JP2009544035A - 測定装置、方法、及びコンピュータ・プログラム - Google Patents

Abstract

試料中の粒子又は白血球を計数する測定装置は、試料を保持する試料取得装置を受けるように構成されたホルダと、拡大手段及び少なくとも１つのデジタル画像取得手段を備え、試料の少なくとも１つのデジタル画像を取得するように構成された撮像システムと、画像分析器であって、デジタル画像を分析して、粒子又は白血球を識別し、且つ粒子又は白血球の数を求めるように構成され、並びにデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子又は白血球を識別し、これらの粒子又は白血球の型を判別し、且つ粒子又は白血球の異なる型の比を求めるように構成され、これらの型が物理的特徴によって区別される、画像分析器とを備える。

Description

本発明は、血液試料などの試料中の白血球などの粒子を計数する測定装置及び方法に関する。本発明はさらに、試料を分析するためのコンピュータ・プログラムに関する。

白血球数を求めることは、患者の治療に関連して重要になることが多い。この分析は、たとえば白血病又は感染性若しくは炎症性疾患を診断するために、或いは治療を監視するために必要とされることがある。患者の待ち時間を最小限にするために、並びに医師が患者を最初に診察したときに治療及び診断をすぐに決定できるようにするために、分析結果をできるだけ早く得られるようにすることが望ましい。したがって、医師又は看護師が迅速に実行でき、検査室へ試験に出す必要のない分析方法を提供することが好ましいはずである。白血球数を求めることは、診断を確立する際に患者に対して実行される最も一般的な試験の１つである。したがって、分析を実行する迅速且つ簡単な方法があると非常に有利であるはずである。

現在、白血球数は通常、血液試料を染色し、且つこの試料を特殊な計算盤、たとえばバーカー（Ｂｕｒｋｅｒ）計算盤に入れて顕微鏡で見ることによって、手作業で得られる。この計算盤は、計算盤を明確に画定された小さな体積に分ける格子を備える。白血球を計算盤の底部に沈澱させて、顕微鏡で計算盤内のすべての細胞に焦点を合わせることができるようにし、したがって計数を容易にする。したがって、試料は、計数を実行できるようになるまで、数分間沈澱させる必要がある。次いで、格子内の１枠当たりの血球数を計数することによって、白血球数を求めることができる。白血球数は分析者によって手作業で得られており、信頼性の高い分析を実行できるためには、その分析者が分析の実行に熟練している必要がある。

この分析には時間がかかる。さらに、分析は手作業で実行されるので、分析を実行する人によって分析の結果が異なる可能性がある。

白血球数を求める既存の自動化された分析方法がいくつかある。白血球数は、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）の原理を用いて求めることができる。コールターの原理は、インピーダンスを感知することによって細胞の寸法を求め、それによって細胞の型を判別することに基づく。コールターの原理によって白血球を計数する方法は、米国特許第５，２６２，３０２号に記載されている。コールターの原理による測定装置は高価であり、したがって相当な投資である。したがって、病院又は検査室は、２つ以上の装置に投資しようとしない。このことは、分析を一箇所で集中して実行する必要があり、患者は分析結果を待つ必要があることを示唆する。

コールターの原理は、現在使用されている主流の自動化された分析方法である。しかし、他の方法もいくつか記載されてきた。白血球数を求めるそのような方法の１つは、米国特許第５，５８５，２４６号に開示されている。この方法では、白血球にタグをつける蛍光染料とリガンドとの複合体と混合することによって、血液試料を調製しなければならない。この試料を毛細管に導入し、毛細管内の試料上を走査するレーザ源によって試料に照射する。この蛍光を測定して、白血球の数を求める。蛍光染料と毛細管上を走査するレーザ源とを使用する類似の方法が、ＷＯ９７／０２４８２に開示されている。この方法は、含有する白血球の数が少ないアフェレーシス生成物中の白血球の計数に適合されている。この方法では、毛細管がかなり太く、毛細管を走査できるようになるまで、白血球が毛細管の底部に沈澱するのを待つ必要がある。

ＷＯ９９／４５３８４では、試料を含む計算盤の厚さが変動する。厚さが変動することで、血液の異なる化合物を分離する。この血液試料を着色剤で染色して、血液試料中の少なくとも３種類の異なる白血球型を分化して強調する。これらの白血球は、光学走査機器を使用して計算盤の一部分を見ることによって計数することができる。

ＷＯ９８／５０７７７では、乳汁中の体細胞の数を評価する方法が開示されている。この方法は、ある体積の試料を試料室中に入れる段階と、試料室を通過した電磁信号を、検出素子からなるアレイ上へ伝送する段階とを含む。検出された電磁信号の強度を処理し、その結果を、試料中に存在する細胞の数と互いに関係付ける。

それでもなお、特殊な訓練を受けなくてもどの使用者も分析を実行できるように、並びに測定装置を比較的安価にできるように、白血球数を求める既存の自動化された方法を高速化し且つ簡単にする必要がある。このことは、治療の現場で（ａｔ ａ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）分析を提供できることを示唆するはずである。さらに、白血球の計数はこのように一般的に実行される分析であるため、その分析方法に対するどんな改善でも、患者の治療に良い影響を与えるはずである。治療の現場で結果を得ることを可能にする分析方法が、特に有利なはずである。

また、白血球分画を得ると、すなわち血液試料中の異なる種類の白血球の分布を検査すると、有利になる可能性がある。この白血球分画では、細胞が通常の分布で存在するか、又はいずれかの細胞型が増加若しくは減少しているかを明らかにすることができる。この情報は、特殊なタイプの疾患を診断する際、有用になる可能性がある。たとえば、好中球の増加は細菌感染を示し、一方リンパ球の増加は急性ウイルス感染によく見られる。

白血球分画もまた、バーカー計算盤内の染色された血球を顕微鏡で見て手作業で計数することによって得ることができる。自動化された方法もいくつか存在する。たとえば、コールターの原理を用いて、電界を通過した細胞によって生成される電気パルスの形状及び寸法を分析することによって分画を得ることができる。パルスの形状及び寸法は、検出される白血球の型と関係付けることができる。そのような方法の１つは、米国特許第４，５２８，２７４号に記載されている。

米国特許第５，１２３，０５５号では、白血球の異なる型を識別する別の方法が記載されている。この方法では、白血球の型を分化するために、いくつかの寸法及び色パラメータを順次分析する必要がある。

それでもなお、白血球分画を求める既存の自動化された方法を高速化し且つ簡単にすることが望ましい。治療の現場で分析を提供できるように、迅速、簡単、且つ比較的安価な分析方法を提供すると、特に有利なはずである。

本発明の目的は、血液試料などの試料中の白血球などの粒子の体積計数を求め、且つ白血球分画などの粒子分画を求める簡単な分析を提供することである。

したがって、本発明の一態様によれば、血液試料などの試料中の白血球などの粒子を計数する測定装置が提供される。

この装置は、試料を保持する測定空洞を備える試料取得装置を受けるように構成されたホルダと、この試料の少なくとも１つの拡大されたデジタル画像を取得するように適合された撮像システムとを備える。装置は、少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、粒子を識別し、且つ試料中の粒子の数を求めるように構成された画像分析器であって、少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子を識別し、且つこれらの粒子の型及び数を求めるように構成され、これらの型が粒子の物理的特徴によって区別され、それによって試料中の粒子の異なる型の比が求められる、画像分析器をさらに備える。

撮像システムは、拡大手段と、少なくとも１つのデジタル画像取得手段とを備えることができる。

一実施例によれば、装置は、血液試料中の白血球の計数に適合され、測定空洞は、染色し且つ溶血させた血液試料を保持するように適合され、画像分析器は、少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、染色した白血球を識別し、且つ試料中の白血球の数を求めるように構成され、またこの画像分析器は、少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された白血球を識別し、且つこれらの白血球の型及び数を求めるように構成され、これらの型は白血球の幾何学的特徴によって区別され、それによって試料中の白血球の異なる型の比が求められる。

本発明の別の態様によれば、試料中の粒子を計数する方法が提供される。前記方法は、試料を試料取得装置の測定空洞内に取得する段階と、測定空洞内の照射した試料の拡大像の少なくとも１つのデジタル画像を取得する段階と、少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、粒子を識別し、且つ試料中の粒子の数を求める段階と、少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、焦点を合わせて撮像された粒子を識別し、且つこれらの粒子の型及び数を求める段階であって、これらの型が粒子の幾何学的特徴によって区別され、それによって試料中の粒子の異なる型の比が求められる、段階とを含む。

一実施例によれば、この方法は、血液試料中の白血球の計数に適合される。この方法は、血液試料を試料取得装置の測定空洞内に取得する段階を含む。この血液試料は、血液試料中の赤血球を溶解させるための溶血剤と、血液試料中の白血球を染色するための染色剤とを含む試薬と混合される。染色剤は、白血球を選択的に染色し、血液試料中の他の細胞を染色しないことが好ましい。この方法は、測定空洞内の試料の拡大像の少なくとも１つのデジタル画像を取得する段階をさらに含む。この方法は、少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、染色した白血球を識別し、且つ試料中の白血球の数を求める段階と、少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、焦点を合わせて撮像された白血球を識別し、且つこれらの白血球の型及び数を求める段階であって、これらの型が染色した細胞の幾何学的特徴によって区別され、それによって血液試料中の白血球の異なる型の比が求められる段階とをさらに含む。

本発明の測定装置と方法はどちらも、全血試料の簡単な分析を可能にする。この目的のため、測定装置は、白血球を染色するための染色剤と混合された血液試料の少なくとも１つのデジタル画像を取得するように構成される。白血球を染色するということは、デジタル画像内で白血球を区別でき、並びに同一又は別のデジタル画像内の細胞の幾何学的特徴によって、白血球の異なる型を区別できることを示唆する。

したがって、測定装置及び方法は、血液試料中のすべての白血球の体積計数と、白血球分画の両方を求めるように構成される。

多くの既存の方法で、異なる血球、さらには血球のサブグループを計数できるが、本発明による測定装置は特に、白血球の分析に適合されている。試薬は、血液試料中の赤血球を溶解させる溶血剤を含む。これにより、試料中の赤血球を計数する可能性がなくなる。一方、赤血球を溶解させることで、血液試料中の白血球を簡単に区別し且つ識別できるようになる。

さらに、測定装置は特に、少なくとも１つのデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された細胞を識別するように適合される。これにより、比較的厚い試料の画像を取得しながら、焦点の合った細胞だけを計数することができる。この特徴は、白血球の総数の計数が白血球の型の識別より容易に行われることを考慮すると、特に有用である。型の識別には、分析するべき細胞のさらなる詳細を必要とするからである。したがって、焦点の合った細胞だけを確実に計数することによって、試料中で白血球の型の識別を実行することができ、同時にこの試料を使用して、試料中の白血球の統計的に信頼性の高い体積計数を求めることができる。

本発明の測定装置及び方法は、全血試料の非常に簡単な分析を提供する。この分析は、複雑な測定装置を必要とせず、操作者が高度な段階を実行する必要はない。したがって、この分析は、患者の診察に関連してすぐに実行することができ、資格のある技術者を必要としない。必要なのは、血液試料を取得し、且つ染色剤と混合することだけである。次いで、血液試料を測定装置のホルダ内に配置することができ、それにすぐに応じて、測定装置は分析結果を示すことができる。

実際、血液試料は、測定空洞内で試薬と混合することができる。したがって、手作業で試料調製を実行する必要はない。数分以内に、血液試料と試薬との反応で赤血球が溶血し、白血球が染色され、その結果試料は、光学測定を行って少なくとも１つのデジタル画像を取得できる状態になる。血液試料は、たとえば血液試料中へ試薬を分散若しくは拡散させることによって、又は試料取得装置を能動的に振動若しくは移動させて測定空洞内で撹拌を生じさせることによって、試薬と混合することができる。

