CN101278190B - 焦点位置决定方法、焦点位置决定装置、微弱光检测装置及微弱光检测方法 - Google Patents

Abstract

目的是提供一种在将试料内的特定的部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下、在设置了试料的时刻能够决定对准于该观察对象部位的物镜的焦点位置的焦点位置决定方法、焦点位置决定装置等。本发明向试料照射光，变更物镜的焦点位置，测量变更后的焦点位置，以变更后的焦点位置将被照射光的试料摄像，基于摄像的摄像图像计算特征量，反复执行焦点位置的变更、焦点位置的测量、试料的摄像及特征量的计算，从执行并储存的多个焦点位置中，基于执行并储存的多个特征量，选出至少1个焦点位置，基于选出的焦点位置决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。决定物镜的焦点位置，进行数字缩放及光学缩放，通过希望的倍率将摄像的图像放大并显示。

Description

焦点位置决定方法、焦点位置决定装置、微弱光检测装置及微弱光检测方法

技术领域

本发明涉及决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置。 

本发明涉及利用包含透镜的放大成像光学机构观察或测量发出微弱光的来源于生物体的被测试料的方法及装置。 

背景技术

[I]目前，利用萤光的生物试料的成像方法，对于生命科学的研究起着很大的作用。通过标记特定的蛋白质并利用发光，能够观察在细胞内外发生的各种生命现象，此外，还能够实时地知道各种生命现象的动态变化等。特别是在最近，通过使用GFP(Green FluorescentProtein：绿色萤光蛋白质)等萤光蛋白质，能够稳定且容易地实现细胞内的构造物的成像，各种生命现象的研究不断地发展。 

此外，偶尔也进行将发现生物发光性蛋白质(具体而言是虫萤光素酶或水母发光蛋白等)的发光关联基因用于细胞内的各种功能解析(具体而言是将发光关联基因用作发现蛋白质的报告分子)的研究。并且，在进行这样的功能解析的基础上，将透镜的焦点对焦在细胞内的特定部位而描绘鲜明的图像、或者高效率地接收来自导入到细胞内的特定的生物发光性蛋白质的发光，这些非常重要。但是，由于来自生物试料的自发光的光强度一般很微弱，所以通常不能通过肉眼直接确认来自生物试料的发光的情况较多。对于这样的发出微弱光的试料，即使调节光学元件(例如检测系统的透镜等)，通过肉眼将透镜 的焦点对准到试料内的部位也是很困难的。 

公开了将光聚焦在试料容器内的试料上的各种方法。但是，哪一种都是用肉眼(目视)能够确认来自试料的光的情况下的方法。例如，在专利文献1及专利文献2中公开了检测试料容器的底面位置、基于检测到的位置信息将光聚焦在试料容器内的试料上的方法。在专利文献1中，通过物镜将光向试料容器的底面照射，一边使光的照射位置上下移动、一边依次检测来自试料容器的底面的镜面反射光的强度，基于检测到的光的强度检测试料容器的底面位置，基于检测到的位置信息推定试料容器内的试料的位置，将光对焦在推定的位置上。此外，在专利文献2中，通过物镜将光从下方斜照试料容器的底面，通过光检测器检测来自试料容器底面的镜面反射光的XY平面上的偏移量，基于检测到的偏移量检测试料容器的光轴上的底面位置，基于检测到的位置信息推定试料容器内的试料的位置，将光聚焦在推定的位置上。由此，可以将物镜的焦点位置对准在试料容器内的试料上。 

此外，在专利文献3及专利文献4中公开了如下方法，即利用以明视场观察细胞等的相位物体的显微镜，将物镜的位置从通常的对焦位置前后偏移而固定，得到散焦引起的较高对比度的观察图像来观察细胞。由此，能够以较高对比度得到作为相位物体的细胞的观察图像。 

[II]目前，利用萤光及发光(化学发光及生物发光)现象的、解析来源于生物的试料的技术，在生命科学领域的研究中起着重要的作用。通过将在细胞内外发生的各种生命现象标记特定的蛋白质，并利用萤光及发光，能够进行实际测量，能够实时地求出它们的动态变化等。特别是在最近，通过使用GFP(Green Fluorescent Protein：绿色萤光蛋白质)等萤光蛋白质，能够稳定且容易地将细胞内的构造物成像，利用萤光图像的解析技术确实对生命现象的研究有很大帮助。 

在利用萤光图像的来源于生物的试料的解析中，在试料过小的情况下，利用光学方式或电子方式(数字方式)将观察图像放大后进行 图像解析的尝试。作为这样的例子，公开了如下装置，即，对于增殖的微生物，利用将用萤光色素进行了萤光染色的萤光图像放大后的放大图像，来测量微生物的数量(参照专利文献5)。 

专利文献1：(日本)特表2002-541430号公报 

专利文献2：(日本)特表2002-542480号公报 

专利文献3：(日本)特开2004-354650号公报 

专利文献4：(日本)特开2005-173288号公报 

专利文献5：(日本)特开2005-172680号公报 

发明内容

[I]但是，在将试料内的特定部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下，在设置了试料的时刻，来自试料的发光较微弱或还没有发生，所以在以往的技术中，在设置了试料的时刻，不能决定对准于该观察对象部位的物镜的焦点位置，所以存在不能将物镜的焦点位置对准到该观察对象部位的问题。 

本发明是鉴于上述问题而做出的，目的是提供一种焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，在将试料内的特定部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下，在设置了试料的时刻，能够决定对准于该观察对象部位的物镜的焦点位置，结果就能够将物镜的焦点位置对准到该观察对象部位。 

[II]但是，一般萤光的亮度较高，另一方面光量不固定而变动或逐渐消失。此外，由于照射激励光，在长时间的观察中，具有激励光的反复照射引起的亮度的变动也容易发生的问题，难以进行精密的图像解析、特别是定量的解析。此外，来自生物的自发光与萤光不同，总是以恒定的光量发光。但是，自发光的光强度很微弱，通常情况下不能用肉眼直接观察，所以不能正确地对准焦点位置，所以不能描绘鲜明的图像、或高效率地接收来自特定的生物发光蛋白质的发光。 

另一方面，也偶尔地进行代替上述萤光蛋白质而使用作为生物发光蛋白质的虫萤光素酶或水母发光蛋白等的基因作为蛋白质发现的报告分子，有助于细胞内的功能解析，推测对于自发光的图像解析的期待也很高。 

因此，本发明的另一目的是提供一种微弱光检测方法及装置，对于不能通过发光等直接观察的试料也能够正确地对准焦点位置。此外，本发明的目的是，特别提供一种能够得到鲜明的发光图像的方法及装置。 

为了解决上述问题、达到目的，有关本发明的技术方案1所述的焦点位置决定方法，决定对准于试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置，其特征在于，包括：光照射步骤，向试料照射光；焦点位置变更步骤，变更物镜的焦点位置；焦点位置计测步骤，计测在上述焦点位置变更步骤中变更的焦点位置；试料摄像步骤，以在上述焦点位置变更步骤中变更后的焦点位置，将在上述光照射步骤中照射了光的试料摄像；特征量计算步骤，基于在上述试料摄像步骤中摄像的摄像图像，计算对摄像图像建立特征的特征量；执行步骤，反复执行上述焦点位置变更步骤、上述焦点位置计测步骤、上述试料摄像步骤以及上述特征量计算步骤；焦点位置选出步骤，从执行上述执行步骤而储存的多个焦点位置中，基于上述执行而储存的多个特征量，选出至少1个选出焦点位置；焦点位置决定步骤，基于在上述焦点位置选出步骤中选出的选出焦点位置，决定对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置；以及焦点位置再决定处理，在从上述试料细胞发出的发光的强度为可由试料摄像单元检测到的程度时，基于不照明试料而对该试料进行摄像的发光图像，再次重新决定由上述焦点位置决定步骤所决定的物镜的焦点位置；上述焦点位置再决定处理包括：决定位置试料摄像步骤，在由上述焦点位置决定步骤决定的焦点位置，不照明试 料而对该试料进行摄像；决定后焦点位置变更步骤，变更在上述焦点位置决定步骤决定的焦点位置；决定后试料摄像步骤，在由上述决定后焦点位置变更步骤变更的焦点位置，不照明试料而对该试料进行摄像；特征量比较步骤，将在上述决定位置试料摄像步骤进行摄像的作为发光图像的特征量的对比度与在上述决定后试料摄像步骤进行摄像的作为发光图像的特征量的对比度进行比较；以及焦点位置再决定步骤，在上述特征量比较步骤进行比较的结果，是在上述决定后试料摄像步骤进行摄像的作为发光图像的特征量的对比度更大的情况下，将在上述决定后焦点位置变更步骤变更的焦点位置，再度决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案2所述的焦点位置决定方法在技术方案1所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，在上述焦点位置选出步骤中，从执行上述执行步骤而储存的多个焦点位置中，基于上述执行并储存的多个特征量，选出两个选出焦点位置；在上述焦点位置决定步骤中，基于在上述焦点位置选出步骤中选出的两个选出焦点位置，将该两个选出焦点位置的中央位置决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案3所述的焦点位置决定方法在技术方案2所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，上述两个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置及物镜的远点侧的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案4所述的焦点位置决定方法在技术方案1所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，在上述焦点位置选出步骤中，从执行上述执行步骤而储存的多个焦点位置中，基于上述执行并储存的多个特征量，选出1个选出焦点位置；在上述焦点位置决定步骤中，基于在上述焦点位置选出步骤中选出的1个选出焦点位置和预定的距离，将从该选出焦点位置离开该距离的位 置，决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案5所述的焦点位置决定方法在技术方案4所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，上述1个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置或物镜的远点侧的焦点位置。 

此外，本发明是关于焦点位置决定装置的，有关本发明的技术方案6所述的焦点位置决定装置，决定对准于试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置，其特征在于，具备：光照射单元，向试料照射光；焦点位置变更单元，变更物镜的焦点位置；焦点位置计测单元，计测物镜的焦点位置；试料摄像单元，将试料摄像；特征量计算单元，基于由上述试料摄像单元摄像的摄像图像，计算对摄像图像建立特征的特征量；控制单元，控制上述焦点位置变更单元、上述焦点位置计测单元、上述试料摄像单元以及上述特征量计算单元以使各个单元反复执行；焦点位置选出单元，从通过上述控制单元反复执行上述各个单元而储存的多个焦点位置中，基于上述反复执行而储存的多个特征量，选出至少1个选出焦点位置；焦点位置决定单元，基于由上述焦点位置选出单元选出的选出焦点位置，决定对准于上述试料细胞内发出微弱光的观察发光蛋白质所局部存在的的物镜的焦点位置；特征量比较单元，比较由上述特征量计算单元预先分别计算出的两个特征量；以及焦点位置再决定单元，基于由上述特征量比较单元比较的结果，再次决定对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置；在由上述焦点位置决定单元决定的焦点位置，用上述试料摄像单元不照明试料而对该试料进行摄像，基于所摄像的发光图像，由上述特征量计算单元计算出特征量；利用上述焦点位置变更单元变更由上述焦点位置决定单元决定的焦点位置，在变更后的焦点位置用上述试料摄像单元不照明试料而对该试料进行摄像，并基于拍摄的发光图像，由上述特征量 计算单元计算出特征量；由上述特征量比较单元比较与上述决定的焦点位置对应的特征量和与上述变更后的焦点位置对应的特征量，在比较的结果是与上述变更后的焦点位置对应的特征量更大的情况下，利用上述焦点位置再决定单元将上述变更后的焦点位置，再次决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案7所述的焦点位置决定装置在技术方案6所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，上述焦点位置选出单元从上述储存的多个焦点位置中，基于上述执储存的多个特征量，选出两个选出焦点位置；上述焦点位置决定单元基于由上述焦点位置选出单元选出的两个选出焦点位置，将该两个选出焦点位置的中央位置决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案8所述的焦点位置决定装置在技术方案7所述的焦点位置决定装置中，上述两个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置及物镜的远点侧的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案9所述的焦点位置决定装置在技术方案6所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，上述焦点位置选出单元从上述储存的多个焦点位置中，基于上述储存的多个特征量，选出1个选出焦点位置；上述焦点位置决定机构基于由上述焦点位置选出机构选出的1个选出焦点位置和预定的距离，将从该选出焦点位置离开该距离的位置，决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案10所述的焦点位置决定装置在技术方案9所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，上述1个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置或物镜的远点侧的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案13所述的焦点位置决定装置在技 术方案6～10中任一项所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，在包括上述光照明机构的照明光学系统的光瞳位置上配置有开口。 

此外，有关本发明的技术方案14所述的焦点位置决定装置在技术方案13所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，将上述开口相对于光轴偏心地配置。 

此外，有关本发明的技术方案15所述的焦点位置决定装置在技术方案6～10中任一项所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，在包括上述光照明机构的照明光学系统中配置有窄频带通滤光器。 

此外，有关本发明的技术方案16所述的焦点位置决定装置在技术方案6～10中任一项所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，上述光照射机构发出单色的可见光。 

此外，有关本发明的技术方案17所述的焦点位置决定装置在技术方案6～10中任一项所述的焦点位置决定装置中，其特征在于，还具备向试料照射激励光的激励光照射机构。 

此外，有关本发明的技术方案20所述的焦点位置决定方法，决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，其特征在于，测量物镜的近点侧的焦点位置及/或物镜的远点侧的焦点位置，基于测量的焦点位置决定对准于上述观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，本发明是关于焦点位置决定方法的，有关本发明的技术方案21所述的焦点位置决定方法，决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，其特征在于，一边使物镜的焦点位置移动一边将试料摄像并且测量物镜的焦点距离，基于摄像的图像，计算构成图像的各像素的像素值的最大值和最小值的差即对比度，基于计算出的对比度及测量的物镜的焦点位置，决定对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案22所述的焦点位置决定方法是，在技术方案21所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，上述对比度是构成像素的各像素的像素值中的包括最大值的高位的像素值的平均值、和构成像素的各像素的像素值中的包括最小值的低位的像素值的平均值的差。 

此外，有关本发明的技术方案23所述的焦点位置决定方法是，在技术方案21或22所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，将计算出的对比度与其他的对比度比较而探索1个其极小值，将摄像作为探索到的极小值的基础的图像时的物镜的焦点位置决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案24所述的焦点位置决定方法是，在技术方案21～23中任一项所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，将计算出的对比度与其他的对比度比较而探索两个其极大值，将摄像作为探索到的各极大值的基础的图像时的物镜的焦点位置的中间决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，有关本发明的技术方案25所述的焦点位置决定方法是，在技术方案21～24中任一项所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，一边使其移动量阶段性地减少一边使物镜的位置移动。 

此外，有关本发明的技术方案26所述的焦点位置决定方法是，在技术方案25所述的焦点位置决定方法中，其特征在于，一边使其移动量减少为前次的移动量的一半一边使物镜的位置移动。 

[II]本发明者首先基于以上的认识，开发了各种成像技术并锐意地研究(参照特愿2005-267531号)。根据该研究，证明了通过用由物镜的开口数(NA)及投影倍率(β)表示的(NA÷β)的平方的值为0.01以上的光学系统进行摄像，仅通过从单一的细胞产生的发光就能够图像化。值得惊奇的是，该摄像条件对于以往难以图像化的所有的来源于生物的试料都具有能够应用的可能性，能够将在短时间内(例如20分钟以内)生物发光那样的通过肉眼(以及显微镜下)不能直接观察的微弱的发光成分的细胞图像摄像。进而，根据发明者 探究的光学条件，发现在将摄像装置的物镜用开口数(NA)/投影倍率(β)的平方表示的光学条件为0.071以上的情况下，能够在1～5分钟以内的短时间进行图像化，能够提供也能够进行图像解析的细胞图像。 

这里，首先，发明者通过低倍率的物镜取得被测试料整体的图像，确认了视野内的希望的发光部位，但在此情况下，希望的发光部位是观察视野的一部分的情况较多，停留在微小的区域中，所以可知其解析及确认功能是很困难的。所以，想要将观察视野内的希望的部位放大而观察，但是想要单纯地通过提高物镜的倍率取得生物发光蛋白质等的微弱的发光图像的情况下，视野变暗，有有时不能容易地确认发光像的技术问题。 

所以，本发明的微弱光检测装置，利用光学成像机构描绘来源于生物的被测试料的图像，其特征在于，包括利用光学成像机构描绘上述被测试料的图像的图像生成工序、从由上述图像生成工序取得的该图像中提取希望的区域的图像提取工序、和将由上述图像提取工序取得的该区域放大的图像放大工序。该装置优选地包括将作为上述被测试料的一部分的希望区域的放大图像叠合在上述被测试料的明视场或暗视场图像上而显示的图像显示工序、或将该图像记录的图像记录工序。 

此外，本发明的微弱光检测方法的特征在于，描绘来源于生物的被测试料的图像，从该图像中提取希望的区域，将该区域放大显示或记录。该方法优选地还具有将作为上述被测试料的一部分的希望区域的放大图像叠合在上述被测试料的明视场或暗视场图像上而显示或记录的工序。此外，在该方法中，上述图像放大工序优选的是光学图像放大工序或通过电气处理的图像放大工序。 

根据本发明，提供一种确定希望的发光部位的图像、将该部分放大显示的方法及装置。这里，在利用包括透镜的放大成像光学机构进 行发出微弱光的被测试料的观察时(或者观察被测试料、作为图像取得时)，基于描绘的图像，将包括发光部位的希望的部位的图像放大并显示(或者指定所描绘的图像内的希望的区域的图像要素，将指定的图像要素以任意倍率放大并图像显示)是重要的结构要素。 

另一方面，可知将除了转移盐基排列及发光关联基因以外还融合了发现萤光蛋白质的萤光关联基因的融合基因导入到细胞中，得到该细胞的萤光图像，基于得到的萤光图像，判断在细胞内的规定的部位中是否局部存在生物发光蛋白质(参照特愿2005-104341号)。这样利用萤光物质的发光进行细胞内的发光蛋白质的发光位置的标记是有效的方法，但即使进行了利用萤光物质的萤光的、细胞内的发光位置的确定，通常该部位也是细胞内的微小的部分，不过是观察视野内的很小一部分，所以将其摄像的CCD摄像机的摄像元件中的有关受光的元件也是一部分，有可能有得到的图像的解析度不够的情况。即只能得到模糊的图像。 

所以，在利用萤光物质的萤光的情况下，也在识别了细胞内的发光蛋白质的发光位置后、在该位置进行标记，将该位置作为细胞内的发光蛋白质的发光位置，接着对该部位进行数字缩放或光学缩放，能够得到希望部位的放大图像(或者在观察导入到细胞内的发光关联基因的微弱发光的微弱发光测量装置中，将包含微弱发光的生物蛋白质的细胞内的发光部位通过标识在其附近的萤光物质发出的萤光鉴别，由此将鉴别的发光部分的像放大，生成为放大图像)。 

