BR112015020098B1 - composição de agente de contraste de partículas para colorir uma amostra de fluido sanguíneo e método para tratar partículas de uma amostra de fluido sanguíneo - Google Patents

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Abstract

MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA COLORAÇÃO E PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS. A presente descrição refere-se a uma metodologia de coloração que utiliza uma composição do agente de contraste de partículas capaz de colorir rapidamente as células em uma única etapa. A composição do agente de contraste de partículas pode ser compreendida por uma combinação de um ou mais agentes de contraste de partículas, um ou mais agentes permeabilizantes e um ou mais agentes fixadores. A composição do agente de contraste de partículas pode incluir cristal violeta, novo azul de metileno, saponina e gluteraldeído.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELA- TOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido de patente US n° 61/799.152, depositado no dia 15 de março de 2013, intitulado "Analysis of Particles in Fluid Samples," o qual está aqui incorporado a titulo de referência, em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente descrição está relacionada, de modo geral, aos agentes de contraste de partículas, e mais especificamente, às composições de agente de contraste de partículas para uso em dispositivos totalmente ou parcialmente automatizados, para diferenciar e quantificar partículas, como células sanguíneas em uma amostra.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A análise de células sanguíneas é um dos testes clínicos realizados com mais frequência para fornecer um panorama do estado de saúde de um paciente. Uma amostra sanguínea pode ser coletada do corpo do paciente e armazenada em um tubo de ensaio contendo um anticoagulante, para impedir a coagulação. Uma amostra de sangue total normalmente compreende três principais classes de células sanguíneas, incluindo as hemácias (eritrócitos), as células brancas (leucócitos) e as plaquetas (trombócitos). Cada classe pode ser adicionalmente dividida em subclasses de membros. Por exemplo, os cinco principais tipos ou subclasses de leucócitos (WBCs) têm diferentes formatos e funções. Os leucócitos podem incluir os neutró- filos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Também há subclasses dos tipos de eritrócitos. As aparências das partículas em uma amostra podem diferir, de acordo com as condições patológicas, a maturidade da célula e outras causas. As subclasses dos eritrócitos podem incluir os reticulócitos e os eritrócitos nucleados.
[004] Uma contagem de células sanguíneas estimando a concentração de RBCs, WBCs ou plaquetas pode ser feita manualmente ou usando um analisador automático. Quando as contagens de células sanguíneas são feitas manualmente, uma gota de sangue é aplicada a uma lâmina para microscópio como um fino esfregaço. Tradicionalmente, o exame manual de um esfregaço manchado de sangue em uma lâmina para microscópio foi usado para determinar o número ou as quantidades relativas dos cinco tipos de leucócitos. Os corantes e manchas histológicos têm sido usados para corar células ou estruturas celulares. Por exemplo, o corante de Wright é um corante histológico que tem sido usado para corar esfregaços sanguíneos para exame sob luz de microscópio. A coloração de uma amostra envolve o uso de múltiplas soluções e etapas em uma ordem adequada para assegurar que o agente de coloração é corretamente aplicado, e que a estrutura da célula está adequadamente preservada. Um agente fixador pode ser aplicado à amostra, em uma primeira etapa, para preservar a amostra contra a degradação e para manter a estrutura da célula. Em seguida, um agente permeabilizante pode ser aplicado em uma segunda etapa para dissolver as membranas celulares para permitir que o agente de coloração entre nas células. O agente de coloração pode ser aplicado à amostra em uma terceira etapa para corar as estruturas adequadas. A amostra pode ser adicionalmente enxaguada para observação, ou etapas adicionais podem ser adotadas para aplicar corantes adicionais, contracorantes ou para realizar outras ações.
[005] É importante realizar as etapas na ordem adequada pelos períodos de tempo adequados. Se a amostra for permeabilizada an- tes de ser fixada, as estruturas celulares na amostra podem se degradar antes de serem fixadas, e qualquer capacidade de discernir a morfologia celular original é perdida. Adicionalmente, a coloração não pode ocorrer antes da etapa de permeabilização, ou o agente de coloração não irá penetrar adequadamente nas células e corar as estruturas dentro das células. Adicionalmente, se qualquer uma das etapas, como fixação, permeabilização e coloração for realizada de modo muito rápido, a morfologia da célula pode ser perdida e/ou a célula e as suas estruturas internas podem não ser adequadamente coradas. As atuais técnicas de coloração exigem várias etapas e tempo significativo.
[006] As atuais técnicas de coloração exigem a diluição das amostras nos agentes de contraste, geralmente a cerca de 1:500 ou 1:5000. Desse modo, ocorre a coloração adequada sob as técnicas de coloração atuais.
[007] Os analisadores automatizados estão se tornando mais prevalentes. Uma contagem de células completa (CBC) pode ser obtida com o uso de um analisador automatizado, um tipo do qual conta o número de diferentes partículas ou células em uma amostra sanguínea com base na impedância ou na dispersão dinâmica de luz conforme as partículas ou células passam por uma área de detecção ao longo de um pequeno tubo. O CBC automatizado pode utilizar instrumentos ou métodos para diferenciar entre diferentes tipos de células que incluem RBCs, WBCs e plaquetas (PLTs), que podem ser contadas separadamente. Por exemplo, uma técnica de contagem que requer um tamanho de partícula ou volume mínimo pode ser usada para contar ape-nas células grandes. Certos tipos de células, como células anormais no sangue, podem não ser contadas ou identificadas corretamente. Pequenas células que aderem umas às outras podem ser erroneamente contadas como uma célula grande. Quando suspeitam-se contagens erradas, pode ser necessário rever manualmente os resultados instrumentais para verificar e identificar as células.
[008] Técnicas de contagem de células sanguíneas automatizadas podem envolver a citometria de fluxo. A citometria de fluxo envolve fornecer uma trajetória de fluxo estreita, e detectar e contar a passagem de células sanguíneas individuais. Os métodos de citometria de fluxo foram usados para detectar partículas suspensas em um fluido, como células em uma amostra sanguínea, e para analisar as partículas quanto ao tipo, dimensão e distribuição de volume de partícula(s), de modo a inferir a concentração do respectivo tipo de partícula ou do volume da partícula na amostra sanguínea. Exemplos de métodos adequados para analisar as partículas suspensas em um fluido incluem sedimentação, caracterização microscópica, contagem com base na impedância e dispersão dinâmica de luz. Essas ferramentas são passíveis de erros de teste. Por outro lado, a caracterização precisa dos tipos e da concentração das partículas pode ser crítica em aplicações como o diagnóstico clínico.
[009] Nas técnicas de contagem com base na formação de imagens, imagens de dados de pixel de uma amostra preparada que pode estar passando por uma área de visualização são capturadas usando a lente objetiva de um microscópio acoplada a uma câmera digital. Os dados da imagem de pixels podem ser analisados usando técnicas de processamento de dados, e também são exibidos em um monitor.
[0010] Aspectos dos sistemas de diagnóstico automatizados com as células sob fluxo são revelados na patente US n° 6.825.926, para Turner et al., e nas patentes US nos 6.184.978; 6.424.415; e 6.590.646, todas de Kasdan et al., que estão aqui incorporadas, por referência, como se elas fossem completamente descritas na presente invenção.
[0011] Sistemas automatizados usando a dispersão dinâmica de luz ou a impedância foram usados para obter uma contagem de células completa (CBC): a contagem de leucócitos total (WBC), o volume de células total dos eritrócitos (distribuição das células vermelhas do sangue), hemoglobina HGB (a quantidade de hemoglobina no sangue); volume médio da célula (MCV) (volume médio das hemácias); MPV (volume PLT médio); hematócrito (HCT); MCH (HGB/RBC) (a quantidade média de hemoglobina por eritrócito); e MCHC (HGB/HCT) (a concentração média de hemoglobina nas células). Processos automatizados ou parcialmente automatizados foram usados para facilitar as análises de amostras sanguíneas e a contagem diferencial de cinco partes dos leucócitos.