測定装置は、試料取得装置の測定空洞内に保持された試料に照射するように構成された電磁放射源をさらに備えることができる。

撮像システムは、異なる光学設定を使用して、試料の複数のデジタル画像を取得するように構成することができ、画像分析器は、それぞれの取得したデジタル画像を分析して、粒子又は染色した白血球を識別し、且つ試料中の粒子又は白血球の数を求めるように構成され、またこの画像分析器は、それぞれの取得したデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子又は白血球を識別し、且つこれらの粒子又は白血球の型及び数を求めるように構成され、これらの型は粒子又は染色した白血球の幾何学的特徴によって区別され、それによって試料中の粒子又は白血球の異なる型の比が求められる。

試料中の被写界深度の方向の異なる水平面で複数のデジタル画像を取得することによって、高い拡大率を使用するときでも、比較的大きな試料体積を分析することができる。拡大率が高いということは、その結果得られる被写界深度が小さいので、１つの画像内で体積全体を見ることが難しくなる。拡大レベルは被写界深度に影響するので、複数のデジタル画像を取得する段階によって、より大きな拡大率を使用できるようになり、それによって各画像内で、とりわけ核の形状、数、又は寸法に応じて、異なる種類の白血球を分化することが可能になる。

別の実施例によれば、撮像システムは、取得した画像内の光の方向に関する情報を提供して、容易に焦点を合わせられるように構成され、それによって取得した画像内で焦点の移動を可能にする。このことは、単一の画像を使用して、試料の深さ全体を一度に分析して試料中の白血球の総数を計数することも、この画像で血液試料の厚さの一部分に焦点が合っているとき、画像内の細胞を分析することによって血液試料中の白血球の異なる型の比を求めることもできることを示唆する。画像内への光の方向についての情報を含む画像は、取得した画像内の光線を追跡して画像の異なる部分に焦点を合わせることができる小さなレンズからなるアレイ（たとえば、複合レンズ）を使用して得ることができる。

撮像システムは、異なる光学設定を使用して、試料の第１及び第２のデジタル画像を取得するように構成することができ、画像分析器は、第１の取得したデジタル画像を分析して、試料中の粒子又は白血球の数を求めるように構成され、またこの画像分析器は、第２の取得したデジタル画像を分析して、試料中の粒子又は白血球の異なる型の比を求めるように構成される。

したがって、測定装置は特に、異なる光学設定を使用して、２つのデジタル画像を取得するように適合される。このことは、第１に体積中の白血球の数を求め、且つ第２に白血球の異なる型の比を求めるように、光学設定を最適化し且つ適合できることを示唆する。

撮像システムは、２つの少なくとも部分的に独立した部分を含むことができ、これらの部分は、照射された試料からの光を撮像システムの第１及び第２の部分へ向ける。

白血球に焦点が合っているか否かを判別する動作は、細胞の細胞質が光を屈折させるレンズとして作用できるということを使用することによって実行することができる。焦点を合わせて撮像された白血球の場合、核は暗い影のように見え、一方周囲の細胞質はほとんど見ることができない。核は、光の強度が著しく低い領域として見え、一方細胞質では、光の強度は影響されない。

撮像システムにあまりに近接して撮像された（近接しすぎて焦点が外れている）白血球の場合、核は暗い影のように見え、一方周囲の細胞質はレンズとして作用して光を屈折させ、その結果、核の周囲に暗い円が生じる。核は、焦点の合った核の画像に対して光の強度が著しく低い領域として見え、細胞質でも光の強度が低く見える。

撮像システムからあまりに遠くで撮像された（遠すぎて焦点が外れている）白血球の場合、核は暗い影のように見え、一方周囲の細胞質はレンズとして作用して光を屈折させ、その結果、核の周囲に明るい円が生じる。核は、焦点の合った核の画像に対して光の強度が著しく低い領域として見え、一方細胞質では、光の強度が高く見える。

別法として、焦点を合わせて撮像された細胞の識別は、撮像された細胞の縁部を分析して、縁部での強度の勾配に基づき、細胞が焦点を合わせて撮像されたかどうかを評価することによって実行することができる。焦点が外れた細胞は、縁部で強度が徐々に減少することを示し、一方焦点を合わせて撮像された細胞では、縁部が鮮明で、細胞の縁部で強度が大きく減少することを示す。したがって、撮像された細胞の縁部で強度がどのように変動するかを分析することによって、細胞が焦点を合わせて撮像されたか否かを判別することができる。

細胞型を判別する代替方法は、画像分析器内で、特定の粒子又は細胞に対して、第１の方向でこの粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像から、第２の方向でこの粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像までを計数して、前記粒子又は細胞が撮像された前記画像の数を求めることによる。

画像分析器は、計数した画像の数に基づき、前記粒子又は細胞の寸法に関係する幾何学的特徴を判別するように構成することができる。

前記少なくとも１つのデジタル画像を取得するために使用される光学設定を有する撮像システムの倍率は、１〜５０倍、より好ましくは１〜２０倍、より好ましくは３〜２０倍、より好ましくは５〜２０倍、より好ましくは約１０倍とすることができる。

撮像システムは、前記少なくとも１つのデジタル画像を、被写界深度を２〜６０マイクロメートルの範囲、より好ましくは２〜３０マイクロメートルの範囲、より好ましくは約８〜１０マイクロメートルにして得るように構成することができる。

この文脈では、「被写界深度」とは、光軸に沿った方向の長さのうち、この長さの範囲内に位置する細胞を画像分析で識別するのに十分なほど焦点を合わせて撮像される長さを意味する。この「被写界深度」は、光学設定によって画定される従来の被写界深度より大きくすることができる。倍率を上げると、被写界深度は減少する。

電磁放射源は、染色剤の吸光度のピークに一致する波長を照射するように構成することができる。したがって、デジタル画像内で光の透過率が低い部分を示すことによって、染色剤の蓄積を含む染色した白血球が検出される。

電磁放射源は、レーザ源を含むことができる。レーザ源は、染色剤の吸光度に適合する明確に規定された波長の光を提供することができる。さらに、レーザ源は、平行光を提供して迷光の外乱を最小限にし、その結果、光の透過率が低い点を鮮明に区別することができる。

別法として、電磁放射源は、発光ダイオードを含むことができる。それでもなお、この放射源は、試料中の他の物質から白血球を適切に区別するのに十分な照射条件を提供することができる。

画像分析器は、吸光度の高い領域を識別して、試料中の粒子又は白血球の数を求めるように構成することができる。画像分析器はさらに、画像内の黒い点又は暗い点を識別するように構成することができる。染色剤は白血球の核内に蓄積させることができるので、吸光度は、別々の点でピークを有することができる。これらの点は、デジタル画像内に黒い点を形成し、白血球として分類することができる。

画像分析器は、少なくとも１つのデジタル画像内で吸光度の高い識別した領域の形状及び寸法を分析することによって、粒子又は白血球の異なる型を区別するように構成することができる。異なる型の白血球は異なる寸法を有するので、血球の寸法を求めることによって、白血球の型を識別することができる。さらに、異なる型を異なるように染色して、デジタル画像内の識別した領域の形状を異なるようにすることができる。これもまた、白血球の型を識別するために使用することができる。血球の寸法を分析することによって、白血球の３つの異なる型の比を指定する白血球分画を得ることができる。白血球分画で白血球の５つの異なる型を区別するには、調査するべき血球のさらなる特徴を必要とする可能性がある。たとえば、各細胞の複数の核、血球中を透過した放射の強度、又は血球の形状を検査することができる。

染色剤は、白血球の核を選択的に染色するように構成することができる。このことは、白血球は着色された点として識別でき、したがってデジタル画像内で容易に区別し且つ計数できることを示唆する。さらに、異なる型の白血球は異なる寸法を有するので、染色点の寸法を使用して、白血球の型を識別することができる。

染色剤は、ヘマトキシリン、メチレン・ブルー、メチレン・グリーン、メチレン・アズール、酢酸クレシル・バイオレット、トルイジン・ブルー、ゲンチアナ・バイオレット、ズダン類似体、ガロシアニン、及びフクシン類似体からなる群の中のいずれか１つ、又はこれらの任意の組合せとすることができる。しかし、染色剤はこの群に限定されるものではなく、多くの他の物質が企図されうることを理解されたい。

溶血剤は、第４級アンモニウム塩、サポニン、デオキシコール酸などの胆汁酸、ジギトキシン、ヘビ毒、グルコピラノシド、又はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）型の非イオン性界面活性剤とすることができる。しかし、溶血剤はこの群に限定されるものではなく、多くの他の物質が企図され得ることを理解されたい。

測定装置は、異なる光学設定で共用される対物レンズをさらに備えることができる。このことは、同一の光路に沿って撮像することによってデジタル画像を得ることができ、その結果、画像の中央が測定空洞内の同一の点に位置決めされることを示唆する。これにより、測定装置が小型化される。

一実施例によれば、撮像システムは、２つの少なくとも部分的に独立した部分を含むことができ、これらの部分は、照射された試料からの光を撮像システムの第１及び第２の部分へ向ける。このことは、試料から撮像システムへの光の経路は、固定の光学設定の範囲内で画定できることを示唆する。したがって、測定装置を、頑丈で且つ衝撃の影響を受けないものとすることができる。

撮像システムは、対物レンズからの光を撮像システムの第１又は第２の部分へ向けるためのビーム・スプリッタをさらに備えることができる。このことは、第１及び第２のデジタル画像を同時に得ることができ、それによって分析を非常に迅速に実行できることを示唆する。

撮像システムの第１の部分は、ビーム・スプリッタから直接光を受け取るように構成することができ、すなわち、撮像システムの第１の部分とビーム・スプリッタとの間に光学素子は配置されない。別法として、光は、対物レンズから直接撮像システムの第１の部分へ通過するように構成することもできる。その場合、第２のデジタル画像を得るために、光路に鏡を挿入して、代わりに光を撮像システムの第２の部分へ偏向させることができる。

撮像システムは、ビーム・スプリッタと撮像システムのうちのデジタル画像を取得するように適合された部分との間に接眼レンズをさらに備えることができる。したがって、接眼レンズは、白血球の異なる型を区別するために、試料のさらなる拡大率を提供することができる。レンズ・パッケージを使用し、次いで接眼レンズ・パッケージにより対物レンズ・パッケージ内の仮想主面を移動させて、像面と対物レンズ・パッケージとの間の関係を変化させ、さらなる拡大率を可能にすることが好ましい。

撮像システムは、ビーム・スプリッタと撮像システムのうちのデジタル画像を取得するように適合された部分との間に、撮像システムの焦点が合うように配置されていない細胞に作用する光学素子をさらに備えることができ、それによって焦点を合わせて撮像された白血球の識別を容易にする。

この光学素子により、厚さが撮像システムの被写界深度よりはるかに大きい試料の画像を取得することができる。光学素子により、焦点が外れた細胞を確実に考慮の対象から除外して、測定の確実性を高めることができる。光学素子は焦点が外れた細胞の撮像に作用するので、焦点の合った細胞が容易に識別される。光学素子は、細胞の撮像に作用する空間フィルタとして実装することができ、その結果、細胞が光を吸収することによって撮像されるとき、細胞の縁部は背景の強度より大きい超過した強度を含む。

