CN101490529B - 测量设备和方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于对样本中的颗粒或白血细胞进行计数的测量设备，其包括：保持器，其被设置成接收保持样本的样本获取装置；成像系统，其包括放大装置和至少一个数字图像获取装置，所述成像系统被设置成获取至少一幅样本的数字图像；以及图像分析器，其被设置成对数字图像进行分析以识别颗粒或白血细胞和确定颗粒或白血细胞的数量，且被设置成分析数字图像以识别在焦点上成像的颗粒或白血细胞、确定这些颗粒或白血细胞的类型(其中通过物理特征来辨别类型)和确定不同类型的颗粒或白血细胞的比值。

Description

测量设备和方法
技术领域
本发明涉及用于计数颗粒的测量设备和方法，所述颗粒是诸如血样这样的样本中的白血细胞。本发明还涉及用于分析样本的计算机程序。 
背景技术
有时，确定白血细胞数量对患者的治疗而言非常重要。这种分析常常是诊断例如白血病、或者传染性或炎症性疾病或者对治疗进行监视所需要的。希望能够尽可能快地获得分析结果以使患者的等待时间最短和使医师在对患者进行首次检查时就能够直接决定疗法和作出诊断。因此提供一种可由医师或护士快速执行而无需送去实验室化验的分析方法是优选的。确定白血细胞数量是在形成诊断时对患者执行的最常见的测试之一。因此，具有一种快速且简单的执行这种分析的方法是非常有利的。 
目前，白血细胞数量通常是通过对血样进行染色且在特殊的计数室(例如Bürker室)中显微观察该样本而经由手工操作程序来获得。该计数室设有将腔室划分成边界明确的小体积的栅格。白血细胞可沉淀在计数室的底部以使显微镜能够聚焦于腔室中的所有细胞，因而有助于计数。因此，在可以执行计数之前样本需要沉淀数分钟。然后可以通过计数栅格中的每个格子内的血细胞数量而确定白血细胞数。白血细胞数由分析化验员手工获得，其中所述分析化验员需要在执行这种分析方面富有经验以便能够执行可靠的分析。 
这种分析是费时的。另外，由于它要手动执行，因此分析结果会因执行这种分析的人员不同而发生变化。 
现有少数几种用于确定白血细胞数的自动分析方法。白血细胞数可以 通过Coulter原理来确定，所述原理基于通过检测阻抗确定细胞尺寸且由此确定细胞类型。在US 5,262,302中描述了用于通过Coulter原理计数白血细胞的方法。根据Coulter原理的测量设备非常昂贵，因此它是一种相当可观的投资。因而，医院或实验室不愿意投资多台设备。这意味着这种分析将必须在集中的场所内执行，且患者将需要等待分析结果。 
Coulter原理是当前正在使用的主要的自动分析方法。然而，还存在描述过的一些其它方法。在US 5,585,246中公开了这样一种用于确定白血细胞数的方法。在此处，血样必须通过与标记白血细胞的荧光染料和配位络合物混合而得到制备。该样本被引入毛细管且被对毛细管中的整个样本进行扫描的激光源辐照。荧光被测量以确定白血细胞的数量。在WO 97/02482中公开了类似的方法，其使用荧光染料和对整个毛细管进行扫描的激光源。该方法适于含有少量白血细胞的单采产品(apheresis products)中的白血细胞计数。在此处，毛细管非常厚，且在可以对毛细管进行扫描之前必须等待直至白血细胞已经沉淀在毛细管底部。 
在WO 99/45384中，示出了具有变化厚度的样本保持室。这种变化厚度使血液的不同化合物分离。用着色剂对血样进行染色以分类突出血样中的至少三种不同的白血细胞类型。白血细胞可通过用光学扫描仪器观察该腔室的一部分而得到计数。 
在WO 98/50777中，公开了一种用于估计乳液中的体细胞数量的方法。该方法包括：将一定体积的样本施加到样本隔室中，和将从样本隔室传来的电磁信号传送到检测元件阵列上。检测到的电磁信号的强度受到处理，且结果与存在于样本中的细胞数量相关联。 
仍然需要加速和简化用于确定白血细胞数的现有自动方法以便能够由任意用户执行这种分析而无需特别培训，以及使测量设备相对便宜些。这意味着这种分析可在护理地点提供。另外，由于白血细胞计数是一种常用分析，因此对该分析方法的任何改进都对患者的看护具有积极作用。能够在护理地点获得结果的分析方法将特别有利。 
而且，获得白血细胞分类计数、即检查血样中的不同类型的白血细胞 的分布是有利的。白血细胞分类计数可以揭露细胞分布是否正常、或者某种细胞是增加还是减少了。这些信息可用于诊断特殊类型的疾病。例如，嗜中性白血细胞的增加表明受到细菌感染，然而淋巴细胞的增加常见于急性病毒感染。 
白血细胞分类计数还可以通过显微观察和人工计数Bürker室中的经染色的血细胞而获得。还存在一些自动方法。例如，分类计数可以利用Coulter原理通过分析细胞穿过电场所产生的电脉冲的形状和尺寸而获得。脉冲的形状和尺寸会与正被检测的白血细胞的类型有关。在US 4,528,274中描述了这样一种方法。 
在US 5,123,055中公开了另一种用于识别不同类型的白血细胞的方法。该方法要求顺序分析数个尺寸和颜色参数以区分白血细胞类型。 
仍然希望能够加快和简化用于确定白血细胞分类计数的已有自动方法。提供快速、简单且相对便宜的分析方法以便能够在护理地点提供这种分析将会是特别有利的。 
发明内容
本发明的目标是提供了一种简单分析方法，其用于确定样本(诸如血样)中的颗粒(诸如白血细胞)的体积计数(volumetric enumeration)和确定颗粒分类计数(诸如白血细胞分类计数)。 
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种用于计数颗粒的测量设备，其中所述颗粒诸如是血样这样的样本中的白血细胞。 
该设备包括设置成接收包括保持样本的测量腔的样本获取装置的保持器，和适于获取至少一幅样本的放大数字图像的成像系统。该设备还包括图像分析器，其被设置成分析所获取的至少一幅数字图像以识别颗粒和确定样本中的颗粒数量，其中图像分析器被设置成分析所获取的至少一幅数字图像以识别在焦点上成像的颗粒和确定这些颗粒的类型和数量，其中通过颗粒的物理特征来辨别类型，从而确定样本中不同类型的颗粒的比值。 
成像系统可以包括放大装置和至少一个数字图像获取装置。 
根据一个实施例，该设备适于计数血样中的白血细胞，测量腔适于保持经染色和溶血的血样，其中图像分析器被设置成分析所获取的至少一幅数字图像以识别经染色的白血细胞和确定样本中的白血细胞数量，其中图像分析器被设置成分析所获取的至少一幅数字图像以识别在焦点上成像的白血细胞和确定这些白血细胞的类型和数量，其中通过白血细胞的几何特征来辨别类型，从而确定样本中不同类型的白血细胞的比值。 
根据本发明的另一方面，提供了一种用于计数样本中的颗粒的方法，所述方法包括：将样本采集到样本获取装置的测量腔中；获取至少一幅测量腔中的受辐照样本的放大数字图像；数字分析所述至少一幅数字图像以识别颗粒和确定样本中的颗粒数量；和数字分析所述至少一幅数字图像以识别在焦点上成像的颗粒和确定这些颗粒的类型和数量，其中通过颗粒的几何特征来辨别类型，从而确定样本中不同类型颗粒的比值。 
根据一个实施例，该方法适于血样中的白血细胞计数。该方法包括将血样采集到样本获取装置的测量腔中。将血样与试剂混合，其中所述试剂包括用于溶解血样中的红血细胞的溶血剂和用于对血样中的白血细胞进行染色的染色剂。染色剂优选选择性地对白血细胞进行染色，且不会对血样中的其它细胞进行染色。该方法还包括获取至少一幅测量腔中的样本的放大数字图像。该方法还包括数字分析所述至少一幅数字图像以识别被染色的白血细胞和确定样本中的白血细胞数量，以及数字分析所述至少一幅数字图像以识别在焦点上成像的白血细胞和确定这些白血细胞的类型和数量，其中类型通过被染色的细胞的几何特征来辨别，从而确定血样中不同类型的白血细胞的比值。 
本发明的测量设备和方法都能实现对全血样本的简单分析。为此，测量设备被设置成获取至少一幅血样数字图像，其中所述样本已混合了用于对白血细胞进行染色的染色剂。白血细胞的染色意味着白血细胞可以在数字图像中被辨别出，且不同类型的白血细胞可以在同一或另外的数字图像中通过细胞的几何特征辨别。 
测量设备和方法因此被设置成既确定血样中的所有白血细胞的体积计 数，又确定白血细胞的分类计数。 
然而很多现有方法也能够对不同血细胞和甚至血细胞的亚族群进行计数，但是根据本发明的测量设备特别适于分析白血细胞。试剂包括将溶解血样中的红血细胞的溶血剂。这消除了对样本中的红血细胞进行计数的可能性。另一方面，红血细胞的溶解简化了对血样中的白血细胞的区分和识别。 