[I]根据有关本发明的焦点位置决定方法，由于测量物镜的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)及/或物镜的远点侧的焦点位置(大致焦点位置)，基于计测的焦点位置决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，所以在将试料内的特定的部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下，在设置了试料的时刻，能够决定对准于该观察对象部位的物镜的焦点位置，结果，起到能够将 物镜的焦点位置调对到该观察对象部位的效果。此外，根据本发明，具有在进行试料内的发光部位的发光观察时，即使没有确认来自该发光部位的发光、也能够将物镜的焦点调对到试料内的发光部位的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，(1)向试料照射光，(2)变更物镜的焦点位置，(3)测量变更后的焦点位置，(4)以变更后的焦点位置将被照射了光的试料摄像，(5)基于摄像的摄像图像计算对摄像图像建立特征的特征量，(6)反复执行(2)～(5)，(7)从执行并储存的多个焦点位置中，基于执行并储存的多个特征量，选出至少1个焦点位置，(8)基于选出的焦点位置，决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，所以，在将试料内的特定的部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下，能够在设置了试料的时刻决定对准于该观察对象部位的物镜的焦点位置，结果，起到能够将物镜的焦点位置调对到该观察对象部位的效果。此外，根据本发明，具有在进行试料内的发光部位的发光观察时，即使没有确认来自该发光部位的发光、也能够将物镜的焦点调对到试料内的发光部位的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，在上述(7)中，从执行并储存的多个焦点位置中，基于执行并储存的多个特征量，选出两个焦点位置，在上述(8)中，基于选出的两个焦点位置，将该两个焦点位置的中央位置(大致中央位置)决定为对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，所以，起到能够容易地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，由于两个焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)及物镜的远点侧的焦点位置(大致焦点位置)，所以，起到能够容易 且简单地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，在上述(7)中，从执行并储存的多个焦点位置中，基于执行并储存的多个特征量，选出1个焦点位置，在上述(8)中，基于选出的1个焦点位置及预先设定的距离，将从该焦点位置离开该规定距离的位置决定为对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，所以，起到能够更容易地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，由于1个焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)及物镜的远点侧的焦点位置(大致焦点位置)，所以，起到能够更容易且简单地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，(9)以在上述(8)中决定的焦点位置将试料摄像，(10)基于摄像的摄像图像计算特征量，(11)变更在上述(8)中决定的焦点位置，(12)以变更后的焦点位置将试料摄像，(13)基于摄像的摄像图像计算特征量，(14)将在(10)中计算的特征量与在(13)中计算的特征量比较，(15)在比较的结果是在(13)中计算的特征量更大的情况下，将在(11)中变更后的焦点位置再次决定为对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，所以不仅在设置了试料的时刻，从开始试料的发光观察开始也能够持续决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，结果起到能够将物镜的焦点位置总是调对到该观察对象部位。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置，由于试料是生物体细胞或组织，所以起到能够将发出微弱光的物 体作为试料使用的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定装置，由于在包括光照射机构(光源)的照明光学系统的光瞳位置上配置有开口，所以能够增大透过光与衍射光的相位差，结果起到能够提高摄像图像的对比度的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定装置，由于将开口相对于光轴偏心地配置，所以能够进一步增大透过光与衍射光的相位差，结果起到能够进一步提高摄像图像的对比度的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定装置，由于在包括光照射机构(光源)的照明光学系统中配置有窄频带通滤光器，所以能够使从光源发出的光成为波长带域带宽很窄的单色光，结果起到能够提高摄像图像的对比度的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定装置，由于光照射机构(光源)发出单色的可见光，所以在将从光源发出的光照射到试料上时，几乎没有波长分散，能够得到鲜明的衍射光，结果起到能够提高摄像图像的对比度的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定装置，由于还具备向试料照射激励光的激励光照射机构(激励用光源)，所以起到能够同时进行试料的萤光观察和发光观察的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法，由于一边使物镜的位置移动一边将试料(具体而言是包括发光的物质的生物试料等)摄像并且测量物镜的焦点位置，基于摄像的图像，计算构成图像的各像素的最大值与最小值的差即对比度，基于计算出的对比度及测量的物镜的焦点位置，决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，所以在将试料内的特定的部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下，在设置了试料的时刻，能够决定对准于该观察对象部位的物镜的焦点位置，结果，起到能够将物镜的焦点位置 调对到该观察对象部位的效果。此外，根据本发明，具有在进行试料内的发光部位的发光观察时，即使没有确认来自该发光部位的发光、也能够将物镜的焦点调对到试料内的发光部位的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法，由于对比度是构成像素的各像素的像素值中的包括最大值的高位的像素值的平均值、和构成像素的各像素的像素值中的包括最小值的低位的像素值的平均值的差，所以具有即使模拟信号(例如反射光或散射光等的干扰光带来的信号等)进入到摄像的图像中、也能够由该图像计算可靠性较高的对比度的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法，由于将计算出的对比度与其他的对比度比较而探索1个其极小值，将摄像作为探索到的极小值的基础的图像时的物镜的焦点位置决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置，所以起到能够容易地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法，由于将计算出的对比度与其他的对比度比较而探索两个其极大值，将摄像作为探索到的各极大值的基础的图像时的物镜的焦点位置的中间决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置，所以起到能够容易地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法，由于一边使其移动量阶段性地减少一边使物镜的位置移动，所以起到能够迅速地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

此外，根据有关本发明的焦点位置决定方法，由于一边使其移动量减少为前次的移动量的一半一边使物镜的位置移动，所以起到能够迅速地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置的效果。 

[II]根据本发明，由于通过低倍率的物镜取得被测试料整体的图像，确认视野内的希望的发光部位，仅进行该部位的放大，所以能够 得到对希望的发光部分特化、放大的观察图像。另外，通过利用物镜的焦点决定方法或焦点决定装置进行物镜的焦点位置决定，将被测试料的图像数字缩放或光学缩放，能够连续地进行焦点位置决定和图像描绘、图像放大。 

附图说明

图1是示意性地表示物点、光学系统的入射光瞳、射出光瞳、成像面的图。 

图2是表示一边移动物镜、一边用CCD摄像机对细胞进行摄像时的CCD摄像机的各像素的输出信号的变化方式的一例、以及对应于该变化方式示意性地画出的培养皿的位置及细胞的位置的图。 

图3是表示在图2的位置α对细胞进行摄像时的CCD摄像机的特定像素列中包含的各像素的光强度的分布、以及在图2的位置β对细胞进行摄像时的CCD摄像机的特定像素列中包含的各像素的光强度分布的图。 

图4是表示与拍摄两个照明图像时的物镜的光轴上的焦点位置及拍摄发光图像时的物镜的光轴上的焦点位置有关的测量结果的图。 

图5是示意性地表示物镜的焦点位置对准于培养皿的外侧底面的位置时的物镜的焦点位置的图。 

图6是表示在近点侧摄像的最高对比度的照明图像与发光图像的图。 

图7是示意地表示拍摄图6的图像时的物镜的焦点位置的图。 

图8是表示在中心点拍摄的最高对比度的照明图像与发光图像的图。 

图9是示意地表示拍摄图8的图像时的物镜的焦点位置的图。 

图10是表示在远点侧拍摄的最高对比度的照明图像与发光图像的图。 

图11是示意地表示拍摄图10的图像时的物镜的焦点位置的图。 

图12是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1的基本结构的图。 

图13是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1的结构的具体例的图。 

图14是表示配设在试料台17附近的各部分结构的一例的图。 

图15是表示开口单元24的结构及物镜30的光瞳处的开口的投影像的一例的图。 

图16是表示开口单元24的另一结构及物镜30的光瞳处的开口的投影像的一例的图。 

图17是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1的结构的另一具体例的图。 

图18是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1进行的焦点位置决定处理的一例的流程图。 

图19是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1进行的焦点位置再决定处理的一例的流程图。 

图20是表示第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构的具体例的图。 

图21是表示第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构的另一具体例的图。 

图22是表示第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构的另一具体例的图。 

图23是表示导入了质粒媒介的HeLa细胞的照明图像及萤光图像的图。 

图24是表示导入了质粒媒介的HeLa细胞的照明图像及萤光图像的图。 

图25是表示来自选定的号码1的HeLa细胞的发光强度的时间变 化的图。 

图26是表示物镜与试料之间位置关系的一例的图。 

图27是表示物镜的位置与图像的对比度之间关系的一例的图。 

图28是表示第3实施方式的焦点位置决定装置1′的结构的框图。 

图29是表示第3实施方式的焦点位置决定装置1′进行的焦点位置决定处理的一例的流程图。 

图30是表示第3实施方式的焦点位置决定装置1′进行的焦点位置决定处理的一例的流程图。 

图31是表示构成图像的各像素的受光强度的一例的图。 

图32是表示构成图像的各像素的受光强度的二维分布的一例的图。 

图33是表示构成图像的各像素的受光强度的二维分布的一例的图。 

图34是表示第3实施方式的焦点位置决定装置1′进行的焦点位置决定处理的一例的流程图。 

图35是表示第3实施方式的焦点位置决定装置1′进行的焦点位置决定处理的一例的流程图。 

图36是表示有关本发明的第1实施方式的光学系统的结构的图。 

图37是表示有关本发明的第1实施方式的试料容器附近的结构的图。 

图38是表示有关本发明的第1实施方式的数字缩放动作的流程图。 

图39是表示有关本发明的第1实施方式的数字缩放结构的框图。 

图40是表示有关本发明的第1实施方式的数字缩放的操作面板的结构的图。 

图41是表示有关本发明的第2实施方式的光学系统的结构的图。 

图42是表示有关本发明的第2实施方式的变形例的装置结构的图。 

图43是表示有关本发明的第2实施方式的数字缩放动作的流程图。 

标记说明 

1焦点位置决定装置 

10试料(生物体细胞) 

10a观察对象部位 

20光照射部(光源) 

30物镜 

40焦点位置变更部(物镜z轴移动机构) 

50焦点位置测量部 

60试料摄像部(CCD摄像机) 

70信息处理装置(个人计算机) 

70a控制部 

70a1特征量计算部 

70a2焦点位置选出部 

70a3焦点位置决定部 

70a4特征量比较部 

70a5焦点位置再决定部 

70b存储部 

70b1摄像图像数据库 

70b2焦点位置管理文件 

80激励光照射部(激励用光源) 

1′焦点位置决定装置 

10′试料(生物体细胞) 

10′a观察对象部位 

20′光照射部(光源) 

30′物镜 

40′物镜移动部 

50′物镜位置测量部 

60′试料摄像部(CCD摄像机) 

70′信息处理装置(个人计算机) 

70′a控制部 

70′a1对比度计算部 

70′a2焦点位置决定部 

70′b存储部 

70′b1图像等文件 

70′b2决定位置管理文件 

A1照明光学系统 

A3试料台 

A2光源 

A4被测试料 

A5观察光学系统 

A8 CCD摄像机 

A9物镜Z轴驱动机构 

A15物镜 

A19成像面 

A21试料容器 

A22水槽 

A27加热板 

A30带盖的密闭容器 

A34数字缩放电路 

A35 CPU 

A37 TV监视器 

A38记录再现控制电路 

A40操作面板 

A51准直透镜 

A53切换式分色镜 

A54遮光盒 

A61激励光源 

具体实施方式

以下，基于附图详细地说明有关本发明的焦点位置决定方法及焦点位置决定装置的实施方式(第1实施方式、第2实施方式及第3实施方式)。另外，需要说明的是，并不是通过该实施方式来限定本发明。 

[第1实施方式] 

首先，参照附图详细地说明本发明的基本原理。本发明决定作为基准的物镜的焦点位置，以决定的焦点位置为基准，测量物镜的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)及/或物镜的远点侧的焦点位置(大致焦点位置)，基于测量的焦点位置决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置，将物镜的焦点位置对准(移动)到决定的焦点位置。 

具体而言，在本发明中，(1)向试料照射光，(2)通过将例如试料的位置及/或物镜的位置沿光轴方向移动及/或变更物镜的焦点距离(在此情况下采用可变焦透镜)，将物镜的焦点距离变更例如一定量，(3)测量变更后的焦点位置，(4)在变更后的焦点位置，利用CCD摄像机拍摄被照射光的试料，(5)基于拍摄的摄像图像，计算对摄像图像赋予特征的特征量(例如，摄像图像的对比度、摄像图像的亮度的积分值、由摄像图像的亮度分布得到的统计量、摄像图像中的具有 超过了规定阈值的亮度的像素数与全像素数之比等)，(6)反复执行(2)～(5)，(7)根据通过执行而储存的多个焦点位置(表示物镜的焦点位置的光轴上的坐标值)，基于通过执行而储存的多个特征量，选出至少1个焦点位置(具体而言，是物镜的近点侧的焦点位置及/或物镜的远点侧的焦点位置)，(8)基于选出的焦点位置，决定对准于试料内的贯彻对象部位的物镜的焦点位置，(9)通过将例如试料的位置及/或物镜的位置变更为沿光轴方向移动及/或物镜的焦点距离(在此情况下采用可变焦透镜)，将物镜的焦点距离对准(移动)到决定的焦点位置。 

这里，本发明也可以是，在上述(7)中，从通过执行而储存的多个焦点位置中，基于通过执行而储存的多个特征量，选出两个焦点位置(具体而言是物镜的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)及物镜的远点侧的焦点位置(大致焦点位置)，在上述(8)中，基于选出的两个焦点位置，将该两个焦点位置的中央位置(大致中央位置)决定为对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，本发明也可以在上述(7)中，从通过执行而储存的多个焦点位置中，基于通过执行而储存的多个特征量，选出1个焦点位置(具体而言是物镜的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)或物镜的远点侧的焦点位置(大致焦点位置))，在上述(8)中，基于选出的1个焦点位置及预先决定的距离，将从该焦点位置离开了该距离的位置决定为对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，本发明也可以是，(10)以在上述(8)中决定的焦点位置，利用CCD摄像机拍摄试料的发光图像，(11)基于拍摄的摄像图像计算特征量，(12)变更由上述(8)决定的焦点位置，(13)在变更后的焦点位置利用CCD摄像机进行摄像，(14)基于拍摄的摄像图像计算特征量，(15)将在(11)中计算的特征量与在(14)中计算的特征量比较，(16)比较的结果，在上述(14)中计算的特征量更大的 情况下，将变更后的焦点位置再次决定为对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，本发明也可以是，在包含上述(1)中使用的光源的照明光学系统的光瞳位置，将开口例如相对于光轴偏心地配置，此外，也可以将窄频带通滤光器配置在包含括上述(1)中使用的光源的照明光学系统中。此外，本发明也可以使用发出单色的可见光的光源，作为在上述(1)中使用的光源。此外，本发明也可以使用生物体细胞或组织等作为试料。 

这里，将使用生物体细胞作为试料的情况作为一例，参照图1进行说明使摄像图像(照明光的图像)产生与生物体细胞的相位分布成比例的对比度的原理。图1是示意地表示物点、光学系统的入射光瞳、射出光瞳、成像面的图。 

如果将生物体细胞(物体)配置在对焦位置后向物体照射光，则如图1所示，从物点射出的光如实线表示那样以球面状扩散而入射到入射光瞳，入射到入射光瞳中的光从射出光瞳射出，从射出光瞳射出的光如实线所示那样变为球面状的聚束光而聚光到成像面上，最终形成物体的像。另外，在到形成像为止的过程中，在通过光学系统的各光线之间不产生光路差(相位差)，在像中没出现模糊。接着，如果将物点移动到虚线所示的位置后向物体照射光，则如图1所示，从物点射出的光如虚线所示地以球面状扩散而入射到入射光瞳中，入射到入射光瞳中的光从射出光瞳射出，从射出光瞳射出的光如虚线所示变为球面状的聚束光而成像在移动后的成像面上，最终形成物体的像。以上，如果以移动后的成像面位置为观察点观察物体，则在通过光学系统的各光线之间不产生光路差(相位差)，但是如果以当初的成像面位置为观察点来观察物体，则在各光线之间产生光路差(相位差)。 

此外，生物体细胞通常在光学上可以作为相位物体处理。生物体细胞通常为大致相同的形状。所以，如果向例如分布在培养皿内的培 养生物体细胞入射照明光，则生物体细胞发挥衍射光栅那样的作用，照射光依赖于生物体细胞的形状，向特有的方向衍射，可以观察衍射光。即，如果从特定的方向向培养皿内的细胞入射照明光，则因细胞而在入射光中发生衍射，在入射光的方向上发生0次衍射光(透过光)，并且对于透过光在特定的角度方向上发生1次衍射光。 

以上，将生物体细胞配置在从光学系统的对焦位置偏离的位置上，从而可以在透过光学系统的各光线之间产生相位差。此外，通过在从观察光学系统的对焦位置向前后偏移的位置观察生物体细胞，在透过生物体细胞的光和由生物体细胞衍射的光之间，产生与自对焦位置的偏移量(散焦量)相对应的相位差。具体而言，通过将物镜沿着光轴移动，以使物镜的焦点位置对准于作为通常观察中的对焦位置的位置上，使物镜从该移动后的位置再移动微小量，能够在透过观察光学系统的各光线之间产生与移动量成比例的相位差。另外，该相位差在通过物镜的最大NA的光线中变为最大。此外，此时通过偏射照明使衍射光的一部分向物镜的NA外衍射，不再透过观察光学系统，所以与折射光的情况同样，能够形成具有立体感的对比度的图像。 

即，利用这些现象，能够得到生物体细胞的鲜明的、由照明光形成的图像(照明图像)，能够进行与相位差显微镜或微分干涉显微镜同样的观察。此外，作为结果，产生的相位差量能够发挥与相位差观察法中使用的相位膜等价的功能，能够给观察图像带来与生物体细胞的相位分布成比例的对比度，能够以高对比度观察无色透明的生物体细胞。 

另外，在以更高的对比度观察生物体细胞的情况下，如果降低观察光学系统的倍率，则通过观察光学系统的衍射光的角度被限制，所以能够提高观察图像的对比度。 

此外，在观察生物体细胞等的相位物体的情况下，同相位物体的相位分布成比例的对比度，与在相位物体的相位量、及在透过光与衍 射光之间给出的相位差量成比例。此外，透过光与衍射光之间的角度依赖于相位物体的形状而变化。再者，如果透过光与衍射光之间的角度变化，则即使是相同的散焦量，在两个光束之间产生的相位差量也不同。所以，通过在显微镜的照明光学系统的光瞳位置将开口相对于照明光学系统的光轴偏心配置，能够生成对物体以特定的角度照射的照明光。并且，由于能够使比沿向物体的入射光的方向透过的透过光具有使开口偏心的量的角度的衍射光入射到光学系统的入射光瞳中，所以能够进一步增大透过光与衍射光的相位差。换言之，通过将开口从照明光学系统的光轴偏心配置，能够使衍射光比透过光更具有角度，所以能够进一步增大透过光与衍射光的相位差(参照特开2004-354650号公报)。即，如果通过这些方法使透过光与衍射光的相位差变大，则能够进一步提高观察图像的对比度。 