代替実施例によれば、撮像システムは、ビーム・スプリッタと撮像システムの第２の部分との間に波面符号化素子をさらに備えることができる。波面符号化素子は、鞍状、すなわち中央は比較的平坦であるが縁部は波状である波長板を通過させることによって、光線を意図的に歪ませる。これにより、特定の光学収差が生じ、像はぼやけて見えるが、焦点ぼけは長い距離範囲にわたって同じになる。したがって、この波面符号化素子により、光軸に沿った深さのうちの分析できる深さが増大する。像内の歪みは主に、焦点ぼけを起こす波面符号化素子の形状によって決まり、この形状は正確にわかっている。したがって、コンピュータは、ぼけを点ごとに取り除くことができる。コンピュータは、本質的にデジタル・フィルタであるものを使用して、この像を復号し、したがって深い被写界深度にわたって鮮明な画像を作成することができる。このようにして、撮像システムの被写界深度を増大させて、焦点を合わせて撮像されるべき試料の深さを大きくすることができる。

別の実施例によれば、撮像システムの一部は、第１と第２の画像の両方を取得するように構成され、撮像システムの拡大システムの少なくとも一部は、異なる光学設定を使用して第１及び第２のデジタル画像を取得するように切替可能である。このことは、測定装置が撮像システムの単一の部分を備えるだけでよいことを示唆する。さらに、たとえば光軸に沿って明確に画定された位置間で可動式の主レンズを設けることによって、いくつかの異なる光学設定を使用することができる。

撮像システムは、第１のデジタル画像を取得するために使用される光学設定の場合より、第２のデジタル画像を取得するために使用される光学設定では倍率が大きくなるように構成することができる。このことは、第２のデジタル画像では細部をより良好に見ることができ、それによって白血球の異なる型を互いにより容易に区別できることを示唆する。

第１のデジタル画像を取得するために使用される光学設定を有する撮像システムの倍率は、１〜５０倍、より好ましくは１〜２０倍、より好ましくは３〜２０倍、より好ましくは３〜１０倍、より好ましくは約４倍とすることができる。これらの倍率の範囲内で、検出するのに十分なほど白血球を拡大しながら、撮像システムは、画像内の血球の数を評価するのに十分な焦点の範囲内で試料の厚さを撮像するように構成することができる。したがって、撮像システムの被写界深度は、試料の厚さを含むことができる。しかし、被写界深度の従来の定義を使用して、撮像システムの被写界深度内で試料の厚さ全体を撮像する必要はない。わずかに焦点が外れて撮像された細胞も、巧みな画像分析を使用して、正しく計数することができる。倍率が低いということは、深い「被写界深度」を得られることを示唆する。したがって、大きな試料の厚さに対処でき、大きな体積を分析することができる。しかし、低い倍率が使用される場合、各血球が３〜４画素などの非常に少ない画素上に撮像されるので、白血球を検出するのが困難になる可能性がある。取得した画像内の画素の数を増やすことによって、すなわちデジタル画像の分解能を高めることによって、より低い倍率を使用することができる。このようにして、１〜４倍という光学倍率を使用しながら、それでもなお白血球を検出することができる。

第２のデジタル画像を取得するために使用される光学設定を有する撮像システムの倍率は、１〜５０倍、より好ましくは１〜２０倍、より好ましくは３〜２０倍、より好ましくは５〜２０倍、より好ましくは約１０倍とすることができる。これらの倍率の範囲内で、白血球は、白血球の異なる型を区別するのに十分なほど拡大される。焦点を合わせて撮像された細胞を強調し且つこれらの細胞の識別を容易にする光学素子を使用することによって、より低い倍率を使用することができる。

撮像システムは、第１の画像を、被写界深度を少なくとも試料取得装置の測定空洞の厚さにして得るように構成することができる。このことは、試料のデジタル画像内で測定空洞の厚さ全体を同時に分析するのに十分な焦点を、試料の厚さ全体で得ることができることを示唆する。したがって、測定空洞内で白血球が沈澱するのを待つ必要はなく、それによって分析を行う時間が短縮される。しかし、反応により赤血球が溶血するのを待ち、且つ測定空洞への試料の導入によって生じる動きが落ち着くのを待つ必要がある可能性がある。これらの待ち時間は非常に短く、ほぼ３０秒以下であるはずである。試料の特定の部分にあまり鮮明に焦点を合わせないことを選択することによって、試料中の白血球の数を識別するのに十分な焦点が、試料の厚さ全体で得られる。このことは、白血球が幾分ぼやける可能性はあるが、それでもなお被写界深度の焦点は合っていると見なすことができることを示唆する。したがって、測定空洞の厚さと、撮像されている測定空洞の断面積を指定するデジタル画像の寸法とによって、分析される試料の体積を明確に画定することができる。

撮像システムは、第１の画像を、被写界深度を５０〜２００マイクロメートルの範囲にして得るように構成することができる。この被写界深度は、測定空洞の深さ又は厚さに一致するように適合することができる。深さを少なくとも５０マイクロメートルにすると、小さい断面積でより大きな体積の血液を分析でき、したがって試料の血球が単一層に圧縮されないようにすることができる。したがって、血液試料の比較的小さな画像を使用して、信頼性の高い白血球数の値を与えるのに十分なほど大きな体積の血液試料を分析することができる。さらに、拡大率が十分なデジタル画像を得ながら、２００マイクロメートルを超える被写界深度を実現するのは難しい。１７０マイクロメートルを超える被写界深度を実現することすら難しい。

撮像システムは、第２の画像を、被写界深度を２〜６０マイクロメートルの範囲にして得るように構成することができる。これは、測定空洞の厚さの一部分を撮像することによって実現することができる。そのような場合、測定空洞の厚さのこの部分だけに焦点を合わせて撮像される。次いで、第２のデジタル画像は、白血球の型を判別するのに十分なほど焦点を合わせて撮像された白血球だけを考慮することによって分析される。第２のデジタル画像は、白血球の異なる型の比を求めるために使用されるので、明確に画定された体積を撮像することは重要ではない。したがって、測定空洞の同一の部分を撮像することによって、適切な第１及び第２の画像を得ることができる。しかし、別法として、測定空洞の異なる部分を撮像して第２の画像を取得することもでき、それによってこの部分の厚さは、第２の画像を得るための撮像システムの被写界深度に一致させることができる。

画像分析器は、少なくとも１つの取得した画像を電子的に拡大するように構成することができる。試料を拡大して、試料の拡大したデジタル画像を取得しながら、取得したデジタル画像自体を電子的に拡大して、この取得したデジタル画像内で、互いに非常に近接して撮像された物体の区別を簡単にすることができる。

本発明の別の態様によれば、血液試料中の白血球の計数のための試料取得装置が提供される。試料取得装置は、血液試料を受け取るための測定空洞を備える。測定空洞は、測定空洞の内壁間に画定された第１及び第２の所定の固定された厚さを有し、第１の厚さは、血液試料中の白血球の全体積計数を求めるように適合され、第２の厚さは、血液試料中の白血球の異なる型の比を求めるように適合される。試料取得装置は、測定空洞を画定する表面上に乾燥した形で配置された試薬をさらに含む。この試薬は、血液試料中の赤血球を溶解させるための溶血剤と、血液試料中の白血球を選択的に染色するための染色剤とを含む。

試料取得装置は、全血試料を測定空洞内へ直接得て、それを分析することを可能にする。試料調製の必要はない。実際、血液試料は、患者の刺し傷をつけた指から直接、測定空洞内へ吸引することができる。試料取得装置に試薬を与えることで、試料取得装置内での反応を可能にし、それにより試料を分析できる状態にする。反応は、血液試料が試薬と接触したときに開始される。したがって、試料を手作業で調製する必要はなく、そのため分析は特に、患者が待っている間に診察室ですぐに実行するのに適したものとなる。

試薬は乾燥した形で与えられるので、試料取得装置の有用性に影響を及ぼすことなく、試料取得装置を輸送し且つ長期間保管することができる。したがって、試薬を有する試料取得装置は、血液試料の分析を行うかなり前に製造し且つ調製することができる。

多くの既存の方法で、異なる血球、さらには血球のサブグループを計数することができるが、本発明による試料取得装置は特に、白血球の計数を実行するように適合されている。試薬は、血液試料中の赤血球を溶解させる溶血剤を含む。これにより、試料中の赤血球を計数する可能性がなくなる。一方、赤血球を溶解させることで、血液試料中の白血球を簡単に区別し且つ識別できるようにする。

染色剤は、個々の白血球に印をつける。これにより、白血球を個別に見又は検出することができる。白血球は、たとえば、測定空洞を走査し又は測定空洞の画像を得ることによって検出することができる。

試料取得装置はさらに、体積測定による白血球数を容易に求められるように特に適合された測定空洞の第１の厚さを提供する。測定空洞は、かなり大きな体積の血液試料の分析を可能にし、したがって体積測定による白血球数を求めるための良好な統計を可能にするのに十分な厚さを有することができる。したがって、白血球数は、画定された体積中で個別に検出された白血球の数を合計することによって得ることができる。

試料取得装置はまた、白血球の異なる型の区別を容易にするように特に適合された測定空洞の第２の厚さを提供する。この点では、第２の厚さを第１の厚さより薄くして、第２の厚さ全体をより大きな拡大像の被写界深度内で撮像できるようにすることができる。そのようなより大きな拡大像は、型に関わらず単に血液試料内の白血球の総数を求めるための撮像と比較して、白血球の異なる型を区別するときに必要とされる可能性がある。

試料取得装置は、前記測定空洞を画定するように、内壁を形成する２つの平面を有する本体部材を備えることができる。これらの平面は、光学測定のための試料の深さを画定するように、互いから所定の距離を空けて配置することができる。このことは、試料取得装置が光学測定に対して明確に画定された深さを提供し、その深さを使用して、血液試料の体積単位当たりの白血球数を正確に求めることができることを示唆する。分析される試料の体積は、測定空洞の深さ及び撮像される試料の面積によって明確に画定される。したがって、明確に画定された体積を使用して白血球の数を血液試料の体積に関連付け、その結果、体積測定による白血球数を求めることができる。

測定空洞は、５０〜２００マイクロメートルの第１の均一な深さを有することが好ましい。深さが少なくとも５０マイクロメートルであるということは、測定空洞では血液試料を塗抹して単一層にするのではなく、それによってより大きな体積の血液を小さな断面積で分析できることを示唆する。したがって、血液試料の比較的小さな画像を使用して、信頼性の高い白血球数の値を与えるのに十分なほど大きな体積の血液試料を分析することができる。第１の深さは、少なくとも１００マイクロメートルであることがより好ましく、それにより、さらに小さな断面積を分析することができ、又はより大きな試料体積を分析することができる。さらに、第１の深さを少なくとも５０マイクロメートル、より好ましくは１００マイクロメートルとすることでまた、２つの平面間に明確に画定された深さを有する測定空洞を容易に製造できるようにする。

厚さが２００マイクロメートル以下である空洞内に配置された大部分の試料の場合、白血球数は非常に少なく、そのため、白血球が互いに重なり合って配置されるために生じる誤差はわずかでしかない。しかし、そのような誤差の影響は白血球数に関係し、したがって、少なくとも白血球数の値が大きい場合は、少なくともある程度までは、結果を統計的に補正することによって処理することができる。この統計的補正は、測定装置の較正に基づくことができる。誤差は、測定空洞の第１の厚さが１７０マイクロメートル以下である場合さらに小さくなり、測定空洞の第１の厚さが１５０マイクロメートル以下である場合さらに小さくなり、それによって、より簡単な較正を使用することができる。それどころかこの厚さでは、重なり合った血球に対していかなる較正も必要としない可能性もある。