另外，该测量设备特别适于分析所述至少一幅数字图像以识别在焦点上成像的细胞。这允许对相对较厚的样本进行成像，而只有处于焦点上的细胞被计数。考虑到对白血细胞总数进行计数要比识别白血细胞类型容易的多(因为分类需要被分析的细胞的更多细节)，这种特征特别有用。因此，通过确保只对处于焦点上的细胞进行计数，可以识别样本中的白血细胞类型，而所述样本同时可被用于确定样本中的白血细胞的统计上可靠的体积计数。 
本发明的测量设备和方法提供了对全血样本的简单分析。这种分析不需要复杂的测量设备或者要由操作人员执行的先进步骤。因此，它可以直接与对患者的检查一同执行，而无需有资质的技术人员。仅仅需要获取血样并且将其与染色剂混合。然后将血样放入测量设备的保持器中，且测量设备直接对此作出响应给出分析结果。 
事实上，血样可以在测量腔内与试剂混合。因此将不必手工进行样本制备。在几分钟或更短的时间内，血样与试剂的反应将溶解红血细胞和将白血细胞染色，使得样本可用于光学测量以获取所述至少一幅数字图像。血样可以例如通过让试剂分散或扩散到血样中、或者通过主动振动或移动样本获取装置以在测量腔中形成搅动而与试剂混合。 
测量设备还可以包括电磁辐射源，其被设置成对保持在样本获取装置的测量腔中的样本进行辐照。 
成像系统可以被设置成利用不同的光学配置获取多幅样本数字图像，其中图像分析器被设置成分析所获取的各幅数字图像以识别颗粒或者被染色的白血细胞，和确定样本中的颗粒或白血细胞数量，其中图像分析器被 设置成分析所获取的各幅数字图像以识别在焦点上成像的颗粒或白血细胞，和确定这些颗粒或白血细胞的类型和数量，其中类型通过颗粒或被染色的白血细胞的几何特征来辨别，从而确定样本中不同类型的颗粒或白血细胞的比值。 
通过在样本中的景深方向上的不同平面上获取多幅数字图像，甚至在采用高放大率的时候也能够分析相对较大的样本体积。高放大率因得到较小景深而使得难以在一幅图像中观察到整个体积。由于放大水平影响景深，因此获取多幅数字图像的步骤允许使用更大的放大率，这继而使得能够在各幅图像中依靠核的形状、数量或尺寸区分不同种类的白血细胞。 
根据另一实施例，成像系统被设置成在所获取的图像中提供与光方向有关的信息以方便聚焦，从而能够在所获取的图像中转移焦点。这意味着单幅图像既可用于通过一次分析样本的整个深度而计数样本中的白血细胞总数，又可用于通过当图像在血样的厚度的一部分位于焦点上的情况下被示出时对图像中的细胞进行分析而确定血样中的不同类型的白血细胞的比值。通过使用小透镜的阵列(例如复透镜)提供在所获取的图像中追踪光线的能力从而使得可以将图像的不同部分放在焦点上，可以获得包含光进入图像的方向的信息的图像。 
成像系统可被设置成利用不同光学配置获取样本的第一和第二数字图像，且其中图像分析器被设置成分析所获取的第一图像以确定样本中的颗粒或白血细胞数，且图像分析器被设置成分析所获取的第二数字图像以确定样本中不同类型的颗粒或白血细胞的比值。 
因此，该测量设备特别适于利用不同的光学配置获取两幅数字图像。这意味着光学配置可得到优化，且适于首先确定体积内的白血细胞数量，和其次确定不同类型的白血细胞的比值。 
成像系统可以包括两个至少部分独立的部分，其将光从受辐照的样本引至成像系统的第一和第二部分。 
用于确定白血细胞是否位于焦点上的动作可以通过利用细胞的细胞质可用作使光折射的透镜这一事实来执行。对于在焦点上成像的白血细胞， 胞核显示为黑暗阴影，而周围的细胞质则几乎不可见。胞核显示为其光强相当低的区域，而细胞质不对光强产生影响。 
对于离成像系统过近(过近以致于不在焦点上)地成像的白血细胞而言，胞核显示为黑暗阴影，而周围的细胞质则用作透镜且使光发生折射，这形成环绕胞核的暗圈。胞核显示为其光强相对于胞核的聚焦图像低很多的区域，细胞质显示出具有低光强。 
对于离成像系统过远(过远以致于不在焦点上)地成像的白血细胞，胞核显示为黑暗阴影，而周围的细胞质用作透镜且使光发生折射，这形成环绕胞核的亮圈。胞核显示为其光强相对于胞核的聚焦图像低很多的区域，而细胞质显示出具有高的光强。 
可选的是，对在焦点上成像的细胞的识别可以通过对成像细胞的边缘进行分析以基于强度在该边缘上的斜率估计该细胞是否在焦点上成像来执行。不在焦点上的细胞的强度在这些边缘上表现出缓慢的下降，而位于焦点上的细胞将成像成具有明显的边缘，因为其强度将在细胞边缘上出现较大的下降。因此，通过分析强度在成像细胞的边缘上如何变化，可以确定细胞是否是在焦点上成像。 
用于确定细胞类型的一种可选方式是通过在图像分析器中，针对特定的颗粒或细胞确定所述颗粒或细胞成像于其中的所述图像的数量，其中该数量从其中颗粒或细胞被确定是沿第一方向离开焦点的图像到其中颗粒或细胞被确定是沿第二方向离开焦点的图像计数。 
图像分析器可被设置成基于所述计数出的图像数，确定与所述颗粒或细胞的尺寸有关的几何特征。 
具有用于获取所述至少一幅数字图像的光学配置的成像系统可以具有1-50x、更优选1-20x、更优选3-20x、更优选5-20x且更优选约为10x的放大率。 
成像系统可以被设置成用其范围为2-60微米、更优选2-30微米、更优选约为8-10微米的景深获取所述至少一幅数字图像。 
当用于本文中时，“景深”将指光轴方向上的长度，其在得到充分聚 焦的情况下成像以允许图像分析识别出位于该长度内的细胞。该“景深”可以比由光学配置定义的常规景深大。随着放大率变大，该景深变小。 
电磁辐射源可以被设置成发射与染色剂的吸收峰相对应的波长。因此，通过在数字图像中显示出低透光率，积聚有染色剂的经染色的白血细胞将被检测出。 
电磁辐射源可以包括激光源。该激光源可提供具有精确定义的波长的光，所述波长与染色剂的吸收率相配。另外，激光源可以提供准直光以使杂散光的干扰最小，从而使得能够清楚地辨别出具有低透光率的点。 
可选的是，电磁辐射源可以包括发光二极管。这种辐射源仍然可以提供足以将白血细胞与样本中的其它物质区分开的辐照条件。 
图像分析器可以被设置成识别具有高的光吸收率的区域，以确定样本中的颗粒或白血细胞的数量。图像分析器可以被进一步设置成识别图像中的黑点或暗点。由于染色剂会积聚在白血细胞的胞核中，因此光吸收率会在独立的点上出现峰值。这些点将形成数字图像中的黑点，且可以被分类成白血细胞。 
图像分析器可以被设置成通过分析在所述至少一幅数字图像中识别出的光吸收率高的区域的形状和尺寸而辨别不同类型的颗粒或白血细胞。由于不同类型的白血细胞具有不同的尺寸，因此白血细胞的类型可以通过确定血细胞尺寸而得到辨别。另外，不同的类型会受到不同地染色，从而使得在数字图像中识别出的区域具有不同形状。这也可以被用于识别白血细胞的类型。说明三种不同类型的白血细胞的比值的白血细胞分类计数可通过分析血细胞尺寸而获得。辨别五种不同类型的白血细胞的白血细胞分类计数需要被调查的血细胞的更多特征。例如，可以检查各细胞的胞核数、穿透该血细胞的辐射强度或者血细胞的形状。 
染色剂可以被设置成选择性地对白血细胞的胞核进行染色。这意味着白血细胞可以作为彩色点而被识别，且因此容易在数字图像中得到辨别和计数。另外，染色点的尺寸可用于识别白血细胞类型，因为不同类型的白血细胞具有不同尺寸。 
染色剂可以是苏木精、亚甲蓝、亚甲绿、亚甲天蓝、乙酸甲苯酯紫、甲苯胺蓝、龙胆紫、苏丹类似物、棓花青、或品红类似物、或者它们的任意组合的组中的任何一种。然而应意识到：染色剂并不局限于这个组，而是可以想到很多其它的物质。 
溶血剂可以是季铵盐、皂草苷、胆汁酸(诸如脱氧胆酸)、毛地黄毒苷、蛇毒、吡喃葡萄糖苷或者Triton型非离子洗涤剂。然而应意识到：溶血剂并不局限于这个组，而是可以想到很多其它的物质。 
测量设备还可以包括由不同光学配置共享的物镜。这意味着数字图像可以通过沿同一光路进行成像而获得，以使得这些图像的中心在测量腔的同一点上。这使测量设备变得紧凑。 
根据一个实施例，成像系统可以包括两个至少部分独立的部分，其将光从受辐照的样本引至成像系统的第一和第二部分。这意味着从样本到成像系统的光路可以被定义在固定的光学配置中。因此，测量设备会是坚固耐用且对冲击不敏感的。 
成像系统还可以包括分束器，其用于将光从物镜引向成像系统的第一或第二部分。这意味着可同时获得第一和第二数字图像，从而分析可非常快地被执行。 
成像系统的第一部分可以被设置成直接从分束器处接收光，即在成像系统的第一部分与分束器之间未设置光学元件。或者，光可以被设置成直接从物镜传至成像系统的第一部分。然后为了获取第二数字图像，作为替代可以在光路中插入反射镜以将光偏转到成像系统的第二部分上。 
成像系统还在分束器和成像系统的适于获取数字图像的部分之间包括目镜。该目镜因此可以进一步放大样本以辨别不同类型的白血细胞。优选使用透镜组，然后目镜组将在物镜组的范围内移动虚主平面以改变像平面和物镜组之间的关系，从而允许得到更多的放大率。 