此外，关于由散焦产生的各光线间的相位差，在物体从观察光学系统的对焦位置向近点侧偏移的情况和向远点侧偏移的情况下，其符号变化。所以，通过散焦，能够在光轴上的两个位置得到物体的高对比度图像。此外，对于图像的对比度，在将培养细胞等的相位物体从观察光学系统的对焦位置向近点侧偏移而观察到的图像和向远点侧偏移而观察到的图像中，对应于该相位物体的相位分布而反转。此外，由于吸收来自附着在培养皿底面上的赃物等的光的物体不再是相位物体，所以即使通过散焦给该物体带来相位差，图像的对比度也不发生变化。因此，通过散焦，能够明确地进行相位物体和非相位物体的区分。所以，通过对向近点侧偏移而摄像的图像和向远点侧偏移而摄像的图像进行图像间运算，能够分离不受由散焦引起的相位差影响的图像成分。特别是，通过在两个图像的各像素间进行差运算，能够使与物体的相位分布相当的图像成分的对比度成为2倍，所以能够消除赃物或异物、照明不均等不具有相位信息的图像成分。即，通过这些方法，能够进一步提高观察图像的对比度。 

接着，参照图2及图3说明，一边使物镜移动一边用CCD摄像机拍摄细胞时从CCD摄像机的各像素输出的输出信号(与各像素捕捉到的光的光强度对应的数字信号)的变化方式的一例、以及基于该输出信号的变化方式的、对准于生物体细胞内的特定部位(观察对象部位)的物镜的焦点距离的决定方式的一例。在将生物体细胞浸渍在装入到试料容器(培养皿)的培养液中的状态下，向生物体细胞照射照明光，如果一边使物镜沿着光轴(z轴)从培养皿的下侧向上侧移动，一边用CCD摄像机拍摄生物体细胞，则来自CCD摄像机的所有像素的输出信号(光强度、光检测信号)的积分值与物镜的焦点位置(z轴上的坐标)的关系成为图2(A)那样。此外，如果对应于图2(A)而示意地表示培养皿的位置及细胞的位置，则成为图2(B)那样。 

具体而言，如果使物镜沿着光轴向上侧移动，则来自CCD摄像机的所有像素的光强度的积分值，首先在照射光较强地反射的试料容器的外侧底面的位置成为极大且最大。接着，如果使物镜沿着光轴进一步向上侧移动，则来自CCD摄像机的所有像素的光强度的积分值逐渐降低，在试料容器的内侧底面的位置处再次变为极大。另外，由于试料容器的内侧底面和与其接触的培养液的折射率差比试料容器的外侧底面与空气的接触面的折射率差小，所以试料容器的内侧底面的位置处的积分值比试料容器的外侧底面的位置处的积分值小。接着，如果使物镜沿着光轴再向上侧移动，则来自CCD摄像机的所有像素的光强度的积分值急剧降低，在图2(A)所示的位置α处再次变为极大。该位置α是能够得到散焦引起的高对比度的摄像图像的z轴上的位置。此外，在该位置α处，物镜的焦点对准于生物体细胞的大致下侧的边缘部分(下侧边缘部)。接着，如果使物镜沿着光轴再向上侧移动，则来自CCD摄像机的所有像素的光强度的积分值降低，在图2(A)所示的位置β处变为极小。在该位置β处，物镜的焦点 对准于生物体细胞的大致中央的位置。接着，如果使物镜沿着光轴再向上侧移动，则来自CCD摄像机的所有像素的光强度的积分值增加，在图2(A)所示的位置γ处再次变为极大。该位置γ也是能够得到起因于散焦的高对比度的摄像图像的z轴上的位置。在该位置γ处，物镜的焦点对准于生物体细胞的大致上侧的边缘部分(上侧边缘部)。 

即，在图2(A)所示的位置α到位置γ的区域(包括位置β)，由于物镜的焦点对准于生物体细胞的内部，所以能够基于该位置α及该位置γ决定对准于生物体细胞内的特定的部位的物镜的焦点位置。此外，也可以将位置β决定为对准于生物体细胞内的规定部位的物镜的焦点位置。 

这里，利用在图2(A)所示的位置α处拍摄生物体细胞时从CCD摄像机的各像素输出的输出信号(与各像素取得的光的光强度对应的数字信号)及在图2(A)所示的位置β处拍摄生物体细胞时从CCD摄像机的各像素输出的输出信号中，分别仅选择超过了预先决定的阈值的输出信号作为有效的输出信号，求出所选择的各个输出信号的强度分布(参照图3)。图3是表示在图2(A)所示的位置α拍摄生物体细胞时的CCD摄像机的特定像素列中包含的各像素的光强度的分布(图3(A))、以及在图2(A)的位置β拍摄生物体细胞时的CCD摄像机的特定像素列中包含的各像素的光强度的分布(细胞内部的中央附近的输出信号的强度分布：图3(B))的图。另外，在图3中，虚线表示阈值。通过对图3所示的强度分布进行统计处理，能够决定能得到高对比度的图像的物镜的焦点位置。进而，也可以一边使物镜的焦点位置在光轴上移动，一边执行超过了比图3所示阈值高的阈值的光强度的像素数的计算、以及计算出的像素数量相对于所有像素数的比例(计算出的像素数÷所有像素数)的计算，将该比例成为最高时的物镜的焦点位置决定为能够得到最高对比度的图像的物镜的焦点位置。 

接着，实际拍摄细胞的发光图像，来确认基于拍摄高对比度的两个图像(照明图像)时的物镜的焦点位置而决定的物镜的焦点位置和生物体细胞内的中心部位(例如发光的部位)的一致程度。另外，这里使用的生物体细胞是添加1mM的虫萤光素而导入了虫萤光素酶基因(pGL3-control vector：プロメガ公司)的HeLa细胞。另外，发光图像是将该HeLa细胞在室温中暴露1分钟后摄像的图像。 

首先，一边使物镜沿着光轴移动、一边用照明光源照明HeLa细胞，一边进行摄像，选出了在物镜的远点侧摄像的对比度最高的摄像图像(照明图像)和在物镜的近点侧摄像的对比度最高的摄像图像(照明图像)。另一方面，一边使物镜沿着光轴移动但不进行照明，一边拍摄HeLa细胞，选出对比度最高的摄像图像(发光图像)。接着，测量拍摄选出的两个照明图像时的物镜(20倍、40倍)的光轴上的焦点位置、和拍摄选出的发光图像时的物镜(20倍、40倍)的光轴上的焦点位置。将测量结果在图4中表示。另外，测量的焦点位置如图5所示，物镜的焦点位置与对准于试料容器(培养皿)的外侧底面的位置时的物镜离开光轴上的位置(基准位置)的距离相同。 

如图4所示，拍摄选出的发光图像(图8(B))时的物镜的焦点位置(在图4所示的“中心点”的栏中记载的10.507.10.506：图9所示的“Zb”)，是拍摄对应于远点侧的照明图像(图10(A))时的物镜的焦点位置(在图4所示的“远点侧”的栏中记载的10.512.10.590：图11中所示的“Za”)和拍摄对应于近点侧的照明图像(图6(A))时的物镜的焦点位置(在图4所示的“近点侧”的栏中记载的10.500.10.503：图7中所示的“Zc”)的大致中央。由此，能够确认基于拍摄选出的两个照明图像(图6(A)及图10(A))时的物镜的焦点位置(图7所示的“Zc”及图11所示的“Za”)而决定的物镜的焦点位置，与细胞内的大致中央部位(例如发光的部位)一致。即，通过上述计算，能够将物镜的焦点位置对准到细胞内的大致中央部位 (例如发光的部位)。另外，图6是表示在近点侧拍摄的最高对比度的照明图像(A)与发光图像(B)的图。图7是示意地表示拍摄图6的图像时的物镜的焦点位置的图。图8是表示在中心点拍摄的最高对比度的照明图像(A)与发光图像(B)的图。图9是示意地表示拍摄图8的图像时的物镜的焦点位置的图。图10是表示在远点侧拍摄的最高对比度的照明图像(A)与发光图像(B)的图。图11是示意地表示拍摄图10的图像时的物镜的焦点位置的图。 

至此，结束了本发明的基本原理的说明。 

[2、装置结构] 

接着，参照图12到图17详细地说明有关本发明的第1实施方式的焦点位置决定装置1的结构。首先，参照图12对第1实施方式的焦点位置决定装置1的基本结构进行说明。图12是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1的基本结构的图。焦点位置决定装置1在进行发光观察时，在设置了生物体细胞及组织等的试料10的时刻，决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。焦点位置决定装置1如图12所示，包括光照射部20、物镜30、焦点位置变更部40、焦点位置测量部50、试料摄像部60和信息处理装置70。 

光照射部(光源)20向试料10照射光。光照射部20是发出可见光区域的波长的光(可见光)的非相干光源，具体而言是卤素灯、LED、钨灯、水银灯等。另外，作为光照射部20，也可以使用激光等的相干光源。但是，在此情况下，将从相干光源发出的光(激光等)利用扩散板等改变为非相干光后向试料10照射。此外，作为光照射部20也可以使用发出红外光的光源。在此情况下，能够在维持不进行照明的状态下进行利用红外光的焦点决定，所以能够防止自萤光带来的图像噪声的发生，并且能够得到比可见光更鲜明的物体信息。即，利用红外光的焦点决定中，具有能够精密地进行该焦点决定的优点。此外，即使是波长与要检测的微弱光一部分重复的光、或波长与该微弱光相 同的光，只要是相对于该微弱光是显著强的光强度并且能够在短时间(例如0.5秒以内)内检测到的光，就能够作为焦点决定用的照射光使用。 

物镜30是用来形成试料10的像的部件。另外，也可以使用可变焦透镜作为物镜。 

具体而言，焦点位置变更部40通过将试料10的位置及/或物镜30的位置在光轴方向上移动及/或变更物镜30的焦点距离，来变更物镜30的焦点位置。 

焦点位置测量部50与焦点位置变更部40连接，基于例如试料10的光轴上的位置、物镜30的光轴上的位置、物镜30的焦点距离中的至少一个，测量物镜30的焦点位置。 

试料摄像部60对试料10进行摄像。具体而言，试料摄像部60是具有摄像元件的高灵敏度的CCD摄像机。 

信息处理装置70具体而言是市售的个人计算机，与焦点位置变更部40、焦点位置测量部50及试料摄像部60连接。信息处理装置70具备控制部70a和存储部70b。控制部70a是综合地控制该控制部70a的CUP等，具有用来保存OS(Operating System)等控制程序、规定各种处理顺序的程序以及所需数据的内部存储器，基于这些程序进行用来执行各种处理的信息处理。 

控制部70a控制焦点位置变更部40、焦点位置测量部50、试料摄像部60、后述的特征量计算部70a1的各部使其反复执行，或者控制控制部70a具备的各部。此外，在键盘或鼠标等输入装置或TV监视器等输出装置和该信息处理装置70连接的情况下，控制部70a取得由输入装置输入的信息、或将信息向输出装置输出。控制部70a包括特征量计算部70a1、焦点位置选出部70a2、焦点位置决定部70a3、特征量比较部70a4和焦点位置再决定部70a5。特征量计算部70a1基于由试料摄像部60摄像的摄像图像计算对摄像图像赋予特征的特 征量(例如摄像图像的对比度、摄像图像的亮度的积分值、由摄像图像的亮度分布得到的统计量、摄像图像中的具有超过了规定阈值的亮度的像素数与所有像素数之比等)。焦点位置选出部70a2从通过由控制部70a使各部(具体而言是焦点位置变更部40、焦点位置测量部50、试料摄像部60、特征量计算部70a1)反复执行而储存的多个焦点位置(由焦点位置测量部50测量的焦点位置)中，基于通过反复执行而储存的特征量，选出至少一个焦点位置。焦点位置决定部70a3基于由焦点位置选出部70a2选出的焦点位置，决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置。特征量比较部70a4比较由特征量计算部70a1预先单独计算的两个特征量的大小。焦点位置再决定部70a5基于由特征量比较部70a4比较的结果，再次决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置。 

存储部70b是储存机构，具体而言，可以使用RAM或ROM等存储装置、硬盘那样的固定盘装置、软盘、光盘等。存储部70b如图所示，保存摄像图像数据库70b1和焦点位置管理文件70b2。摄像图像数据库70b1将用来唯一地识别摄像图像的图像识别信息、摄像图像、拍摄该摄像图像时的物镜的焦点位置、该摄像图像的特征量相互建立关联而保存。焦点位置管理文件70b2保存对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置(具体而言是由焦点位置决定部70a3决定的焦点位置、由焦点位置再决定部70a5再次决定的焦点位置)。这里，在摄像图像包括照明图像、发光图像、萤光图像。 

接着，参照图13说明第1实施方式的焦点位置决定装置1的结构的具体一例。另外，关于与上述说明重复的部分，有时省略其说明。图13是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1的结构的具体一例的图。图13所示的焦点位置决定装置1是以倒立型显微镜为基础的结构，与图12所示的焦点位置决定装置1同样，是为了进行发出微弱光的生物体细胞的发光观察而使用的。图13所示的焦点位置决定 装置1除了上述各部(光照射部20、物镜30、焦点位置变更部40、焦点位置测量部50、试料摄像部60、信息处理装置70)以外，还具备照明光学系统、观察光学系统、目镜43等构成。以下，详细地说明构成该焦点位置决定装置1的各部。 

试料10被浸渍在装入到试料容器11的培养液中。 

试料容器11具体而言是培养皿，是至少其底面为光学透明的容器(能够用通常的物镜应对)。另外，该底面具体而言是与显微镜用盖玻璃相同的材料、厚度为0.17mm。这里，作为试料容器11，除了培养皿以外，也可以使用载玻片、微板等。此外，对于试料容器11，如图14所示，也可以配设盖18。再次回到图13，试料容器11配置在装满经由喷嘴13供给的纯水的水槽12内。另外，该纯水是以保持试料容器11内的湿度为目的而装入在水槽12内的。 

将从气体储存瓶14排出的混合气体(包含5％二氧化碳(CO₂)、95％氧(O₂)的气体)通过气体供给管15，如图示那样从水槽12的上方以50mL/min的流速供给水槽12。另外，水槽12的形状也可以是图14所示那样的、将试料容器11整体遮盖的形状。在此情况下，在水槽12的上部配设有可拆装的盖19。再次回到图13，水槽12配置在加热板16之上。 

加热板16是进行环境温度的设定的部件，配置在试料台17之上。另外，加热板16通过与该加热板16连接的温度控制器(未图示)的控制，可以按0.5℃间隔进行环境温度的设定。 

试料台17是用来设置试料10等的板状部件，如图示那样与光轴(z轴)正交地配设。试料台17在以相互正交的朝向(90°方向)安装在该台的规定位置上的两个步进马达(未图示)的驱动力的作用下，能够从配设该台的位置向正交于光轴(z轴)的方向(例如x方向及y方向)移动。另外，各步进马达由与该各马达连接的试料台控制器(未图示)控制。此外，试料台控制器与信息处理装置70连接， 基于来自信息处理装置70的指令适当地驱动各步进马达，移动试料台17。 

照明光学系统是用来将从光源20发出的照明光向试料10引导的系统，由准直透镜21、将照明光的光轴偏转的偏转反射镜22、和将光源20的像进行投影的聚光透镜23构成。 

这里，在聚光透镜23的光瞳位置，拆装自如地配设有图15(A)所示的开口单元24。图15是表示开口单元24的结构及物镜30的光瞳处的开口的投影像的一例的图。开口单元24由环形一部分的开口24a和具有遮光性的遮光板24b构成。开口24a相对于光轴配设以使其成为相对于光瞳的中心偏心的状态，是能够自如地引起横向偏移的结构。开口24a的开口直径决定为，使开口24a的投影像如图15(B)所示那样大致内接在物镜30的光瞳的外周部分。开口24a的宽度(图15(A)所示的“Ro-Ri”)优选为处于共轭关系的物镜30的光瞳半径的3分之1以下。由此，通过根据观察的生物体细胞的种类适当设定物镜30的移动量，能够得到最优的对比度的像。 

另外，开口单元24如图16(A)所示，也可以具备矩形的开口24a。图16是表示开口单元24的另一结构及物镜30的光瞳中的开口的投影像的一例的图。该矩形的开口24a以相对于光瞳中心偏心的状态配置在从光瞳的中心位置离开规定距离的位置上。通过使用具备该矩形开口24a的开口单元24对试料10进行偏射照明，使开口24a的像投影在物镜30的光瞳上。此外，矩形的开口24a相对于光瞳的中心不是以同心圆状配设，所以例如在观察的生物体细胞较细长的情况下能够得到较高对比度的像。这里，偏射照明光被入射到具有立体尺寸的生物体细胞中，被分离为透过光、折射光及衍射光后从生物体细胞射出。在生物体细胞内，从接近于球或椭圆体的形状的轮廓的部分折射光较多，从扁平部分透过光与衍射光较多。由细胞内的接近于球或椭圆体的形状的部分折射的折射光的一部分变得比物镜30的NA 大，所以不被取入到物镜30中。 

此外，如图17所示，也可以在偏转反射镜22的下侧配设用来使光源20成为准单色的干涉滤光器25。由此，从光源20发出的照明光通过偏转滤光器22被偏转行进方向，偏转后的照明光通过干涉滤光器25后成为波长带宽很窄的单色光，朝向聚光透镜23。另外，并不限于干涉滤光器，也可以使用窄频带通滤光器。 

再次回到图13，观察光学系统是用来形成试料10的像的系统，倒立配置在试料台17的下方。观察光学系统除了物镜30以外，还包括使由物镜30形成的像(试料10的像)成像在成像面上的中继透镜31、将来自物镜30的光偏转的偏转反射镜32、和与中继透镜31一起使由物镜30形成的像(试料10的像)成像在成像面上的中继透镜33。 

焦点位置变更部40具体而言是利用齿轮齿条机构(未图示)使物镜30在光轴方向(z轴方向)上移动(驱动)的物镜z轴移动(驱动)机构。包含在齿轮齿条机构中的旋钮，在受计算机控制的步进马达(未图示)的作用下旋转。另外，物镜z轴移动机构除了齿轮齿条机构以外，也可以通过摩擦辊机构使物镜30沿光轴方向移动。此外，焦点位置变更部40也可以是除了使物镜沿着光轴移动的结构以外、还使试料台17沿着光轴移动的结构。在物镜z轴移动机构中，如图所示，具备物镜加热器41。 