さらに、測定空洞の第１の厚さは、測定空洞の深さ全体を同時に分析できるようなデジタル画像を測定装置が得るのに十分なほど小さい。この測定装置では拡大システムが使用されるので、大きな被写界深度を得るのは容易ではない。したがって、１つのデジタル画像内で厚さ全体を同時に分析するためには、測定空洞の第１の厚さが１５０マイクロメートルを超えないことが好ましいはずである。この被写界深度は、１７０マイクロメートル又さらには２００マイクロメートルの測定空洞の第１の厚さに対処するように構成することができる。

測定空洞は、２０〜６０マイクロメートルの第２の均一な厚さを有することが好ましい。測定空洞のこの第２の厚さにより、白血球の異なる型を区別するために必要な拡大像の被写界深度内で、第２の厚さ全体の撮像が可能になるはずである。さらにそれでもなお、第２の厚さで十分な体積を撮像でき、十分な数の白血球を分析することができる。これにより、白血球の異なる型の比を求めることができ、統計的な確実性が良好になるはずである。通常、２００個の白血球の型を分析することが望ましい。

試料取得装置は、揮発性液体中に溶かして表面に付着させた試薬を備えることができる。この液体は蒸発して、試薬を乾燥した形で残す。

試薬は、測定空洞内に挿入する前に揮発性液体中に溶かすと有利であることがわかった。このことは、試料取得装置の製造及び調製中に、測定空洞の狭い空間からこの液体が効果的に蒸発できることを示唆する。試薬は、測定空洞のうちの第１の厚さの部分に乾燥した形で配置できることが好ましい。

試薬は、好ましくは有機溶媒中に、より好ましくはメタノール中に溶かすことができる。そのような溶媒は揮発性であり、適切に使用して、試薬を測定空洞の表面上に乾燥させることができる。

試料取得装置は、測定空洞を試料取得装置の外部と連通させる試料入口をさらに備えることができ、この入口は、血液試料を取得するように構成される。試料入口は、毛細管力によって血液試料を引き込むように構成することができ、測定空洞はさらに、血液を入口から空洞内へ引き込むことができる。また、試料取得装置は、まず測定空洞のうちの第１の厚さの部分内に試料を引き込むように構成することができる。次いで、試料の一部を、毛細管力によって測定空洞のうちの第２の厚さの部分内へさらに移動させることができる。結果として、単に試料入口を血液と接触させることによって、血液試料を測定空洞内に容易に取得することができる。その場合、試料入口及び測定空洞の毛細管力が、明確に規定された量の血液を測定空洞内へ引き込む。別法として、試料取得装置に外部からポンピング力を加えることによって、血液試料を測定空洞内へ吸引し又は引き込むこともできる。別の代替形態によれば、血液試料をピペット内に取得し、次いでピペットを用いて測定空洞内に導入することができる。

試料取得装置は使い捨てとすることができ、すなわち、一度しか使用されないように構成される。試料取得装置は血液試料を受け取ることができ、且つ試料で細胞計数を行うために必要な試薬をすべて保持するので、白血球の計数を実行するためのキットを提供する。このことは特に、試料取得装置は一度だけの使用に適合されており、試料取得装置を清浄にし且つ試薬を再度付着できるかどうかを考慮せずに形成できるので可能になる。また、試料取得装置は、プラスチック材料で成型することができ、それによって低価格で製造することができる。したがって、使い捨ての試料取得装置を使用してもなお、費用効果を高くすることができる。

本発明はまた、コンピュータ可読媒体内で実施される、試料の分析のためのコンピュータ・プログラム製品に関し、このコンピュータ・プログラム製品は、試料の少なくとも１つの画像をデジタル処理で分析して、試料中の粒子の数を求めるコンピュータ・コードと、試料の少なくとも１つの画像をデジタル処理で分析して、試料の焦点の合った領域内で粒子の１つ又は複数の型を識別するコンピュータ・コードであって、粒子の各型が１つ又は複数の際立った物理的特徴に関連付けられる、コンピュータ・コードと、試料中の粒子の数及び型に対応する情報を出力するコンピュータ・コードとを含む。本発明はまた、試料を分析するコンピュータ・プログラムに関し、このコンピュータ・プログラムは、少なくとも１つのデジタル画像を分析して、粒子を識別し、且つ試料中の粒子の数を求め、並びに少なくとも１つのデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子を識別し、且つこれらの粒子の型及び数を求めるコンピュータ・プログラム・コードを含み、これらの型が、粒子の物理的特徴によって区別され、それによって試料中の粒子の異なる型の比が求められる。

次に本発明について、添付の図面を参照して例示によってさらに詳細に説明する。

試料取得装置の概略図である。 第１の実施例による測定装置の概略ブロック図である。 第２の実施例による測定装置の概略ブロック図である。 本発明の第１の実施例による方法の流れ図である。 本発明の一実施例による可動式レンズの構成の概略図である。 本発明の一実施例による構成の概略図である。 ３つの異なる層で撮像された試料の図である。 図１０による測定装置の焦点が細胞から外れているときの、カメラで見た白血球の図である。 図１０による測定装置の焦点が細胞に合っているときの、カメラで見た白血球の図である。 図１０による測定装置の焦点が細胞から外れているときの、カメラで見た白血球の図である。 図１０による測定装置の焦点が細胞から外れているときの、分析されるべき細胞の断面の強度を記録した図である。 図１０による測定装置の焦点が細胞に合っているときの、分析されるべき細胞の断面の強度を記録した図である。 図１０による測定装置の焦点が細胞から外れているときの、分析されるべき細胞の断面の強度を記録した図である。 第３の実施例による測定装置の概略図である。 本発明の第２の実施例による方法の流れ図である。 第４の実施例による測定装置の概略図である。

次に図１を参照して、第１の実施例による試料取得装置１０について説明する。試料取得装置１０は、使い捨てであることが好ましく、分析に使用した後は捨てられる。このことは、試料取得装置１０が複雑な取扱いを必要としないことを示唆する。試料取得装置１０は、プラスチック材料で形成されることが好ましく、射出成型によって製造することができる。これにより、試料取得装置１０の製造は簡単且つ安価になり、それによって、試料取得装置１０の費用を抑えることができる。

試料取得装置１０は本体部材１２を備え、本体部材１２は基部１４を有する。操作者は、分析結果に何ら干渉することなく、基部１４に触れることができる。基部１４はまた、分析装置内のホルダに嵌合できる突起１６を有することができる。突起１６は、試料取得装置１０が分析装置内に正しく配置されるように構成することができる。

試料取得装置１０は、試料入口１８をさらに備える。試料入口１８は、試料取得装置１０内の対向する壁同士の間に画定され、これらの壁は、試料入口１８内に毛細管力が生じるように、互いに近接して配置される。試料入口１８は、試料取得装置１０の外部と連通して、血液を試料取得装置１０内へ引き込むことができる。試料取得装置１０は、試料取得装置１０の内部の対向する壁同士の間に配置された測定空洞２０の形で、白血球を計数するための計算盤をさらに備える。測定空洞２０は、試料入口１８に連通するように構成される。測定空洞２０を画定する壁は、毛細管力により血液を試料入口１８から測定空洞２０内へ引き込むことができるように、試料入口１８の壁よりともに近接して配置される。

測定空洞２０は、第１の厚さを有する第１の部分２０ａと、第２のより小さな厚さを有する第２の部分２０ｂとを有する。第１の部分２０ａは試料入口１８と連通し、第２の部分２０ｂは第１の部分２０ａと連通する。したがって、毛細管力により、血液を測定空洞２０の第１の部分２０ａから第２の部分２０ｂ内へ引き込むことができる。

測定空洞２０の第１の部分２０ａの壁は、互いから５０〜２００マイクロメートルの距離を空けて配置される。第１の部分２０ａは、少なくとも厚さ１００マイクロメートルであることがより好ましい。さらに、第１の部分２０ａは、厚さ１５０マイクロメートル以下であることがより好ましい。この距離は、第１の部分２０ａ全体にわたって概して均一である。第１の部分２０ａの厚さは、検査される血液の体積を画定する。分析結果は、検査される血液試料の体積と比較されるので、第１の部分２０ａの概して均一な厚さは非常に精密である必要があり、すなわち、異なる試料取得装置１０の第１の部分２０ａ間の厚さの変動は、ごくわずかしか許容されない。厚さは、十分な数の粒子又は細胞を計数できるように、小さな面積の空洞内で比較的大きな試料体積を分析できるように選択される。測定空洞２０の第１の部分２０ａは特に、血液試料中の体積測定による総白血球数を求めるように適合される。第１の部分２０ａの厚さ全体を、撮像システムの被写界深度内で撮像できるように選択することができる。次いで、画像を分析し、且つ画像内に存在する白血球の数を計数して、体積測定による白血球数を求めることができる。

試料取得装置１０は通常、０．５×１０^９個／リットル（血液）を超える白血球数を測定するように適合される。ずっと少ない白血球数では、試料体積が小さすぎて、統計的に有意の量の白血球を計数することができない。さらに、白血球数が１２×１０^９個／リットル（血液）を超えるときは、血球が互いに重なり合って配置されることの影響が、測定される白血球数に対して意味を持ち始める。この白血球数では、第１の部分２０ａの厚さが１４０マイクロメートルである場合、白血球は、分析される試料の断面の約８％に及ぶ。したがって、正しい白血球数を得るために、この影響を考慮する必要がある。したがって、１２×１０^９個／リットル（血液）を超える白血球数の値の統計的補正を使用することができる。白血球数が増えるほど、重なり合う血球の影響が大きくなるので、白血球数が増えるほど、この統計的補正は大きくなる。統計的補正は、測定装置の較正を用いて決定することができる。代替手段として、統計的補正は、測定装置を試料取得装置１０に関連して使用するように設定する一般的なレベルで決定することができる。この統計的補正は、コールターの原理を使用する分析装置内で現在実行される統計的補正と同様の大きさのものである。試料取得装置１０を使用して、５０×１０^９個／リットル（血液）もの白血球数を分析できることが企図されている。

測定空洞２０の第２の部分２０ｂは特に、血液試料中の白血球の異なる型の比を求めるように適合される。第２の部分２０ａの厚さ全体を、撮像システムの被写界深度内で撮像するべきである。次いで、画像を分析し、且つ画像内に存在する各型の白血球の数を計数して、白血球の異なる型の比を求めることができる。

測定空洞２０の第２の部分２０ｂの壁は、互いから２０〜６０マイクロメートルの距離を空けて配置される。この距離は、第２の部分２０ｂ全体にわたって概して均一である。分析は主に、異なる型の白血球の数を互いに比較するものなので、分析される厳密な体積を知ることは重要ではない。したがって、第２の部分２０ｂの厚さは、第１の部分２０ａの厚さほど精密である必要はない。第２の部分２０ｂの厚さは、統計的に有意の結果を得るのに十分な量の白血球を分析できるようにする必要がある。さらに、前述のように、第２の部分２０ｂの厚さは、撮像システムの被写界深度内でその全体が撮像されるように適合されるべきである。したがって、試料中のすべての白血球は焦点を合わせて撮像され、試料の分析は、試料のうちの焦点が外れて撮像された部分から生じる画像内のノイズによって妨げられない。第２の部分２０ｂを第１の部分２０ａより薄くして、撮像システムの被写界深度内で第２の部分全体の撮像を可能にしながら、より大きな拡大率を使用できるようにする。白血球の総数を計数するだけでなく、白血球の型も判別できるようにするためには、より大きな拡大率が必要となる可能性がある。

測定空洞２０の壁の表面は、少なくとも部分的に試薬２２で被覆される。試薬２２は、凍結乾燥、加熱乾燥、又は真空乾燥させ、且つ測定空洞２０の表面に付着させることができる。血液試料を測定空洞２０内に取得すると、血液は乾燥した試薬２２と接触し、試薬２２と血液との間で反応を開始する。

