯度和测酶活时设置的标准品酶活梯度，如果梯度设置不合理，均会很影响结果的灵敏度和准确性；使用黑色检测板测酶活，可明显降低光线对荧光试剂淬灭的负面影响，由此大大提高实验结果的稳定性、灵敏度和准确性；最终的检测结果设计为唾液酸酶活/蛋白浓度的值，这样可降低不同样本之间的差异，使彼此更具有可比性，保证检测结果的稳定性和可靠性。
附图说明
图1为采用本发明质量评估方法分别测定正常精子（人）和不育精子（人）的唾液酸酶活性/蛋白浓度的单位酶活值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
实施例1
检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，试剂盒包括细胞裂解液，磷酸缓冲液或者BWW培养液，蛋白酶抑制剂Cocktail，试剂A液，试剂B液，牛血清白蛋白，荧光试剂，唾液酸酶标准原液和检测缓冲液；所述细胞裂解液不含酶活抑制剂；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠；所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml；试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、精子的洗涤
收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；
B、提取精子蛋白
向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；
C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度
（1）用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋白标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释。
（2）按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37℃反应30min，然后用酶标仪读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。
D、测定精子唾液酸酶活性
（1）用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入检测缓冲液稀释。
（2）用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃避光孵育1小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。
采用本发明质量评估方法分别测定正常精子（人）和不育精子（人）的唾液酸酶活性/蛋白浓度的单位酶活值。结果显示正常精子的唾液酸酶活性明显高于不育精子（见图1）。
实施例2
检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，试剂盒包括细胞裂解液，磷酸缓冲液或者BWW培养液，蛋白酶抑制剂Cocktail，试剂A液，试剂B液，牛血清白蛋白，荧光试剂，唾液酸酶标准原液和检测缓冲液；所述细胞裂解液不含酶活抑制剂；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠；所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml；试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、精子的洗涤
收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；
B、提取精子蛋白
向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；
C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度
（1）用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋白标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释。
（2）按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37℃反应30min，然后用酶标仪读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。
D、测定精子唾液酸酶活性
（1）用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入检测缓冲液稀释。
（2）用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃避光孵育2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。
用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。
实施例3
检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：试剂盒包括细胞裂解液，磷酸缓冲液或者BWW培养液，蛋白酶抑制剂Cocktail，试剂A液，试剂B液，牛血清白蛋白，荧光试剂，唾液酸酶标准原液和检测缓冲液；所述细胞裂解液不含酶活抑制剂；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠；所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml；试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、精子的洗涤
收集新鲜液化精液标本，用BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；
B、提取精子蛋白
向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；
C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度
（1）用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋白标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释。
（2）按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37℃反应30min，然后用酶标仪读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。
D、测定精子唾液酸酶活性
（1）用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入检测缓冲液稀释。
（2）用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃避光孵育1.5小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。
用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。
实施例4
本实施例在实施例1的基础上：
所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，加入体积为精子体积的2倍。
实施例5
本实施例在实施例1的基础上：
所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，加入体积为精子体积的3倍。
所述的C步骤，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml。
实施例6
本实施例在实施例2的基础上：
所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，加入体积为精子体积的2.5倍。
所述的C步骤，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml。
所述的C步骤，酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。
实施例7
本实施例在实施例2的基础上：
所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，体积为精子体积的2.3倍。
所述的C步骤，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml。
所述的C步骤，酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。
所述C步骤的检测板为96孔透明板，所述D步骤的检测板为96孔黑板。
所述的D步骤，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。
实施例8
本实施例在实施例3的基础上：
所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，体积为精子体积的2倍。
所述的C步骤，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml。
所述的C步骤，酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。
所述C步骤的检测板为96孔透明板，所述D步骤的检测板为96孔黑板。
所述的D步骤，用检测缓冲液稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM。
所述的D步骤，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。
实施例9
本实施例在实施例3的基础上：
所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，体积为精子体积的3倍。
所述的C步骤，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml。
所述的C步骤，酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。
所述C步骤的检测板为96孔透明板，所述D步骤的检测板为96孔黑板。
所述的D步骤，用检测缓冲液稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM。
所述的D步骤，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。
实施例10
本实施例在实施例1的基础上：
所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2；试剂B液为：4％硫酸铜。
实施例11
本实施例在实施例1的基础上：
所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.3；试剂B液为：4％硫酸铜。
所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
实施例12
本实施例在实施例4的基础上：
所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.25；试剂B液为：4％硫酸铜。
所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述乙酸钠的pH值为5。
实施例13
本实施例在实施例6的基础上：
所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.28；试剂B液为：4％硫酸铜。
所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述乙酸钠的pH值为6。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
实施例14
本实施例在实施例8的基础上：
所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2；试剂B液为：4％硫酸铜。
所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液。
所述乙酸钠的pH值为5.5。
所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠。
实施例15
检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，试剂盒包括细胞裂解液，磷酸缓冲液或者BWW培养液，蛋白酶抑制剂Cocktail，试剂A液，试剂B液，牛血清白蛋白，荧光试剂，唾液酸酶标准原液和检测缓冲液；所述细胞裂解液不含酶活抑制剂；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠；所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml；试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、精子的洗涤
1. 新鲜液化精液标本收集 4-5ml（根据病人精子数量调整，冰上保存与运输）.