[0012] Os vários sistemas automatizados descritos acima baseiam-se na análise rápida das amostras. O número e a duração das etapas do processo de coloração podem ser um fator limitante na velocidade e na eficiência dos sistemas de análise de partículas automatizados. Os sistemas de análise de partículas automatizados podem ser mais eficientes se o processo de coloração for abreviado, e serão ainda mais eficientes se o processo de coloração for realizado em uma única etapa. Adicionalmente, os sistemas de análise de partículas automatizados podem ser mais eficientes se o tamanho total da amostra for mantido em um mínimo.
SUMÁRIO
[0013] Uma composição do agente de contraste de partículas é revelada para colorir uma amostra de fluido sanguíneo sendo visualizada em um sistema de análise de partícula automatizado. A composição do agente de contraste de partículas pode incluir ao menos um agente de contraste de partículas selecionado do grupo que consiste em cristal violeta, novo azul de metileno, verde de metila, eosina Y e safranina O. A composição do agente de contraste de partículas pode incluir, ainda, um agente permeabilizante selecionado do grupo que consiste em um tensoativo, uma saponina, um sal de amónio quaternário, um tensoativo não iônico, um detergente; e um tensoativo zwitterionico. A composição do agente de contraste de partículas pode incluir, ainda, um agente fixador selecionado do grupo que consiste em gluteraldeído e formaldeido.
[0014] Em uma modalidade, o agente permeabilizante pode ser a saponina presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/L e cerca de 750 mg/L, sob condições de coloração. O agente fixador pode ser o gluteraldeído presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em ou abaixo de 0,1%, sob condições de coloração.
[0015] Em uma modalidade, o ao menos um agente de contraste de partículas pode incluir cristal violeta, novo azul de metileno e eosi- na-Y. A razão entre o cristal violeta e o novo azul de metileno pode estar entre cerca de 1:90 e cerca de 1:110, sob condições de coloração. A eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 3 pM a cerca de 300 pM, sob condições de coloração.
[0016] Em uma modalidade, o cristal violeta pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 6 pM a cerca de 10 pM, sob condições de coloração. O novo azul de metileno pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 70 pM a cerca 2,4 mM, sob condições de coloração. A eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 pM a cerca de 50 pM, sob condições de coloração.
[0017] Em algumas modalidades, o cristal violeta é aproximadamente 90% puro, ou mais. O novo azul de metileno pode ser aproximadamente 70% puro, ou mais. A eosina-Y pode ser aproximadamente 80% pura, ou mais.
[0018] Em algumas modalidades, o cristal violeta está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 7,8 pM, sob as condições de coloração. O novo azul de metileno pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 pM, sob condições de coloração. A eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 pM, sob condições de coloração. Em algumas modalidades, a composição do agente de contraste de partículas pode adicionalmente incluir os componentes tampão.
[0019] Um método é divulgado para tratar partículas de uma amostra de fluido sanguíneo que será visualizada com o uso de um sistema de análise de partícula automatizado. O método pode incluir combinar a amostra de fluido sanguíneo com uma composição do agente de contraste de partículas para obter uma mistura de amostra e incubar a mistura de amostra a uma temperatura entre cerca de 37° Celsius e cerca de 60° Celsius, durante menos de 90 segundos. A composição do agente de contraste de partículas inclui ao menos um agente de contraste de partículas selecionado do grupo que consiste em cristal violeta, novo azul de metileno, verde de metila, eosina Y e safranina O; um agente permeabilizante selecionado do grupo que consiste em um tensoativo, uma saponina, um sal de amónio quaternário, um tensoativo não iônico, um detergente; e um tensoativo zwit- teriônico; e um agente fixador selecionado do grupo que consiste em gluteraldeído e formaldeido.
[0020] Em algumas modalidades, o agente de contraste de partículas pode incluir cristal violeta, novo azul de metileno em quantidades suficientes para resultar em uma razão de cristal violeta para novo azul de metileno entre cerca de 1:1 a cerca de 1:500, sob condições de coloração. a saponina pode estar incluída em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/L e cerca de 750 mg/L, sob condições de coloração. O gluteraldeído pode ser incluído em quantidades suficientes para resultar em concentrações em ou abaixo de 0,1%, sob condições de coloração. O método pode incluir a mistura de amostra sendo incubada durante menos de 60 segundos.
[0021] Em algumas modalidades, a composição do agente de contraste de partículas pode incluir o cristal violeta presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em cerca de 6 pM a cerca de 10 pM, sob condições de coloração. O novo azul de metileno pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 70 pM a cerca 2,4 mM, sob condições de coloração. A eosina-Y pode estar presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 pM a cerca de 50 pM, sob condições de coloração. A amostra de fluido sanguíneo pode ser combinada com a composição do agente de contraste de partículas em uma razão da amostra de fluido sanguíneo para a composição do agente de contraste de partículas de cerca de 1:2 a cerca de 1:10.
[0022] Em algumas modalidades, o método pode incluir aquecer a mistura de amostra até entre 46°C e cerca de 49°C, durante entre 40 e 50 segundos.
[0023] Em alguma modalidade, o cristal violeta pode ser aproximadamente 90% puro, ou mais. O novo azul de metileno pode ser aproximadamente 70% puro, ou mais. A eosina-Y pode ser aproximadamente 80% pura, ou mais.
[0024] Em algumas modalidades, o agente de contraste de partículas pode incluir o cristal violeta presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em cerca de 7,8 pM, sob condições de coloração. O novo azul de metileno presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 pM, sob condições de coloração, e a eosina-Y presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 pM, sob condições de coloração. A composição do agente de contraste de particulas pode incluir, ainda, componentes de tampão. A amostra de fluido sanguíneo pode ser combinada com a composição do agente de contraste de partículas em uma razão da amostra de fluido sanguíneo para a composição do agente de contraste de partículas de cerca de 1:3 a cerca de 1:4. A mistura de amostra pode ser aquecida até cerca de 47°C, durante cerca de 45 segundos.
[0025] A descrição acima e muitos outros recursos e vantagens presentes das modalidades da presente invenção serão evidentes e adicionalmente compreendidas por referência à descrição detalhada a seguir, quando considerada em conjunto com os desenhos em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0026] O relatório descritivo faz referência às seguintes figuras em anexo, onde o uso de números de referência semelhantes, em figuras diferentes, tem por objetivo ilustrar componentes semelhantes ou análogos.
[0027] A figura 1 é um diagrama esquemático de um fluxo continuo para transportar um fluido de amostra, de acordo com uma modalidade.
[0028] A figura 2 é um diagrama esquemático da preparação de uma composição do agente de contraste de partículas de acordo com uma modalidade.
[0029] A figura 3 é um fluxograma de um processo de coloração de uma etapa rápido de acordo com uma modalidade.
[0030] A figura 4 é uma ilustração representativa dos leucócitos selecionados corados, de acordo com o processo de coloração de uma etapa rápido, de acordo com uma modalidade.
[0031] A figura 5 é uma ilustração representativa dos leucócitos selecionados de uma amostra corada com uma composição do agente de contraste de partículas de acordo com uma modalidade.
[0032] A figura 6 é uma ilustração representativa das células coradas de acordo com o exemplo 1 anterior.
[0033] A figura 7 é uma ilustração representativa das células coradas de acordo com o exemplo 2 anterior.
[0034] A figura 8 é uma ilustração representativa das células coradas de acordo com o exemplo 3 anterior.
[0035] A figura 9 é uma ilustração representativa das células coradas de acordo com o exemplo 4 anterior.
[0036] A figura 10 é uma ilustração representativa das células coradas de acordo com um exemplo anterior.
[0037] A figura 11 é uma ilustração representativa das células coradas de acordo com o exemplo 5 anterior.
[0038] A figura 12 é uma ilustração representativa das células coradas de acordo com o exemplo 6 anterior.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0039] A presente descrição está relacionada a uma composição do agente de contraste de partículas surpreendente e inesperada para gerar, rapidamente, distinções visuais em uma amostra. A composição do agente de contraste de partículas pode ser especialmente útil em sistemas de citometria de fluxo automatizados. A composição do agente de contraste de partículas é compreendida de uma combinação de um agente de contraste de partículas, um agente permeabi- lizante e um agente fixador. Em uma modalidade, a composição do agente de contraste de partículas é uma mistura de cristal violeta, novo azul de metileno, saponina e gluteraldeído. Em uma modalidade que é surpreendentemente eficaz, sob condições de coloração, o cristal violeta está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 7,8 pM, o novo azul de metileno está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 pM, a saponina está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/L e cerca de 750 mg/L, a composição inclui ainda eosina-Y presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 pM e o gluteraldeído está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em ou abaixo de 0,1%.