試薬２２は、ピペット又はディスペンサを使用して試薬２２を測定空洞２０内に挿入することによって加えられる。試薬２２は、測定空洞２０内に挿入されると、揮発性液体、たとえばメタノールなどの有機溶媒中に溶ける。試薬２２を含む溶媒で、測定空洞２０を満たすことができる。次いで、乾燥を実行して溶媒を蒸発させ、試薬２２を測定空洞２０の表面に付着させる。

狭い空間の表面上に試薬を乾燥させるので、周囲雰囲気と接触する液体の表面は非常に小さく、それによって液体の蒸発はより難しくなる。したがって、メタノールなどの揮発性液体を使用し、それにより、測定空洞の狭い空間から効果的に液体を蒸発させることができると有利である。

代替製造方法によれば、試料取得装置１０は、２つの部品を互いに貼り合わせることによって形成することができ、それによって、一方の部品が測定空洞２０の底面壁を形成し、他方の部品が測定空洞２０の上面壁を形成する。これにより、２つの部品を互いに貼り合わせる前に、露出した表面上に試薬２２を乾燥させることができる。したがって、溶媒は揮発性である必要はないので、試薬２２を水に溶かすことができる。

試薬２２は、赤血球溶血剤と白血球染色剤とを含む。溶血剤は、第４級アンモニウム塩、サポニン、デオキシコール酸などの胆汁酸、ジギトキシン、ヘビ毒、グルコピラノシド、又はトリトン型の非イオン性界面活性剤とすることができる。染色剤は、ヘマトキシリン、メチレン・ブルー、メチレン・グリーン、メチレン・アズール、酢酸クレシル・バイオレット、トルイジン・ブルー、ゲンチアナ・バイオレット、ズダン類似体、ガロシアニン、若しくはフクシン類似体、又はこれらの任意の組合せとすることができる。血液試料が試薬２２と接触すると、溶血剤は赤血球を溶解させるように作用し、その結果溶解した赤血球は、血漿と混合する。さらに、染色剤は、白血球の核中に蓄積する。試薬２２は、白血球の核をすべてはっきりと染色するのに十分な量の染色剤を含むべきである。したがって、染色剤が余ることが多く、それらは血漿中に混在する。余った染色剤は、血漿中に、染色剤の均質で低い背景レベルを生じる。白血球中に蓄積した染色剤は、背景レベルの染色剤と区別することができる。

試薬２２はまた、他の成分を含むこともでき、この成分は、活性、すなわち血液試料との化学反応に関与するものであっても、不活性、すなわち血液試料との化学反応に関与しないものであってもよい。活性成分は、たとえば、溶血又は染色作用を触媒するように構成することができる。不活性成分は、たとえば、測定空洞２０の壁の表面への試薬２２の付着を改善するように構成することができる。

数分以内に、又はさらには１分未満で、血液試料は試薬２２と反応し、その結果、赤血球が溶解し、染色剤が白血球の核中に蓄積する。

次に図２を参照して、血液試料中の白血球の分析のための測定装置３０の第１の実施例について説明する。装置３０は、血液試料を有する試料取得装置１０を受けるための試料ホルダ３２を備える。試料ホルダ３２は、試料取得装置１０を受けるように構成されて、試料取得装置１０の測定空洞２０を装置３０内に正しく配置する。装置３０は、試料取得装置１０内の血液試料を照明するための光源３４を備える。光源３４は、可視スペクトル全体の光を照射する白熱電球とすることができる。白血球の核内に蓄積した染色剤は、特定の波長の光を吸収し、その結果、試料のデジタル画像内に白血球の核が浮かび上がる。カラー画像を取得した場合、白血球は、特に着色された点として浮かび上がる。白黒画像を取得した場合、白血球は、より明るい背景に対して暗い点として浮かび上がる。

別法として、光源３４は、レーザ又は発光ダイオードとすることができる。光源３４を使用して画像内のコントラストを上げて、白血球をより容易に検出することができる。この場合、光源３４は、染色剤の吸収ピークに一致する波長の電磁放射を放射するように構成される。波長はさらに、血液中の白血球以外の成分の吸収が比較的低くなるように選択するべきである。さらに、試料取得装置１０の壁は、波長に対して本質的に透過性とするべきである。たとえば、染色剤としてメチレン・ブルーを使用するとき、光源３４は、波長６６７ｎｍの光を照射するように構成することができる。

装置３０は撮像システム３６をさらに備え、撮像システム３６は、光源３４に対して試料ホルダ３２の反対側に配置される。したがって、撮像システム３６は、血液試料中を透過した放射を受け取るように構成される。この実施例の撮像システム３６は拡大手段３８を含み、拡大手段３８は２つの独立した部分に分割される。拡大手段３８の第１の部分３８ａは、測定空洞２０の第１の部分２０ａ内の血液試料中を透過した放射を受け取るように構成される。撮像システムは、拡大手段３８の第１の部分３８ａによって拡大された測定空洞２０の第１の部分２０ａを撮像するように構成された第１の画像取得手段４０をさらに含む。拡大手段３８の第１の部分３８ａは、１〜５０倍、より好ましくは１〜２０倍、最も好ましくは１〜４倍の倍率を提供するように構成される。これらの倍率の範囲内で、白血球を区別することができる。より低い倍率を使用できるようにするために、分解能を上げて画像を取得することができる。さらに、拡大手段３８の第１の部分３８ａの被写界深度は、測定空洞２０の厚さを含むように構成することができる。

拡大手段３８の第１の部分３８ａは、試料ホルダ３２に近接して配置された対物レンズ又はレンズ系４２と、対物レンズ４２から距離を空けて配置された接眼レンズ又はレンズ系４４とを備える。対物レンズ又はレンズ系４２及び接眼レンズ又はレンズ系４４はそれぞれ、１つ又は複数の個々のレンズ又は他の光学構成要素を含むことができる。対物レンズ４２は試料の第１の拡大像を提供し、この第１の拡大像はさらに、接眼レンズ４４によって拡大される。拡大手段３８は、試料の適切な拡大及び撮像を実現するためのレンズをさらに備えることができる。拡大手段３８の第１の部分３８ａは、測定空洞２０の第１の部分２０ａ内の試料が、試料ホルダ３２内に置かれたとき、第１の画像取得手段４０の像面上に焦点を結ぶように構成される。

第１の画像取得手段４０は、試料の第１のデジタル画像を取得するように構成される。第１の画像取得手段４０は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラなどの任意の種類のデジタル・カメラとすることができる。本明細書中に記載のデジタル・カメラへの言及は、画像分析部分の一実施例としてのみ考慮されるべきである。デジタル・カメラの画素寸法により、撮像システム３６には、像面内の錯乱円は被写界深度内で画素寸法を超えてはならないという制約が課される。しかし、白血球は、幾分ぼやけた場合でもなお検出することができ、したがって、この文脈で定義する被写界深度内であると見なされる限り、錯乱円は画素寸法を超えてもよい。したがって本明細書では、「被写界深度」とは、光軸に沿った方向の長さのうち、この長さの範囲内に位置する細胞を画像分析で識別するのに十分なほど焦点を合わせて撮像される長さを意味する。この「被写界深度」は、光学設定によって画定される従来の被写界深度とは異なる可能性があり、実行するべき特定の画像分析に依存する可能性がある。

デジタル・カメラ４０は、測定空洞２０の第１の部分２０ａ内の試料の第１のデジタル画像を取得し、この第１のデジタル画像内では、試料の厚さ全体で、白血球を計数するのに十分に焦点が合っている。撮像システム３６は、測定空洞２０の第１の部分２０ａの面積を画定し、この面積が第１のデジタル画像内に撮像される。撮像される面積は、測定空洞２０の第１の部分２０ａの厚さとともに、撮像される試料の体積を画定する。

拡大手段３８の第２の部分３８ｂは、測定空洞２０の第２の部分２０ｂ内の血液試料中を透過した放射を受け取るように構成される。撮像システムは、拡大手段３８の第２の部分３８ｂによって拡大された測定空洞２０の第２の部分２０ｂを撮像するように構成された第２の画像取得手段４１をさらに含む。拡大手段３８の第２の部分３８ｂは、５〜２００倍、より好ましくは５〜１００倍、最も好ましくは５〜２０倍の倍率を提供するように構成される。これらの倍率の範囲内で、白血球を区別することができる。より低い倍率を使用できるようにするために、分解能を上げて画像を取得することができる。さらに、拡大手段３８の第２の部分３８ｂの被写界深度はそれでもなお、測定空洞２０の厚さを含むように構成することができる。

第１の部分３８ａと同様に、拡大手段３８の第２の部分３８ｂもまた、試料ホルダ３２に近接して配置された対物レンズ又はレンズ系４３と、対物レンズ４３から距離を空けて配置された接眼レンズ又はレンズ系４５とを備える。この場合も、対物レンズ又はレンズ系４３及び接眼レンズ又はレンズ系４５はそれぞれ、１つ又は複数のレンズ又は他の光学構成要素を含むことができる。対物レンズ４３は試料の第１の拡大像を提供し、この第１の拡大像はさらに、接眼レンズ４５によって拡大される。拡大手段３８は、試料の適切な拡大及び撮像を実現するためのレンズ又は他の光学構成要素をさらに備えることができる。拡大手段３８の第２の部分３８ｂは、測定空洞２０の第２の部分２０ｂ内の試料が、試料ホルダ３２内に置かれたとき、第２の画像取得手段４１の像面上に焦点を結ぶように構成される。

第２の画像取得手段４１は、試料の第２のデジタル画像を取得するように構成される。第２の画像取得手段４１は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラなどの任意の種類のデジタル・カメラとすることができる。第２の画像は、白血球の異なる型を判別するために使用されるので、像面内の錯乱円は、被写界深度内で画素寸法を超えてはならない。デジタル・カメラ４１は、測定空洞２０の第２の部分２０ａ内の試料の第２のデジタル画像を取得し、この第２のデジタル画像内では、試料の厚さ全体で、存在する白血球の型を識別するのに十分に焦点が合っている。

撮像システム３６は、撮像システム３６を調整する必要なく試料取得装置１０内の血液試料を撮像するように構成することができる。撮像システム３６は、撮像システムを試料ホルダに固定した関係で維持する筐体内に配置されることが好ましい。

装置３０は、画像分析器４６をさらに備える。画像分析器４６は、第１のデジタル・カメラ４０及び第２のデジタル・カメラ４１に接続されて、デジタル・カメラ４０、４１によって取得した第１及び第２のデジタル画像を受け取る。画像分析器４６は、第１のデジタル画像内の白血球に相当するパターンを識別して、デジタル画像内に存在する白血球の数を計数するように構成される。したがって、画像分析器４６は、より明るい背景の中で暗い点を識別するように構成することができる。画像分析器４６は、デジタル画像を分析する前に、まずデジタル画像を電子的に拡大するように構成することができる。このことは、デジタル画像を電子的に拡大することでデジタル画像が幾分ぼやけるとしても、画像分析器４６は、互いに近接して撮像された白血球をより容易に区別できることを示唆する。

画像分析器４６は、第１のデジタル・カメラ４０及び第２のデジタル・カメラ４１からの画像情報を受け取るように適合されたプロセッサを含むことができる。プロセッサは、たとえば、画像分析ソフトウェア又はアルゴリズムとともに構成することができ、その正確な性質は、本明細書中に記載の分析を実行するように適合することができる。

画像分析器４６は、第１のデジタル画像内で識別される白血球の数を、前述のように明確に画定された血液試料の体積で割ることによって、血液の体積当たりの白血球の数を計算することができる。体積測定による白血球数は、装置３０のディスプレイ上に提示することができる。