物镜加热器41如图所示，与物镜30接触地安装在物镜30的周围。物镜加热器41受与该物镜加热器41连接的温度调节装置(未图示)控制。物镜加热器41从物镜30的外侧按0.5℃间隔进行物镜30的温度设定，从而将物镜30的温度保持为一定。 

目镜43是将试料10的像放大的透镜，是用来使观察者通过目视观察试料10的像的透镜。 

切换反射镜44如图所示，配设在目镜43与中继透镜33之间。 由此，能够任意地切换通过目镜43进行的试料10的目视下的观察和通过试料摄像部60进行的试料10的观察。另外，作为切换反射镜44，除了机械地切换两个光路的形式以外，也可以使用利用半反射镜将两个光路分离的形式。 

红外线截止滤光器45如图所示，拆装自如地配设在试料摄像部60的受光面的上方，截断成为背景光的红外线。换言之，红外线截止滤光器45根据需要防止成为背景光的红外线入射到试料摄像部60中。 

试料摄像部60具体而言是在其受光面上具有摄像元件60a的CCD摄像机。该摄像元件60a的像素数是1360×1024。在该CCD摄像机尽量使用高感度的结构，以便能够检测到从试料10发出的微弱光。这里，作为CCD摄像机，为了拍摄彩色的明视场像，也可以使用3片式的彩色摄像机。此外，试料摄像部60并不限于CCD摄像机，也可以使用例如CMOS图像传感器或SIT摄像机等。试料摄像部60通过信号线缆与信息处理装置70(与该信息处理装置70连接的TV监视器)连接。在试料摄像部60的底部，为了抑制从CCD摄像机发出的暗电流而配设有冷却装置61。 

冷却装置61由珀尔帖元件构成，将试料摄像部60的温度冷却到0℃左右并保温。 

信息处理装置70还具备输入输出装置(TV监视器、键盘、鼠标等)。信息处理装置70将由试料摄像部60拍摄的摄像图像描绘到TV监视器上。 

以上，在图13所示的焦点位置决定装置1中，首先，从光照射部20发出的光通过准直透镜21而成为平行光，该平行光被投影在聚光透镜23的光瞳位置。接着，将从光照射部20发出的光的像通过聚光透镜23作为柯而勒照明将试料10照明。接着，将试料10照明的光透过试料10入射到物镜30中。接着，入射到物镜30中的光(测 量光)通过物镜30、中继透镜31及中继透镜32，将试料10的像形成在成像面上。接着，形成在成像面上的试料10的像原样入射到目镜43中，并且通过切换反射镜44成像的CCD摄像机60的像素元件60a上。 

这样，结束第1实施方式的焦点位置决定装置1的结构的说明。 

[3、焦点位置决定装置1的处理] 

接着，参照图8对第1实施方式的焦点位置决定装置1进行的焦点位置决定处理进行说明。图18是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1进行的焦点位置决定处理的一例的流程图。另外，这里，对利用图13所示的焦点位置决定装置1进行生物体细胞的发光观察的情况下的焦点位置决定处理进行说明。 

观察者将装入了作为试料10的生物体细胞的试料容器11设置在试料台17上，如果启动焦点位置决定装置1及光照射部20，则焦点位置决定装置1进行以下的处理。 

首先，焦点位置决定装置1将从光源20发出的照明光向生物体细胞照射(步骤SA-1)。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使作为焦点位置变更部40的物镜z轴移动机构动作，通过物镜z轴移动机构使物镜30从初始位置沿着光轴移动一定量，来变更物镜30的焦点位置(步骤SA-2)。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使焦点位置测量部50动作，通过焦点位置测量部50测量物镜30的焦点位置(步骤SA-3)。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使作为试料摄像部60的CCD摄像机动作，通过CCD摄像机将生物体细胞摄像(步骤SA-4)。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a 使特征量计算部70a1动作，通过特征量计算部70a1基于在步骤SA-4中摄像的摄像图像计算该摄像图像的对比度(步骤SA-5)。 

这里，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a，将在步骤SA-3中测量的焦点位置、在步骤SA-4中摄像的摄像图像以及在步骤SA-5中计算的对比度相互建立关联，保存在存储部70b的摄像图像数据库70b1中。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a反复执行步骤SA-2到步骤SA-5，直到由步骤SA-2变更的物镜30的焦点位置超过光轴上的预先设定的位置(步骤SA-6)。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使焦点位置选出部70a2动作，通过焦点位置选出部70a2选出保存在摄像图像数据库70b1中的多个对比度中的极大的两个对比度，取得与选出的对比度建立对应而保存在摄像图像数据库70b1中的焦点位置(步骤SA-7)。换言之，焦点位置决定装置1通过焦点位置选出部70a2，从保存在摄像图像数据库70b1中的多个焦点位置中，基于保存在摄像图像数据库70b1中的多个特征量，选出物镜30的近点侧的焦点位置(大致焦点位置)及物镜30的远点侧的焦点位置(大致焦点位置)。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使焦点位置决定部70a3动作，通过焦点位置决定部70a3，基于在步骤SA-7中选择的两个焦点位置，将该两个焦点位置的中央的位置(大致中央的位置)决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置(步骤SA-8)。 

接着，焦点位置决定装置1通过信息处理装置70的控制部70a使物镜z轴移动机构动作，通过物镜z轴移动机构调节物镜30的位置，以使物镜30的焦点位置对准于在步骤SA-8中决定的中央的位置(大致中央的位置)(步骤SA-9)。 

如以上说明，第1实施方式的焦点位置决定装置1通过光源20向生物体细胞照射照射光。接着，焦点位置决定装置1一边通过物镜z轴移动机构使物镜30沿着光轴每次一定量地反复移动，一边在每次移动时通过焦点位置测量部50测量物镜30的焦点位置，通过CCD摄像机将生物体细胞照明并摄像，通过特征量计算部70a1计算摄像的摄像图像的对比度。接着，焦点位置决定装置1由焦点位置选出部70a2选出两个通过使物镜30反复移动而储存的多个对比度中的极大的对比度，从通过使物镜30反复移动而储存的多个焦点位置中取得将对应于选出的对比度的摄像图像摄像时的物镜30的焦点位置。接着，焦点位置决定装置1通过焦点位置决定部70a3基于取得的两个焦点位置将该两个焦点位置的中央的位置(大致中央的位置)决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置，通过物镜z轴移动机构使物镜30移动，将物镜30的焦点位置调对到所决定的焦点位置。由此，在将生物体细胞内的特定的部位作为观察对象部位10a而进行该观察对象部位10a的发光观察的情况下，在设置了生物体细胞的时刻，能够决定对准于该观察对象部位10a的物镜30的焦点位置，结果，能够将物镜30的焦点位置调对到该观察对象部位10a。具体而言，根据焦点位置决定装置1，在利用包括透镜的放大成像光学机构观察发生微弱光的生物体细胞、或测量来自该生物体细胞的发光、或观察例如来自生物体细胞内的生物体发光蛋白质的微弱发光等的显微镜中，即使没有确认来自生物体细胞的发光，也能够将物镜的焦点自动地调对到生物体细胞内的发光的部位(生物发光蛋白质局部存在的部位)。所以，在利用包括透镜的放大成像光学机构进行发出微弱光的试料的观察时，能够比通过手动进行的情况更迅速且高精度地将物镜的焦点位置设定在试料的作为目的的部位上。此外，在焦点位置决定装置1中，在决定物镜的焦点位置中使用了试料的照明图像，该照明图像由于明亮并且对比度较高，所以能够比通过 目视进行的情况更容易且迅速地决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。此外，在焦点位置决定装置1中，摄像对比度较高的试料10的照明图像时的物镜30的焦点位置对应于试料10的大致上下边缘部，所以也可以将其中央位置(大致中央位置)决定为对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。由此，能够容易且简便地决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。 

这里，在测量生物(生物体细胞等)的发光现象的情况下，在设置了试料的时刻，来自生物发光的强度很微弱，所以即使是高性能的CCD摄像机也几乎不能检测到。即，不能如通常的显微镜观察那样一边确认生物内的观察对象部位(细胞等)一边调对物镜的焦点。即，在设置了生物的时刻，通常不能观察生物的内部构造。此外，在观察萤光或发光(化学发光或生物发光)的显微镜中，在细胞间同时观察细胞内的发光蛋白质局部存在的部位(微弱发光的部位)时，通过基于细胞等的相位物体的照明图像检测到的物镜的焦点位置并不对准于具备存在于细胞内的发光蛋白质的发光部分，观察图像会模糊。此外，在萤光观察中，对于通过萤光激励光发出萤光的相位物体，将萤光强度最大的位置决定为焦点位置。但是，在该决定方法的情况下，起因于激励光的光毒性较强，所以对于具有活的细胞等的生物火星的试料反复决定焦点是不优选的，所以需要尽量减少焦点的决定次数。但是，在长期间的萤光观察中，如果减少焦点位置的决定次数抉择观察图像的鲜明度有可能变得不稳定。所以，在焦点位置决定装置1中，作为照明光的图像观察，将从卤素灯等的光源20发出的光照射在生物上，通过显微镜取得生物的照明图像，基于取得的照明图像决定物镜30的焦点位置。即，将生物体细胞在照明下摄像，推测生物体细胞的内部的位置。由此，能够在设置了生物的时刻观察生物的内部构造。此外，在细胞间同时观察细胞内的发光蛋白质局部存在的部位(微 弱发光的部位)时，能够将物镜的焦点调对到局部存在于细胞内的发光蛋白质的发光部分上。此外，由于不是通过萤光决定物镜的焦点位置，所以能够进行长期间的萤光观察。 

另外，焦点位置决定装置1也可以在步骤SA-7中，通过焦点位置选出部70a2，从保存于摄像图像数据库70b1中的多个焦点位置中，基于保存在摄像图像数据库70b1中的多个特征量，选出物镜30的近点侧的焦点位置(在物镜30的近点侧能够得到对比度较高的摄像图像时的物镜30的焦点位置)，在步骤SA-8中，通过焦点位置决定部70a3，将从选出的物镜30的近点侧的焦点位置向光轴上方离开预先测量的生物体细胞的厚度的一半的距离后的位置决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。换言之，焦点位置决定装置1也可以选出在照明下的观察的近点侧的能够得到高对比度的图像时的物镜30的焦点位置，将从选出的焦点位置向光轴的上方离开细胞的厚度的一半左右后的位置决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。此外，焦点位置决定装置1也可以在步骤SA-7中，通过焦点位置选出部70a2，从保存于摄像图像数据库70b1中的多个焦点位置中，基于保存在摄像图像数据库70b1中的多个特征量，选出物镜30的远点侧的焦点位置(在物镜30的远点侧能够得到对比度较高的摄像图像时的物镜30的焦点位置)，在步骤SA-8中，通过焦点位置决定部70a3，将从选出的物镜30的远点侧的焦点位置向光轴下方离开预先测量的生物体细胞的厚度的一半的距离后的位置决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。换言之，焦点位置决定装置1也可以选出在照明下的观察的远点侧的能够得到高对比度的图像时的物镜30的焦点位置，将从选出的焦点位置向光轴的下方离开细胞的厚度的一半左右后的位置决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。由此，与移动物镜30及试料10而选出 近点侧与远点侧的散焦位置的情况相比，能够更容易且简便地决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置。 

这里，焦点位置决定装置1也可以通过执行以下的工序1到工序6，决定对准于配置在试料容器11中的生物体细胞内的观察对象部位10a的焦点位置。 

(工序1)投入光源20的电源，将光源20的开闭器开闭，从试料容器11的上方照射照明光。 

(工序2)决定对准于试料容器11的底面(外侧底面或内侧底面)的物镜30的焦点位置(对应于图14的“Zc”)。具体而言，通过物镜z轴移动机构，一边使物镜30沿着光轴每次移动一定量，一边每当移动一定量就通过CCD摄像机将生物体细胞在照明下摄像，通过特征量计算部70a1计算来自摄像的摄像图像的所有像素的光强度的积分值(来自CCD摄像机的输出信号的强度)，通过控制部70a确认计算出的积分值是否是极大值，在确认是极大值的情况下，认为在将作为该极大值的基础的摄像图像摄像时物镜30的焦点对准于试料容器11的底面，通过焦点位置测量部50测量该摄像时的物镜30的焦点位置(对应于图14的“Zd”)。即，一边将物镜30沿着光轴移动，一边通过照明图像决定来自试料容器11的底面的反射光的极大值。 

(工序3)在物镜30的近点侧，决定摄影对比度较高的摄影图像时的物镜30的焦点位置(对应于图14的“Zc”)。具体而言，一边通过物镜z轴移动机构使物镜30从在(工序2)中移动到的位置再沿着光轴每次移动一定量，一边每当移动一定量就通过CCD摄像机将生物体细胞在照明下摄像，通过特征量计算部70a1计算摄像的摄像图像的对比度，通过控制部70a确认计算出的对比度是否是极大值，在确认是极大值的情况下，认为在将作为该极大值的基础的摄像图像摄像时物镜30的焦点对准于生物体细胞的大致下端面，通过焦点位置测量部50测量该摄像时的物镜30的焦点位置(对应于图14的 “Zc”)。 

(工序4)在物镜30的远点侧，决定摄影对比度较高的摄影图像时的物镜30的焦点位置(对应于图14的“Za”)。具体而言，一边通过物镜z轴移动机构使物镜30从在(工序3)中移动到的位置再沿着光轴每次移动一定量，一边每当移动一定量就通过CCD摄像机将生物体细胞在照明下摄像，通过特征量计算部70a1计算摄像的摄像图像的对比度，通过控制部70a确认计算出的对比度是否是极大值，在确认是极大值的情况下，认为在将作为该极大值的基础的摄像图像摄像时物镜30的焦点对准于生物体细胞的大致上端面，通过焦点位置测量部50测量该摄像时的物镜30的焦点位置(对应于图14的“Za”)。 

(工序5)将在(工序3)中决定的焦点位置(对应于图14的“Zc”)及在(工序4)中决定的焦点位置(对应于图14的“Za”)的大致中央的位置(例如对应于图14的“Zb((Zc+Za)÷2)”)决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。 

(工序6)移动物镜30，以使物镜30的焦点位置对准于在(工序5)中决定的中央的位置。 

另外，在工序4及工序5中，也可以每当使物镜30移动一定量就通过CCD摄像机将生物体细胞在照明下摄像，并且测量该摄像时的物镜30的焦点位置，一边使物镜30移动一边计算摄像的多个摄像图像的对比度(来自多个摄像图像的各像素的输出信号的总和)，将计算出的各对比度(各总和)比较，选出极大的对比度(总和)，通过从一边使物镜移动一边测量的多个物镜30的焦点位置中选择将对应于选出的对比度(总和)的摄像图像摄像时的物镜30的焦点位置，来决定对应于图14的“Zc”或“Za”的物镜30的焦点位置。此外，焦点位置决定装置1也可以代替CCD摄像机而配设光电二极管。在此情况下，每当使物镜30移动一定量，就将光点二极管的输出电流 放大而变换为电压信号并且测量物镜30的焦点位置，一边使物镜30移动一边比较变换出的多个电压信号的强度，选出极大的电压信号的强度，通过从一边使物镜移动一边测量的多个物镜30的焦点位置中选择将对应于选出的电压信号的强度的物镜30的焦点位置，来决定对应于图14的“Zc”或“Za”的物镜30的焦点位置。此外，在焦点位置决定装置1中，使物镜30或试料10移动的量(移动量)优选为在由CCD摄像机摄像的像中不发生模糊的范围。具体而言，该移动量优选为将由光源20发出的光的波长用物镜30的NA的平方除后的值(λ÷NA²：λ是波长，NA是开口数)以下。 

此外，在焦点位置决定装置1中，也可以使用单色性较高的光源(激光等)作为光源20。这里，如果光源的单色性较高，则在将照明光照射在相位物体上时几乎没有波长分散，所以能够得到鲜明的衍射光。因而，在近点侧的摄像图像、远点侧的摄像图像的哪一个中，其对比度与使用白色光源时相比也很高。由此，能够容易地选出将对比度为极大的摄像图像摄像时的物镜的焦点位置。 

此外，在焦点位置决定装置1中，观察者(操作者)也可以一边通过手动旋转物镜z轴移动机构的旋钮一边经由目镜43通过目视决定生物体细胞的像的对比度较高的两个部位的物镜的位置，通过焦点位置测量部50测量该决定时的物镜的焦点位置，通过焦点位置决定部70a3将测量的两个焦点位置的中央位置(大致中央位置)对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置。 

此外，根据焦点位置决定装置1，通过使物镜30的位置相对于通常的观察的对焦位置相对于试料前后移动微小量，即使不使用相位差用的物镜也能够得到与相位差观察法同样的对比度的像。此外，根据焦点位置决定装置1，由于不需要考虑物镜30和聚光透镜23的光瞳像差，所以能够使用低倍率的物镜。即根据焦点位置决定装置1，即使使用在相位差观察法中不使用的1倍或2倍的倍率的物镜，也能够 观察培养细胞那样的相位物体，能够进行通过以往的观察法不能实现的大范围中的观察。此外，根据焦点位置决定装置1，能够得到通过偏射照明对相位分布添加了阴影的具有立体感的高对比度的像。此外，根据焦点位置决定装置1，能够通过切换反射镜44切换为目视的观察和TV监视器的观察。此外，通过使用半反射镜作为切换反射镜，能够同时进行目视的观察和TV监视器的观察。此外，根据焦点位置决定装置1，通过将开口拆下，能够作为通常的显微镜进行试料的观察。此外，根据焦点位置决定装置1，通过分两个阶段实施物镜30的焦点位置的决定，即使在使用高倍率的物镜的情况下也能够进行焦点位置的决定。此外，根据焦点位置决定装置1，由于不使用激励光，所以具有即使对发出萤光的生物学试料反复执行焦点位置决定处理、也几乎没有光毒性的影响的优点。换言之，在对活着的细胞连续地、经时地进行观察的情况下，通过反复执行焦点决定处理，能够持续摄像鲜明的摄像图像。此外，根据焦点位置决定装置1，在利用红外光进行焦点位置决定处理的情况下，能够在维持着不进行可见光的照明的状态下进行调对物镜的焦点位置和将试料的暗视场图像摄像两者，所以能够有效地防止因自发光使摄像图像产生干扰。 

此外，焦点位置决定装置1也可以在从试料10发出的发光的强度变为能够通过CCD摄像机检测到的程度的情况下，再次重新决定在设置了试料10的时刻决定的、对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置(焦点位置再决定处理)。这里，在通过高倍率(例如40倍以上)的物镜30观察来自试料10的发光的情况下，物镜30的倍率变得越高，焦点深度越变得很浅，所以如果物镜30的焦点位置没有精确地对准于试料10内的观察对象部位10a，则试料10的像模糊。在上述焦点位置决定处理中决定的焦点位置对准于试料10的大致中心，但在以更高精度取得来自试料10的发光的情况下，需要决定更高精度地对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜30 的焦点位置。所以，通过执行焦点位置再决定处理，不仅在设置了试料10的时刻，在开始试料10的发光观察后也能够持续地决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置，结果，能够使物镜的焦点位置总是对准于该观察对象部位10a。这里，参照图19，对焦点位置决定装置1进行的焦点位置再决定处理进行说明。图19是表示第1实施方式的焦点位置决定装置1进行的焦点位置再决定处理的一例的流程图。 