[0040] Esses exemplos ilustrativos são dados para apresentar o leitor ao assunto geral discutido aqui, e não se destinam a limitar o escopo dos conceitos revelados. As seções a seguir descrevem vários recursos adicionais e exemplos com referência aos desenhos em que números iguais indicam elementos iguais, e descrições direcionais são usadas para descrever as modalidades ilustrativas, porém, como as modalidades ilustrativas, elas não devem ser usadas para limitar a presente descrição. Os elementos incluídos nas ilustrações da presente invenção podem não estar desenhados em escala.
[0041] A composição do agente de contraste de partículas da invenção, quando aplicada a uma amostra de fluido sanguíneo, causa a coloração das células em tal amostra similar àquela de um esfregaço sanguíneo tratado com um corante de esfregaço sanguíneo padrão, e em particular similar ao corante de esfregaço sanguíneo com o corante de Wright. O corante de Wright é um corante histológico que facilita a diferenciação dos tipos de células sanguíneas (por exemplo, WBC). Ele é usado principalmente para corar os esfregaços de sangue periférico e os aspirados de medula óssea que são examinados sob um microscópio óptico. Em citogenética, ele é usado para corar cromossomos para facilitar o diagnóstico de síndromes e doenças. Há corantes relacionados conhecidos como o corante de Wright tamponado, o corante de Wright-Giemsa e o corante de Wright-Giemsa tamponado. Devido ao processo com o corante de Wright’s envolver um solvente alcoólico, esse procedimento de coloração é destrutivo para as células viáveis, e não resulta em célu- las substancialmente intactas. O corante May-Grünwald, que produz uma coloração mais intensa, também demora mais tempo para funcionar.
[0042] Os aspectos e as modalidades da presente invenção ba- seiam-se na descrição surpreendente e inesperada de que certas composições de agente de contraste de partículas, incluindo, por exemplo, composições de tintura/corante e/ou combinações dos mesmos, têm propriedades inesperadas e eficácia, quando usadas para realizar análise de amostra baseada em imagem automatizada, como análise sanguínea. Hematologia - sistema de análise de partículas
[0043] As composições e o método revelados na presente invenção podem ser usados com muitos tipos diferentes de sistemas de formação de imagens hematológicos. Em particular, as composições e os métodos descritos na presente invenção podem ser usados com análise de amostra baseada em imagem, como análise de fluxo contínuo. Um exemplo de tal análise de fluxo continuo pode incluir métodos de citometria de fluxo conhecidos e tradicionais. Adicionalmente, as composições e os métodos aqui descritos podem ser vantajosamente usados com os sistemas e métodos de análise de fluxo continuo descritos em detalhes resumidamente abaixo, e descritas adicionalmente nos pedidos codepositados intitulados "Flowcell Systems And Methods For Particle Analysis In Blood Samples," Pedido N° / , depositado em 17 de março de 2014, e "Hematology Systems and Methods," Pedido N° PCT, depositado em 17 de março de 2014, ambos estando aqui incorporados por referência.
[0044] A figura 1 é uma representação esquemática de um fluxo continuo exemplificador 22 para transportar um fluido de amostra (por exemplo, a mistura de amostra descrita a seguir) através de uma zona de visualização 23 de um dispositivo de imageamento de elevada resolução óptica 24 em uma configuração para a formação de imagens das partículas microscópicas em um fluxo de amostra 32 usando o processamento de imagem digital. O fluxo contínuo 22 está acoplado a uma fonte 25 do fluido da amostra, que pode ter sido submetido ao processamento, como por contato com uma composição do agente de contraste de partículas, conforme descrito em mais detalhes abaixo. O fluxo contínuo 22 também é acoplado a uma ou mais fontes 27 de um líquido de alinhamento de partícula e/ou organela intracelular (PIOAL), como uma solução de glice- rol transparente com viscosidade maior que a viscosidade do fluido da amostra.
[0045] O fluido da amostra é injetado através de uma abertura achatada em uma extremidade distai 28 de um tudo de alimentação de amostra 29, e no interior do fluxo continuo 22 em um ponto onde o fluxo PIOAL foi substancialmente estabelecido, resultando em um fluxo laminar estável e simétrico do PIOAL acima e abaixo (ou em lados opostos) do fluxo de amostra em forma de fita. Os fluxos de amostra e PIOAL podem ser fornecidos por bombas medidoras de precisão que movem o PIOAL com o fluido de amostra injetado ao longo de uma trajetória de fluxo que se estreita substancialmente. O PIOAL envolve e comprime o fluido de amostra na zona 21, onde a trajetória do fluxo estreita. Portanto, a diminuição na espessura da trajetória do fluxo na zona 21 pode contribuir para uma focalização geométrica do fluxo da amostra 32. A película de fluido de amostra 32 é envelopada e transportada juntamente com o PIOAL a jusante da zona de estreitamento 21, passando na frente de ou, de outro modo, através da zona de visualização 23 do dispositivo de imageamento de elevada resolução óptica 24, onde as imagens são coletadas, por exemplo, usando um CCD. A película de fluido de amostra flui juntamente com o PIOAL até uma descarga 33.
[0046] Conforme mostrado aqui, a zona de estreitamento 21 pode ter uma porção de trajetória do fluxo proximal 21a com uma espessura proximal PT e uma porção de trajetória do fluxo distal 21b com uma es- pessura distal DT, de modo que a espessura distal DT é menor que a espessura proximal PT. O fluido de amostra pode, portanto, ser injetado através da extremidade distai 28 do tubo da amostra 29 em um local que é distai à porção proximal 21a e proximal à porção distai 21b. Portanto, o fluido de amostra pode entrar no envelope PIOAL conforme o fluxo de PIOAL é compactado pela zona 21, sendo que o tubo be injeção de fluido de amostra tem uma porta de saída distai através da qual o fluido de amostra é injetado no fluido da bainha fluida, com a porta de saída distai sendo delimitada pela diminuição no tamanho da trajetória do fluxo do fluxo continuo.
[0047] O dispositivo de imageamento de elevada resolução óptica digital 24 com lentes objetivas 46 é direcionado ao longo de um eixo óptico que intercepta o fluxo da amostra em forma de tira 32. A distância relativa entre a objetiva 46 e o fluxo contínuo 33 é variável pela operação de um motor de acionamento 54, para separar e coletar uma imagem digitalizada focalizada em uma matriz fotossensora. Composição do agente de contraste de partículas
[0048] A figura 2 é um diagrama esquemático da preparação de uma composição do agente de contraste de partículas de acordo com uma modalidade. No bloco 208, um agente de contraste de partículas 202, um agente permeabilizante 204 e um agente fixador 206 são combinados para criar a composição do agente de contraste de partículas 210. Em uma modalidade, o agente de contraste de partículas 202, o agente permeabilizante 204 e o agente fixador 206 são combinados ao mesmo tempo. Em outras modalidades, um dentre o agente de contraste de partículas 202, o agente permeabilizante 204 e o agente fixador 206 é combinado com outro do agente de contraste de partículas 202, o agente permeabilizante 204 e o agente fixador 206, que é, em seguida, combinado com o último do agente de contraste de partículas 202, agente permeabilizante 204 e agente fixador 206, em qualquer ordem. A combi- nação no bloco 208 pode ser realizada em qualquer ordem e de qualquer maneira adequada.
[0049] Em modalidades alternativas, um dentre o agente permea- bilizante 204 e o agente fixador 206 não está incluído na composição do agente de contraste de partículas 210. Em ainda outras modalidades, materiais adicionais são combinados no bloco 208 como parte da composição do agente de contraste de partículas 210, conforme descrito em mais detalhes abaixo.