画像分析器４６はさらに、第２のデジタル画像内の白血球に相当するパターンを識別して、デジタル画像内に存在する白血球の数を計数するように構成される。画像分析器４６はさらに、検出した各白血球の形状及び寸法を分析して、白血球の型を判別する。したがって、画像分析器４６は、より明るい背景の中で暗い点を白血球として識別するように構成することができる。画像分析器４６は、デジタル画像を分析する前に、まずデジタル画像を電子的に拡大するように構成することができる。このことは、デジタル画像を電子的に拡大することでデジタル画像が幾分ぼやけるとしても、画像分析器４６は、互いに近接して撮像された白血球をより容易に区別できることを示唆する。次いで、画像分析器４６は、様々な物理的基準によって白血球の型を判別する。重要な基準は、撮像された白血球の寸法である。文献によれば、リンパ球の直径は約５〜１１マイクロメートルであり、顆粒球の直径は約８〜１５マイクロメートルであり、単球の直径は約１６〜２５マイクロメートルである。予想される寸法は場合によって重複するので、さらなる情報を使用して、異なる白血球型を互いに区別することが好ましい。そのような情報は、たとえば、核の形状及び／又は寸法とすることができる。顆粒球は、たとえば、分葉核に相当する１つの細胞内の２つ以上の点の存在によって識別することができる。これを使用して、分級によって行われる評価を改善することができる。

さらなる物理的特性を使用することによって、顆粒球がさらに好酸球、好中球、及び好塩基球に分化されて、５つの要素に分化された白血球数を得ることができる。また、３つの要素の白血球計数も、これらの追加の物理的特性を使用して改善することができる。したがって、分析ではさらに、検出された血球の形状を検査することができる。また、分析ではさらに、検出された血球中を透過した放射の強度を検査することもできる。

画像分析器４６は、各型の白血球の数を計算することができる。通常、画像分析器４６は、特定の数、たとえば１０００個の白血球を計数し且つ分類することができる。次いで、その型に属すると分類された白血球の数を分析された白血球の総数で割った値として、白血球の各型の百分率又は比を求めることができる。統計的に有意の測定は、約２００個の白血球の型を分析することによって求めることができる。しかし、統計を改善するためには、より多くの白血球の型を分析することが望ましい。さらに、画像分析器４６は、適切に分類するのに十分に焦点を合わせて撮像された白血球を分析するように構成することができる。また、２つ以上の白血球が互いに非常に近接している場合、これらの白血球を正しく分けるのは難しい可能性があり、したがって、そのような白血球は、画像分析器４６によって完全に無視することができる。一方、撮像システム３６は、測定空洞２０の第２の部分２０ｂの厚さ全体に焦点を合わせて撮像するように構成されるので、画像分析器４６は、第２のデジタル画像だけで白血球の各型の体積計数を求めることができる。

画像分析器４６は、画像分析を実行するためのコードを含む処理装置として実現することができる。

次に図３を参照して、血液試料中の白血球の分析のための測定装置１３０の第２の実施例について説明する。装置１３０は、血液試料を有する試料取得装置１１０を受けるための試料ホルダ１３２を備える。装置１３０は、試料取得装置１１０を受けるように構成される。測定空洞１２０は、撮像される領域全体にわたって１つの均一な厚さを有する。したがって、測定空洞１２０の厚さは、図１を参照して前述した実施例による試料取得装置１０の測定空洞２０の第１の部分２０ａに一致する。試料ホルダ１３２は、試料取得装置１１０を受けるように構成されて、試料取得装置１１０の測定空洞１２０を装置１３０内に正しく配置する。装置１３０は、第１の実施例の光源３４と対応する形で、試料取得装置１１０内の血液試料を照明するための光源１３４を備える。

装置１３０は撮像システム１３６をさらに備え、撮像システム１３６は、光源１３４に対して試料ホルダ１３２の反対側に配置される。したがって、撮像システム１３６は、血液試料中を透過した放射を受け取るように構成される。この実施例の撮像システム１３６は、同一の光路に沿って第１及び第２のデジタル画像を取得するように構成され、その結果、画像の中央が測定空洞１２０内の同一の点に位置決めされる。それでもなお、試料の第１及び第２のデジタル画像は、異なる光学設定を使用して取得される。これは、以下に説明するように、複数の異なる方法で実現することができる。

図３に示すように、撮像システムは拡大手段１３８を備え、拡大手段１３８は、１つの共通部分と２つの独立した部分とを含む。したがって、拡大手段１３８は、試料ホルダ１３２に近接して配置された対物レンズ又はレンズ系１４２を備えることができる。対物レンズ又はレンズ系１４２は、第１及び第２のデジタル画像の両方を取得するための２つの光学設定で共用される。対物レンズ１４２は、試料の第１の拡大像を提供する。撮像システム１３６は、光を２つの異なる方向に、第１の画像取得手段１４０及び第２の画像取得手段１４１へ向けるためのビーム・スプリッタ１３９をさらに備えることができる。第１の画像取得手段１４０及び第２の画像取得手段１４１は、ＣＣＤカメラなどの任意の種類のデジタル・カメラとすることができる。拡大手段１３８は、ビーム・スプリッタ１３９と第１のデジタル・カメラ１４０との間に配置された第１の接眼レンズ又はレンズ系１４４を備える。対物レンズ１４２は試料の第１の拡大像を提供し、この第１の拡大像はさらに、接眼レンズ１４４によって拡大される。拡大手段１３８は、第１のデジタル画像内の試料の適切な拡大及び撮像を実現するためのレンズ又は光学素子をさらに備えることができる。

拡大手段１３８は、ビーム・スプリッタ１３９と第２のデジタル・カメラ１４１との間に配置された第２の接眼レンズ又はレンズ系１４５をさらに備える。対物レンズ１４２は、試料の第１の拡大像を提供し、この第１の拡大像はさらに、接眼レンズ１４５によって拡大される。拡大手段１３８は、第２のデジタル画像内の試料の適切な拡大及び撮像を実現するためのレンズ又は光学素子をさらに備えることができる。対物レンズ１４２及び接眼レンズ１４５はレンズ・パッケージとして実装することができ、その場合、対物レンズ・パッケージ１４２に対して試料取得装置１１０を移動させることなく、接眼レンズ・パッケージ１４５により対物レンズ・パッケージ１４２内の仮想主面を移動させて、像面と対物レンズ・パッケージ１４２との間の関係を変化させ、さらなる拡大を可能にする。このようにして、第１及び第２のデジタル画像内で異なる拡大像を得ることができる。

具体的には、この実施例で示す拡大手段１３８は、焦点の合った白血球の撮像を強調する光学素子１４７を備える。これにより、どの血球型が焦点を合わせて撮像されているか、及びそれによって、白血球の異なる型を区別するときにどの血球型を考慮するべきかを識別する可能性を高める。

光学素子１４７により、撮像システム１３６のうちの第２のデジタル画像を取り込む部分の被写界深度より試料の厚さがはるかに大きい画像を取得することができる。光学素子１４７は、焦点が外れた細胞を確実に考慮から除外して、測定の確実性を高めることができる。光学素子１４７は、焦点が外れた細胞の撮像に作用するので、焦点の合った細胞が容易に識別される。光学素子１４７は、細胞の撮像に作用する空間フィルタとして実装することができ、その結果、細胞が光を吸収することによって撮像されるとき、細胞の縁部は背景の強度より大きい超過した強度を含む。これは、画像分析で容易に検出することができ、したがって、これらの細胞はすぐに考慮から切り捨てられる。

代替実施例によれば、拡大手段は、ビーム・スプリッタ１３９と第２のデジタル・カメラ１４１との間に波面符号化素子を備えることができる。したがって、波面符号化素子は、光学素子１４７と置き換えることができる。波面符号化素子は、鞍状、すなわち中央は比較的平坦であるが縁部は波状である波長板を通過させることによって、光線を意図的に歪ませる。これにより、特定の光学収差が生じ、像はぼやけて見えるが、焦点ぼけは長い距離範囲にわたって同じになる。したがって、この波面符号化素子により、光軸に沿った深さのうちの分析できる深さが増大する。像内の歪みは主に、焦点ぼけを起こす波面符号化素子の形状によって決まり、この形状は正確にわかっている。したがって、コンピュータは、ぼけを点ごとに取り除くことができる。コンピュータは、本質的にデジタル・フィルタであるもの使用して、この像を復号し、したがって、深い被写界深度にわたって鮮明な画像を作成することができる。このようにして、拡大手段は、撮像システムの被写界深度を増大させて、焦点を合わせて撮像されるべき試料の深さを大きくすることができる。

この実施例では、ビーム・スプリッタは画像システム１３６と置き換えることができ、画像システム１３６は、試料からの本質的にすべての光を２つのデジタル・カメラ１４０、１４１のうちの選択した一方へ向けるための鏡又は他の素子（図示せず）を含むことができる。次いで、この鏡を回転又は移動させて、試料を見ているカメラ１４０、１４１を移動させることができる。これにより、より多くの光をデジタル・カメラ１４０、１４１へ通過させることができ、したがって、画像を取得するための光条件をより良好にする。しかし、２つの画像を同時に記録することはできず、画像システム１３６は可動部を必要とする。代替形態によれば、カメラのうちの一方は、鏡が光路から完全に取り除かれたときに試料を見るように構成することができる。

別の代替形態によれば、対物レンズ１４２は、第１の画像を得るために必要なすべての拡大を提供することができる。したがって、ビーム・スプリッタ又は鏡から直接第１のデジタル・カメラ１４０へ光を通過させることができる。

さらなる別の代替形態によれば、対物レンズは、第１及び第２の光学設定によって共用されない。したがって、ビーム・スプリッタ又は鏡は、試料ホルダ１３２に近接して配置することができ、拡大手段１３８は、ビーム・スプリッタと第１のデジタル・カメラ１４０との間及びビーム・スプリッタと第２のデジタル・カメラ１４１との間の両方の光路に、対物レンズと接眼レンズの両方を備えることができる。

さらなる代替形態によれば、第１及び第２のデジタル画像は、１つのデジタル・カメラを用いて得られる。この場合、拡大手段１３８を切り替え又は変更して、２つのデジタル画像を得るための光学設定を変更する必要がある。したがって、対物レンズ２４２は、図５に示すように、２つの異なる明確に画定された位置間で可動式とすることができる。したがって、対物レンズ２４２は、光軸に沿って移動するように構成することができ、止め具と接触する。たとえば、光軸の縁部が凸部２５０、２５２と接触する。したがって、対物レンズと試料取得装置との間の距離を正確に制御して、取得するべき画像の拡大を制御することができる。

前述のいずれの代替形態でも、第１のデジタル・カメラ１４０は、拡大手段１３８によって提供される第１の光学設定で測定空洞１２０を撮像するように構成される。したがって、拡大手段１３８は、１〜５０倍、より好ましくは１〜２０倍、最も好ましくは１〜４倍の倍率を提供するように構成される。これらの倍率の範囲内で、白血球を区別することができる。より低い倍率を使用できるようにするために、分解能を上げて画像を取得することができる。さらに、それでもなお、拡大手段１３８の被写界深度は、測定空洞１２０の厚さを含むように構成することができる。

図２に示す第１の実施例を参照して記載したように、第２の実施例の第１のデジタル・カメラ１４０は、試料の第１のデジタル画像を取得するように構成される。第１のデジタル・カメラ１４０は、第１の実施例で定義した被写界深度内に測定空洞１２０の厚さ全体が含まれるように、試料を見る。撮像システム１３６は、測定空洞１２０の面積を画定し、この面積が第１のデジタル画像内に撮像される。撮像される面積は、測定空洞１２０の厚さとともに、撮像される試料の体積を画定する。