首先，焦点位置决定装置1通过控制部70a使CCD摄像机，通过CCD摄像机，以由焦点位置决定部70a3决定的焦点位置(在上述图18的步骤SA-8中决定的、对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置)不进行试料10的照明而进行摄像(步骤SB-1)。 

接着，焦点位置决定装置1通过控制部70a使特征量计算部70a1动作，通过特征量计算部70a1，基于在步骤SB-1中摄像的摄像图像(发光图像)，计算特征量(例如来自发光图像的各像素的发光强度、由发光图像的发光强度分布得到的统计量、发光图像的对比度等)(步骤SB-2)。 

接着，焦点位置决定装置1通过控制部70a使物镜z轴移动机构动作，通过物镜z轴移动机构，使物镜30沿着光轴移动一定量，来变更由焦点位置决定部70a3决定的焦点位置(步骤SB-3)。另外，焦点位置的变更除了物镜30的移动以外，也可以通过试料台17的移动来进行。 

接着，焦点位置决定装置1通过控制部70a使CCD摄像机动作，通过CCD摄像机，以在步骤SB-3中变更后的焦点位置，将试料10不进行照明而进行摄像(步骤SB-4)。 

接着，焦点位置决定装置1通过控制部70a使特征量计算部70a1动作，通过特征量计算部70a1，基于在步骤SB-4中摄像的摄像图像 (发光图像)，计算特征量(例如来自发光图像的各像素的发光强度、由发光图像的发光强度分布得到的统计量、发光图像的对比度等)(步骤SB-5)。 

接着，焦点位置决定装置1通过控制部70a使特征量比较部70a4动作，通过特征量比较部70a4，将在步骤SB-2中计算的特征量与在步骤SB-5中计算的特征量比较(步骤SB-6)。另外，在特征量的比较中，因试料10的种类或特性，有更适合通过对比度比较的情况和更时刻通过由发光强度分布得到的统计量比较的情况，但最终通过S/N(信噪比)进行比较。 

接着，焦点位置决定装置1在步骤SB-6中的比较结果是在步骤SB-5中计算出的特征量更大的情况下(步骤SB-7：是)，通过控制部70a使焦点位置决定部70a5动作，通过焦点位置决定部70a5将在步骤SB-3中变更后的焦点位置决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜的焦点位置(步骤SB-8)。 

另一方面，焦点位置决定装置1在步骤SB-6中的比较结果是在步骤SB-5中计算出的特征量不是更大的情况下(步骤SB-7：否)，通过控制部70a确认步骤SB-3的执行次数是否达到了规定次数(步骤SB-3中的物镜30的移动量是否达到了规定量)，在达到了规定次数的情况下(步骤SB-9：是)，通过控制部70a使物镜z轴移动机构动作，通过物镜z轴移动机构，使在步骤SB-3中变更后的物镜30的焦点位置回到由焦点位置决定部70a3当初决定的焦点位置(在上述图18的步骤SA-8中决定的、对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置)(步骤SB-10)。此外，焦点位置决定装置1在没有达到规定次数的情况下(步骤SB-9：否)，通过控制部70a回到步骤SB-3的处理。 

以上，结束第1实施方式的焦点位置决定装置1的说明。 

[第2实施方式] 

接着，参照图20到图22详细地说明有关本发明的第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构。另外，有时将与上述第1实施方式的说明重复的说明省略。 

图20是表示第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构的具体的一例的图。图20所示的焦点位置决定装置1是以倒立型显微镜为基础的结构，是为了同时进行发出微弱光的生物体细胞的发光观察和萤光观察而使用的。焦点位置决定装置1在同时进行萤光观察和发光观察时，在设置了生物体细胞或组织等的试料10的时刻，决定对准于试料10内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置。焦点位置决定装置1如图20所示，还具备由激励光照射部(激励用光源)80、准直透镜81、偏转反射镜82以及分色镜83构成的激励用光学系统而构成。 

另外，在图20所示的焦点位置决定装置1中，在试料10存在于空气中(试料10没有浸渍在培养液等的液体中)的情况下，作为物镜30而使用开口数(NA)为0.9左右的物镜，在试料10浸渍在液体中的情况下，作为物镜40而使用开口数为1.0以上的物镜。此外，试料10由作为萤光色素(萤光物质)的玫瑰绿(Rhodamine Green：RhG)预先染色。这里，作为萤光物质，除了玫瑰绿以外，也可以使用例如TMR(Tetramethylrhodamine)、5-Tamra(5-carboxytetramethylrhodamine)、FITC(Fluorescein-isothiocyanate)、TOTO1、Acridine-Orange、Texas-Red等。 

激励光照射部80是发出可见光区域的波长的激光的气体激光(例如氩气激光、氦氖激光(He·Ne激光)等)，具体而言是波长488nm而输出10mW的氩气激光。这里，在将试料10用作为萤光物质的TMR染色的情况下，为了激励该TMR，作为激励光照射部80而使用波长514.5nm的氩气激光。此外，在将试料10用作为萤光物质的5-Tamra染色的情况下，为了激励该5-Tamra，作为激励光照射部80而使用波 长543.5nm的He·Ne激光。 

准直透镜81将从激励光照射部80发出的激光变换为具有束宽度的圆形的平行光束。 

偏转反射镜82将由准直透镜81变换为平行光束后的激光的光轴偏转。 

分色镜83具体而言是切换式分色镜，将由偏转反射镜82偏转的激光向物镜30入射。另外，切换式分色镜具有将激励用光源80的震荡波长的光反射、将萤光信号及发光信号的波谱透过的波谱特性。这里，分色镜83收纳在保持器(未图示)中，能够配合激光的震荡波长而更换。另外，如果不需要将从激励光照射部80发出的激光的波长，则作为分色镜83也可以不是切换式、而使用通常的分色镜。 

以上，在图20所示的焦点位置决定装置1中，从试料10发出的萤光及发光通过物镜30到达分色镜83。接着，到达分色镜83的萤光及发光透过分色镜83，通过中继透镜31及中继透镜33，被切换反射镜44反射，由处于CCD摄像机60的受光面上的摄像元件60a聚集焦点。另外，在将切换反射镜44从光路拆下的情况下，从试料10发出的萤光及发光到达目镜43。由此，观察者能够直接观察试料10的像。 

接着，参照图21详细地说明第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构的另一具体的一例。图21是表示第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构的另一具体的一例的图。 

如图21所示，焦点位置决定装置1的主体(光学系统部分)固定在主体架台106上。另外，主体架台106是能够沿上下方向移动的结构。主体架台106安装在支柱105上。支柱105固定在底板100上。焦点位置决定装置1的观察光学系统及CCD摄像机等收纳在镜筒中。镜筒由镜筒上部107及与该镜筒上部107连结的镜筒下部108构成。镜筒上部107固定在主体架台106上。镜筒下部108固定在基础架台 104上。镜筒可沿上下方向移动地安装。基础架台104固定在底板100上。焦点位置决定装置1的主体被具有遮光性的遮光箱101覆盖。遮光箱101固定在底板100上。在遮光箱101的上面上安装有遮光盖102。遮光盖102的一端通过铰链103与遮光箱101连结，能够开闭地安装。 

装入了试料10的试料容器11配设在试料台17上。这里，如图22所示，也可以将试料容器11装入到水槽12中而配设在试料台17上。 

再回到图21，在光照射部20中使用例如卤素灯、金属卤化物灯等，从光照射部20发出的光通过光纤26照射到试料台17上的包括试料10的试料容器11上。 

在观察光学系统中不使用偏转反射镜32，而在镜筒下部108上如图示那样配设有使由物镜30形成的像(试料10的像)成像的中继透镜34。 

这里，图21所示的焦点位置决定装置1如图22所示，作为焦点位置变更部40，也可以不是物镜z轴移动机构，而具备使试料台17沿着z轴移动的台z轴移动机构。这里，在图22中，在主体架台106上设置有具备台z轴移动机构的Z轴移动台。该Z轴移动台以支撑该XY试料台的形式安装在能够沿XY方向移动的XY试料台的下方。在该Z轴移动台的上方配置有试料容器11，试料容器11随着Z轴移动台的上下移动而上下移动。Z轴移动台在齿轮齿条机构的作用下上下运动。另外，齿轮齿条机构的动作是通过由步进马达旋转驱动齿轮齿条机构的旋钮(未图示)来实施的。并且，步进马达的驱动受计算机控制。由此，能够进行与使物镜上下移动的情况同样的操作。这里，Z轴移动台的上下移动也可以通过手动进行。此外，齿轮齿条机构的动作也可以旋转该齿轮齿条机构的旋钮(未图示)来进行。 

再次回到图21，CCD摄像机60配设为，使其受光面的中心大致 对准于光轴。从试料(生物体细胞)发出的萤光或发光透过分色镜83，通过中继透镜34聚光到CCD摄像机60的受光面上。这里，在将红外光取出的情况下，在启动焦点位置决定装置1之前将安装在CCD摄像机60的前面上的红外线截止滤光器45拆下。CCD摄像机60经由线缆与处理来自CCD摄像机60的输出信号的信息处理装置70连接。 

信息处理装置70根据CCD摄像机的输出信号描绘发光图像而解析它、或测量发光强度的时间变化、或解析输出信号。此外，信息处理装置70在物镜30的焦点位置对准于试料10内的观察对象部位10a后，为了受光来自试料10的萤光及发光，通过控制部70a使CCD摄像机动作。 

激励光照射部80是波长488nm、输出10mW的氩气激光，如图所示，配设在遮光箱101之外。另外，在遮光箱101上设有通过光纤的激光入射口84。从激励光照射部80发出的激光通过准直透镜81在光纤内传播，传播的激光到达分色镜83。到达分色镜83的激光被分色镜83反射而从下方入射到物镜30中，入射的激光聚光而被照射在试料10上。分色镜83收纳在保持器85中，配合激光的震荡波长、可更换地配设。 

以上，在图21所示的焦点位置决定装置1中，从试料10发出的萤光及发光通过物镜30到达分色镜83。接着，到达了分色镜83的萤光及发光透过分色镜83，通过中继透镜34，由处于CCD摄像机的受光面上的摄像元件60a聚集焦点。 

这样，结束第2实施方式的焦点位置决定装置1的结构的说明。 

接着，关于第2实施方式的焦点位置决定装置1进行的焦点位置决定处理及焦点位置再决定处理，由于与上述第1实施方式的说明同样，所以省略其说明。 

如以上说明，第2实施方式的焦点位置决定装置1还具备激励用 光学系统。第2实施方式的焦点位置决定装置1通过光源20向生物体细胞照射照射光。接着，焦点位置决定装置1一边通过物镜z轴驱动机构使物镜30沿着光轴每次一定量地发福移动，一边每当移动时通过焦点位置测量部50测量物镜30的焦点位置，通过CCD摄像机将生物体细胞在照明下摄像，通过特征量计算部70a1计算摄像的摄像图像的对比度。接着，焦点位置决定装置1通过由焦点位置选出部70a2选择两个通过使物镜30反复移动而储存的多个对比度中的极大的对比度，从通过使物镜30反复移动而储存的多个焦点位置取得将对应于选出的对比度的摄像图像摄像时的物镜30的焦点位置。接着，焦点位置决定装置1通过焦点位置决定部70a3基于取得的焦点位置将该两个焦点位置的中央的位置(大致中央的位置)决定为对准于生物体细胞内的观察对象部位10a的物镜30的焦点位置，通过物镜z轴移动机构使物镜30移动，使物镜30的焦点位置对准于决定的焦点位置。由此，在以生物体细胞内的特定的部位为观察对象部位10a而同时进行该观察对象部位10a的萤光观察的情况下，在设置的主体细胞的时刻能够决定对准于该观察对象部位10a的物镜30的焦点位置，结果，能够使物镜30的焦点位置对准于该观察对象部位10a。 

这里，对利用第2实施方式的焦点位置决定装置1一边同时观察生物体细胞的发光图像和萤光图像一边进行生物体细胞内的ATP测量的方法，以下说明其几种。虫萤光素酶的发光反应(发光的强度)取决于ATP量，所以以往以来就利用虫萤光素酶的发光反应来定量ATP。并且，在生物、临床检查、食品卫生等的领域中，进行使用虫萤光素酶的细胞内的ATP量的测量。另外，ATP(三磷酸腺苷)是细胞内的能量的供给源，是与生命现象密切关联的物质。另一方面，萤火虫的虫萤光素酶在ATP、O₂、Mg²的存在下，将D-虫萤光素作为发光基质，将生成氧萤虫素、CO₂、AMP、焦磷酸的反应为触媒，通过该反应发光。 

生物体细胞内的ATP量的测量通常在以下的(1A)～(1C)的工序中进行(H.J.Kennedy，A.E.Pouli，E.K.Ainscow，L.S.Jouaville，R.Rizzuto，G.A.Rutter，“Glucose generates sub-plasma membrane ATPmicrodomains in single islet β-cells.”，Journal of Biological Chemistry，vol.274，pp.13281-13291，1999)。 

(1A)将细胞或细菌溶解而提取ATP。 

(1B)将该提取液添加到包括虫萤光素及虫萤光素酶的反应液中。 

(1C)通过测量从添加了提取液的反应液产生的发光量，将细胞内的ATP定量。 

此外，细胞内的ATP量的测量通常在以下的(2A)～(2C)的工序中进行。 

(2A)将虫萤光素酶基因导入到细胞中并发现。 

(2B)将虫萤光素添加到含有细胞的培养液中。 

(2C)检测从添加了虫萤光素的培养液产生的发光量，将细胞内的ATP定量。 

进而，活的细胞内的规定的部位(具体而言是线性体)中的ATP量的经时的测量在以下的(3A)及(3B)的工序中进行(H.J.Kennedy，A.E.Pouli，E.K.Ainscow，L.S.Jouaville，R.Rizzuto，G.A.Rutter，“Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in singleislet β-cells.”，Journal of Biological Chemistry，vol.274，pp.13281-13291，1999)。 

(3A)将线性体转移基因融合到虫萤光素酶基因中，将该融合的基因导入到细胞中。导入到细胞中的融合基因除了转移盐基排列及发光关联基因以外还融合了发现萤光蛋白质的萤光关联遗传基因。 

(3B)通过以虫萤光素酶局部存在于细胞内的线性体中为前提，经时地测量从细胞的发光量，测量细胞内的线性体中的ATP量的时 间变动。具体而言，拍摄导入了该融合基因的细胞的萤光画面，基于得到的萤光图像判断在规定的部位是否局部存在发光蛋白质。在判断结果结论为局部存在的情况下，检测来自细胞的发光量。由此，能够判断在该细胞的规定的部位上是否局部存在发光蛋白质。即，对于导入了融合基因的活的细胞确认发光蛋白质的局部存在，并且测量来自该细胞的发光量。此外，可以确认测量的发光量是来自规定的部位的。 

另外，在导入了融合基因的活的细胞在摄像视野的范围内存在多个的情况下，拍摄多个细胞的萤光图像及发光图像，基于该萤光图像对每个细胞判断在规定的部位是否局部存在发光蛋白质，通过将摄像的萤光图像及摄像的发光图像叠合，从判断结果为判断局部存在的细胞之中选择测量对象的细胞，测量来自所选择的细胞的发光量。由此，能够从多个细胞中识别各个细胞、将来自单一的细胞的规定的部位的发光量与其他分离来测量。此外，通过同时取得萤光图像及发光图像，能够同时得到测量对象的细胞中的发光蛋白质的局部存在、也从该细胞发出的发光强度。因此，能够进行排除了基因的导入效率及细胞周期带来的各个细胞的生理状态的差异的影响的解析。这里，作为一例，在将萤光图像摄像后，进行发光蛋白质是否局部存在于规定的部位的判断，在判断为局部存在的情况下，也可以将发光图像摄像。进而，也可以在将萤光图像及发光图像摄像后进行局部存在的判断。 

以上，结束第2实施方式的焦点位置决定装置1的说明。 

[第3实施方式] 

接着，对于有关本发明的第3实施方式的焦点位置决定装置1′的概要、其结构及其处理，参照附图详细地说明。另外，有时将与上述第1实施方式或第2实施方式的说明重复的内容省略。 

首先，详细地说明本发明的概要。本发明一边使物镜的位置移动一边将试料(具体而言是包含发光的物质的生物试料)摄像并且测量物镜的焦点位置，基于摄影的图像，计算构成图像的各像素的像素值 的最大值与最小值的差即对比度，基于计算出的对比度及测量的物镜的焦点位置决定对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。具体而言，本发明通过将在物镜处于位置z时将试料摄像的图像的对比度、与将物镜移动到从位置z离开Δz的位置而将试料摄像的图像的对比度比较，求出物镜的焦点位置。即，本发明着眼于物镜的位置与图像的对比度的关系，求出对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。因而，在本发明中，在决定对准于观察对象部位的物镜的焦点位置之前，得到物镜的位置与图像的对比度的关系。由此，在将试料内的特定的部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下，在设置了试料的时刻能够决定对准于该观察对象部位的透镜的焦点位置，结果，能够将物镜的焦点位置调对到该观察对象部位。此外，由此，在进行试料内的发光部位的发光观察时，即使没有确认来自该发光部位的发光，也能够将物镜的焦点调对到试料内的发光部位。图像的对比度有时并不随着物镜的位置的变化而平滑地变化。换言之，有时表示图像的对比度与物镜的位置的关系的曲线并不是平滑的，而在对比度的值中出现不均匀。所以，在这样的情况下，本发明也可以对于将物镜的位置与图像的对比度建立了关联的数据进行平滑处理以使表示图像的对比度与物镜的位置的关系的曲线变得平滑后，利用平滑处理后的数据决定对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。 

另外，本发明也可以将对比度设为构成图像的各像素的像素值中的包含最大值的多个高的像素值的平均值、与构成像素的各像素的像素值中的包括最小值的多个低位的像素值的平均值的差。由此，即使模拟信号(例如反射光或散射光等的干扰光带来的信号等)进入到摄像的图像中，也能够由该图像计算出可靠性较高的对比度。 