[0050] A composição do agente de contraste de partículas 210 pode ser fornecida como parte de um kit. A composição do agente de contraste de partículas 210 pode ser fornecida já preparada ou como um ou mais componentes que devem ser combinados. Agente de contraste de partículas
[0051] O agente de contraste de partículas 202 pode ser qualquer agente de contraste capaz de produzir distinções visíveis, como aquelas semelhantes a um corante de Wright. Exemplos de tais agentes de contraste incluem o azul de alcian e o azul de alcian 86 (mucossubstáncias PAS neutras e ácidas); Vermelho alizarina S; vermelho allura AC (azocorante vermelho #40); azul analine (cílios intensificados com ácido oxálico); Auramina O; Azure B; Azure C; Marrom Bismarck; Azul brilhante FCF (azul de Comassie); Azul cresil brilhante; Verde brilhante; CArmim (corante nuclear vermelho composto de ácido carmínico e alume de potássio); Vermelho congo; Preto Clorozol E (núcleos pretos, citosol cinza, glicogênio rosa); Acetato de cresil violeta; Vermelho darrow; Azul de eosina; Eritrosina B (corante vermelho #3); Etileosina; Verde rápido FCF (corante verde #3); Fucsina básica - (núcleos e flagelos); Fluoresceína- (mercúrio cromo); Giemsa- esfregaços de sangue periférico; Hematoxilina de Harris - mancha nuclear regressiva; índigo carmim (Corante azul #2); Verde Janus B (mitocôndria); Corante Jenner - (esfregaços de sangue peri- férico); Verde claro SF amarelado; MacNeal- (mancha de sangue te- tracromo); Verde de malaquita; Alaranjado de metila; Amarelo Mar- tius; Hematoxilina de Mayer - mancha nuclear progressiva; Metil violeta 2B; Metenamina-prata - Ácido periódico; Metileno violeta; May Grunwald- coloração hematológica; MTT- corante de formazan; Mu- cicarmina- corante de tumor primário; Vermelho neutro; Nigrosina; Azul Nilo A; Vermelho rápido nuclear C.l. 60760; Naftal AS; Corante de formazan nitroazul de tetrazólio rápido; Laranja G; Laranja II; Or- ceína; Corante de Papanicolaou EAS- corante citoplasmático brilhante; Pararosanilina; Pararosanalina; Ácido periódico Schiff - (PAS, corante específico de carboidrato); Filoxina B; Protargol S; Pironina B; Pironina Y; Resazurina; Romanowsky-Giemsa; Rosa de bengala; Sa- franina O; Negru Sudão B; Sudão III- (com alfa-naftol cora os grânulos mieloides); Sudão IV- cora os triglicerídeos; Tartrazina- (corante azo amarelo #5); Tionian - cora a meta cromatina; Trifenil tetrazólio; TTC - Corante vermelho formazan; Azul toluidina O; Corante de Wright - (fixador, tampão e corante para esfregaços sanguíneos convencionais); e Wright Giemsa.-
[0052] Por meio de esforços e experimentação não triviais, desco- briu-se, surpreendentemente, que resultados eficazes podem ser alcançados na composição do agente de contraste de partículas 210, conforme descrito em mais detalhes na presente invenção, com o uso de um agente de contraste de partículas 202 que inclui ao menos um dentre cristal violeta, novo azul de metileno, safranina O, eosina Y e verde de metila. O agente de contraste de partículas 202 é adicionado em uma quantidade eficaz para corar células viáveis e/ou substancialmente intactas para a classificação e subclassificação baseada em imagem. O agente de contraste de partículas 202 pode ser qualquer combinação de dois ou mais dos agentes de contraste de partículas supracitados. O agente de contraste de partículas 202 pode ser selecionado para obter, de modo eficaz, imagens coradas "tipo Wright" de células vitais e/ou substancialmente intactas.
[0053] Em uma modalidade, o agente de contraste de partículas 202 inclui cristal violeta. O cristal violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 1 pM a cerca de 100 pM, sob condições de coloração. Como usado aqui, o termo "sob condições de coloração" refere-se a quando o componente é misturado com a amostra. O cristal violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 6 pM a cerca de 10 pM, sob condições de coloração. O cristal violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 7,8 pM, sob condições de coloração. O cristal violeta pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar concentrações muito próximas de 7,8 pM, sob condições de coloração. O cristal violeta pode ser purificado até ao menos 90% de pureza. O cristal violeta pode ser purificado até ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% de pureza. O cristal violeta pode ser purificado até 99% de pureza. O agente de contraste de partículas 202 pode ser, unicamente, cristal violeta, ou ele pode ser cristal violeta combinado com um ou mais agentes de contraste de partículas adicionais.
[0054] Em uma modalidade, o agente de contraste de partículas 202 inclui novo azul de metileno. O novo azul de metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 70 pM a cerca de 2,4 mM, sob condições de coloração. O novo azul de metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 500 pM a cerca de 950 pM, sob condições de coloração. O novo azul de metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 735 pM, sob condições de coloração. O novo azul de metileno pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar concentrações muito próximas de 735 pM, sob condições de coloração. O novo azul de metileno pode ser purificado até ao menos 70% de pureza. O novo azul de metileno pode ser purificado até ao menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. O novo azul de metileno pode ser purificado até ao menos 100% de pureza.
[0055] Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes são alcançados quando o agente de contraste de partículas 202 inclui tanto o cristal violeta como o novo azul de metileno. A razão entre o cristal violeta e o novo azul de metileno pode ser entre cerca de 1:1 a cerca de 1:500 (molar/molar). A razão entre o cristal violeta e o novo azul de metileno pode ser entre cerca de 1:50 a cerca de 1:160 (molar/molar). A razão entre o cristal violeta e o novo azul de metileno pode ser entre cerca de 1:90 a cerca de 1:110 (molar/molar).
[0056] Em uma modalidade, o agente de contraste de partículas 202 inclui eosina Y. A eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 3 pM a cerca de 300 pM, sob condições de coloração. A eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 10 pM a cerca de 50 pM, sob condições de coloração. A eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 27 pM, sob condições de coloração A eosina Y pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar concentrações muito próximas de 27 pM, sob condições de coloração. A eosina Y pode ser purificada até ao menos 80% de pureza. A eosina Y pode ser purificada até ao menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. A eosina Y pode ser purificada até ao menos 100% de pureza.
[0057] Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes são alcançados quando o agente de contraste de partículas 202 é uma combinação de cristal violeta, novo azul de metileno e eo- sina Y, cada um com qualquer combinação de concentrações e purezas, conforme descrito acima. Em algumas modalidades, o agente de contraste de partículas 202 é, especificamente, o cristal violeta presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 7,8 pM, o novo azul de metileno está presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 735 pM e a eosina Y está presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 27 pM. Em algumas modalidades, o agente de contraste de partículas 202 é, especificamente, cristal violeta pelo menos 99% puro presente em quantidades suficientes para obter cerca de 7,8 pM, novo azul de metileno ao menos 99% puro presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 735 pM, e eosina Y ao menos 99% pura presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 27 pM.
[0058] Em uma modalidade, o agente de contraste de partículas 202 inclui safranina O. A safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 1 pM a cerca de 100 pM, sob condições de coloração. A safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar entre cerca de 3 pM a cerca de 30 pM, sob condições de coloração. A safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 9 pM, sob condições de coloração. A safranina O pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar concentrações muito próximas de 9 pM, sob condições de coloração. A safranina O pode ser purificada até ao menos 80% de pureza. A safranina O pode ser purificada até ao menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. A safranina O pode ser purificada até ao menos 100% de pureza.
[0059] Em uma modalidade, o agente de contraste de partículas 202 inclui verde de metila. O verde de metila pode estar presente em quantidades suficientes para alcançar cerca de 0,1 g/L, sob condi- ções de coloração. O verde de metila pode estar presente em quantidades suficientes para concentrações muito próximas de 0,1 g/L, sob condições de coloração. O verde de metila pode ser purificado até ao menos 80% de pureza. O verde de metila pode ser purificado até ao menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de pureza. O verde de metila pode ser purificado até ao menos 100% de pureza.