さらに、前述のいずれの実施例でも、第２のデジタル・カメラ１４１は、拡大手段１３８によって提供される第２の光学設定で測定空洞１２０を撮像するように構成される。拡大手段１３８は、５〜２００倍、より好ましくは５〜１００倍、最も好ましくは５〜２０倍の倍率を提供するように構成される。これらの倍率の範囲内で、白血球を区別することができる。より低い倍率を使用できるようにするために、分解能を上げて画像を取得することができる。しかし、第２のデジタル画像は、測定空洞１２０のうちの第１のデジタル画像と同一の部分を見るので、第２の光学設定でより大きい拡大像を使用すると、被写界深度内で測定空洞１２０の厚さ全体が撮像されない可能性がある。したがって、第２のデジタル画像は、焦点の合った白血球を撮像するが、焦点が外れた白血球及び血液試料の他の要素も撮像し、その結果、画像内にぼやけた外乱を発生させる。これらの条件では、前述のように、光学素子１４７により、焦点を合わせて撮像された細胞を識別する確率を高め、型についての分類を容易にする。

拡大手段１３８は、第２のデジタル・カメラ１４１の像面内で、測定空洞１２０の厚さの上部に焦点を合わせるように構成できると有利である。このことは、血液試料のうちの焦点が外れた部分の外乱は底部に近く、比較的低いままであることを示唆する。しかし、第２のデジタル画像内で、測定空洞１２０の任意の部分に焦点を合わせて撮像することが考えられる。さらに、拡大手段１３８は、通常、測定空洞１２０のうちの厚さ２０〜６０マイクロメートルに焦点を合わせて撮像するように構成することができる。

さらに別の代替形態によれば、図６に図示のように、１つのデジタル画像だけが取得される。しかし、このデジタル画像は、検出される光の方向についての情報を提供する必要がある。このことは、デジタル画像は、検出した放射についての情報だけでなく、検出した放射が放出された空間内の点についての情報も含むことを示唆する。次いで、このデジタル画像は、デジタル画像の焦点を望みに応じて移動できるような形で提示することができる。したがって、このデジタル画像を使用して、第１に、測定空洞の深さ全体内の白血球の総数を計数し、且つ第２に、焦点を厚さの一部分へ移動させることによって、試料中の白血球の異なる型の比を求めることができる。この代替形態は、図６に示すように実装することができ、光源３３４と、対物レンズ３４２と、１つのデジタル・カメラ３４０とを備える。これらの部品は、前述の場合と同様の形で実装することができる。装置は、試料取得装置１１０とデジタル・カメラ３４０との間の光路内に設けられた小さなレンズ３６０からなるアレイをさらに備える。小さなレンズ３６０からなるアレイは、取得した画像内の光線を追跡して画像の異なる部分に焦点を合わせることを可能にする。

次に図３に戻ると、装置１３０は、画像分析器１４６をさらに備える。画像分析器１４６は、第１のデジタル・カメラ１４０及び第２のデジタル・カメラ１４１に接続されて、デジタル・カメラ１４０、１４１によって取得した第１及び第２のデジタル画像を受け取る。別法として、画像分析器１４６は、上の段落に記載したように、光の方向についての情報を含む１つのデジタル画像だけを受け取る。画像分析器１４６は、上の第１の実施例の画像分析器４６に対する記載と同様の形で、第１及び第２のデジタル画像を分析するように構成される。しかし、第２のデジタル画像は、被写界深度内の試料の厚さの一部分のみを撮像することによって得ることができるので、画像分析器１４６は、第２のデジタル画像をより注意深く処理する必要がある可能性がある。まず第１に、画像分析器１４６は、焦点を合わせて撮像されたものと識別した白血球だけを分析する。これが可能なのは、画像分析器１４６が白血球の異なる型の比を求めるだけでよく、したがって分析される試料の体積を厳密に知る必要がないからである。焦点が外れて撮像された細胞は、画像分析器１４６が細胞の誤った寸法を求め、したがって細胞を誤って分類しうるような形で、ぼやけている可能性がある。したがって、焦点を合わせて撮像された細胞だけを確実に分析することによって、分析の確実性を高める。

図７は、試料７１０の３つの異なる層７２０ａ〜ｃで撮像された試料７１０を示す。層７２０ｂは、以下に詳細に論じる焦点面を示す。光学系の被写界深度では、厳密に焦点面内に位置しない場合でも、物体は焦点が合っていると見なすことができる。図７では、焦点面７２０ｂの被写界深度を破線領域７２０ｂ’で示す。

図８ａ〜ｃは、カメラで見た３つの異なる白血球を示し、図９ａ〜ｃは、それらのそれぞれの光分布を示す。

図８ｂは、焦点を合わせて撮像された白血球を示す。核は暗い影のように見え、一方周囲の細胞質はほとんど見ることができない。図９ｂでは、光の強度の分布を示す。核は、光の強度が著しく低い部分として見え、一方細胞質では、光の強度は影響されない。

図８ａは、画像取得手段４４１にあまりに近接して撮像されて焦点が外れた白血球を示す。核は暗い影のように見え、一方周囲の細胞質はレンズとして作用して光を屈折及び拡散させ、その結果、核の周囲に暗い円が生じる。図９ａでは、光の強度の分布を示す。核は、光の強度が著しく低い部分として見え、細胞質でも光の強度が低く見える。

図８ｃは、画像取得手段４４１からあまりに遠くで撮像されて焦点が外れた白血球を示す。核は暗い影のように見え、一方周囲の細胞質はレンズとして作用して光を屈折させ、その結果、核の周囲に明るい円が生じる。図９ｃでは、光の強度の分布を示す。核は、光の強度が著しく低い部分として見え、一方細胞質では、光の強度が高く見える。

画像分析器１４６はさらに、焦点を合わせて撮像された白血球の寸法を求めるように構成される。次いで、この求めた寸法を使用して、第１の実施例を参照して前述した方法に対応する方法で白血球を分類することができる。第２のデジタル画像は、少しぼやけて分析するのが難しい可能性があるので、画像分析器１４６は、比較的少ない数、たとえば２００個の白血球だけを計数し且つ分類するように構成することができる。それでもなお、この数は、試料中の白血球の異なる型の比の統計的に有意の結果を形成するのに十分な数となり得る。代替形態として、画像分析器１４６は、寸法の測定と、細胞が焦点を合わせて撮像されているか否かの検証とを、同一の画像処理段階内で実行するように構成することもできる。したがって、すべての撮像された細胞の寸法が求められるが、試料中の白血球の異なる型の比を求めるときは、焦点を合わせて撮像された細胞だけが考慮される。

画像分析器１４６は、画像分析を実行するためのコードを含む処理装置として実現することができる。

図７〜９ａ〜ｃの原理及び図１０の設定を使用すると、装置３０は、異なる光学設定を使用して、試料のいくつかのデジタル画像を取得するように構成することができる。たとえば、いくつかのデジタル画像は、図１０に示すように、試料７１０の１０個の異なる層７２０ａ〜ｊを撮像することができる。画像分析器は、特定の粒子又は細胞に対して、前記粒子又は細胞が撮像された前記画像の数を求めるように構成される。画像の計数は、第１の方向でこの粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像から開始し、この粒子又は細胞に焦点が合っていると判別された１つ又は複数の画像を介して続き、第２の方向でこの粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像で終了する。第１及び第２の方向は基本的に、焦点面に対して対向する法線である。図８ａ及び図９ａでは、細胞は、第１の方向で焦点が外れていると判別される。この方向で焦点が外れる境界は、特定の細胞に対して異なる領域（中央及び円環領域）で最大のコントラストが測定された画像であると判別される。撮像システムにさらに近接している細胞の場合、暗い核の周囲に暗い円環を有する同じ基本形状が検出されるが、これらの細胞はよりぼやけており、コントラストは、第１の方向で焦点が外れる境界と判別した画像のものより低い。同様に、他方の境界も、どの画像内で暗い核と核を取り囲む光との間に最大のコントラストが検出されるかを識別することによって判別される。焦点面が撮像システムからさらに遠い画像では、細胞はなお、暗い核及び明るい円として検出されるが、これらの細胞はよりぼやけており、コントラストは、第２の方向で焦点が外れる境界と見なされる画像のものより低い。

これは、それぞれの白血球の曲率半径に関する情報をもたらす。同等に小さな白血球は、同等に短い焦点距離をもたらし、境界をなす画像間の画像を計数した結果、画像の数は同等に少なくなる。また、これらの白血球は焦点の内外に素早く移動するとも言える。同等に大きな白血球は、より長い焦点距離をもたらし、一方向で白血球の焦点が外れた画像と、他の方向で白血球の焦点が外れた画像との間の距離は、同等により大きくなる。また、異なる取得した画像と隣接する層からの画像とを比較すると、これらの白血球は焦点の内外にゆっくりと移動するとも言える。焦点距離及び境界をなす画像は距離に関係するが、それぞれの画像に対して焦点面内の距離が指定されている場合、距離は代わりに画像の数として表すことができることに留意されたい。

図１０の実施例は、光源４３４と、試料取得装置４１０と、光学系４３８（拡大係数１０倍）と、光を画像取得手段４４０へ向ける絞り４５０とを備える。図４を参照して、白血球の体積計数の方法について説明する。この方法は、血液試料を試料取得装置内に取得するステップ１０２を含む。無希釈の全血試料を試料取得装置内に取得する。この試料は、毛細管血又は静脈血から取得することができる。毛細管血の試料は、患者の刺し傷をつけた指から直接、測定空洞内へ引き込むことができる。血液試料は、試料取得装置内の試薬と接触して、反応を開始する。赤血球は溶解し、染色剤は白血球の核内に蓄積する。血液試料を取得してから数分以内に、試料を分析できる状態になる。別法として、血液試料を取得し、試料取得装置内に導入する前に、溶血剤及び染色剤を混合する。次いでステップ１０４で、試料取得装置を分析装置内に配置する。分析装置のボタンを押すことによって、分析を開始することができる。別法として、分析は、この装置が試料取得装置の存在を検出することよって自動的に開始される。

ステップ１０６で、試料に照射し、ステップ１０８で、異なる光学設定を使用して、試料の第１及び第２のデジタル画像を取得する。試料には、波長が染色剤の吸収ピークに一致する電磁放射で照射する。このことは、デジタル画像が白血球の核の位置に黒い又はより暗い点を含むことを示唆する。

ステップ１１０で、取得したデジタル画像を画像分析器へ転送し、画像分析器は、第１及び第２のデジタル画像の画像分析を実行する。画像分析器は、第１のデジタル画像内の黒い点の数を計数して、血液試料中のすべての白血球の体積計数を求める。画像分析器はまた、第２のデジタル画像内の特定の数の黒い点の寸法及び形状を分析して、白血球を分類し、且つ血液試料中の白血球の異なる型の比を得る。

図１１に示す別の実施例によれば、画像を取得するステップ１０８ｂは、異なる層の複数のデジタル画像を取得するステップを含む。

画像分析器では、それぞれのデジタル画像（各層から）を分析して、どの白血球に焦点が合っているかを判別し、これらの白血球に対して、画像を分析して白血球を分類し、且つ血液試料中の白血球の異なる型の比を得る。

本明細書中に記載の好ましい実施例は決して限定するものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義する保護の範囲内で、多くの代替実施例が可能であることが強調されるべきである。