此外，本发明也可以将计算出的对比度与其他对比度比较来探索一个其极小值，将摄像作为探索出的极小值的基础的图像时的物镜的焦点位置决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置，也可以将计 算出的对比度与其他对比度比较来探索两个其极大值，将摄像作为探索出的各极大值的基础的图像时的物镜的焦点位置的中间决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。由此，能够容易地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。细胞等的生物试料是相位物体，在对象区域中具有折射率差。因此，在将这样的相位物体作为观察对象的情况下，如果如图26那样使物镜在z轴方向上移动，则图像的对比度如图27所示那样变化，结果可以得到两个极大值及夹在该两个之间的1个极小值。所以，本发明者发现，对准于观察对象部位的物镜的焦点位置是图像的对比度为极小值时的物镜的焦点位置，还有对准于观察对象部位的物镜的焦点位置是凸显的对比度为极大值时的物镜的两个焦点位置的大致中间。 

此外，本发明也可以一边阶段性地减少其移动量一边使物镜的位置移动。具体而言，本发明也可以一边使其移动量减少为前次移动量的一半一边使物镜的位置移动。由此，能够迅速地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。 

接着，参照图28，详细地说明有关本发明的第3实施方式的焦点位置决定装置1′的结构。焦点位置决定装置1′由光照射部20′、物镜30′、物镜移动部40′、物镜位置测量部50′、试料摄像部60′、和信息处理装置70′构成。 

光照射部(光源)20′向含有发光的物质的生物试料那样的试料10′照射光。光照射部20′是发出可见光区域的波长的光(可见光)的非相干光源，具体而言是卤素灯、LED、钨灯、水银灯等。物镜30′是用来形成试料10′的像的部件。物镜移动部40′将物镜30′的位置在光轴(z轴)方向上移动。物镜位置测量部50′与焦点位置变更部40′连接，测量物镜30′的光轴上的位置。 

试料摄像部60′将试料10′摄像。试料摄像部60′具体而言是具有摄像元件的高感度的CCD摄像机。 

信息处理装置70′具体而言是市售的个人计算机，与物镜移动部40′、物镜位置测量部50′及试料摄像部60′连接。信息处理装置70′具备控制部70′a和存储部70′b。 

控制部70′a是综合地控制该控制部70′a的CUP等，具有用来保存OS(Operating System)等的控制程序、规定各种处理顺序的程序以及需要的数据的内部存储器，基于这些程序进行用来执行各种处理的信息处理。控制部70′a不仅控制该控制部具备的各部，还控制物镜移动部40′、物镜位置测量部50′、试料摄像部60′。此外，在键盘或鼠标等的输入装置或TV监视器等的输入装置与该信息处理装置70′连接的情况下，控制部70′a取得由输入装置输入的信息、或将信息向输出装置输出。控制部70′a由对比度计算部70′a1、焦点位置决定部70′a2构成。对比度计算部70′a1基于由试料摄像部60′摄像的摄像图像，计算由构成图像的各像素的像素值的最大值和最小值的差定义的对比度。焦点位置决定部70′a3基于由对比度计算部70′a1计算的对比度及由物镜位置测量部50′测量的物镜的位置，决定对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。 

存储部70′b是储存机构，具体而言，可以使用RAM或ROM等的存储器装置、硬盘那样的固定盘装置、软盘、光盘等。存储部70′b如图所示，具备图像等文件70′b1和决定位置管理文件70′b2。图像等文件70′b1将由试料摄像部60′摄像的图像、由对比度计算部70′a1计算的对比度、和由物镜位置测量部50′测量的物镜的位置相互建立关联而保存。具体而言，图像等文件70′b1将用来唯一地识别摄像图像的图像识别信息、图像、对比度、和将该图像摄像时的物镜的位置相互建立关联而保存。决定位置管理文件70′b2保存对准于试料10′内的观察对象部位10′a的物镜30′的焦点位置(具体而言是由焦点位置决定部70′a2决定的焦点位置)。 

接着，参照图29、图30、图34、图35等详细地说明第3实施方 式的焦点位置决定装置1′的结构的具体的一例。首先，参照图29及图30等说明第3实施方式的焦点位置决定装置1′进行的焦点位置决定处理的一例，接着，参照图34及图35等说明第3实施方式的焦点位置决定装置1′进行的焦点位置决定处理的另一例。 

观察者如果将生物体细胞等的试料10′设置在规定的位置、启动焦点位置决定装置1′及光源20′，则焦点位置决定装置1′进行图29所示的以下的处理。 

首先，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，通过试料摄像部60′将被照射了从光源20′发出的照明光的试料10′摄像，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-1)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的光轴(z轴)上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向预先设定的变量Z_k代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-1)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤SC-1中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到预先设定的变量C_k中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-2)。另外，图像的对比度由通过将构成图像的各像素的受光强度I_i(图31的I₀、I₁、I₂、……、I_k、……、I_n)的分布如图32所示那样二维地再现而得到的受光强度的最大值I_max与受光强度的最小值I_min的差、即[I_max-I_min]定义。 

这里，模拟信号(例如起因于反射光或散射光等的干扰光的信号等)有可能会进入到测量数据(构成图像的各像素的受光强度)中。 所以，为了提高计算出的对比度的值的可靠性，也可以将对比度用受光强度的值I_max·mean与受光强度的值I_min·mean的差、即[I_max·mean-I_min·mean]定义。由此，能够降低起因于干扰光的测量误差(受光强度的误差)。另外，光强度的值I_max·mean是包含最大的受光强度的值I_max的多个高位受光强度的值、即按照受光强度较大的顺序从第1个受光强度的值到第N个受光强度的值的平均值，例如如图33所示，也可以用最大的受光强度的值I_max、第二大的受光强度的值I_max·2_nd、以及第三大的受光强度的值I_max·3_rd的平均值、即[(I_max+I_max·2_nd+I_max·3_rd)/3]定义。此外，光强度的值I_min·mean是包含最小的受光强度的值I_min的多个高位受光强度的值、即按照受光强度较小的顺序从第1个受光强度的值到第N个受光强度的值的平均值，例如如图33所示，也可以用最小的受光强度的值I_min、第二小的受光强度的值I_min·2_nd、以及第三小的受光强度的值I_min·3_rd的平均值、即[(I_min+I_min·2_nd+I_min·3_rd)/3]定义。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′从初始位置沿光轴方向移动一定量(步骤SC-3)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，将试料10′用试料摄像部60′摄像，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-4)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的z轴上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向预先设定的变量Z_k+1 代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-4)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤 SC-4中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到预先设定的变量C_k+1中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-5)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使焦点位置决定部70′a2动作，通过焦点位置决定部70′a2比较C_k的值与C_k+1的值的大小，在[C_k＜C_k+1]的情况下(步骤SC-6：是)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1 的值代入到Z_k中(步骤SC-7)，向步骤SC-3返回。此外，焦点位置决定装置1′在不是[C_k＜C_k+1]的情况下(步骤SC-6：否)，通过焦点位置决定部70′a2判断C_k的值是最初的对比度的极大值(第1极大值)，将得到C_k时的物镜的位置Z_k的值向预先设定的变量Z_max·1_st 保存(步骤SC-8)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a，将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SC-9)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′在光轴方向上移动一定量(步骤SC-10)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-11)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的z轴上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向预先设定的变量Z_k+1代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-11)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a 使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤SC-11中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到预先设定的变量C_k+1中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-12)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使焦点位置决定部70′a2动作，通过焦点位置决定部70′a2比较C_k的值与C_k+1的值的大小，在不是[C_k≤C_k+1]的情况下(步骤SC-13：否)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SC-14)，向步骤SC-10返回。此外，焦点位置决定装置1′在是[C_k≤C_k+1]的情况下(步骤SC-13：是)，通过焦点位置决定部70′a2判断C_k的值是对比度的极小值，并且决定对应于该极小值的物镜30′的位置是对准于试料10′的观察对象部位10a的物镜30′的焦点位置，将得到C_k时的物镜的位置Z_k的值向预先设定的变量Z_min保存(步骤SC-15)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向对应于变量Z_min的值的位置移动(步骤SC-16)。 

这样，结束图29所示的焦点位置决定处理的说明。 

这里，焦点位置决定装置1′也可以接着步骤SC-15而进行图30所示的位置决定处理。由此，能够进一步提高对准于试料10′的观察对象部位10′a的物镜30′的焦点位置的测量精度。以下，对图30所示的焦点位置决定处理进行说明。另外有时省略与上述说明重复的说明。 

接着步骤SC-15，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k 中(步骤SC-17)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a 使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′在光轴方向上移动一定量(步骤SC-18)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-19)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的z轴上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向预先设定的变量Z_k+1代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-19)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤SC-19中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到变量C_k+1中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SC-20)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使焦点位置决定部70′a2动作，通过焦点位置决定部70′a2比较C_k的值与C_k+1的值的大小，在不是[C_k≥C_k+1]的情况下(步骤SC-21：否)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SC-22)，向步骤SC-18返回。此外，焦点位置决定装置1′在是[C_k≥C_k+1]的情况下(步骤SC-21：是)，通过焦点位置决定部70′a2判断C_k的值是第二个对比度的极大值(第2极大值)，并且决定对应于在步骤SC-8中得到的第1极大值的物镜30′的位置与对应于该第2极大值的物镜30′的位置的中间是对准于试料10′的观察对象部位10a的物镜30′的焦点位置，将得到C_k时的物镜的位置Z_k的值向预先设定的变量Z_max·2_nd保存(步骤SC-23)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a 使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向对应于“(Z_max·1_st+Z_max·2_nd)/2的值的位置移动(步骤SC-24)。 

这样，结束图30所示的焦点位置决定处理的说明。 

接着，参照图34及图35等，说明第3实施方式的焦点位置决定装置1′进行的焦点位置决定处理的另一例。另外，有时省略与上述说明重复的说明。 

焦点位置决定装置1′在最初的阶段中增大物镜30′的移动量，一边改变物镜30′的移动方向一边使其移动量逐渐变小，最终使物镜30′的位置向图像的对比度成为极小值的位置收敛。 

具体而言，焦点位置决定装置1′执行以下的步骤1～11。 

步骤1：在物镜30′的开始位置(初始位置)处，取得图像的对比度(C₁)。 

步骤2：使物镜30′向预先设定的z轴的正(+)方向较大地移动到超过对应于上述第2极大值的物镜30′的位置左右的位置。 

步骤3：在由步骤2移动的位置处，取得图像的对比度(C_k)。 

步骤4：使物镜30′向z轴的正方向移动1步(预先设定的每1次的移动量)。 

步骤5：在由步骤4移动的位置处，取得图像的对比度(C_k+1)。 

步骤6：比较C_k的值与C_k+1的值的大小。 

步骤7：在满足“C_k＞C_k+1”的情况下，使物镜30′向z轴的负(-)方向较大地移动到对应于上述第1极大值的物镜30′的位置附近。此外，在满足“C_k＜C_k+1”的情况下，使物镜30′向z轴的负方向移动1步。 

步骤8：在由步骤7移动的位置处，取得图像的对比度(C_k+1)。 

步骤9：比较C_k的值与C_k+1的值的大小。 

步骤10：在满足“C_k＜C_k+1”的情况下，使物镜30′向z轴的正方向较大地移动到对应于上述第2极大值的物镜30′的位置附近。 

步骤11：通过一边减小物镜30′的移动量一边重复上述步骤，求出对应于图像的对比度的极小值的物镜30′的位置，将该位置决定为对准于试料10′的观察对象部位10′a的物镜30′的焦点位置。 

另外，焦点位置决定装置1′在上述所示的步骤中，也可以将第2次以后的物镜30′的移动时的移动量设定为前面进行的移动时的移动量的一半，在移动目的地的位置处比较C_k的值与C_k+1的值的大小，将接着的移动时的移动量设定为刚才的移动时的移动量的一半，反复进行这样的移动及比较。即，也可以通过每当对比度的比较时将物镜30′的移动量减少为一半，减少物镜30′的移动距离，最终使物镜30′的位置收敛到对比度成为极小值时的物镜的位置。具体而言，焦点位置决定装置1′也可以执行图34及图35所示的焦点位置决定处理。由此，能够更高速地决定对准于试料10′的观察对象部位10′a的物镜30′的焦点位置。 

这里，对图34及图35所示的焦点位置决定处理进行说明。另外，有时省略与上述说明重复的说明。观察者将生物体细胞等的试料10设置在规定的位置，如果启动焦点位置决定装置1′及光源20′，则焦点位置决定装置1′进行以下的处理。 

首先，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，通过试料摄像部60′将被照射了从光源20′发出的照明光的试料10′摄像，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-1)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的光轴(z轴)上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向预先设定的变量Z_k代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-1)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a 使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤SD-1中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到预先设定的变量C_k中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-2)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′从初始位置沿光轴(z轴)的正(+)方向移动预先设定的移动步数N(N是保存移动步数的变量)(步骤SD-3)。另外，光轴的正负方向及每1步的移动量预先设定。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，用试料摄像部60′将试料10′摄像，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-4)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的z轴上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向预先设定的变量Z_k+1 代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-4)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤SD-4中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到预先设定的变量C_k+1中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-5)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a，在保存移动步数的变量N中代入该N的值的一半(N/2)的值(步骤SD-6)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a 使焦点位置决定部70′a2动作，通过焦点位置决定部70′a2比较C_k的值与C_k+1的值的大小，在是[C_k＜C_k+1]的情况下(步骤SD-7：是)，通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向光轴(z轴)的负(-)方向移动在步骤SD-6中更新的移动步数N(步骤SD-8)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SD-9)，向步骤SD-4返回。此外，焦点位置决定装置1′在不是[C_k＜C_k+1]的情况下(步骤SD-7：否)，通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向光轴(z轴)的正(+)方向移动在步骤SD-6中更新的移动步数N(步骤SD-10)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SD-11)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，通过试料摄像部60′将试料10′摄像，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-12)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的z轴上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向变量Z_k+1代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-12)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤SD-12中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到变量C_k+1中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-13)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a，在保存移动步数的变量N中代入该N的值的一半(N/2)的值 (步骤SD-14)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使焦点位置决定部70′a2动作，通过焦点位置决定部70′a2比较C_k的值与C_k+1的值的大小，在是[C_k＞C_k+1]的情况下(步骤SD-15：是)，通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向光轴(z轴)的负(-)方向移动在步骤SD-14中更新的移动步数N(步骤SD-16)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SD-17)，向步骤SD-12返回。此外，焦点位置决定装置1′在不是[C_k＞C_k+1]的情况下(步骤SD-15：否)，通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向光轴(z轴)的正(+)方向移动在步骤SD-6中更新的移动步数N(步骤SD-18)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k 中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SD-19)。 

接着，前进到图35，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，用试料摄像部60′将试料10′摄像，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-20)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的z轴上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向变量Z_k+1代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-20)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤SD-20中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到变量C_k+1中，并且保存在 图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-21)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a，在保存移动步数的变量N中代入该N的值的一半(N/2)的值(步骤SD-22)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使焦点位置决定部70′a2动作，通过焦点位置决定部70′a2比较C_k的值与C_k+1的值的大小，在不是[C_k＞C_k+1]的情况下(步骤SD-23：否)，通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向光轴(z轴)的负(-)方向移动在步骤SD-22中更新的移动步数N(步骤SD-24)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SD-25)，向步骤SD-20返回。此外，焦点位置决定装置1′在是[C_k＞C_k+1]的情况下(步骤SD-23：否)，通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向光轴(z轴)的正(+)方向移动在步骤SD-22中更新的移动步数N(步骤SD-26)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SD-27)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使试料摄像部60′动作，通过试料摄像部60′将试料10′摄像，通过信息处理装置70′的控制部70′a将摄像的试料的图像保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-28)。此外，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜位置测量部50′动作，通过物镜位置测量部50′测量物镜30′的z轴上的位置，通过信息处理装置70′的控制部70′a将测量的物镜30′的位置向变量Z_k+1代入，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-28)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使对比度计算部70′a1动作，通过对比度计算部70′a1，根据在步骤 SD-28中摄像的图像计算该图像的对比度，通过信息处理装置70′的控制部70′a将计算出的对比度的值代入到变量C_k+1中，并且保存在图像等文件70′b1的规定的存储区域中(步骤SD-29)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a，在保存移动步数的变量N中代入该N的值的一半(N/2)的值(步骤SD-30)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使焦点位置决定部70′a2动作，通过焦点位置决定部70′a2比较C_k的值与C_k+1的值的大小，在不是[C_k＝C_k+1]的情况下(步骤SD-31：否)，通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向光轴(z轴)的负(-)方向移动在步骤SD-30中更新的移动步数N(步骤SD-32)，通过信息处理装置70′的控制部70′a将C_k+1的值代入到C_k中，并且将Z_k+1的值代入到Z_k中(步骤SD-33)，向步骤SD-28返回。此外，焦点位置决定装置1′在是[C_k＝C_k+1]的情况下(步骤SD-31：是)，通过焦点位置决定部70′a2判断C_k的值是对比度的极小值，并且决定对应于该极小值的物镜30′的位置是对准于试料10′的观察部位10′a的物镜30′的焦点位置，将得到C_k时的物镜的位置Z_k的值向预先设定的变量Z_min保存(步骤SD-34)。 

接着，焦点位置决定装置1′通过信息处理装置70′的控制部70′a使物镜移动部40′动作，通过物镜移动部40′使物镜30′向对应于变量Z_min的值的位置移动(步骤SD-35)。 

这样，结束图34及图35所示的焦点位置决定处理的说明。 

如以上说明，第3实施方式的焦点位置决定装置1′一边使物镜的位置移动一边将试料摄像并且测量物镜的焦点位置，基于摄像的图像计算构成图像的各像素的像素值的最大值与最小值的差即对比度，基于计算出的对比度及测量的物镜的焦点位置决定对准于观察对象 部位的物镜的焦点位置。由此，在将试料内的特定部位作为观察对象部位进行该观察对象部位的发光观察的情况下，在设置了试料的时刻能够决定对准于该观察对象部位的物镜的焦点位置，结果，能够将物镜的焦点位置调对到该观察对象部位。此外，在进行试料内的发光部位的发光观察时，即使没有确认来自该发光部位的发光，也能够将物镜的焦点调对到试料内的发光部位。 

另外，第3实施方式的焦点位置决定装置1′也可以将计算出的对比度与其他对比度比较，探索1个其极小值，将摄像作为探索到的极小值的图像时的物镜的焦点位置决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。具体而言，第3实施方式的焦点位置决定装置1′也可以将物镜一步步地在z轴方向上移动，在各个步中比较图像的对比度，将图像的对比度为极小时的物镜的z轴位置决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。由此，能够容易地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，第3实施方式的焦点位置决定装置1′也可以将计算出的对比度与其他对比度比较，探索两个其极大值，将摄像作为探索到的各极大值的图像时的物镜的焦点位置的中间决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。具体而言，第3实施方式的焦点位置决定装置1′也可以将物镜一步步地在z轴方向上移动，在各个步中比较图像的对比度，决定两处图像的对比度为极大时的物镜的z轴位置，将对应于该两处极大值的物镜的z轴位置的中间位置决定为对准于观察对象部位的物镜的焦点位置。由此，能够容易地决定对准于试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，第3实施方式的焦点位置决定装置1′也可以一边使其移动量阶段性地减少一边使物镜的位置移动。具体而言，第3实施方式的焦点位置决定装置1′也可以在移动的每步使物镜的z轴方向的移动幅度大致变为一半，来使物镜移动。由此，能够迅速地决定对准于 试料内的观察对象部位的物镜的焦点位置。 