2. 加入等体积PBS，吹打均匀。
3. 低速离心（1500rcf/5min），弃去上清液。
4. 加入PBS至3-4ml，吹打均匀。
5. 低速离心（1500rcf/5min），弃去上清液，将上清液剩至300μl左右，吹打均匀。
6. 加入PBS至1ml，高速离心（4度，12000rpm/5min），尽可能弃去上清液。
B、提取精子蛋白
7. 向精子沉淀中加入2-3倍体积的裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail（终浓度为1X），吹打混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心（12000rpm/5min），上清液即蛋白提取物；
C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度
8. 用裂解液配制BSA蛋白标准原液（20mg/ml），取适量20mg/ml的蛋白标准原液，用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125/0mg/ml的浓度梯度将其稀释为蛋白标准溶液，向96孔透明板内依次加入20μl各蛋白标准溶液。
9. 加2微升待测样本于96孔板内，加裂解液至20微升。
10.按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液（室温24小时内稳定），将其加入上述各孔，200微升/孔。
11. 轻轻混匀30s，将96孔透明板置于37度反应30min，然后用酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度。
用于检测的孔内样本蛋白浓度应在0.1-2mg/ml范围内，如果超出则应将孔内待测样本的蛋白浓度调整在此线性范围之内。
D. 测定精子唾液酸酶活性
1. 用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向96孔黑板内依次加入50μl各唾液酸酶标准溶液。
2. 加25微升待测样本于96孔黑板内，加检测缓冲液至50微升。
3.用检测缓冲液按1:200稀释荧光试剂，将其加入上述各孔内，50微升/孔。
4. 将96孔黑板置于37度避光孵育1-2小时，然后用酶标仪在激发波长/发射波长为365/450nm波长下读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性。
5.最后将得到的唾液酸酶活性/总蛋白浓度，计算得出单位酶活值(U AUS/gprotein)即可。
用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3-5mU/ml范围内，如果超出则应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。

Claims (8)

1.检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：试剂盒包括细胞裂解液，磷酸缓冲液或者BWW培养液，蛋白酶抑制剂Cocktail，试剂A液，试剂B液，牛血清白蛋白，荧光试剂，唾液酸酶标准原液和检测缓冲液；所述细胞裂解液不含酶活抑制剂；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2-11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的荧光试剂是2′-4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠；所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml；试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
A、精子的洗涤
收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；
B、提取精子蛋白
向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；
C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度
（1）用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋白标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释；
（2）按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37℃反应30min，然后用酶标仪读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度；
D、测定精子唾液酸酶活性
（1）用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入检测缓冲液稀释；
（2）用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。
2.根据权利要求1所述的检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述乙酸钠的pH值为5-6。
3.根据权利要求1所述的检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述B步骤的细胞裂解液不含酶活抑制剂，加入体积为精子体积的2-3倍。
4.根据权利要求1所述的检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的C步骤，用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液的浓度为20mg/ml。
5.根据权利要求1所述的检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的C步骤，酶标仪在562nm波长下读取各孔吸光度。
6.根据权利要求1所述的检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述C步骤的检测板为96孔透明板，所述D步骤的检测板为96孔黑板。
7.根据权利要求1所述的检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的D步骤，用检测缓冲液稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM。
8.根据权利要求1所述的检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述的D步骤，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧光强度。
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