図１０の装置は、白血球の総数を求めながら、それぞれの白血球の分類を判別することができるので、独立した装置とすることができる。別法として、図１０の装置は、図２の実施例の画像取得手段４１として、又は図３の実施例の画像取得手段１４１として使用することもできる。そのような設計の原理を図１２に示す。この実施例は、光源５３４と、絞り５５０と、試料取得装置５１０と、ビーム・スプリッタ５３９と、光を第１の画像取得手段５４０へ向ける第１の光学系５３８ａ（第１の拡大係数約３倍）と、光を鏡５３４を介して第２の画像取得手段５４１へ向ける第２の光学系５３８ｂ（第２の拡大係数約１０倍）とを備える。第２の光学系はまた、焦点を変える手段５４２を備え、又は可動式とすることができる。それによって、第２の取得手段５４１は、複数のデジタル画像を取得することができる。一実施例では、第１の画像取得手段５４０は省かれ、粒子又は白血球の総数は、第２の画像取得手段５４１によって取得した画像から求められる。

Claims (37)

1. 試料中の粒子を計数する測定装置であって、
   試料を保持する測定空洞を備える試料取得装置を受けるように構成されたホルダと、
   前記試料の少なくとも１つの拡大されたデジタル画像を取得するように適合された撮像システムと、
   前記少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、前記粒子を識別し、且つ前記試料中の粒子の数を求めるように構成された画像分析器であって、前記少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子を識別し、且つこれらの粒子の型及び数を求めるように構成され、前記型が、前記粒子の物理的特徴によって区別され、それによって前記試料中の粒子の異なる型の比が求められる、画像分析器とを備える、測定装置。
2. 前記装置が、血液試料中の白血球の計数に適合され、前記測定空洞が、染色し且つ溶血させた血液試料を保持するように適合され、前記画像分析器が、前記少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、染色した白血球を識別し、且つ前記試料中の白血球の数を求めるように構成され、また前記画像分析器が、前記少なくとも１つの取得したデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された白血球を識別し、且つこれらの白血球の型及び数を求めるように構成され、前記型が、前記白血球の物理的特徴によって区別され、それによって前記試料中の白血球の異なる型の比が求められる、請求項１に記載の測定装置。
3. 前記試料取得装置の前記測定空洞内に保持された前記試料に照射するように構成された電磁放射源をさらに備える、請求項１又は２に記載の測定装置。
4. 前記撮像システムが、異なる光学設定を使用して、前記試料の複数のデジタル画像を取得するように構成され、前記画像分析器が、それぞれの取得したデジタル画像を分析して、粒子又は染色した白血球を識別し、且つ前記試料中の粒子又は白血球の数を求めるように構成され、また前記画像分析器が、それぞれの取得したデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子又は白血球を識別し、且つこれらの粒子又は白血球の型及び数を求めるように構成され、前記型が、前記粒子又は染色した白血球の物理的特徴によって区別され、それによって前記試料中の粒子又は白血球の異なる型の比が求められる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の測定装置。
5. 前記撮像システムが、前記取得した画像内の光の方向についての情報を提供するように構成され、それによって前記取得した画像内で焦点の移動を可能にする、請求項１に記載の測定装置。
6. 前記撮像システムが、異なる光学設定を使用して、前記試料の第１及び第２のデジタル画像を取得するように構成され、前記画像分析器が、前記第１の取得したデジタル画像を分析して、前記試料中の粒子又は白血球の数を求めるように構成され、また前記画像分析器が、前記第２の取得したデジタル画像を分析して、前記試料中の粒子の異なる型の比を求めるように構成される、請求項１に記載の測定装置。
7. 前記撮像システムが、２つの少なくとも部分的に独立した部分を含み、これらの部分が、照射された試料からの光を前記撮像システムの第１及び第２の部分へ向ける、請求項６に記載の測定装置。
8. 前記画像分析器が、撮像された粒子又は細胞の縁部を分析して、前記縁部での強度の勾配に基づき、前記粒子又は細胞が焦点を合わせて撮像されたかどうかを評価するように構成される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の測定装置。
9. 前記画像分析器が、特定の粒子又は細胞に対して、第１の方向で前記粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像から、第２の方向で前記粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像までを計数して、前記粒子又は細胞が撮像された前記画像の数を求めるように構成される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の測定装置。
10. 前記画像分析器が、前記計数した画像の数に基づき、前記粒子又は細胞の寸法に関係する物理的特徴を判別するように構成される、請求項９に記載の測定装置。
11. 前記少なくとも１つのデジタル画像を取得するために使用される前記光学設定を有する前記撮像システムの倍率が、１〜５０倍、より好ましくは１〜２０倍、より好ましくは３〜２０倍、より好ましくは５〜２０倍、より好ましくは約１０倍である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の測定装置。
12. 前記撮像システムが、前記少なくとも１つのデジタル画像を、被写界深度を２〜６０マイクロメートルの範囲、より好ましくは２〜３０マイクロメートルの範囲、より好ましくは約８〜１０マイクロメートルにして得るように構成される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の測定装置。
13. 前記電磁放射源が、染色剤の吸光度のピークに一致する光の波長を照射するように構成される、請求項３から１２までのいずれか一項に記載の測定装置。
14. 前記電磁放射源が、レーザ源を含む、請求項３から１３までのいずれか一項に記載の測定装置。
15. 前記電磁放射源が、発光ダイオードを含む、請求項３から１３までのいずれか一項に記載の測定装置。
16. 前記画像分析器が、吸光度の高い領域を識別して、前記試料中の粒子又は白血球の数を求めるように構成される、請求項４から１５までのいずれか一項に記載の測定装置。
17. 前記画像分析器が、暗い点を識別して、前記試料中の粒子又は白血球の数を求めるように構成される、請求項１６に記載の測定装置。
18. 前記画像分析器が、前記少なくとも１つのデジタル画像内で吸光度の高い識別した領域の形状及び寸法を分析することによって、粒子又は白血球の異なる型を区別するように構成される、請求項４から１７までのいずれか一項に記載の測定装置。
19. 試料中の粒子を計数する方法であって、
    試料を試料取得装置の測定空洞内に取得する段階と、
    前記測定空洞内の照射された試料の拡大像の少なくとも１つのデジタル画像を取得する段階と、
    前記少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、前記粒子を識別し、且つ前記試料中の粒子の数を求める段階と、
    前記少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、焦点を合わせて撮像された粒子を識別し、且つこれらの粒子の型及び数を求める段階であって、前記型が、前記粒子の物理的特徴によって区別され、それによって前記試料中の粒子の異なる型の比が求められる段階とを含む、方法。
20. 前記方法が、血液試料中の白血球の計数に適合され、
    血液試料を試料取得装置の測定空洞内に取得する段階であって、前記血液試料が、前記血液試料中の赤血球を溶解させるための溶血剤と、前記血液試料中の白血球を染色するための染色剤とを含む試薬と混合される段階と、
    前記測定空洞内の前記照射された試料の拡大像の少なくとも１つのデジタル画像を取得する段階と、
    前記少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、前記選択的染色によって染色した白血球を識別し、且つ前記試料中の白血球の数を求める段階と、
    前記少なくとも１つのデジタル画像をデジタル処理で分析して、焦点を合わせて撮像された白血球を識別し、且つこれらの白血球の型及び数を求める段階であって、前記型が、前記染色した白血球の物理的特徴によって区別され、それによって前記血液試料中の白血球の異なる型の比が求められる段階とを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記試料が、前記測定空洞内で前記試薬と混合される、請求項１９に記載の方法。
22. 前記試料取得装置の前記測定空洞内に保持された前記試料に照射する段階をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
23. 異なる光学設定を使用して、前記試料の複数のデジタル画像を取得し、それぞれの取得したデジタル画像を分析して、粒子又は染色した白血球を識別し、且つ前記試料中の粒子又は白血球の数を求め、またそれぞれの取得したデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子又は白血球を識別し、且つこれらの粒子又は白血球の型及び数を求め、前記型が、前記粒子又は染色した白血球の物理的特徴によって区別され、それによって前記試料中の粒子又は白血球の異なる型の比が求められる、請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の方法。
24. 前記少なくとも１つのデジタル画像が、光の方向についての情報を前記取得した画像内に記録するように取得され、それによって前記取得した画像内で焦点の移動を可能にし、前記分析が、焦点を順次移動させることによって実行される、請求項１９から２３までのいずれか一項に記載の方法。
25. 前記少なくとも１つのデジタル画像を取得する段階が、前記測定空洞内の前記試料の第１の拡大像の第１のデジタル画像を取得する段階と、前記測定空洞内の前記試料の第２の拡大像の第２のデジタル画像を取得する段階とを含み、前記第２の拡大像が、前記第１の拡大像より大きく、前記第１の取得したデジタル画像を分析して、前記試料中の粒子又は白血球の数を求め、前記第２の取得したデジタル画像を分析して、前記試料中の粒子又は白血球の異なる型の比を求める、請求項１９から２４までのいずれか一項に記載の方法。
26. 特定の細胞に対して、第１の方向で前記粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像から、第２の方向で前記粒子又は細胞の焦点が外れていると判別された画像までを計数して、前記細胞が撮像された前記画像の数を求める段階をさらに含む、請求項１９から２５までのいずれか一項に記載の方法。
27. 前記計数した画像の数に基づき、前記細胞の寸法に関係する物理的特徴が判別される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記少なくとも１つのデジタル画像が、１〜５０倍、より好ましくは１〜２０倍、より好ましくは３〜２０倍、より好ましくは５〜２０倍、より好ましくは約１０倍の倍率を使用して取得される、請求項１９から２７までのいずれか一項に記載の方法。
29. 前記撮像システムが、前記少なくとも１つのデジタル画像を、被写界深度を２〜６０マイクロメートルの範囲、より好ましくは２〜３０マイクロメートルの範囲、より好ましくは約８〜１０マイクロメートルにして得るように構成される、請求項１９から２８までのいずれか一項に記載の方法。
30. 前記試料が、前記染色剤の吸光度のピークに一致する波長の光で照射される、請求項２２から２９までのいずれか一項に記載の方法。
31. 前記照射が、レーザ源を用いて実行される、請求項２２から３０までのいずれか一項に記載の方法。
32. 前記照射が、発光ダイオードを用いて実行される、請求項２２から３１までのいずれか一項に記載の方法。
33. 前記分析が、吸光度の高い領域を識別して、前記試料中の粒子又は白血球の数を求める段階を含む、請求項１９から３２までのいずれか一項に記載の方法。
34. 前記分析が、暗い点を識別して、前記試料中の粒子又は白血球の数を求める段階を含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記分析が、前記少なくとも１つのデジタル画像内で吸光度の高い識別した領域の形状及び寸法を分析することによって、粒子又は白血球の異なる型を区別する段階を含む、請求項１９から３４までのいずれか一項に記載の方法。
36. コンピュータ可読媒体内で実施される、試料の分析のためのコンピュータ・プログラム製品であって、
    試料の少なくとも１つの画像をデジタル処理で分析して、前記試料中の粒子の数を求めるコンピュータ・コードと、
    前記試料の前記少なくとも１つの画像をデジタル処理で分析して、前記試料の焦点の合った領域内で粒子の１つ又は複数の型を識別するコンピュータ・コードであって、粒子の各型が１つ又は複数の際立った物理的特徴に関連付けられる、コンピュータ・コードと、
    前記試料中の粒子の数及び型に対応する情報を出力するコンピュータ・コードとを含む、コンピュータ・プログラム製品。
37. 試料を分析するコンピュータ・プログラムであって、
    少なくとも１つのデジタル画像を分析して、粒子を識別し、且つ前記試料中の粒子の数を求め、並びに
    前記少なくとも１つのデジタル画像を分析して、焦点を合わせて撮像された粒子を識別し、且つこれらの粒子の型及び数を求めるコンピュータ・プログラム・コードを含み、前記型が、前記粒子の物理的特徴によって区別され、それによって前記試料中の粒子の異なる型の比が求められる、コンピュータ・プログラム。

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