成像系统还可以在分束器和成像系统的适于获取数字图像的部分之间包括光学元件，其用于影响不处于成像系统的焦点上的细胞，从而便于识别在焦点上成像的白血细胞。 
该光学元件允许获取比成像系统的景深大很多的样本厚度的图像。该光学元件确保不考虑位于焦点之外的细胞从而提高测量结果的确定性。由于该光学元件影响位于焦点之外的细胞的成像，因此位于焦点上的细胞将易于识别。该光学元件可以实现为空间滤波器，其对细胞的成像产生作用以使细胞边缘包括比背景强度大的过调(overshoot)强度，其中细胞通过吸收光线而被成像。 
根据可选实施例，成像系统还可以在分束器和成像系统的第二部分之间包括波前编码元件。该波前编码元件通过让光线经过鞍形波片而故意使光线扭曲，其中所述鞍形玻片在中间相对平坦，但是具有裙状边。这引起特殊的光学像差，虽然图像看上去模糊，但是散焦在大段距离上都是一样的。该波前编码元件因此增加了沿光轴的分析深度。图像上的这种扭曲主要由散焦的波前编码元件的形状决定，其中所述形状是精确已知的。因此，计算机能够逐点消除模糊。计算机可以利用实质上是数字滤波器的东西对图像进行解码，由此形成在大景深上清晰的图像。通过这种方式，成像系统的景深可得到增加，从而使样本的更大深度能够在焦点上成像。 
根据另一实施例，成像系统的一部分被设置成既获取第一图像又获取第二图像，且成像系统的放大系统的至少一部分是可切换的以便能够利用不同的光学配置获取第一和第二数字图像。这意味着该测量设备只需要包括成像系统的一个单独部件。另外，通过例如提供可在光轴上的精确定义的位置之间移动的主透镜允许使用数种不同的光学配置。 
该成像系统可以被设置成在用于获取第二数字图像的光学配置中具有比用于获取第一数字图像的光学配置中的放大率大的放大率。这意味着在第二数字图像中能够更好地观察细节，从而更容易辨别不同类型的白血细胞。 
具有用于获取第一数字图像的光学配置的成像系统可以具有1-50x、更优选1-20x、更优选3-20x、更优选3-10x且更优选约为4x的放大率。在放大率的这些范围内，白血细胞得到充分放大以便能够被检出，同时成像系统可以被设置成在充分聚焦的范围内对样本厚度进行成像以便能够估计图 像中的血细胞数量。因此，成像系统可以具有覆盖样本厚度的景深。然而，利用景深的常规定义，整个样本厚度不必在成像系统的景深范围内成像。通过巧妙的图像分析，仍然可以正确地对略微偏离焦点成像的细胞进行计数。低放大率意味着可以获得大“景深”。因此允许大的样本厚度，和可以分析较大的体积。然而，如果使用低放大率，那么白血细胞会难以检测，因为每个血细胞被成像在非常少的像素(诸如3-4个像素)上。通过增加所获取的图像中的像素数量、即通过改善该数字图像的分辨率，可以使用更低的放大率。通过这种方式，可以使用1-4x的光学放大率，同时仍然能够检测出白血细胞。 
具有用于获取第二数字图像的光学配置的成像系统可以具有1-50x、更优选1-20x、更优选3-20x、更优选5-20x且更优选约为10x的放大率。在放大率的这些范围内，白血细胞被充分放大以便能够辨别不同类型的白血细胞。通过使用用于强调在焦点上成像的细胞和方便识别这些细胞的光学元件，可以使用更低的放大率。 
成像系统可以被设置成用至少为样本获取装置的测量腔的厚度的景深来获取第一图像。这意味着整个样本厚度均可获得充分聚焦，从而使得测量腔的整个厚度可以同时在样本的该数字图像中得到分析。因此，不必等待白血细胞沉淀在测量腔中，从而减少了用于分析的时间。然而，需要等待使红血细胞溶解的反应和等待因将样本引入测量腔而引起的运动停止。这些等待时间会非常短，在30秒或更少的量级上。通过选择不是非常严格地聚焦在样本的特定部分上，整个样本厚度得到充分聚焦以允许识别样本中的白血细胞数量。这意味着白血细胞会稍显模糊，却仍然被视为在景深的焦点上。样本的受到分析的体积因此由测量腔的厚度和数字图像的尺寸精确定义，其中所述尺寸说明了被成像的测量腔的横截面积。 
该成像系统可以被设置成用其范围在50-200微米内的景深来获取第一图像。该景深可以适于与测量腔的深度或厚度相对应。至少50微米的深度允许在小横截面积上分析较大体积的血液，从而避免将样本的血细胞挤入单层。因此，可以使用相对较小的血样图像分析足够大体积的血样以给出 可靠的白血细胞计数值。另外，难以在获得充分放大的数字图像的同时实现超过200微米的景深。甚至难以实现超过170微米的景深。 
该成像系统可以被设置成用其范围在2-60微米内的景深来获取第二图像。这可以通过对测量腔的厚度的一部分成像来实现。在这种情况下，只有测量腔厚度的一部分在焦点上成像。然后通过只考虑在得到充分聚焦的情况下成像的白血细胞来对第二数字图像进行分析以确定它们的类型。由于第二数字图像被用于确定不同类型的白血细胞的比值，因此成像体积是否得到精确定义并不重要。因此，能够通过对测量腔的同一部分成像而获得恰当的第一和第二图像。然而，可选地，也可以通过对测量腔的不同部分成像来获取第二图像，其中该部分可以具有与用于获取第二图像的成像系统的景深相对应的厚度。 
图像分析器可以被设置成对所获取的至少一幅图像进行电子放大。在样本被放大以获得样本的放大数字图像的同时，所获取的数字图像本身可以得到电子放大以简化对在所获取的数字图像中彼此非常接近地成像的目标的识别。 
根据本发明的另一方面，提供了一种用于血样中的白血细胞的计数的样本获取装置。该样本获取装置包括用于接收血样的测量腔。该测量腔具有在测量腔的内壁之间定义的第一和第二预设的固定厚度，其中第一厚度适于确定血样中的白血细胞的总体积计数，第二厚度适于确定血样中的不同类型的白血细胞的比值。样本获取装置还包括试剂，其以干燥的形式设置在限定测量腔的表面上。该试剂包括用于溶解血样中的红血细胞的溶血剂，和用于选择性地对血样中的白血细胞进行染色的染色剂。 
样本获取装置使得能够直接将全血样本采集到测量腔中和将其用于分析。而无需进行样本的制备。实际上，血样可以直接从刺破的患者手指吸入测量腔。向样本获取装置提供试剂使得能够在样本获取装置内发生反应，这使得样本随时可用于分析。该反应在血样接触试剂时开始。因此无需手工制备样本，这使得这种分析尤其适于在患者等待的同时直接在检查室内执行。 
由于试剂是以干燥的形式提供的，因此该样本获取装置可以被运输和进行长时间保存，而不会影响样本获取装置的有效性。因此，可以在对血样进行分析之前早早地制造和制备这种具有试剂的样本获取装置。 
尽管多种现有方法能够对不同的血细胞和甚至血细胞的亚族群进行计数，但是根据本发明的样本获取装置特别适于执行对白血细胞的计数。该试剂包括将溶解血样中的红血细胞的溶血剂。这消除了对样本中的红血细胞进行计数的可能性。另一方面，红血细胞的溶解简化了对血样中的白血细胞的区分和识别。 
染色剂提供了对单个白血细胞的标记。这使得能够单独地观察和检测白血细胞。可以例如通过扫描测量腔或获取测量腔的图像对白血细胞进行检测。 
该样本获取装置还提供了特别适于方便确定白血细胞的体积计数的测量腔第一厚度。该测量腔具有足够大的厚度以允许有相当大体积的血样用于分析，从而允许白血细胞的体积计数的确定具有良好的统计性。因此可以通过将在所定义的体积内单独检测到的白血细胞的数量加在一起而获得白血细胞计数。 
样本获取装置还提供了特别适于方便辨别不同类型的白血细胞的测量腔第二厚度。关于这一点，第二厚度可以比第一厚度薄，从而允许整个第二厚度在更大放大率的景深内成像。与仅用于确定血样中的白血细胞总数而不管类型的成像相比，在辨别不同类型的白血细胞时需要这种更大的放大率。 
样本获取装置可以包括具有两个平的表面的主体构件，所述表面形成用于限定所述测量腔的内壁。这些平表面可以被设置成彼此相隔预定距离以确定用于光学测量的样本深度。这意味着样本获取装置提供了用于光学测量的精确定义的深度，所述光学测量可用于精确确定单位体积的血样中的白血细胞计数。被分析的样本体积可以由测量腔的深度和样本的成像面积来精确定义。因此，该精确定义的体积可被用于将白血细胞数与血样体积联系在一起，以便确定白血细胞的含量。 
测量腔优选具有均匀的第一深度，其为50-200微米。至少为50微米的深度意味着测量腔不会迫使血样被涂成单层，从而使得能够在较小的横截面积上分析较大体积的血样。因此，可以使用相对较小的血样图像分析足够大体积的血样以给出可靠的白血细胞计数值。第一深度更优选至少为100微米，其允许分析甚至更小的横截面积或者分析更大的样本体积。另外，至少为50微米且更优选为100微米的第一深度还简化了在两平面之间具有精确定义的深度的测量腔的制造。 