[0060] Em algumas modalidades, o agente de contraste de partículas 202 inclui um ou mais de cristal violeta, novo azul de metileno, safranina O, eosina Y e verde de metila, em quantidades eficazes para gerar distinções visuais nas partículas, por exemplo, pela acentuação das características das partículas de teor intracelular em uma amostra, quando presentes para formação de imagens. O agente de contraste de partículas 202 pode estar presente em quantidades suficientes para acentuar e/ou corar as estruturas subcelulares dos neu- trófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos, bem como os re- ticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas, blasto, promielócito, mie- lócito, metamielócito ou fragmentos de célula. Distinções visualizáveis ou visuais podem incluir quaisquer características de partícula ou in- trapartícula que podem ser visualizáveis ou, de outro modo, detectá- veis usando qualquer fonte de luz (por exemplo, UV, visível, IV).
[0061] Nas modalidades onde a composição do agente de contraste de partículas 210 inclui dois ou mais agentes de contraste de partículas 202, as quantidades de cada um dos agentes de contraste de partículas 202 pode ser ajustada adequadamente, dependendo de se os agentes de contraste de partículas 202 têm efeitos independentes, competitivos e/ou intensificadores sobre a geração de distinções visuais para a classificação e subclassificação de partículas.
Agente permeabilizante
[0062] Em algumas modalidades, o agente permeabilizante 204 pode incluir um tensoativo. Em algumas modalidades, o agente per- meabilizante 204 pode incluir uma saponina. Em modalidades alternativas, o agente permeabilizante 204 pode incluir ao menos um dentre um sal de amónio quaternário, um tensoativo não iônico e um tensoativo zwitteriônico. O agente permeabilizante pode alterar a permeabili-dade de uma célula para aumentar a acessibilidade do agente de contraste de partículas 202 aos conteúdos intracelulares. O agente permeabilizante pode ser selecionado e incluído em quantidades suficientes para permitir um rápido procedimento de coloração de uma única etapa.
[0063] Exemplos de um tensoativo não iônico podem incluir (1) éteres alquílicos ou arílicos de polioxietileno (polietoxilatos), incluindo hidrófobos alifáticos de cadeia linear eterificados com o polietilenogli- col ou com o polioxietilenoetanol, por exemplo, Brij® 35; (2) hidrófobos alifáticos/aromáticos de cadeia ramificada (por exemplo, octilfenol) eterificados com o polietilenoglicol, por exemplo, Triton X®-100; (3) hidrófobos alifáticos/aromáticos de cadeia linear (por exemplo, n-nonilfenol) eterificados com o polietilenoglicol, por exemplo, Igepal® C0897; e (4) hidrófobos alifáticos de cadeia linear (por exemplo, ácido carboxílico) esterificados com o polietilenoglicol, por exemplo, Myrj® 53, e outros. Exemplos de tensoativos de éteres alquílicos ou arílicos de polioxietileno não iônicos (polietoxilatos) podem incluir éter laurílico de polioxietileno (4) (Brij® 30); o éter laurílico de polioxietileno(23) (Brij® 35); o éter cetílico de polioxietileno(2) (Brij® 52); o éter cetílico de polioxieti- leno(20) (Brij® 58); o éter estearílico de polioxietileno (2) (Brij® 72); o éter estearílico de polioxietileno (10) (Brij® 76); o éter estearílico de polioxietileno (20) (Brij® 78); o éter oleílico de polioxietileno (2) (Brij® 92); o éter oleílico de polioxietileno (10) (Brij® 96); o éter oleílico de polioxietileno (20) (Brij® 98); o éter estearílico de polioxietileno (21) (Brij® 721); o éter estearílico de polioxietileno (100) (Brij® 700); e outros. Ou- tros exemplos de tensoativos não iônicos podem incluir Triton X®-100 (não reduzido ou reduzido), Triton®X-114 não reduzido ou reduzido), Triton X®-165 e Triton X®-305 (não reduzido e reduzido), e outros.
[0064] Em uma modalidade, o agente permeabilizante 204 pode incluir Brij® 35 em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 0,10 g/L a cerca de 0,20 g/L, sob condições de coloração. O Brij® 35 pode estar presente em quantidades suficientes para resultar nas concentrações de cerca de 0,10 g/L a cerca de 0,16 g/L, sob condições de coloração. O Brij® 35 pode estar presente em quantidades suficientes para resultar nas concentrações de cerca de 0,012 g/L a cerca de 0,14 g/L.
[0065] Exemplos de tensoativos zwitteriônicos podem incluir TDAPS (propanossulfonato de tetradecildimetilamônio), CHAPSO (3-[(3- colamidopropil) dimetilamônio]-2-hidróxi-1 -propanossulfonato), N-óxidos de alquil N,N-dimetila com de cerca de 12 a cerca de 16 átomos de carbono, N-óxido de laurildimetilamina (LO), DDAPS (N-dodecil-N, N-dimetil- 3-amônio-1-propanossulfonato) e outros.
[0066] Em algumas modalidades, o agente permeabilizante 204 inclui um agente suficiente para lisar eritrócitos. Em algumas modalidades, o agente permeabilizante 204 inclui um agente suficiente para lisar os eritrócitos além dos reticulócitos ou eritrócitos nucleados. Em algumas modalidades, o agente permeabilizante 204 inclui um agente suficiente para lisar os eritrócitos, enquanto que os leucócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas e outras células permanecem substancialmente intactos. Em algumas modalidades, o agente permeabilizante 204 torna os membros e/ou membranas nucleares dos leucócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados e/ou plaquetas mais permeáveis e/ou porosos, para facilitar o acesso pelo agente de contraste de partículas 202.
[0067] Em algumas modalidades, o agente permeabilizante 204 é selecionado para ser capaz de criar rapidamente os poros ou aberturas necessárias para permitir que o agente de contraste de partículas 202 entre nas células na amostra.
[0068] Através de experimentação e esforços não triviais, descobriu-se que, surpreendentemente, resultados eficazes podem ser obtidos, em algumas modalidades da composição do agente de contraste de partículas 210 com o uso de um agente permeabilizante 204 que inclui 5PD-lítico, disponível junto à Clinical Diagnostic Solutions (CDS) em Ft. Lauderdale, Flórida. 5PD-lítico inclui a saponina. O 5PD-lítico é descrito de maneira geral na patente US No. 6.632.676, aqui incorporada por referência.
[0069] Através de experimentação e esforços não triviais, descobriu- se, surpreendentemente, que resultados eficazes podem ser alcançados em algumas modalidades da composição do agente de contraste de partículas 210 com o uso de um agente permeabilizante 204 inclui uma saponina presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 mg/L a cerca de 1000 mg/L, sob condições de coloração. Em algumas modalidades, a saponina está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 50 mg/L a cerca de 750 mg/L. Em algumas modalidades, a saponina pode ser um éter de saponina substituído com amónio quaternário.
Agente fixador
[0070] Em algumas modalidades, o agente fixador 206 pode ser selecionado para assegurar que os leucócitos não se degradam durante a coloração e a formação de imagens. Em algumas modalidades, o agente fixador 206 pode assegurar que outras células e estruturas celulares não se degradam. Exemplos de agentes fixadores podem incluir o gluta- raldeído; formaldeído; agentes de reticulação; picrato de amónia em solução salina isotônica (por exemplo, para a coloração com azul de metileno); álcool etílico; metanol (por exemplo, em temperatura ambiente, - 20°C ou -70°C); Heidenhain’s Susa - HgCh, NaCI ácido tricloroacético, formalina; Bouin’s - Ácido pícrico, Formalina, ácido acético; Duboseq- Brazil - Bouins com EtOH 80%; Carnoy’s - EtOH, clorofórmio, ácido acético; Zenker’s - HgCi2, K^CrO?, NaSθ4.H2θ; acetocarmim; Ga- tensby’s - Ácido crômico, tetróxido de ósmio, NaCI; Baker’s - Formalina, CaCh,; Smith’s - teC^O?, formalina, ácido acético; verde de metila 1%, ácido acético 1%; Fenol, formalina, glicerol, violeta de genciana; Schaudin - HgCh, EtOH, ácido acético; Champy’s - Ácido crômico, K2CrO?, OSO4; Fleming’s - Ácido crômico, OsO4, ácido acético; Formol- Prata - Formaldeido, AgNOs; Fixador de tecido Streck’s - Bronopol, Diazolidinilureia, ZnSO4 7H2O, citrato de sódio; 1% de imidazolidinilureia em PBS; Glioxal: Gliofix, Prefer, Safefix, Histochoice; Glidante- Hidantoina; Dimetilolureia; H id roxi meti lg liei nato de sódio; Karnovsky’s; Cloreto mercúrico (B-5); Hollande’s; e outros. Além disso, fixadores exemplares adequados podem incluir qualquer um dos seguintes, sozinhos ou em combinação.