此外，第3实施方式的焦点位置决定装置1′也可以将对比度定义为构成各像素的像素值中的包括最大值的多个高位的像素值的平均值与构成各像素的像素值中的包括最小值的多个低位的像素值的平均值的差。由此，即使模拟信号(例如反射光或散射光等的干扰光带来的信号等)进入到摄像的图像中，也能够由该图像计算出可靠性较高的对比度。 

[II]以下，基于附图详细地说明有关本发明的微弱光检测装置及微弱光检测方法的实施方式。另外，并不通过该实施方式限定本发明。 

[第1实施方式] 

利用图36到图37对第1实施方式进行说明。图36是以倒立型显微镜为基础的微弱光检测装置的概略图。微弱光检测装置由光源A2、用来使从光源A2发出的光成为平行光、向被测试料A4导引的照明光学系统A1、用来生成被测试料A4的像的观察光学系统A5、用来将被测试料A4的像放大而进行目视观察的目镜A6、和具有用来将被测试料A4的像摄像的摄像元件A7的CCD摄像机A8构成。此外，在CCD摄像机A8上，通过信号线缆A100连接着兼作为电视监视器的计算机A16。 

照明光学系统A1从光源A2侧开始依次由聚光透镜A10、用来使照明光的光轴A11偏转的偏转反射镜A12、以及聚焦透镜14构成。光源A2使用卤素灯、LED光源、钨灯、水银灯等的可视域波长的非相干光源。或者也可以将激光那样的相干光源的光用扩散板等改变为非相干的光而作为光源使用。光源的波长通常使用可见光，但也可以使用红外光。 

观察光学系统A5从被测试料A4侧开始依次由用来形成被测试料A4的像的物镜A15、第1中继透镜A16、用来将来自物镜A15的光偏转的偏转反射镜A17、和用来与第1中继透镜A16一起将物镜 A15的像(被测试料A4的像)成像在成像面A19上的第2中继透镜A18构成。此外，在第2中继透镜A18与成像面A19之间配置有切换反射镜A20，以便能够将被测试料A4的像切换为通过目镜A6的目视观察和通过CCD摄像机A8的观察。另外，切换反射镜A20除了机械的切换类型以外，也可以利用半反射镜将两个光路分离。 

接着，利用图37对本发明的微弱光检测装置的结构进行说明。被测试料与培养液一起被装入到培养皿等的试料容器A21中。在试料容器A21的周围配置有水槽A22，通过喷嘴A23对该水槽A22内供给纯水。该纯水是为了保持试料容器内的湿度而输送的。此外，通过气体供给管A24将CO₂气体供给到水槽22的上面上。CO₂气体被从至于测量装置主体的外部的气体储存器A25供给。参照图39。气体储存器内被5％CO₂、95％O₂的混合气体充满。CO₂气体被从气体储存器A25向装入有试料容器A21的带盖密闭容器A30内、通过气体供给管A24以50mL/min的速度供给。此外，试料容器整体载置于加热板A27之上。加热板A27受温度控制器(未图示)以0.5°步幅间隔进行环境温度的设定。试料容器A21的底面是与显微镜用盖玻璃相同的材质，厚度为0.17mm，能够应对通常的物镜。试料容器A21的底面光学地透明。另外，试料容器A21并不限于培养皿，也可以使用玻璃载片、微片等。 

在试料容器A21的上面上配置有试料容器盖A26，以使其覆盖并罩住试料容器A21的上面前面。试料容器盖A26有光学透明的丙烯树脂等的合成树脂形成，防止赃物等的异物进入到试料容器A21内的被测试料A4内。此外，还防止试料容器A21内的被测试料A4蒸发。包括水槽A22的试料容器A21收纳在带盖密闭容器A30内。带盖密闭容器A30由光学透明的丙烯树脂等的合成树脂形成，在上面上经由铰链A32安装有盖A31。盖A31通过铰链A32可以用手动开闭。 

在试料台A3上，分别在90°方向上分别安装有两个步进马达(未图示)，各个步进马达连接在试料台控制器上。试料台控制器连接在计算机A16上，通过来自计算机A16的指令驱动两个步进马达，使试料台A3在X方向、Y方向上移动。在试料台A3下方倒立地配置有物镜A15，物镜加热器A28接触在物镜A15上而安装在周围。物镜加热器A28与温度调节装置相连，以0.5°步调间隔进行温度控制，从外侧将物镜保持为一定温度。此外，在物镜加热器的周围具备物镜Z轴驱动机构A9，将物镜A15沿着Z轴(光轴方向)自动地驱动。物镜Z轴驱动机构A9通过齿轮齿条机构(未图示)使物镜上下移动。齿轮齿条机构的旋钮的旋转动作通过受计算机控制的步进马达(未图示)进行。另外，物镜Z轴驱动机构A9除了齿轮齿条机构以外，也可以通过摩擦辊机构进行。 

受光器使用CCD(Charge Coupled Device)照相机。使用图39说明受光部分的结构。处于CCD摄像机A8的受光面上的摄像元件的像素数为1360×1024。由于从被测试料发出的光是微弱光，所以作为受光器的CCD摄像机A8尽量使用高感度的。为了抑制从CCD摄像机A8发出的暗电流，在CCD摄像机A8的底部装备有由珀尔帖元件构成的冷却装置A29，将CCD摄像机A8的温度在0℃左右冷却保温。在CCD摄像机A8的受光面的上方配置有红外线截止滤光器，将作为背景光的红外线截断。在CCD摄像机上通过信号线缆连接有TV监视器，在TV监视器上描绘有试料图像。CCD摄像机也可以是3板式彩色照相机而能够得到彩色的明视场像。 

另外，光检测器并不限于CCD摄像机，当然也可以使用例如COMS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)图像传感器或SIT(Silicon Intensified Target)照相机等。 

在测量生物发光蛋白质的发光现象的情况下，在试料设置时发光强度还很微弱，几乎不能作为光信号由受光器检测到。因而，细胞的 内部构造通常不能观察。即，不能如通常的显微镜观察那样一边确认试料内的作为观察对象的细胞一边调对物镜的焦点。所以，作为明视场像观察，将来自卤素灯等的光源的光通过照明光学系统投光到被测试料中，对被测试料投光而得到被测试料的显微镜的明视场像，基于此来决定物镜的焦点位置。即，在明视场观察中，将能够得到高对比度像的、物镜的光轴上的两个部位的大致中心位置作为物镜的焦点位置。由此，在生物发光蛋白质的发光强度变大时，能够得到对焦于CCD摄像机上的鲜明的发光像。在前面的实施例中已详细地说明了物镜的焦点位置决定方法。 

接着，基于图36说明第1实施方式的光学系统的作用。光源A2在聚光透镜A10的作用下成为平行光，被投影到聚焦透镜A14的光瞳位置上。该光源A2的像被聚焦透镜A14作为柯而勒照明将被测试料A4照明。将被测试料A4照明的光透过被测试料A4而入射到物镜A15中。入射到物镜A15中的测量光通过物镜A15、第1中继透镜A16及第2中继透镜A18在成像面A19上形成被测试料A4的像。这里，使用倍率×20的物镜。 

形成在成像面A19上的被测试料A4的像原样入射到目镜A6中，并且通过切换反射镜A20成像在CCD摄像机A8的摄像元件A7上。在CCD摄像机A8的受光面的前方设置有红外线截止滤光器A13，由此将作为背景光的红外线截断。另外，并不限于使物镜移动，当然也可以使试料台A3沿着光轴移动。 

接着，基于图39的框图说明数字缩放功能。被测试料的图像被输入到CCD摄像机A8的摄像元件A7中，在这里被变换为模拟的电信号即图像信号。变换后的图像信号被输入到信号处理电路A33中，在这里被实施放大处理及滤波处理、轮廓强调等的图像处理后，被导入到数字缩放电路A34中。图像信号被数字缩放电路A34A/D变换而生成数字图像信号，并且对该数字图像信号，根据从CPU(Central Processing Unit)A35给出的数字缩放控制信号实施数字缩放处理。接着，将该处理后的数字图像信号通过显示控制电路A38输入到TV监视器A37中，在TV监视器A37的画面上显示被测试料的放大图像。 

另一方面，从数字缩放电路输出的数字图像信号也被输入到记录再现控制电路A38中。记录再现控制电路A38将输入的数字图像信号基于从CPUA35给出的记录控制信号记录到收容于存储器插槽(未图示)中的可拆装的记录媒体A39中。作为记录媒体而使用存储卡。此外，记录再现控制电路A38应答于从CPUA35给出的再现控制信号，将记录在记录媒体A39中的数字图像信号读出。该读出的数字图像信号经由记录再现控制电路A38被输入到TV监视器A37中，由此，在TV监视器37的画面上显示被验物体的图像。另外，图像的记录并不限于存储卡，也可以记录到例如硬盘、磁盘、光磁盘等的记录媒体中。 

此外，在CPUA35上连接着图40所示那样的操作面板A40。在操作面板A40上具备电源开关A46，进行操作面板A40的电源的开启、关闭。通过操作面板A40的指示，经由CPUA35将数字缩放控制信号供给到数字缩放电路A34中。此时，从CPUA35发出的数字缩放控制信号为矩形波的连续脉冲信号。并且，在操作面板40中还组装有录像按钮A42及再现按钮A43。如果将其中的录像按钮A42开启，则CPUA35进入到录像模式，生成录像控制信号并供给到记录再现控制电路A38中。另一方面，如果将再现按钮A43开启，则CPUA35进入到再现模式，生成上述再现控制信号而供给到记录再现控制电路A38中。用来控制该CPUA35的动作的控制程序存储在存储器A41中。 

通过这些按钮的按压操作，从操作基板对CPUA35输出对应于各按钮的指示信号，进行缩放中心位置、缩放倍率等的调节。另外，在 图40中，作为例子表示了这些快门按钮A48、放大按钮A43、缩小按钮A44、十字光标按钮A45，其他操作部件省略其标记。 

由以上说明可知，该第1实施方式的微弱光测量装置通过将取得的图像信号数字处理，具有能够调节缩放绿的数字缩放功能。数字缩放功能的缩放倍率M最大是4.0倍，通过按照上述数字缩放控制信号控制数字缩放电路A34，能够在M＝1.00～4.00的范围内改变该缩放倍率M。另外，对于担负数字缩放功能的数字缩放电路A34，由于使用公知的技术，所以这里省略说明。 

上述数字信号处理部除了对从模拟信号处理部(A/D变换器)输入的图像数据根据需要而实施γ修正等的数字处理以外，还作为基于来自CPUA35的控制信号从由CCD取入的图像数据(CPU的所有像素区域的图像数据)取入数字缩放区域的图像数据的图像取入机构使用。即，通过对数字信号处理部从CPUA35输入控制缩放倍率及缩放中心位置的控制信号，将以该缩放中心位置为中心的该缩放倍率的图像数据切取而生成1画面量的图像，能够将该图像作为数字缩放区域的图像取入。 

特别是，在数字信号处理部中，为了将缩放中心位置及缩放倍率在视觉上显示给操作者，可以将取入的数字缩放区域的图像输出到显示存储器中、显示在TV监视器A37上。由此，摄影者除了能够掌握缩放中心位置以外，通过按压操作上述十字光标按钮A45，能够将缩放中心位置移动到任意位置，能够在期望的位置指定缩放中心位置。此外，通过将放大按钮A43、缩小按钮A44按下操作，能够使数字缩放区域变化而指定为希望的缩放倍率。 

上述存储卡A39记录保存图像数据。如图40所示，使模式开关A47为摄像模式，如果通过快门按钮A48的按下操作而有图像的记录指示输入，则从CPUA35对数字信号处理部输出控制信号，从CCD读入1个片段的图像数据，通过数字信号处理部实施了数字信号处理 后，将该图像数据写入到存储器A41中。写入到存储器A41中的图像数据被压缩电路压缩处理，由记录再现控制电路A38记录、保存到存储卡A39中。 

显示图像的缩放并不限于数字缩放，也可以使用光学缩放来进行。光学缩放通过缩放透镜进行。光学缩放如通常进行那样，是通过不仅马达的马达驱动使CCD摄像机与第2中继透镜之间的焦点距离沿着光轴移动来进行的。缩放透镜的结构由3变倍透镜组、进行像差修正等的修正透镜组、以及进行焦点调节的对焦透镜构成，能够使透镜的焦点距离以10级手动或自动地变化。缩放透镜的驱动是通过安装在缩放透镜的周围的缩放马达的动作进行的。缩放马达使用超声波马达等，基于从CPUA35发出的控制信号，使透镜沿着光轴移动。 

[第2实施方式] 

(萤光与生物发光的同时测量) 

图41中表示能够同时进行数字缩放和光学缩放、并且能够进行萤光与生物发光的同时测量的微弱光检测装置的光学系统的概况。另外，关于光学系统的结构及动作，除了追加有激励用光学系统A49以外，基本上与图36的第1实施方式中说明的内容相同。基本的结构使用倒立型光学显微镜作为基础。并且，附带有照明用光源、试料台、物镜、计算机。光学系统由将光引导到培养皿等的试料容器A21内的被测试料A4中的照明光学系统A1、以及将从被测试料A4发出的微弱光导引到CCD摄像机A8中的观察光学系统A5构成。 

激励用光学系统A49由激励光源A50、准直透镜A51、偏转反射镜A52、切换式分色镜A53构成。激励光源通常使用氩气激光、氦氖激光等的可视域的气体激光。此外，切换式分色镜A53具有将激励光源的震荡波长的光反射、使萤光及发光信号的波谱透过的波谱特性。 

在主体外部具备激励光源A50。激励光源A50是波长488nm、输 出10mW的氩气激光。激光被准直透镜变换为具有束宽度的圆形的平行光束，被偏转反射镜A52反射，入射到设置在观察光学系统A5中的切换式分色镜A53中。入射到观察光学系统A5中的激光被切换式分色镜A53反射，从下入射到物镜A28中，聚光照射在试料容器A21内的被测试料A4上。切换式分色镜A53收纳在保持器(未图示)中，配合激励激光的震荡波长可更换地设置。另外，如果不需要变更激励光源A50的波长，也可以不使用切换式分色镜A53而将通常的分色镜固定而设置在观察光学系统A5中。 

为了得到细胞图像而使用NA(数值孔径)0.9左右的数值孔径的物镜(空气中的情况)。对于被液体浸渍的被测试料，使用1.0以上的高NA的物镜。从被测试料A4发出的萤光信号或发光信号再次通过物镜A15，通过装置主体的观察光学系统A5，到达切换式分色镜A53。接着，通过切换式分色镜A53，通过第1中继透镜A16、第2中继透镜A18，被切换反射镜A20反射，将焦点聚集在CCD摄像机A8内的摄像元件A7的受光面上。 

从被测试料发出的萤光信号或发光信号在将切换反射镜A20从光路中拆下的情况下，在由成像面A19成像后到达目镜A6，观察者能够直接观察图像。 

来自CCD摄像机A8的光信号被发送给置于微弱光装置主体外部的计算机A16，通过计算机A16进行发光图像的描绘、解析、还有发光强度的时间测量、信号解析等。解析结果被显示在计算机A16的监视器画面上。即，计算机A16不仅描绘试料图像，还进行发光强度的时间变化等的解析。 

作为萤光色素而使用玫瑰绿(Rhodamine Green：RhG)。作为萤光物质，除了玫瑰绿(Rhodamine Green：RhG)以外，也可以使用例如TMR(Tetramethylrhodamine)、5-Tamra(5-carboxytetramethylrhodamine)等。在此情况下，为了激励萤光物 质TMR可以使用波长514.5nm的氩气激光、为了激励萤光物质5-Tamra可以使用波长543.5nm的He·Ne激光作为激励激光光源。作为其他萤光色素，也可以使用FITC(Fluorescein-isothiocyanate)、TOTO1、Acridine-Orange、Texas-Red等。 

图42中表示能够同时进行数字缩放和光学缩放、并且能够进行萤光与生物发光的同时测量的微弱光检测装置的实施例。测量装置主体将铝等的金属板的表面黑色涂装，装入到以盒型组合的构造的遮光盒A54内，通过固定工具A56固定在底板A55上。遮光盒A54在上面上分离安装有遮光盖A57，遮光盖A57的一端通过铰链A58与遮光盒A54主体连结，遮光盖A57能够以扇状手动或自动地开闭。 

作为照明用的光源，使用例如卤素灯或金属卤化物灯等的非相干光源。照明用的光源设置在光源盒A59内。从光源盒A59通过照明用光纤A60从试料台A3上的试料容器A21的上面导引照明光，将被测试料A4整体照明。在观察光学系统中，不使用在第1实施例中使用的偏转反射镜，通过物镜A15聚光的从被测试料A4发出的信号光通过透镜A67由CCD摄像机A8受光。 

在微弱光检测装置主体外部，激光光源A61固定在激励光源盒A62内，从激光光源A61射出的激光通过安装固定在激励光源盒A62内的准直透镜A63成为束直径被放大的平行光，通过配设在遮光盒A54上的圆形的激光入射口A64入射到装置主体上。作为激光光源A61，使用波长488mm、输出10mW的氩气激光。通过激光入射口A64入射到微弱光检测装置主体中的激光到达切换式分色镜A65，被切换式分色镜A65反射，从下部入射到物镜A15中，聚光照射在被测试料A4上。切换式分色镜A65具有将包括激励光源的波长区域、比该波长区域短的波长区域的光反射、使比激励光源的波长区域长的波长区域的光透过的光学特性。切换式分色镜A65在镜筒A70内收纳在保持器A72中。安装在该保持器A72内的切换式分色镜A65配 合激励激光的震荡波长可更换地设置。 

镜筒A70分离为镜筒上部A78、镜筒下部A66，镜筒上部A78、镜筒下部A66相连结。镜筒上部A78经由镜筒Z轴驱动机构A76被保持在支柱A73上。镜筒上部A78通过镜筒Z轴驱动机构A76的驱动动作能够沿着光轴上下移动。另外，镜筒Z轴驱动机构A76能够通过齿轮齿条机构沿着光轴使镜筒上部A78的位置上下移动。 