对于设在其厚度不超过200微米的腔内的大多数样本而言，白血细胞的计数非常低以致于彼此重叠的白血细胞只会引起微小的偏差。然而，这种偏差的影响将与白血细胞计数有关，因此至少在某种程度上可以通过至少对白血细胞计数的较大值进行统计校正而得到处理。这种统计校正可以基于测量设备的标定。这种偏差对于其第一厚度不超过170微米的测量腔而言还会更少些，且对于其第一厚度不超过150微米的测量腔而言更少，从而可以采用更为简单的标定。这种厚度甚至可以不需要对重叠的血细胞进行任何标定。 
另外，测量腔的第一厚度足够小，以使测量设备能够获取使得该测量腔的整个深度可同时得到分析的数字图像。由于在该测量设备中将会使用放大系统，因此不容易获得大景深。因此，测量腔的第一厚度优选不超过150微米以使整个厚度能够同时在数字图像中得到分析。景深可被设置成处理170微米或者甚至200微米的测量腔第一厚度。 
测量腔优选具有均匀的第二厚度，其为20-60微米。该测量腔第二厚度将允许整个第二厚度在辨别不同类型的白血细胞所需要的放大率的景深内成像。另外，该第二厚度仍可提供足够的分析体积，从而使得有足够数量的白血细胞受到分析。这使得能够以良好的统计确定性确定不同类型的白血细胞的比值。通常需要分析200个白血细胞的类型。 
样本获取装置可以设有已施加到表面上的试剂，所述试剂溶解在挥发性液体中，而所述挥发性液体已经蒸发从而使试剂处于干燥的形式。 
已经认识到试剂在被插入测量腔之前要有利地溶解在挥发性液体中。 这意味着在样本获取装置的制造和制备过程中，液体可以以有效的方式从测量腔的狭窄空间中蒸发掉。该试剂可以优选地以干燥的形式被布置在测量腔的具有第一厚度的部分中。 
试剂可优选溶解在有机溶剂中，更优选地溶解在甲醇中。这些溶剂是挥发性的，且可以恰当地用于将试剂干燥到测量腔的表面上。 
样本获取装置还可以包括样本入口，其使测量腔与样本获取装置的外部相通，其中该入口被设置用于获取血样。该样本入口可被设置成通过毛细管作用力抽吸血样，且测量腔可以进一步地将血液从该入口吸入腔中。该样本获取装置还可以被设置成首先将样本吸入测量腔的具有第一厚度的部分。样本的部分然后可以通过毛细管作用力被进一步送入测量腔的具有第二厚度的部分。因此，通过简单地使样本入口接触血液可以轻易地将血样采集到测量腔中。然后，样本入口和测量腔的毛细管作用力将精确定义的数量的血液吸入测量腔。可选的是，可以通过向样本获取装置施加外部泵送力将血样吸入或抽入测量腔。根据另一种可选方式，血样可被采集到吸液管中，然后通过吸液管引入测量腔。 
样本获取装置可以是一次性的，即它被设置成只能使用一次。样本获取装置提供用于执行白血细胞计数的成套装置，因为样本获取装置能够接收血样和保持所有必要的试剂以给出用于细胞计数的样本。这是特别可行的，因为样本获取装置适于一次性使用，且可以在不考虑清洗样本获取装置和重新施加试剂的可能性的情况下形成。样本获取装置还可以用塑料材料模制而成，从而以低价率制造。因此，使用一次性的样本获取装置仍然具有成本效率。 
本发明还涉及一种包含在计算机可读介质中的用于样本分析的计算机程序产品，其包括：用于数字分析至少一幅样本图像以确定样本中的颗粒数的计算机代码；用于数字分析所述至少一幅样本图像以识别样本聚焦区域中的一种或多种颗粒的计算机代码，其中各种颗粒均与一种或多种辨别物理特征相关联；以及用于输出与样本中的颗粒数量和类型相对应的信息的计算机代码。本发明还涉及用于分析样本的计算机程序，该计算机程序 包括计算机程序代码，所述代码用于：分析至少一幅数字图像以识别颗粒和确定样本中的颗粒数；以及分析所述至少一幅数字图像以识别在焦点上成像的颗粒和确定这些颗粒的类型和数量，所述类型通过颗粒的物理特征来辨别，从而确定样本中不同类型的颗粒的比值。 
附图说明
现在将通过参考附图以举例的方式对本发明进行更详细的描述。 
图1是样本获取装置的示意图； 
图2是根据第一实施例的测量设备的示意性方框图； 
图3是根据第二实施例的测量设备的示意性方框图； 
图4是根据本发明第一实施例的方法的流程图； 
图5是根据本发明实施例的活动透镜构造的示意图； 
图6是根据本发明实施例的构造的示意图； 
图7示出了在三个不同层上成像的样本； 
图8a示出了当细胞位于根据图10的测量设备的焦点之外时，照相机视野中的白血细胞； 
图8b示出了当细胞在根据图10的测量设备的焦点上时，照相机视野中的白血细胞； 
图8c示出了当细胞位于根据图10的测量设备的焦点之外时，照相机视野中的白血细胞； 
图9a示出了当细胞位于根据图10的测量设备的焦点之外时，记录得到的被分析的细胞的截面强度； 
图9b示出了当细胞在根据图10的测量设备的焦点上时，记录得到的被分析的细胞的截面强度； 
图9c示出了当细胞位于根据图10的测量设备的焦点之外时，记录得到的被分析的细胞的截面强度； 
图10是根据第三实施例的测量设备的示意图； 
图11是根据本发明的第二实施例的方法的流程图；以及 
图12是根据第四实施例的测量设备的示意图。 
具体实施方式
现在参见图1，将描述根据第一实施例的样本获取装置10。样本获取装置10优选是一次性的，且将在用于分析之后被丢弃。这意味着样本获取装置10无需复杂的处理。样本获取装置10优选由塑料材料形成，且可以通过注塑成型的方式进行制造。这使得样本获取装置10的制造简单且廉价，从而可以使样本获取装置10的成本处于较低水平。 
样本获取装置10包括主体构件12，其具有底部14，所述底部可以由操作人员接触而不会对分析结果造成任何干扰。底部14还可以具有突出部16，其可以将保持器安装在分析设备中。突出部16可被设置成使样本获取装置10将被正确放置在分析设备中。 
样本获取装置10还包括样本入口18。样本入口18被限定在样本获取装置10的相对的壁之间，所述壁被设置成彼此接近以致于会在样本入口18中形成毛细管作用力。样本入口18与样本获取装置10的外部相通，以允许将血液吸入样本获取装置10。样本获取装置10还包括用于对白血细胞进行计数的腔室，其为设在样本获取装置10内部的相对的壁之间的测量腔20的形式。测量腔20被设置成与样本入口18相通。与样本入口18的壁相比，用于限定测量腔20的壁被设置成彼此更为接近，以便毛细管作用力可以将血液从样本入口18吸入测量腔20。 
测量腔20具有第一部分20a和第二部分20b，第一部分20a具有第一厚度，第二部分20b具有更小的第二厚度。第一部分20a与样本入口18相通，而第二部分20b与第一部分20a相通。因此，毛细管作用力可以将血液从测量腔20的第一部分20a吸入第二部分20b。 
测量腔20的第一部分20a的壁被设置成彼此相隔50-200微米的距离。第一部分20a更优选为至少100微米厚。另外，第一部分20a的厚度更优选不超过150微米。所述距离在整个第一部分20a上基本一致。第一部分20a的厚度限定了被检血液的体积。由于分析结果要与被检血样的体 积进行比较，所以第一部分20a的基本一致的厚度必须非常精确，即：在不同样本获取装置10的第一部分20a之间，厚度只允许有非常小的变化。厚度被选择成允许在腔的较小区域内获得相对较大的分析样本体积，以使可供计数的颗粒或细胞足够多。测量腔20的第一部分20a特别适于确定血样中的白血细胞总体积计数。第一部分20a的整个厚度可被选择成允许它在成像系统的景深内成像。然后对图像进行分析，并且计算该图像中的白血细胞数量以求出白血细胞体积计数。 
样本获取装置10通常适于测量比0.5×109细胞/升血液高的白血细胞计数。在白血细胞计数比之低很多的情况下，将会因样本体积过小而不能提供具有统计意义的数量的白血细胞用于计数。另外，当白血细胞计数超过12×109细胞/升血液时，在测量出的白血细胞计数中，因血细胞相互重叠而带来的影响将变得严重。在该白血细胞计数下，如果第一部分20a的厚度为140微米，白血细胞将覆盖分析样本的截面的约8％。因此，为了获得正确的白血细胞计数，这种影响必须加以考虑。因此，可以对高于12×109细胞/升血液的白血细胞计数的值进行统计校正。该统计校正将随着白血细胞计数的增大而增大，因为因血细胞重叠而带来的影响会随着白血细胞计数的增加而变大。该统计校正可通过测量设备的标定而求出。作为替换，可以基于一般水平求出该统计校正以设置与样本获取装置10结合使用的测量设备。该统计校正的量级与目前在利用Coulter原理的分析设备中执行的统计校正类似。预期样本获取装置10可用于分析与50×109细胞/升血液一般大的白血细胞计数。 
测量腔20的第二部分20b特别适于确定血样中不同类型的白血细胞的比值。第二部分20b的整个厚度将在成像系统的景深内成像。然后对图像进行分析，并且计算该图像中的各类白血细胞的数量以求出不同类型的白血细胞的比值。 