[0071] Em algumas modalidades, 0 agente fixador 206 pode ser um agente oxidante, um agente mercúrico, um picrato, um fixador com efeito de proteção de solvente orgânico mediado por tampão hepes- ácido glutâmico (HOPE) ou um conservante hidrossolúvel. Exemplos de agentes oxidantes incluem dicromato de potássio, ácido crômico, permanganate de potássio e outros. Exemplos de mercúricos incluem B-5, fixador de Zernker e outros. Exemplos de conservantes hidrosso- lúveis incluem metilparabeno, propilparabeno, dimetilolureia, 2- piridinotiol-1-óxido, ácido ascórbico, sorbato de potássio e outros.
[0072] Através de experimentação e esforços não triviais, descobriu- se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados, em algumas modalidades da composição do agente de contraste de partículas 210 com 0 uso de um agente fixador 206 que inclui ao menos um dentre gluteraldeído e formaldeido.
[0073] Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados pelo uso de um agente fixador 206 que inclui gluteraldeído em ou abaixo de 0,1% em peso. Componentes adicionais
[0074] Em algumas modalidades, os componentes adicionais opcionais 212 podem ser opcionalmente combinados no bloco 208 na composição do agente de contraste de partículas 210. Exemplos de componentes adicionais 212 podem incluir componentes tampão, agentes modificadores de viscosidade, um agente antimicrobiano, um agente de ajuste osmótico, um modificador de força iônica, um tensoativo, um agente quelante e outros. Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados quando a composição do agente de contraste de partículas 210 inclui uma solução salina tamponada com fosfato.
[0075] Agentes modificadores de viscosidade exemplificadores incluem hidrocoloides naturais (e derivados), como carragena, goma de alfarrobeira, goma guar e gelatina; açúcares (e derivados), como a dextrose e a frutose; polidextrose; dextranas; polidextranas; sacarí- deos; e polissacarídeos; hidrocoloides semissintéticos (e derivados), como metilcelulose e carboximetilcelulose; Hidrocoloides sintéticos (e derivados), como Carbopol®; e Argilas (e derivados), como bentonita e Veegum®.
Processo de coloração de uma etapa rápido
[0076] A figura 3 é um fluxograma de um processo de coloração de uma etapa rápido 300, de acordo com uma modalidade. Embora o processo de coloração de uma etapa rápido 300 pode conter várias subeta- pas, o termo "uma etapa" é usado para identificar que a amostra não precisa ser introduzida em várias soluções diferentes durante o procedimento de coloração. A composição do agente de contraste de partículas 210 é preparada no bloco 302, conforme descrito acima com referência à figura 2. Opcionalmente, em algumas modalidades, os componentes, como quaisquer agentes de contraste de partículas 202, podem ser purificados no bloco 306. A purificação dos agentes de contraste de partículas 202 pode reduzir o nível de precipitados formados após o contato com uma amostra, assim reduzindo o sinal de fundo e melhorando os resultados da análise da amostra de sangue baseada em imagem, com uma menor necessidade de rever adicionalmente as imagens ou lâminas, ou microscopia manualmente preparada.
[0077] No bloco 308, a composição do agente de contraste de partículas 210 é combinada com a amostra. A composição do agente de contraste de partículas 210 pode ser combinada com a amostra de qualquer maneira adequada, incluindo a mistura. A combinação no bloco 308 pode incluir diluir a amostra com uma certa quantidade de composição do agente de contraste de partículas 210. A amostra pode ser diluída com a composição do agente de contraste de partículas 210. A quantidade de diluição pode ser selecionada para fornecer uma quantidade ideal de células por quadro, durante uma análise baseada em imagem. A quantidade de diluição pode ser selecionada para for-necer uma quantidade ideal de leucócitos por quadro, durante uma análise baseada em imagem. A quantidade de diluição pode ser, de outro modo, selecionada para fornecer um valor ótimo para qualquer outra análise não baseada em imagem.
[0078] Através de experimentação e esforços não triviais, descobriu- se surpreendentemente que resultados eficazes podem ser obtidos em algumas modalidades da composição do agente de contraste de partículas 210 com o uso de uma razão da composição do agente de contraste de partículas 210 para a amostra entre cerca de 2:1 a cerca de 20:1. A razão entre a composição do agente de contraste de partículas 210 e a amostra pode ser entre cerca de 3:1 a cerca de 10:1. A razão entre a composição do agente de contraste de partículas 210 e a amostra pode ser entre cerca de 3:1 a cerca de 4:1. A razão entre a composição do agente de contraste de partículas 210 e a amostra pode ser de cerca de 3:1 ou cerca de 4:1. Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser obtidos usando uma razão da composição do agente de contraste de partículas 210 para a amostra muito próxima de 3:1 ou muito próxima de 4:1.
[0079] Resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados usando o agente de contraste de partículas com 40 ml_ de 5PD- lítico e 50 ml_ de solução salina tamponada com fosfato, com uma razão de diluição de 10:1 da composição do agente de contraste de partículas 210 para a amostra. Resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados usando o agente de contraste de partículas com 40 ml_ de 5PD-lítico, mais saponina e 40 ml_ de solução salina tamponada com fosfato, com uma razão de diluição de 5:1 da composição do agente de contraste de partículas 210 para a amostra. Resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados usando o agente de contraste de partículas com 40 ml_ de 5PD-lítico, mais saponina e 36 ml_ de solução salina tamponada com fosfato, com uma razão de diluição de 4:1 da composição do agente de contraste de partículas 210 para a amostra.
[0080] Em algumas modalidades, a amostra é combinada com a composição do agente de contraste de partículas 210 sob temperaturas elevadas, como qualquer uma das temperaturas descritas a seguir com referência à incubação.
[0081] Como usado aqui, a amostra e a composição do agente de contraste de partículas 210 combinadas são chamadas de mistura de amostra.
[0082] No bloco 310, a mistura de amostra é incubada por uma certa quantidade de tempo a uma determinada temperatura. A incubação pode aumentar a permeabilidade das células ou de suas estruturas internas, permitindo que o agente de contraste de partículas 202 se infiltre melhor nas células ou nas estruturas celulares. O tempo e temperatura de incubação podem ser selecionados para permitir que a composição do agente de contraste de partículas 210 permeie, fixe e colore adequadamente a amostra. O tempo e a temperatura de incubação podem ser selecionados para garantir a lise dos eritrócitos e preservando, ao mesmo tempo, os leucócitos, as plaquetas e os eritrócitos nucleados substancialmente intactos.
[0083] Através de experimentação e esforços não triviais, descobriu- se surpreendentemente que resultados eficazes podem ser obtidos em algumas modalidades da composição do agente de contraste de partículas 210 com a incubação da mistura de amostra em temperaturas entre cerca de 37 °C e cerca de 60 °C, durante cerca de 1 a 60 segundos. A mistura de amostra pode ser aquecida até temperaturas entre cerca de 46 °C e cerca de 49 °C. A mistura de amostra pode ser incubada durante entre 40 e 50 segundos. A mistura de amostra pode ser incubada por até uma hora. Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser obtidos pela incubação da mistura de amostra a cerca de 48 °C durante cerca de 45 segundos. Em algumas modalidades, resultados surpreendentemente eficazes podem ser obtidos pela incubação da mistura de amostra a cerca de 47 °C durante cerca de 45 segundos.
[0084] Em algumas modalidades, a combinação no bloco 308 e a incubação no bloco 310 são concluídas aproximadamente na mesma quantidade de tempo ou em menos tempo que o tempo necessário para uma mistura de amostra ser processada no equipamento de image- amento e para que as linhas do equipamento de imageamento serem esguichadas e/ou limpas. Dessa maneira, uma primeira mistura de amostra pode ser visualizada, enquanto que uma segunda mistura de amostra está sendo combinada e incubada. Quando a primeira mistura de amostra foi visualizada e o equipamento de imageamento foi limpo, a segunda mistura de amostra pode ser imediatamente visualizada.