在安装于微弱光测量装置主体上的镜筒下部A66上配置有透镜A67，在其Z轴上的焦点位置上安装有CCD摄像机A8，以使其受光面的大致中心对准于该Z轴上的焦点位置。透镜A67为缩放透镜。关于缩放透镜的动作，由于已在第1实施方式中叙述，所以省略说明。由于从试料发出的光是微弱光，所以CCD摄像机A8尽量使用高感度的。这里，CCD摄像机A8的像素数为1360×1024。为了抑制从CCD摄像机A8发出的暗电流，在CCD摄像机A8的底部上安装有由珀尔帖元件构成的冷却装置A29，将CCD摄像机A8的温度在0℃左右下冷却保温。在CCD摄像机A8的受光面的上方设置有红外线截止滤光器A68，将作为背景光的红外光截断。但是，在将红外光作为信号光取出的情况下，在测量前将该红外线截止滤光器A68从镜筒下部A66拆下。在CCD摄像机A8的输出部上，经由信号线缆A69连接着焦点检测部、接着是位置检测部、还有计算机A16，在附属于计算机A16的TV监视器A72上描绘出试料图像。CCD摄像机A8也可以为3板式彩色照相机而能够得到彩色的明视场像。另外，主体架台可以使镜筒A70滑动上下，来进行位置调节。 

试料容器A21通过固定销(未图示)固定在XY试料台A3上。XY试料台能够沿着XY平面、通过齿轮齿条机构自如地移动XY平面上的位置。在试料容器A21的下方设置有物镜A15。物镜A15安装在物镜Z轴驱动机构A9上，能够沿着光轴(Z轴)移动。物镜Z轴驱动机构A9通过导线A69连接在设置于微弱光检测装置外部的焦 点检测部A70上，从焦点检测部A70连接着位置检测部A71，位置检测部A71的输出信号被输出到附属于计算机A16的TV监视器A72中。另一方面，导线A69被分支，CCD摄像机A8的输出信号被引导到信号处理部A74中，信号处理部A74的输出信号连接在计算机A16上。 

从细胞发出的萤光或发光信号透过物镜A15及切换式分色镜A65，通过安装在镜筒下部A66的下部的透镜A67，聚光在CCD摄像机A8的受光面上。 

微弱光测量装置主体固定在基础架台A75上。基础架台A75安装在支柱A73上，基础架台A75能够上下移动。镜筒下部A66通过固定工具(未图示)固定在基础架台A75上。此外，支柱A73、基础架台A75固定在底板A55上。 

接着说明动作。将从CCD摄像机A8得到的照明光源的被测试料的照明图像的信号导引到信号处理部A74中，将来自各图像的输出强度信号统计处理，得到光信号强度分布。与物镜Z轴驱动机构A9联动，使物镜Z轴驱动机构A9动作，使物镜A15沿着光轴移动适当量。物镜Z轴驱动机构A9经由信号线缆连接在物镜驱动装置A77上，基于物镜驱动装置A77的指令，物镜Z轴驱动机构A9动作，能够自动地使物镜A15上下移动。 

在物镜A15的每个移动步调中将来自CCD摄像机A8的光输出信号用信号处理部A74信号解析，检测能够得到高对比度图像的物镜A15的光轴上的位置。找到能够得到上下两个部位的高对比度图像的物镜A15的光轴上的位置，通过信号处理部A74进行计算，将上下两个部位的大致中央位置设为被测试料A4的发光位置。接着，使物镜Z轴驱动机构A9动作，使物镜A15移动到该位置。由此，由于决定了物镜A15的焦点位置，所以在该位置上将物镜A15固定，通过CCD摄像机A8将从被测试料A4发出的萤光信号及发光信号受 光。物镜的焦点位置决定方法在前面的实施例中已详细地说明。 

物镜A15可更换地安装在物镜Z轴驱动机构A9上。如果提高物镜A15的倍率而将被测试料A4摄像，则得到的图像变暗。细胞等的被测试料A4在培养液中运动。如果通过高倍率的物镜观察它，则视野变窄，根据情况，有时被测试料A4运动而从视野中消失。因而，首先通过×10、×20的低倍率的物镜观察被测试料A4。接着，确认被测试料A4的希望的位置，利用鼠标及键盘进行指定，进行试料图像的放大。或者，也可以对发光图像的发光部分和其以外的部分的光强度决定临界值而双值化，求出发光部分的区域，对该区域进行放大。 

另外，也可以省略信号处理部A74，将信号功能部A74的功能合并在计算机A16的功能中使用。 

物镜Z轴驱动机构A9通过导线A69连接在设置于微弱光检测装置外部的焦点检测部A70上，从焦点检测部A70连接在位置检测部A71上，将位置检测部A71的输出信号输出到TV监视器中。 

(测量步骤) 

1)以下表示进行数字缩放或光学缩放的任一种的情况下的测量步骤。 

图38中表示进行数字缩放的情况下的流程图。 

1、将被测试料(细胞)浸渍在装入了培养液的培养皿(试料容器)中。 

2、光源的照明开始。 

3、输入受光器的电源，描绘被测试料(细胞)的图像。利用焦点位置决定方法及装置，决定被测试料的焦点位置，将物镜移动到焦点位置。 

4、指定得到的图像中的希望的区域。 

5、光源的照明结束。 

6、输入激励光源。 

7、描绘被测试料(细胞)的萤光图像。 

8、断开激励光源的电源。 

9、描绘被测试料(细胞)的发光图像。 

10、在进行数字缩放的情况下，指定希望的发光区域。 

11、数字缩放驱动。 

12、在进行数字缩放而得到希望的缩放图像的情况下，进行物镜的焦点位置决定动作，将物镜移动到被测试料的焦点位置。然后，将其显示在TV监视器上或者输入到存储卡中。在进行数字缩放而不能得到希望的缩放的情况下，重新进行发光区域的指定，或者通过数字图像解析计算焦点位置的偏差量，将物镜移动到对应于偏移量的修正位置，回到9。 

13、结束。 

但是，在不需要萤光图像的叠合的情况下，不进行在激励光源的标识在细胞内的希望的部位上的萤光物质的激励。仅通过发光图像也同样进行物镜的焦点位置的检测，将物镜移动到焦点位置，能够进行数字缩放或光学缩放、或者数字缩放与光学缩放两者。利用焦点位置决定方法及装置决定被测试料的焦点位置的定时也可以在指定了得到的图像中的规定的区域中后、即在4之后进行。此外，根据需要，物镜的焦点位置决定动作也可以在3或12中的任一个中进行1次。 

2)以下表示同时进行数字缩放与光学缩放的情况下的测量步骤。 

图43中表示流程图。 

1、将被测试料(细胞)浸渍在装入了培养液的培养皿(试料容器)中。 

2、光源的照明开始。 

3、输入受光器的电源，描绘被测试料(细胞)的图像。利用焦点位置决定方法及装置，决定被测试料的焦点位置决定方法及装置，决定被测试料的焦点位置，将物镜移动到焦点位置。 

4、指定得到的图像中的希望的区域。 

5、光源的照明结束 

6、输入激励光源。 

7、描绘被测试料(细胞)的萤光图像。 

8、将激励光源的电源断开。 

9、描绘被测试料(细胞)的发光图像。 

10、指定希望的发光区域。 

11、在进行数字缩放的情况下，进行上述测量步骤1)的10～12。但是，在该测量步骤2)中不进行偏差量的计算，在通过由数字缩放得到的图像不能得到希望的图像的情况下，进行光学缩放驱动(图42的缩放透镜A67的移动)，描绘(显示)发光图像。 

12、光学缩放驱动。进行物镜的焦点位置决定动作，将物镜移动到被测试料的焦点位置。 

13、结束。利用焦点位置决定方法及装置决定被测试料的焦点位置的定时也可以在指定了得到的图像中的规定的区域中后、即在4之后进行。此外，根据需要，物镜的焦点位置决定动作也可以在3或12中的任一个中进行1次。 

但是，在不需要萤光图像的叠合的情况下，不进行激励光源的表示在细胞内的希望的部位上的萤光物质的激励。仅通过发光图像也同样进行物镜的焦点位置检测，将物镜移动到焦点位置，够进行数字缩放或光学缩放、或者数字缩放与光学缩放两者。在进行数字缩放及光学缩放后，再通过进行物镜的焦点位置决定动作，在试料内的希望的区域中能够得到更鲜明的图像。 

以上，通过实施方式说明了本发明，但包含从上述说明中导出的所有的发明，也涵盖其均等物。此外，本发明并不限于上述实施方式，能够进行各种变更，包含它们的设计物或制造物、或者使用的方法。另外，在第2实施方式中，也能够进行通过数字缩放图像进行发光量 的测量、并且通过光学缩放图像得到观察用图像的同时使用。在同时使用这样的数字图像和光学图像的情况下，能够一边进行慢速的连续的发光量的测量，一边另外地描绘高倍率下的鲜明的发光图像。 

此外，与萤光不同，生物发光那样的很微弱的发光图像根据被测试料的种类而需要使将图像形成所需的发光信号曝光规定时间的累积时间为10～60分钟的较长的形成时间。在单纯想要光学缩放而提高倍率的情况下需要比低倍率更长的曝光时间。由此，如果想要通过光学缩放取得微弱发光图像，则相对于低倍率的情况，在高倍率的情况下需要2倍以上的曝光时间，仅在图像形成中就非常花费时间。另一方面，在进行慢速的摄像的情况下，由于不能通过比摄像间隔长的曝光时间进行摄像，所以需要尽量在短时间内得到放大的微弱光图像。摄像的被测试料的数量越多，越优选地进行数字缩放。 

另外，数字缩放图像与光学缩放图像不同，仅通过将已经取得的图像用数字放大就能够迅速地得到放大图像，所以在低倍率的逐一的图像化监视中能够总是指定希望的部位而与将该放大图像放大前的图像一起并列显示。 

实施例 

在本实施例中，通过第2实施方式的焦点位置决定装置1将物镜的焦点调对到导入了质粒媒介的多个HeLa细胞上，从多个HeLa细胞中选择作为对象的HeLa细胞，经时地测量来自所选择的HeLa细胞内的线性体的发光量及ATP量。首先，按照以下的(步骤1)～(步骤7)进行本实施例的实验。 

(步骤1)制作萤光蛋白质(GFP)、线性体转移信号和虫萤光素酶连接的融合基因。 

(步骤2)将载入了融合基因的质粒媒介导入到HeLa细胞中。 

(步骤3)通过焦点位置决定装置1将物镜的焦点位置预调对到HeLa细胞内的线性体上，通过CCD摄像机将HeLa细胞在照明下和 无照明时分别摄像，基于摄像的摄像图像(萤光图像)判断在线性体中是否局部存在GFP，确认在线性体中是否局部存在虫萤光素酶(参照图23)。图23是表示导入了质粒媒介的HeLa细胞的照明图像及萤光图像的图。 

(步骤4)对HeLa细胞投放组胺，引起经由Ca²⁺的线性体的ATP量的变动。 

(步骤5)通过CCD摄像机将HeLa细胞在照明下和无照明时分别摄像，经时地取得捕获了来自HeLa细胞内的线性体的发光的发光图像(参照图24)。图24是表示导入了质粒媒介的HeLa细胞的照明图像及发光图像的图。 

(步骤6)通过将摄像的照明图像、萤光图像及发光图像叠合，选择作为对象的HeLa细胞。 

(步骤7)测量来自选择的HeLa细胞内的线性体的发光强度的时间变化，并且监视ATP量的时间变动。 

接着，对实验结果进行说明。如图23所示，在号码1的HeLa细胞中，可以确认通过质粒媒介导入了融合基因并且在线性体中局部存在虫萤光素酶。此外，在号码2及号码4的HeLa细胞中，可以确认没有通过质粒媒介导入融合基因。进而，在号码3的HeLa细胞中，可以确认通过质粒媒介导入了融合基因但在线性体中没有局部存在虫萤光素酶。即，可以确认通过质粒媒介导入了融合基因且在线性体中局部存在虫萤光素酶的HeLa细胞只是号码1的HeLa细胞，所以将作为对象的HeLa细胞选择为号码1的HeLa细胞。此外，如图24所示，可以确认，来自号码3的HeLa细胞的发光强度最大，接着来自号码1的HeLa细胞的发光强度较大，接着来自号码2及号码4的HeLa细胞的发光强度是同样的大小。并且，如图25所示，可以监视来自号码1的HeLa细胞的线性体的发光强度的经时变动。图25是表示来自选择的号码1的HeLa细胞的发光强度的时间变化的图。 

工业实用性 

以上，有关本发明的焦点位置决定方法、焦点位置决定装置、微弱光检测装置及微弱光检测方法在生物体细胞的发光观察、萤光观察、萤光发光同时观察中可以适当地实施。此外，在设置了被测试料后，利用本实施例的物镜的焦点决定方法或焦点决定装置决定了物镜的焦点位置后，通过进行被测试料的图像的数字缩放或光学缩放，图像放大时的图像为高对比度并且变得鲜明，在解析图像的方面也具有能够高精度地实施的优点。关于本发明的焦点位置决定方法或焦点位置决定装置、还有数字缩放或光学缩放的方法、装置，并不限于在实施例中说明的包含生物发光蛋白质的生物试料，对于不伴随着发光的通常的相位物体也能够适用。 

Claims (10)

1.一种焦点位置决定方法，决定对准于试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置，其特征在于，包括：

光照射步骤，向试料照射光；

焦点位置变更步骤，变更物镜的焦点位置；

焦点位置计测步骤，计测在上述焦点位置变更步骤变更的焦点位置；

试料摄像步骤，在由上述焦点位置变更步骤变更的焦点位置，对在上述光照射步骤被照射光的试料进行摄像；

特征量计算步骤，根据在上述试料摄像步骤摄像的摄像图像，计算对摄像图像赋予特征的特征量；

执行步骤，反复执行上述焦点位置变更步骤、上述焦点位置计测步骤、上述试料摄像步骤以及上述特征量计算步骤；

焦点位置选出步骤，从执行上述执行步骤而储存的多个焦点位置中，基于上述执行而储存的多个特征量，选出至少1个选出焦点位置；

焦点位置决定步骤，基于在上述焦点位置选出步骤选出的选出焦点位置，决定对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置；以及

焦点位置再决定处理，在从上述试料细胞发出的发光的强度为可由试料摄像单元检测到的程度时，基于不照明试料而对该试料进行摄像的发光图像，再次重新决定由上述焦点位置决定步骤所决定的物镜的焦点位置；

上述焦点位置再决定处理包括：

决定位置试料摄像步骤，在由上述焦点位置决定步骤决定的焦点位置，不照明试料而对该试料进行摄像；

决定后焦点位置变更步骤，变更在上述焦点位置决定步骤决定的焦点位置；

决定后试料摄像步骤，在由上述决定后焦点位置变更步骤变更的焦点位置，不照明试料而对该试料进行摄像；

特征量比较步骤，将在上述决定位置试料摄像步骤进行摄像的作为发光图像的特征量的对比度与在上述决定后试料摄像步骤进行摄像的作为发光图像的特征量的对比度进行比较；以及

焦点位置再决定步骤，在上述特征量比较步骤进行比较的结果，是在上述决定后试料摄像步骤进行摄像的作为发光图像的特征量的对比度更大的情况下，将在上述决定后焦点位置变更步骤变更的焦点位置，再度决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。

2.如权利要求1所述的焦点位置决定方法，其特征在于，

在上述焦点位置选出步骤，从执行上述执行步骤而储存的多个焦点位置中，基于上述执行而储存的多个特征量，选出两个选出焦点位置；

在上述焦点位置决定步骤，基于在上述焦点位置选出步骤选出的两个选出焦点位置，将该两个选出焦点位置的中央位置决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。

3.如权利要求2所述的焦点位置决定方法，其特征在于，

上述两个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置及物镜的远点侧的焦点位置。

4.如权利要求1所述的焦点位置决定方法，其特征在于，

在上述焦点位置选出步骤，从执行上述执行步骤而储存的多个焦点位置中，基于上述执行而储存的多个特征量，选出1个选出焦点位置；

在上述焦点位置决定步骤，基于在上述焦点位置选出步骤选出的1个选出焦点位置和预定的距离，将从该选出焦点位置离开该距离的位置，决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。

5.如权利要求4所述的焦点位置决定方法，其特征在于，

上述1个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置或物镜的远点侧的焦点位置。

6.一种焦点位置决定装置，决定对准于试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置，其特征在于，具备：

光照射单元，向试料照射光；

焦点位置变更单元，变更物镜的焦点位置；

焦点位置计测单元，计测物镜的焦点位置；

试料摄像单元，对试料进行摄像；

特征量计算单元，基于由上述试料摄像单元拍摄的摄像图像，计算对摄像图像赋予特征的特征量；

控制单元，控制上述焦点位置变更单元、上述焦点位置计测单元、上述试料摄像单元以及上述特征量计算单元，使各个单元反复执行动作；

焦点位置选出单元，从通过上述控制单元使上述各个单元反复执行动作而储存的多个焦点位置中，基于通过上述反复执行而储存的多个特征量，选出至少1个选出焦点位置；

焦点位置决定单元，基于由上述焦点位置选出单元选出的选出焦点位置，决定对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置；

特征量比较单元，比较由上述特征量计算单元预先分别计算出的两个特征量；以及

焦点位置再决定单元，基于由上述特征量比较单元比较的结果，再次决定对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置；

在由上述焦点位置决定单元决定的焦点位置，用上述试料摄像单元不照明试料而对该试料进行摄像，基于所摄像的发光图像，由上述特征量计算单元计算出特征量；

利用上述焦点位置变更单元变更由上述焦点位置决定单元决定的焦点位置，在变更后的焦点位置用上述试料摄像单元不照明试料而对该试料进行摄像，并基于拍摄的发光图像，由上述特征量计算单元计算出特征量；

由上述特征量比较单元比较与上述决定的焦点位置对应的特征量和与上述变更后的焦点位置对应的特征量，在比较的结果是与上述变更后的焦点位置对应的特征量更大的情况下，利用上述焦点位置再决定单元将上述变更后的焦点位置，再次决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。

7.如权利要求6所述的焦点位置决定装置，其特征在于，

上述焦点位置选出单元从上述储存的多个焦点位置中，基于上述储存的多个特征量，选出两个选出焦点位置；

上述焦点位置决定单元基于由上述焦点位置选出单元选出的两个选出焦点位置，将该两个选出焦点位置的中央位置决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。

8.如权利要求7所述的焦点位置决定装置，其特征在于，

上述两个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置及物镜的远点侧的焦点位置。

9.如权利要求6所述的焦点位置决定装置，其特征在于，

上述焦点位置选出单元从上述储存的多个焦点位置中，基于上述储存的多个特征量，选出1个选出焦点位置；

上述焦点位置决定单元基于由上述焦点位置选出单元选出的1个选出焦点位置和预定的距离，将从该选出焦点位置离开该距离的位置，决定为对准于上述试料细胞内发出微弱光的发光蛋白质所局部存在的部位的物镜的焦点位置。

10.如权利要求9所述的焦点位置决定装置，其特征在于，

上述1个选出焦点位置是物镜的近点侧的焦点位置或物镜的远点侧的焦点位置。

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