测量腔20的第二部分20b的壁被设置成彼此相隔20-60微米的距离。该距离在整个第二部分20b上基本一致。由于该分析主要用于将不同类型的白血细胞的数量相互作比较，所以是否知道确切的分析体积并不重要。 因此，第二部分20b的厚度不必像第一部分20a的厚度那样精确。第二部分20b的厚度必须允许用于分析的白血细胞数量足够多以便能够获得具有统计意义的结果。另外，如上所述，第二部分20b的厚度应适于全部都能够在成像系统的景深内成像。因此，样本中的所有白血细胞均在焦点上成像，且对样本的分析不受由在焦点外成像的样本部分引起的图像噪声的妨碍。第二部分20b比第一部分20a薄以便能够使用更大的放大率，同时允许整个第二部分在成像系统的景深内成像。需要更大的放大率以便不仅能够计算白血细胞的总数，而且还能够确定白血细胞的类型。 
测量腔20的壁的表面至少部分涂有试剂22。试剂22可被冻结干燥、加热干燥或真空干燥，且被施加到测量腔20的表面上。当血样被采集到测量腔20内时，血液将接触干燥的试剂22并且引发试剂22与血液之间的反应。 
通过利用吸液管或分配器将试剂22插入测量腔20来施加试剂22。在被插入测量腔20时，试剂22溶解在挥发性液体(例如甲醇这样的有机溶剂)中。具有试剂22的溶剂可充满测量腔20。然后进行干燥以使溶剂蒸发并且试剂22将附着在测量腔20的表面上。 
由于试剂将被干燥到狭窄空间的表面上，因此液体与环境大气的接触表面将会非常小，从而使得液体的蒸发更为困难。因此使用挥发性液体(诸如甲醇)是有利的，所述挥发性液体使得液体能够以有效的方式从测量腔的狭窄空间中蒸发。 
根据可选的制造方法，通过使两个片相互连接来形成样本获取装置10，其中一个片形成测量腔20的底壁，另一片形成测量腔20的顶壁。这允许在使两个片相互连接之前将试剂22干燥到开放表面上。因此，可以将试剂22溶解在水中，因为溶剂不必是挥发性的。 
试剂22包括红血细胞溶血剂和白血细胞染色剂。溶血剂可以是季铵盐、皂草苷、胆汁酸(诸如脱氧胆酸)、毛地黄毒苷、蛇毒、吡喃葡萄糖苷或者Triton型非离子洗涤剂。染色剂可以是苏木精、亚甲蓝、亚甲绿、亚甲天蓝、乙酸甲苯酯紫、甲苯胺蓝、龙胆紫、苏丹类似物、棓花青、或 品红类似物、或者它们的任意组合。当血样接触试剂22时，溶血剂将起到溶解红血细胞的作用以使溶解的红血细胞与血浆混合。另外，染色剂将积聚在白血细胞的胞核中。试剂22应该包含足量的染色剂以清楚地对所有白细胞的胞核进行染色。因此常常会有过剩的染色剂，其将混合在血浆中。过剩的染色剂将在血浆中形成染色剂的均匀的低背景水平。在染色剂的背景水平上，积聚在白血细胞中的染色剂可被识别。 
试剂22还可以包括其它组分，其可以是活性的(即参加与血样的化学反应)，或者是非活性的(即不参加与血样的化学反应)。活性组分可以例如被设置成对溶血或染色作用起催化作用。非活性的组分可以例如被设置成改善试剂22在测量腔20的壁的表面上的附着。 
在几分钟或者甚至不到一分钟内，血样将会与试剂22发生反应，以使红血细胞溶解和染色剂积聚在白血细胞的胞核内。 
现在参见图2，将描述用于对血样中的白血细胞进行分析的测量设备30的第一实施例。设备30包括样本保持器32，其用于接收带有血样的样本获取装置10。样本保持器32被设置成接收样本获取装置10以使样本获取装置10的测量腔20正确定位于设备30内。设备30包括光源34，其用于照射样本获取装置10内的血样。光源34可以是白炽灯，其在整个可见光谱上发光。积聚在白血细胞胞核中的染色剂将吸收特定波长的光，从而使得白血细胞的胞核显示在样本的数字图像中。如果得到彩色图像，白血细胞将显现为特殊颜色的点。如果得到黑白图像，白血细胞则将显现为较亮的背景下的黑点。 
作为替换，光源34可以是激光器或发光二极管。这可被用于提高图像中的对比度，以便能够更容易地检测出白血细胞。在这种情况下，光源34被设置成发出其波长对应染色剂的吸收峰的电磁辐射。该波长还应被选择成使血液中的非白血细胞成分的吸收相对较低。另外，样本获取装置10的壁对该波长应该基本透明。例如，当亚甲蓝被用作染色剂时，光源34可被设置成用波长为667nm的光辐照。 
设备30还包括成像系统36，其设在样本保持器32的与光源34相对 的那侧。成像系统36因此被设置成接收已穿透血样的辐射。此实施例中的成像系统36包括放大装置38，其分为两个独立部分。放大装置38的第一部分38a被设置成接收已穿透测量腔20的第一部分20a中的血样的辐射。成像系统还包括第一图像获取装置40，其被设置成对被放大装置38的第一部分38a放大的测量腔20的第一部分20a进行成像。放大装置38的第一部分38a被设置成提供1-50x、更优选1-20x且最优选1-4x的放大率。在放大率的这些范围内能够辨别出白血细胞。可以以改善的分辨率获取该图像，以便允许使用更低的放大率。另外，放大装置38的第一部分38a的景深可设置成包括测量腔20的厚度。 
放大装置38的第一部分38a包括设在样本保持器32附近的物镜或透镜系统42，和设置成与物镜42相隔一定距离的目镜或透镜系统44。物镜或透镜系统42和目镜或透镜系统44中的每一个可包括一个或多个单独的透镜或其它光学元件。物镜42提供对样本的首次放大，样本由目镜44进一步放大。放大装置38可以包括另外的透镜，用于实现样本的适当放大和成像。放大装置38的第一部分38a被设置成使测量腔20的第一部分20a中的样本在被放入样本保持器32内时将被聚焦在第一图像获取装置40的像平面上。 
第一图像获取装置40被设置成获取样本的第一数字图像。第一图像获取装置40可以是任何一种数字相机，诸如CCD-或者CMOS-相机。对在此描述的数字相机的参考应该仅被看作为图像分析部分的一个实施例。数字相机的像素尺寸对成像系统36形成限制，以便像平面上的模糊圈不会超出景深内的像素尺寸。然而，即使白血细胞稍显模糊却仍然可以被检测出，因此模糊圈可以超出像素尺寸而同时被看作落在景深内，如在上下文中定义的那样。因此在用于本文中时，“景深”将指光轴方向上的长度，其在得到充分聚焦的情况下成像以允许图像分析识别出位于该长度内的细胞。该“景深”不同于由光学配置定义的常规景深，且取决于要执行的特定图像分析。 
数字相机40将获取测量腔20的第一部分20a中的样本的第一数字图 像，其中：在用于对白血细胞进行计数的第一数字图像中整个样本厚度都得到充分聚焦。成像系统36限定测量腔20的第一部分20a的将成像在第一数字图像中的面积。该成像面积和测量腔20的第一部分20a的厚度一起限定被成像的样本的体积。 
放大装置38的第二部分38b被设置成接收已穿透测量腔20的第二部分20b中的血样的辐射。成像系统还包括第二图像获取装置41，其被设置成对被放大装置38的第二部分38b放大的测量腔20的第二部分20b进行成像。放大装置38的第二部分38b被设成提供5-200x、更优选5-100x且最优选5-20x的放大率。在放大率的这些范围内能够辨别白血细胞。可以以改善的分辨率获取图像以允许使用较低的放大率。另外，放大装置38的第二部分38b的景深仍可设成包括测量腔20的厚度。 
与第一部分38a类似，放大装置38的第二部分38b也包括设在样本保持器32附近的物镜或透镜系统43，和设置成与物镜43相隔一定距离的目镜或透镜系统45。同样，物镜或透镜系统43和目镜或透镜系统45中的每一个可以包括一个或多个透镜或其它光学元件。物镜43提供对样本的首次放大，样本由目镜45进一步放大。放大装置38可以包括另外的透镜或其它光学元件，用于实现样本的适当放大和成像。放大装置38的第二部分38b被设置成使测量腔20的第二部分20b中的样本在被放入样本保持器32内时将被聚焦在第二图像获取装置41的像平面上。 
第二图像获取装置41被设置成获取样本的第二数字图像。第二图像获取装置41可以是任何一种数字相机，诸如CCD-或者CMOS-相机。由于第二图像被用于确定白血细胞的不同类型，因此像平面上的模糊圈不可超出景深内的像素尺寸。数字相机41将获取测量腔20的第二部分20a中的样本的第二数字图像，其中：在用于识别所存在的白血细胞的类型的第二数字图像中，整个样本厚度得到充分聚焦。 
成像系统36可被设置用于在不必对成像系统36进行调节的情况下对样本获取装置10中的血样进行成像。优选，成像系统36被设在壳体内，所述壳体将成像系统保持成相对于样本保持器固定。 
设备30还包括图像分析器46。图像分析器46连接第一和第二数字相机40、41以接收由数字相机40、41获取的第一和第二数字图像。图像分析器46被设置成识别第一数字图像中的对应白血细胞的图案以计数存在于该数字图像中的白血细胞数量。因此，图像分析器46可被设置成识别较亮背景下的黑点。图像分析器46可以被设置成在分析数字图像之前首先将该数字图像电子放大。这意味着图像分析器46能够更轻易地辨别彼此靠近地成像的白血细胞，即使对数字图像的这种电子放大使得该数字图像稍显模糊。 