[0085] Em modalidades alternativas, a combinação no bloco 308 e a incubação no bloco 310 são concluídas em menos do dobro de tempo necessário para uma mistura de amostra ser processada no equipamento de imageamento e para que as linhas do equipamento de imageamento serem esguichadas e/ou limpas. Dessa maneira, enquanto uma primeira mistura de amostra está sendo visualizada, uma segunda mistura de amostra pode estar pronta para ser visualizada, e uma terceira mistura de amostra e uma quarta mistura de amostra podem estar no processo de serem combinadas e incubadas. Quando a primeira mistura de amostra foi visualizada e o equipamento de imageamento foi limpo, a segunda mistura de amostra pode ser imediatamente visualizada. A terceira mistura de amostra pode estar concluindo a sua combinação e incubação, e a quarta mistura de amostra ainda pode estar sendo combinada e incubada. Uma vez que a segunda mistura de amostra foi visualizada e o equipamento de imageamento foi limpo, a terceira mistura de amostra pode ser imediatamente visualizada, enquanto que a quarta mistura de amostra começa a concluir a combinação e a incubação, e uma quinta mistura de amostra começa a combinar e a incubar. O processo pode continuar indefinidamente para visualizar continuamente as misturas de amostras.
[0086] Através de experimentação e esforços não triviais, desco- briu-se que resultados surpreendentemente eficazes podem ser obtidos através de uma combinação de certas modalidades da composição do agente de contraste de partículas 210, certas maneiras de combinar a composição do agente de contraste de partículas 210 com a amostra e certas maneiras de incubar a mistura de amostra.
[0087] Especificamente, resultados surpreendentemente eficazes podem ser alcançados pelo uso de uma composição do agente de contraste de partículas 210, incluindo cristal violeta 90% puro ou mais, a cerca de 7,8 pM sob condições de coloração, novo azul de metileno 70% puro ou mais a cerca de 735 pM sob condições de coloração, eo- sina-Y 80% pura ou mais a cerca de 27 pM sob condições de coloração, saponina pré-tratada de cerca de 50 mg/L a cerca de 750 mg/L sob condições de coloração e gluteraldeído a cerca de 0,1% ou menos, sob condições de coloração; onde o agente de contraste de partículas 210 é combinado com a amostra em uma razão de agente de contraste de partículas 210 para amostra entre cerca de 3:1 e cerca de 4:1; e onde a mistura de amostra resultante é incubada a cerca de 48 °C durante cer-ca de 45 segundos.
[0088] Certas composições de agente de contraste de partículas eficazes 210 e procedimentos de coloração permitem que as imagens manchadas tipo Wright, de células vitais e/ou substancialmente intactas, sejam obtidas com eficácia com um analisador visual automatizado, usando corantes em um sistema solvente não baseado em álcool. Certas composições de agente de contraste de partículas eficazes 210 e procedimentos de coloração permitem a rápida coloração de amostras, de modo que vários componentes celulares, lobos nucleares e estruturas granulares são claramente distinguíveis. Certas composições de agente de contraste de partículas 210 eficazes e procedimen-tos de coloração são adequados para a coloração supravital. Certas composições de agente de contraste de partículas 210 eficazes e pro-cedimentos de coloração são gerar distinções visuais para a classificação e a subclassificação de partículas. Certas composições do agente de contraste de partículas eficazes 210 e procedimentos de coloração são eficazes para melhorar as características do teor intracelular das partículas em um soro, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido sinovial, fluido seminal, fluido peritoneal, fluido amniótico, fluido de lavagem, fluido do aspirado da medula óssea, efusões, exsudatos ou amostras de sangue. Certas composições do agente de contraste de partículas 210 eficazes e procedimentos de coloração são eficazes para colorir neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, plaquetas, reticulócitos, eritrócitos nucleados, blastos, promielócitos, mielócitos, metamielócitos, excrementos, bactérias, epitélios e/ou parasitas. Certas composições do agente de contraste de partículas 210 eficazes e procedimentos de coloração são eficazes para gerar distinções visuais para a classificação e subclassificação de partículas, por exemplo, pelo fornecimento de coloração diferencial dos grânulos primários e secundários nas células, como para auxiliar na subclassificação de granulócitos imaturos e na determinação de suas idades com base na coloração diferencial ou na intensificação dos grânulos primários e secundários. Certas composições do agente de contraste de partículas 210 eficazes e procedimentos de coloração são eficazes para gerar distinções visuais para contar e caracterizar os eritrócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados e plaquetas, bem como para a contagem diferencial dos leucócitos e a caracterização e análise dos leucócitos. Certas composições do agente de contraste de partículas 210 eficazes e procedimentos de coloração são eficazes para gerar distinções visuais em células vitais e/ou viáveis, e/ou em células com estruturas que permanecem substancialmente intactas. Certas composições do agente de contraste de partículas eficazes 210 e procedimen-tos de coloração são eficazes para colorir as estruturas subcelulares dos neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos, bem como reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas, blastos, promielócitos, mielócitos, metamielócitos ou fragmentos de células.
[0089] A rápida coloração permitida por certas composições do agente de contraste de partículas 210 eficazes, e procedimentos de coloração aqui descritos pode ser usada com a formação de imagens manual ou semiautomatizada, e/ou com os procedimentos de análise.
[0090] Através de experimentação e esforços não triviais, desco- briu-se que resultados surpreendentemente efetivos podem ser alcançados com certas modalidades da composição do agente de contraste de partículas 210 que compreende os agentes de contraste de partículas em um sistema solvente não baseado em álcool que são capazes, pela primeira vez, pelo conhecimento do inventor, de gerar imagens "tipo Wright" de células vitais e/ou substancialmente intactas que podem revelar vários componentes celulares, lóbulos nucleares e estruturas granulares, e que tornam essa partícula e/ou características celulares visualmente distintas.
[0091] Através de experimentação e esforços não triviais, desco- briu-se surpreendentemente que resultados eficazes podem ser alan- çados usando uma composição do agente de contraste de partículas 210 composta conforme é mencionado na tabela 1, onde o Reagente Corante de Trabalho e feito pela mistura de 40 mL de novo azul de metila e 5 mL de cristal violeta. Tabela 1
Figure img0001
[0092] A figura 4 é uma ilustração representativa dos leucócitos selecionados de uma amostra colorida com a composição do agente de contraste de partículas 210 apresentada na tabela 1 e colorida usando os procedimentos de coloração de uma etapa rápidos apresentados acima. Os leucócitos estão intactos e mostram características de coloração de um corante de Wright. Os vários tipos de leucócitos (por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófi- los, etc.) são visualmente diferenciáveis.
[0093] Em algumas modalidades, as características das células coradas pelas composições do agente de contraste de partículas dessa descrição estão indicadas na tabela 2. Tabela 2
Figure img0002
Figure img0003
[0094] Em certas modalidades, a composição corante/de tintura tendo em vista a estabilidade, facilidade de armazenamento, eliminação e/ou toxicidade limitada.
[0095] A figura 5 é uma ilustração representativa de leucócitos selecionados de uma amostra colorida com a composição do agente de contraste de partículas 210 de acordo com uma modalidade, incluindo células visualizadas por imageamento manual, em montagem úmida e por imageamento por fluxo automático.
Experimentação inicial
[0096] Conforme descrito com referência aos exemplos abaixo, várias composições de coloração e métodos foram testados e modificados para resultar nas modalidades divulgadas acima.
[0097] Em um Exemplo 1 inicial, um método de coloração em duas etapas existiu, onde uma amostra e uma modalidade precoce de uma composição do agente de contraste de partículas foram combinados e incubados durante 40 segundos a 47,5 °C e, então, um reagente de supressão foi aplicado à mistura de amostra. A composição do agente de contraste de partículas incluía o Diluente da Série Coulter LH, o Reagente Lítico Coulter Lyse Sill diff, o kit reagente Coulter LH Série Pak e o kit reagente Coulter LH Série RETIC PAK. Os resultados são mostrados na figura 6.