图像分析器46可包括处理器，其适于从第一和第二数字相机40、41处接收图像信息。该处理器可以配置有图像分析软件或算法，例如其精确特性适于执行本文所描述的分析。 
图像分析器46可以通过将在第一数字图像中辨别出的白血细胞数除以血样的体积而计算出单位体积血液中的白血细胞数，如上所述，所述血样体积已被明确定义。白血细胞体积计数可以在设备30的显示器上给出。 
图像分析器46还被设置成识别第二数字图像中的对应白血细胞的图案，以计算存在于该数字图像中的白血细胞数。图像分析器46还将分析所检测出的每个白血细胞的形状和尺寸，以确定该白血细胞的类型。因此，图像分析器46可设置成将较亮背景中的黑点识别为白血细胞。图像分析器46可设置成在分析数字图像之前首先对该数字图像进行电子放大。这意味着图像分析器46能够更轻易地辨别彼此靠近地成像的白血细胞，即使对数字图像的这种电子放大使得该数字图像稍显模糊。图像分析器46然后依据各种物理标准确定白血细胞的类型，其中一项重要标准是被成像的白血细胞的尺寸。依照文献，淋巴细胞的直径约为5-11微米，粒细胞的直径约为8-15微米，且单核白细胞的直径约为16-25微米。由于所期望的尺寸在某些情况下发生重叠，因此优选利用另外的信息来鉴别不同的白血细胞类型。这种信息例如为胞核的形状和/或尺寸。例如，可以通过在对应分叶核(segmented nucleus)的细胞内出现两个或更多个点而识别出粒细胞。这可被用来改进通过尺寸分类而进行的评估。 
可以通过利用另外的物理特性来获得分化成五个部分的白血细胞计数，其中粒细胞进一步分化为嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。分为三部分的白血细胞计数也可以利用这些附加物理特性而得到改善。该分析由此可以进一步检查所检测出的血细胞的形状。该分析还可以进一步检查穿透所检测出的血细胞的辐射强度。 
图像分析器46可以计算各类白血细胞的数量。图像分析器46通常可以对特定数量(例如1000)的白血细胞进行计数和分类。各类白血细胞的百分比或比值然后可以在将分类成属于该类型的白血细胞的数量除以被分析的白血细胞的总数时求出。通过对约200个白血细胞进行类型分析可以求出具有统计意义的测量结果。然而，希望更多数量的白血细胞被用于类型分析以改善统计性。另外，图像分析器46可以被设置成分析在得到充分聚焦的情况下成像以便被正确分类的白血细胞。而且在两个或多个白血细胞彼此非常接近的情况下，它们难以正确分开，因此这些白血细胞会被图像分析器46完全忽略。另一方面，由于成像系统36被设置成使测量腔20的第二部分20b的整个厚度在焦点上成像，因此图像分析器46可以仅根据第二数字图像确定各类白血细胞的体积计数。 
图像分析器46可以以处理单元的形式实现，其包括用于执行这种图像分析的代码。 
现在参见图3，将描述用于分析血样中的白血细胞的测量设备130的第二实施例。设备130包括样本保持器132，其用于接收带有血样的样本获取装置110。设备130被设置成接收样本获取装置110，其中测量腔120在整个成像区域上具有一致的厚度。因此，测量腔120具有与根据上面参考图1所描述的实施例的样本获取装置10的测量腔20的第一部分20a相一致的厚度。样本保持器132被设置成接收样本获取装置110以使样本获取装置110的测量腔120被正确定位在设备130内。设备130包括光源134，其用于以与第一实施例的光源34相一致的方式照明样本获取装置110内的血样。 
设备130还包括成像系统136，其被设在样本保持器132的与光源134 相对的那侧。成像系统136因此被设置成接收已穿透血样的辐射。此实施例中的成像系统136被设置成沿同一光路获取第一和第二数字图像以使这些图像的中心在测量腔120中的同一点上。仍用不同的光学配置获取样本的第一和第二数字图像。这可以以多种不同的方式来实现，其将在下面得到描述。 
如图3所示，成像系统包括放大装置138，其包括共用部分和两独立部分。放大装置138因此可包括物镜或透镜系统142，其被设在样本保持器132附近且由两光学配置共用以获取第一和第二数字图像。物镜142提供对样本的首次放大。成像系统136还可以包括分束器139，其用于沿两个不同方向将光引向第一和第二图像获取装置140、141，所述图像获取装置可以是任何一种数字相机，诸如CCD-相机。放大装置138包括第一目镜或透镜系统144，其被设置在分束器139与第一数字相机140之间。物镜142提供对样本的首次放大，样本由目镜144进一步放大。放大装置138可以包括另外的透镜或光学元件，用于实现样本在第一数字图像中的恰当放大和成像。 
放大装置138还包括第二目镜或透镜系统145，其被设在分束器139和第二数字相机141之间。物镜142提供对样本的首次放大，样本由目镜145进一步放大。放大装置138可以包括另外的透镜或光学元件，用于实现样本在第二数字图像中的恰当放大和成像。物镜142和目镜145可以以透镜组的形式实现，目镜组145然后在物镜组142的范围内移动虚主平面以改变像平面与物镜组142之间的关系从而获得另外的放大率，与之同时，样本获取装置110相对于物镜组142不动。通过这种方式可以在第一和第二数字图像中获得不同的放大率。 
特别是，该实施例所示的放大装置138包括光学元件147，其加强了位于焦点上的白血细胞的成像。这使得识别何种血细胞在焦点上成像且因此何种血细胞在辨别不同白血细胞类型时应加以考虑的能力得到提升。 
光学元件147允许获取比捕获第二数字图像的成像系统136的部分的景深大很多的样本厚度的图像。光学元件147确保不考虑位于焦点之外的 细胞从而提高测量结果的确定性。由于光学元件147影响位于焦点之外的细胞的成像，因此位于焦点上的细胞将易于识别。光学元件147可以实现为空间滤波器，其对细胞的成像产生作用以使细胞边缘包括比背景强度大的过调强度，其中细胞通过吸收光线而成像。这可在图像分析中轻易地检出，因此可以迅速放弃考虑这些细胞。 
根据可选实施例，放大装置可以在分束器139与第二数字相机141之间包括波前编码元件。该波前编码元件因此可以替代光学元件147。波前编码元件通过让光线经过鞍形波片而故意使光线扭曲，其中所述鞍形玻片在中间相对平坦，但是具有裙状边缘。这引起特殊的光学像差，虽然图像看上去模糊，但是散焦在大段距离上都是一样的。该波前编码元件因此增加了沿光轴的分析深度。图像上的这种扭曲主要由散焦的波前编码元件的形状决定，其中所述形状是精确已知的。因此，计算机能够逐点消除模糊。计算机可以利用实质上是数字滤波器的东西对图像进行解码，由此形成在大景深上清晰的图像。通过这种方式，放大装置可以增加成像系统的景深，从而使样本的更大深度能够在焦点上成像。 
在该实施例中，分束器可被取代，成像系统136可包括反射镜或其它元件(未示出)，用于基本上将所有来自样本的光引向在两个数字相机140、141中选定的那一个。反射镜然后可以被转动或移动以变换正在观察样本的相机140、141。这使得能有更多的光传到数字相机140、141上，因此为获取图像提供更好的光照条件。然而，这两个图像不可同时记录，且成像系统136将需要活动部件。根据一种可选方式，相机之一可以被设置成在反射镜被完全移离光路时观察样本。 
根据另一可选方式，物镜142可以提供获取第一图像所需的所有放大。因此，光可以直接从分束器或反射镜传至第一数字相机140。 
根据又一可选方式，没有物镜被第一和第二光学配置所共用。因此，分束器或反射镜可被设在样本保持器132附近，放大装置138可以在分束器与第一数字相机140之间和分束器与第二数字相机141之间的光路上都既包括物镜又包括目镜。 
根据进一步的可选方式，第一和第二数字图像由一个数字相机来获取。在这种情况下，放大装置138必须被切换或改变来改变光学配置以获取这两幅数字图像。因此，物镜242可以在明确限定的两个不同位置之间移动，如图5所示那样。物镜242因此被设置成沿光轴移动并且将接触挡块，例如光轴的边缘接触突出部250、252。物镜与样本获取装置之间的距离因此可得到精确控制以控制所获取的图像的放大率。 
在上述可选方式中的任何一个中，第一数字相机140被设置成利用由放大装置138提供的第一光学配置对测量腔120进行成像。放大装置138因此被设置成提供1-50x、更优选1-20x、且最优选1-4x的放大率。在放大率的这些范围内能够辨别白血细胞。可以以改善的分辨率获取该图像以允许使用较低的放大率。另外，放大装置138的景深仍可设置成包括测量腔120的厚度。 
如参考图2所示的第一实施例所描述的那样，第二实施例中的第一数字相机140被设置成获取样本的第一数字图像。第一数字相机140观察样本以使测量腔120的整个厚度均落在关于第一实施例所定义的景深内。成像系统136限定测量腔120的将成像在第一数字图像中的面积。该成像面积和测量腔120的厚度一同限定正被成像的样本的体积。 
另外，在上述实施例中的任何一个中，第二数字相机141被设置成利用由放大装置138提供的第二光学配置对测量腔120进行成像。放大装置138被设置成提供5-200x、更优选5-100x、且最优选5-20x的放大率。在放大率的这些范围内能够辨别白血细胞。可以以改善的分辨率获取该图像以允许使用较低的放大率。然而，由于第二数字图像所观察的测量腔120的部分与第一数字图像相同，因此在第二光学配置中使用更大的放大率会阻碍测量腔120的整个厚度在景深内成像。因此，第二数字图像不仅将对处于焦点上的白血细胞成像而且还将对血样的处于焦点之外的白血细胞和其它部分成像，从而在图像中产生模糊干扰。在这些情况下，上述光学元件147将改善识别在焦点上成像的细胞的几率，从而使得更易于进行分类。 
放大装置138可以有利地被设置成使测量腔120的厚度的顶部处于第 二数字相机141的像平面中的焦点上。这意味着血样的处于焦点之外的那些部分的干扰位于底部附近，且保持相对较低。然而，可以想象使测量腔120的任意部分成像在第二数字图像中的焦点上。另外，放大装置138可被设置成通常使测量腔120的20-60微米的厚度成像在焦点上。 
根据又一可选实施例，如图6所示，只获取一幅数字图像。然而，该数字图像需要提供被检光的方向信息。这意味着该数字图像不仅包含被检辐射的信息，而且还包含被检辐射在空间中的发射点的信息。该数字图像然后可以以数字图像的焦点可根据需要移动的方式给出。该数字图像因此可以首先被用于对测量腔的整个深度内的白血细胞总数进行计数，其次通过将焦点移至厚度的一部分而确定样本中不同类型的白血细胞的比值。该可选方式可以如图6所示那样来实现，其包括光源334、物镜342和一个数字相机340。这些部分的实现方式可以与上述方式类似。该设备还包括小透镜阵列360，其被设置在样本获取装置110与数字相机340之间的光路上。所述小透镜阵列360使得能够在所获取的图像中追踪光线以便可以将图像的不同部分放在焦点之上。 
现在参见图3，设备130还包括图像分析器146。图像分析器146连接第一和第二数字相机140、141以接收由数字相机140、141获取的第一和第二数字图像。或者，图像分析器146只接收一幅包含光的方向信息的数字图像，正如在上一段落中描述的那样。图像分析器146被设置成以与关于上述第一实施例的图像分析器46描述的方式类似的方式分析第一和第二数字图像。然而，由于第二数字图像可以通过只对样本厚度的落在景深中的那部分成像来获得，因此图像分析器146必须更仔细地处理第二数字图像。首先，图像分析器146将只分析被识别出在焦点上成像的白血细胞。这是可行的，因为图像分析器146可以只确定不同类型的白血细胞的比值，且因此将不必精确知道分析样本的体积。在焦点之外成像的细胞会是模糊的，以致于图像分析器146不能正确确定这些细胞的尺寸，从而将这些细胞错误分类。因此，通过确保只分析在焦点上成像的细胞，该分析的确定性得到改善。 
图7示出了在样本710的三个不同层720a-c上成像的样本。层720b表示焦平面，其将在下面详细讨论。光学系统具有景深，在该景深内物体可以被视为处于焦点上，即使他们并不是正好落在焦平面上。在图7中，用虚线720b’来表示焦平面720b的景深。 
图8a-c示出了相机视图中的三种不同白血细胞，图9a-c示出了它们对应的光分布。 
图8b示出了在焦点上成像的白血细胞。胞核显示为黑色阴影，而周围的细胞质则几乎不可见。在图9b中示出了光强分布。胞核显示为其光强相当低的部分，而细胞质则不对光强产生影响。 
图8a示出了离图像获取装置441过近以致于不能在焦点上成像的白血细胞。胞核显示为黑色阴影，而周围的细胞质则用作透镜且使光发生折射和散射，这形成环绕胞核的黑圈。在图9a中示出了光强的分布。胞核显示为其光强相当低的部分，细胞质显示出具有低光强。 
图8c示出了离图像获取装置441过远以致于不能在焦点上成像的白血细胞。胞核显示为黑色阴影，而周围的细胞质用作透镜且使光发生折射，这形成环绕胞核的亮圈。在图9c中示出了光强的分布。胞核显示为其光强相当低的部分，而细胞质显示出具有高的光强。 
图像分析器146进一步设置成确定在焦点上成像的白血细胞的尺寸。所确定的尺寸然后可被用于对白血细胞进行分类，其中所述分类方式与上面参考第一实施例所描述的方式相当。由于第二数字图像会有些模糊和难以分析，图像分析器146可被设置成只对相对较小数量(比如说200)的白血细胞进行计数和分类。这仍然足以形成样本中的不同类型白血细胞的比值的具有统计意义的结果。作为可选方式，图像分析器146被设置成在同一图像处理步骤中测量尺寸和验证细胞是否在焦点上成像。因此，每个被成像的细胞的尺寸均被求出，但是在确定样本中的不同类型白血细胞的比值时只考虑在焦点上成像的细胞。 
图像分析器146可以以处理单元的形式实现，其包括用于执行这种图像分析的代码。 
当采用图7-9a-c的原理和图10的配置时，设备30可被设置成利用不同的光学配置获取样本的数幅数字图像。例如，所述数幅数字图像可以对图10所示的样本710的十个不同的层720a-j进行成像。图像分析器被设置成针对特殊的颗粒或细胞确定所述颗粒或细胞成像于其中的所述图像的数量。图像的计数从其中颗粒或细胞被确定是沿第一方向离开焦点的图像开始，经由其中颗粒或细胞被确定是位于焦点上的图像继续，且以其中颗粒或细胞被确定是沿第二方向离开焦点的图像结束。第一和第二方向是关于焦平面的基本相反的法线。在图8a和图9a中，细胞被确定是沿第一方向离开焦点。沿该方向离开焦点的极限被确定是其中特定细胞的不同区域(中心区域和环状区域)之间的对比度被测出最大的图像。对于更接近成像系统的细胞，将检测到具有环绕黑暗胞核的黑环的相同的基本形状，但是它们会更为模糊，且对比度将低于确定为沿第一方向离开焦点的极限的图像中的对比度。类似地，通过识别在哪幅图像中检测到在黑暗胞核和环绕胞核的光之间存在最大对比度确定其它极限。在其焦平面离成像系统更远的图像中，细胞将仍被检测为黑暗的胞核和光圈，但是它们将会更加模糊，且对比度将低于被看作是沿第二方向离开焦点的极限的图像中的对比度。 
这将给出关于相应白血细胞的曲率半径的信息。相比较小的白血细胞将给出相比较短的焦距，且将在对处于极限图像之间的图像进行计数时，得到相比较低的图像数。这也可以被表达成它们快速移入和移离焦点。相比较大的白血细胞将给出相比较长的焦距，且在其中它们沿一个方向离开焦点的图像与其中它们沿另一方向离开焦点的图像之间的距离将相比较大。这也可以被表达成：当将所获取的不同图像与来自相邻层的图像作比较时，它们将缓慢地移入和移离焦点。注意：焦距和极限图像涉及距离，但是利用关于相应图像的在焦平面上的特定距离，距离可以替换表示成图像的数量。 
图10的实施例包括光源434、样本获取装置410、光学系统438(其具有10x的放大系数)、将光引至图像获取装置440的光圈450。参见图4， 将描述用于白血细胞的体积计数的方法。该方法包括将血样采集到样本获取装置的步骤102。未经稀释的全血样本被采集到样本获取装置中。可以从毛细管血或静脉血中采集样本。毛细管血的样本可以直接从刺破的患者手指抽入测量腔。血样接触样本获取装置中的试剂，引发反应。红血细胞将被溶解，且染色剂将积聚在白血细胞的胞核中。在采集血样之后的几分钟内，样本就可以用于分析。可选的是，采集样本且在将其引入样本获取装置之前使其与溶血剂和染色剂混合。在步骤104，样本获取装置然后被放入分析设备。通过按压分析设备的按钮来启动分析。或者，该分析通过设备检测到样本获取装置的存在而自动启动。 
在步骤106，样本被辐照，且在步骤108，利用不同的光学配置获取样本的第一和第二数字图像。用其波长与染色剂的吸收峰相对应的电磁辐射辐照样本。这意味着数字图像将在白血细胞胞核的位置上包含有黑色或者较暗的点。 
在步骤110，所获取的数字图像被传给图像分析器，所述图像分析器执行第一和第二数字图像的图像分析。图像分析器对第一数字图像中的黑点数进行计数，以确定血样中的所有白血细胞的体积计数。该图像分析器还分析第二数字图像中的一定数量的黑点的尺寸和形状，以对白血细胞进行分类和获取血样中的不同类型的白血细胞的比值。 
根据图11所示的另一实施例，图像获取步骤108b包括在不同层上获取多幅数字图像。 
在图像分析器中，对(来自各层的)相应的数字图像进行分析以确定哪些白血细胞位于焦点上，且针对这些白血细胞对图像进行分析以对白血细胞进行分类，和获取血样中不同种类的白血细胞的比值。 