[0098] Em um exemplo inicial 2, após o Exemplo 1, o método de coloração em duas etapas do Exemplo 1 foi substituído por um método de coloração de uma etapa. Os resultados aprimorados dos basófilos são indicados na figura 7, em comparação com os resultados do Exemplo 1.
[0099] Em um exemplo inicial 3, uma composição do agente de contraste de partículas, sem incluir gluteraldeído, resultou em leucócitos enfraquecidos que poderiam se romper devido às forças de cisa- Ihamento no fluxo continuo. As imagens dos resultados do exemplo 3, indicando membranas danificadas, são mostradas na figura 8.
[00100] Em um exemplo inicial 4, após o exemplo 3, o gluteraldeído foi adicionado à composição do agente de contraste de partículas. As membranas dos leucócitos estavam mais intactas no exemplo 4, porém as membranas do núcleo ainda estavam danificadas. Após fazer o ajuste para o PIOAL para reduzir o teor de glicerol, a morfologia dos leucócitos estava, em sua maior parte, inalterada durante o imageamento, conforme mostrado na Figura 9.
[00101] Nos exemplos iniciais, com coloração com dois corantes usando as composições do agente de contraste de partículas do novo azul de metileno e cristal violeta, a maior parte dos tipos de célula foram bem distinguíveis, exceto pelos eosinófilos, que estavam, de certo modo, inconsistentes e nem sempre eram fáceis de distinguir dos neutrófilos, conforme mostrado na figura 10. Nos Exemplos 5 e 6 subsequentes, um terceiro agente de contraste de partículas foi adicionado à composição do agente de contraste de partículas.
[00102] No exemplo 5, verde de metila foi adicionado à composição do agente de contraste de partículas. O verde de metila auxiliou a coloração dos eosinófilos melhor, mas o núcleo das células não corava mais com a cor roxa desejada, mas sim com a cor azul. A figura 11 mostra imagens dos neutrófilos do exemplo 5 com os núcleos de cor azul, mas sem detalhes dos grânulos.
[00103] No exemplo 6, a eosina Y foi usada ao invés do verde de metila como um terceiro agente de contraste de partículas na composição do agente de contraste de partículas. A eosina y reteve a coloração púrpura do núcleo e os grânulos ficam consistentemente coloridos com um brilho ligeiramente alaranjado, conforme visto na figura 12.
[00104] Através dos experimentos mencionados acima e de experimentos adicionais, determinou-se que as modalidades apresentadas e as modalidades reivindicadas fornecem resultados preferenciais.
[00105] Todas as patentes, publicações de patente, pedidos de patente, artigos de periódicos, livros, referências técnicas e similares discutidos na presente descrição estão aqui incorporados a título de referência em suas totalidades para todos os fins.
[00106] Quaisquer cabeçalhos usados na presente invenção são apenas para fins de organização e não devem ser interpretados como limitantes da descrição ou das reivindicações sob qualquer aspecto.
[00107] Diferentes disposições dos componentes mostradas nos desenhos ou descritas acima, assim como componentes e etapas não demonstradas ou descritas, são possíveis. De modo similar, alguns recursos e subcombinações são úteis e podem ser utilizados sem referência a outros recursos e subcombinações. As modalidades da invenção foram descritas para fins ilustrativos e não de restrição, e modalidades alternativas serão evidentes para os leitores dessa patente. Em certos casos, as etapas ou operações do método podem ser realizadas ou executadas em ordem diferente, ou as operações podem ser adicionadas, deletadas ou modificadas. Pode ser entendido que, em determinados aspectos da invenção, um único componente pode ser substituído por vários componentes, e vários componentes podem ser substituídos por um único componente, para fornecer um elemento ou estrutura, ou para realizar uma determinada função ou funções. Exceto onde tal substituição não seria funcional para praticar certas modalidades da invenção, tal substituição é considerada como estando dentro do escopo da invenção. Consequentemente, a presente invenção não se limita às modalidades descritas acima ou representadas nos desenhos, e várias modalidades e modificações podem ser feitas sem afastar do escopo das reivindicações abaixo.

Claims (11)

1. Composição de agente de contraste de partículas para colorir uma amostra de fluido sanguíneo sendo visualizada em um sistema de análise de partículas automatizado, caracterizada pelo fato de compreender: ao menos dois agentes de contraste de partículas selecio-nados do grupo que consiste em cristal violeta, novo azul de metileno, verde de metila, eosina Y e safranina O; um agente permeabilizante incluindo saponina presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/mL e cerca de 750 mg/L sob condições de coloração; e um agente fixador selecionado do grupo que consiste em gluteraldeído e formaldeido.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-da pelo fato de que: o agente permeabilizante é saponina presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações entre cerca de 50 mg/L e cerca de 750 mg/L, sob condições de coloração; e o agente fixador é o gluteraldeído presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações em ou abaixo de 0,1%, sob condições de coloração.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracteriza-da pelo fato de que: o ao menos um agente de contraste de partículas inclui cristal violeta, novo azul de metileno e eosina-Y; uma razão entre o cristal violeta e o novo azul de metileno está entre cerca de 1:90 a cerca de 1:110, sob condições de coloração; e a eosina-Y está presente em quantidades suficientes para re- sultar em concentrações de cerca de 3 pM a cerca de 300 pM, sob con-dições de coloração.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que: o cristal violeta está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 6 pM a cerca de 10 pM sob condições de coloração; o novo azul de metileno está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 70 pM a cerca de 2,4 mM, sob condições de coloração; e a eosina-Y está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 pM a cerca de 50 pM, sob condições de coloração.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que: o cristal violeta está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 7,8 pM, sob condições de coloração; o novo azul de metileno está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 pM, sob condições de coloração; e a eosina-Y está presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 pM, sob condições de coloração.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de compreender, adicionalmente: componentes tampão.
7. Método para tratar partículas de uma amostra de fluido sanguíneo que será visualizada com o uso de um sistema de análise de partículas automatizado, caracterizado pelo fato de compreender: combinar a amostra de fluido sanguíneo com a composição do agente de contraste de partículas, conforme definida na reivindicação 1, para obter uma mistura da amostra; e incubar a mistura de amostra a uma temperatura entre cerca de 37° Celsius e cerca de 60° Celsius durante menos de 90 segundos.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: a composição do agente de contraste de partículas inclui: cristal violeta, novo azul de metileno em quantidades suficientes para resultar em uma razão entre cristal violeta e novo azul de metileno entre cerca de 1:1 a cerca de 1:500, sob condições de coloração; e gluteraldeído, em quantidades suficientes para resultar em concentrações em ou abaixo de 0,1%, sob condições de coloração, e a incubação da mistura de amostra inclui o aquecimento da mistura de amostra durante menos de 60 segundos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: a composição do agente de contraste de partículas inclui: cristal violeta presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 6 pM a cerca de 10 pM, sob condições de coloração; novo azul de metileno presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 70 pM a cerca de 2,4 mM, sob condições de coloração; e eosina-Y presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 10 pM a cerca de 50 pM, sob condições de coloração, a combinação da amostra de fluido sanguíneo com a composição do agente de contraste de partículas inclui combinar em uma razão entre amostra de fluido sanguíneo e a composição do agente de contraste de partículas de cerca de 1:2 a cerca de 1:10.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que incubar a mistura de amostra inclui aquecer a mistura de amostra até entre cerca de 46 °C e cerca de 49 °C, durante entre 40 e 50 segundos.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: a composição do agente de contraste de partículas inclui: cristal violeta presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 7,8 pM, sob condições de coloração; novo azul de metileno presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 735 pM, sob condições de coloração. eosina-Y presente em quantidades suficientes para resultar em concentrações de cerca de 27 pM, sob condições de coloração; e componentes tampão, a combinação da amostra de fluido sanguíneo com a composição do agente de contraste de partículas inclui combinar em uma razão entre a amostra de fluido sanguíneo e a composição do agente de contraste de partículas de cerca de 1:3 a cerca de 1:4; e incubar a mistura de amostra inclui aquecer a mistura de amostra até cerca de 47°C durante cerca de 45 segundos.
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