应强调：在此描述的优选实施例并非限制性的，且在由所提交的权利要求定义的保护范围内存在多种替换实施例。 
图10的设备可以是独立的单元，因为可以在确定相应白血细胞的分类的同时确定白血细胞的总数。或者，图10的设备可以被用作图2的实施例中的图像获取装置41，或者用作图3的实施例中的图像获取装置141。这 种设计在图12中大体示出。该实施例包括光源534、光圈550、样本获取装置510、分束器539、将光引至第一图像获取装置540的第一光学系统538a(其具有约3x的第一放大系数)，和经由反射镜534将光引至第二图像获取装置541的第二光学系统538b(其具有约10x的第二放大系数)。第二光学系统还包括用于改变焦点的装置542，或者是活动的。因此，第二获取装置541能够获取多幅数字图像。在一个实施例中，第一图像获取装置540被省略，且颗粒或白血细胞的总数从由第二图像获取装置541获取的图像中求出。 

Claims (41)

1.一种用于对样本中的白血细胞进行计数的测量设备，所述设备包括：
保持器，其被设置成接收样本获取装置，所述样本获取装置包括用于接收样本的测量腔，其中所述样本获取装置包含试剂，所述试剂以干燥的形式设置在限定测量腔的表面上，所述试剂包括用于样本中的红血细胞的溶血剂和用于样本中的白血细胞的染色剂；
成像系统，其适于利用不同的光学配置获取样本在沿光轴方向的不同平面上的多幅放大数字图像；以及
图像分析器，其被设置成对所获取的每一幅数字图像进行分析以识别染色的白血细胞和确定样本中的白血细胞数，其中所述图像分析器被设置成分析所获取的每一幅数字图像以识别在焦点上成像的白血细胞和确定这些白血细胞的类型和数量，所述类型通过染色的白血细胞的物理特征来辨别，其中在所获取的每一幅数字图像中，只有处于焦点上的白血细胞被计数，从而确定样本中不同类型的白血细胞的比值。
2.如权利要求1所述的测量设备，还包括电磁辐射源，所述电磁辐射源被设置成对保持在所述样本获取装置的测量腔中的样本进行辐照。
3.如权利要求1所述的测量设备，其中：所述成像系统被设置成在所获取的图像中提供光的方向信息，从而能够在所获取的图像中转移焦点。
4.如权利要求1所述的测量设备，其中：所述成像系统被设置成利用不同光学配置获取样本的第一和第二数字图像，其中所述图像分析器被设置成分析所获取的第一数字图像以确定样本中的白血细胞的数量，且所述图像分析器被设置成分析所获取的第二数字图像以确定样本中不同类型的白血细胞的比值。
5.如权利要求4所述的测量设备，其中：所述成像系统包括两个至少部分独立的部分，其将光从受辐照的样本引至所述成像系统的第一和第二部分。
6.如权利要求1所述的测量设备，其中：所述图像分析器被设置成分析被成像的白血细胞的边缘，以基于在所述边缘上的强度斜率估计所述白血细胞是否在焦点上成像。
7.如权利要求1所述的测量设备，其中：所述图像分析器被设置成针对特定白血细胞确定所述特定白血细胞成像于其中的图像的数量，其中所述数量从其中白血细胞被确定是沿第一方向离开焦点的图像到其中白血细胞被确定是沿第二方向离开焦点的图像计数。
8.如权利要求7所述的测量设备，其中：所述图像分析器被设置成基于所述计数出的图像数，确定与所述白血细胞的尺寸有关的物理特征。
9.如权利要求1所述的测量设备，其中：具有用于获取所述多幅放大数字图像的光学配置的成像系统具有1-50x的放大率。
10.如权利要求9所述的测量设备，其中：具有用于获取所述多幅放大数字图像的光学配置的成像系统具有1-20x的放大率。
11.如权利要求9所述的测量设备，其中：具有用于获取所述多幅放大数字图像的光学配置的成像系统具有3-20x的放大率。
12.如权利要求9所述的测量设备，其中：具有用于获取所述多幅放大数字图像的光学配置的成像系统具有5-20x的放大率。
13.如权利要求9所述的测量设备，其中：具有用于获取所述多幅放大数字图像的光学配置的成像系统具有10x的放大率。
14.如权利要求1所述的测量设备，其中：所述成像系统被设置成用范围为2-60微米的景深获取所述多幅放大数字图像。
15.如权利要求14所述的测量设备，其中：所述成像系统被设置成用范围为2-30微米的景深获取所述多幅放大数字图像。
16.如权利要求14所述的测量设备，其中：所述成像系统被设置成用范围为8-10微米的景深获取所述多幅放大数字图像。
17.如权利要求2所述的测量设备，其中：所述电磁辐射源被设置成用与染色剂的吸收峰相对应的光波长进行辐照。
18.如权利要求2所述的测量设备，其中：所述电磁辐射源包括激光源。
19.如权利要求2所述的测量设备，其中：所述电磁辐射源包括发光二极管。
20.如权利要求1所述的测量设备，其中：所述图像分析器被设置成识别具有高的光吸收率的区域，以确定样本中的白血细胞的数量。
21.如权利要求20所述的测量设备，其中：所述图像分析器被设置成识别暗点以确定样本中的白血细胞的数量。
22.如权利要求1所述的测量设备，其中：所述图像分析器被设置成通过分析在所述多幅放大数字图像中识别出的光吸收率高的区域的形状和尺寸而辨别不同类型的白血细胞。
23.一种用于对样本中的白血细胞进行计数的方法，所述方法包括：
将样本采集到样本获取装置的测量腔中，试剂以干燥的形式设置在限定测量腔的表面上，从而所述样本与所述试剂相混合，所述试剂包括用于样本中的红血细胞的溶血剂和用于样本中的白血细胞的染色剂；
辐照保持在样本获取装置的测量腔中的样本；
利用不同的光学配置获取测量腔中的受辐照样本的在沿光轴方向的不同平面上的多幅放大数字图像；
数字分析每一幅数字图像以识别染色的白血细胞和确定样本中的染色的白血细胞的数量；以及
数字分析所述每一幅数字图像以识别在焦点上成像的白血细胞和确定这些白血细胞的类型和数量，其中通过染色的白血细胞的物理特征来辨别所述类型，其中在所述每一幅数字图像中，只有处于焦点上的白血细胞被计数，从而确定样本中不同类型的白血细胞的比值。
24.如权利要求23所述的方法，其中：获取所述多幅放大数字图像以使得在所获取的图像中记录光的方向信息，从而能够在所获取的图像中转移焦点，且其中通过顺序转移焦点来执行分析。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述获取多幅放大数字图像包括：获取测量腔中的样本的具有第一放大率的第一数字图像，和获取测量腔中的样本的具有第二放大率的第二数字图像，其中所述第二放大率大于所述第一放大率，其中对所获取的第一数字图像进行分析以确定样本中的白血细胞的数量，和对所获取的第二数字图像进行分析以确定样本中的不同类型的白血细胞的比值。
26.如权利要求23所述的方法，还包括：针对特定白血细胞确定所述特定白血细胞成像于其中的所述图像的数量，其中所述数量从其中白血细胞被确定是沿第一方向离开焦点的图像到其中白血细胞被确定是沿第二方向离开焦点的图像计数。
27.如权利要求26所述的方法，其中：基于所述计数的图像数，确定与所述白血细胞的尺寸有关的物理特征。
28.如权利要求23所述的方法，其中：使用1-50x的放大率获取所述多幅放大数字图像。
29.如权利要求28所述的方法，其中：使用1-20x的放大率获取所述多幅放大数字图像。
30.如权利要求28所述的方法，其中：使用3-20x的放大率获取所述多幅放大数字图像。
31.如权利要求28所述的方法，其中：使用5-20x的放大率获取所述多幅放大数字图像。
32.如权利要求28所述的方法，其中：使用10x的放大率获取所述多幅放大数字图像。
33.如权利要求23所述的方法，其中：所述成像系统被设置成用范围为2-60微米的景深获取所述多幅放大数字图像。
34.如权利要求33所述的方法，其中：所述成像系统被设置成用范围为2-30微米的景深获取所述多幅放大数字图像。
35.如权利要求33所述的方法，其中：所述成像系统被设置成用范围为8-10微米的景深获取所述多幅放大数字图像。
36.如权利要求23所述的方法，其中：用波长对应染色剂的吸收峰的光辐照样本。
37.如权利要求23所述的方法，其中：用激光源执行所述辐照。
38.如权利要求23所述的方法，其中：用发光二极管执行所述辐照。
39.如权利要求23所述的方法，其中：所述分析包括识别具有高的光吸收率的区域，以确定样本中的白血细胞的数量。
40.如权利要求39所述的方法，其中：所述分析包括识别暗点以确定样本中的白血细胞的数量。
41.如权利要求23所述的方法，其中：所述分析包括通过分析在所述多幅放大数字图像中识别出的光吸收率高的区域的形状和尺寸而辨别不同类型的白血细胞。
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