DE10393248T5

DE10393248T5 - Verfahren zum Feststellen von Mikroorganismen oder Zellen

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Publication number: DE10393248T5
Application number: DE10393248T
Authority: DE
Inventors: Naohiro Yokosuka Noda; Takuya Yokosuka Onodera; Koji Ibaraki Maruyama; Takeshi Ibaraki Saika; Yasunobu Ibaraki Tanaka; Masao Nasu; Nobuyasu Ibaraki Yamaguchi
Original assignee: Nitto Denko Corp; Fuji Electric Systems Co Ltd
Current assignee: Fuji Electric Co Ltd
Priority date: 2002-09-05
Filing date: 2003-08-28
Publication date: 2005-09-08
Also published as: AU2003261795A1; WO2004022774A1; AU2003261795A8; JPWO2004022774A1; US20060148028A1

Abstract

Verfahren zum Markieren von Mikroorganismen oder Zellen, die in einer Probe enthalten sind, mit einem Färbemittel und Nachweis derselben durch Bildmessung, umfassend:
1) einen Schritt des Festhaltens der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen oder Zellen auf der Haftschicht eines Sammelblattes, das aus einer Substratschicht, die mindestens auf ihrer Oberfläche einen Fokusmarker zur Autofokussierung hat, und einer Haftschicht mit einer vorbestimmten Dicke, die auf der Oberfläche dieser Substratschicht aufgebracht ist, zusammengesetzt ist,
2) einen Schritt des Färbens der festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen mit einem Färbereagenz,
3) einen Schritt des Autofokussierens des Fokusmarkers,
4) einen Schritt des Bewegens mindestens Eines aus Licht empfangendem, optischen System für die Bildmessung oder Sammelblatt, ausgehend von der Fokusposition als einen Bezugspunkt durch die oben erwähnte Autofokussierung, um relativ die Strecke, die äquivalent ist zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht, um die Mikroorganismen oder Zellen auf der oben erwähnten Haftschicht zu fokussieren,...

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Markieren von Mikroorganismen oder Zellen, die in einer Probe enthalten sind, mit einem Färbereagenz und Nachweis derselben durch Messen deren Bilder. Die oben erwähnten Mikroorganismen umfassen Prokaryonten wie beispielsweise Mikroben, Actinomyceten und dergleichen, Eukaryonten wie Hefen und Schimmelpilze, Algen, Viren und so weiter. Die Zellen umfassen kultivierte Zellen, die von Tieren und Pflanzen abstammen, sowie Pollen von der japanischen Sicheltanne (Cryptomeria japonica) und der Hinoki-Scheinzypresse. Die Anwendungsgebiete der vorliegenden Nachweismethode umfassen medizinische Behandlung, Herstellung von Lebensmitteln, Wasserversorgung und -entsorgung.

Stand der Technik

Das Feststellen von Mikroorganismen oder Zellen von Tieren und Pflanzen in Proben ist industriell eine sehr wichtige Technik, beispielsweise zum Bestätigen einer Sterilität und zum Feststellen etwaiger Anomalien in den Lebensbedingungen von Zellen.

Das Verfahren, das bislang im Allgemeinen zum Nachweis von Bakterien und anderen Mikroorganismen oder Zellen verwendet worden ist, die auf der zu untersuchenden Fläche vorhanden sind und nicht mit bloßem Auge erkannt werden können, ist das Messen einer Kolonie, die durch das Kultivierungsverfahren entsteht, durch visuelles Fixieren mit dem bloßen Auge oder mit einem Mikroskop oder, anders ausgedrückt, durch Kopieren des auf der zu untersuchenden Fläche gefundenen Mikroorganismus auf ein Agarmedium, wobei das feste Agarmedium gegen die zu untersuchende Fläche gedrückt wird und die Mikroorganismen in einer geeigneten Umgebung auf dem Agarmedium, auf dem sie sich befinden, kultiviert werden. Beispielsweise kann das Agarstempelverfahren erwähnt werden, das auf der Verwendung von FOOD STAMP (Lebensmittelstempel) (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) beruht.

Das auf der Verwendung eines Membranfilters und dergleichen beruhende Membranfilterverfahren, mit dem Mikroorganismen gesammelt werden können, ist ein Verfahren des Messens eines Kolonie, bei dem Mikroorganismen gesammelt werden, während die zu untersuchende Fläche ausreichend mit Salzlösung, Phosphatpuffer und dergleichen abgespült wird und die Mikroorganismen frei gelegt werden und nachdem die Mikroorganismen auf dem Membranfilter gesammelt werden, während dieses gesammelte Spülmittel durch einen Membranfilter gefiltert wird, werden die Mikroorganismen und das flüssige Kulturmedium in ausreichend engen Kontakt gebracht, um auf dem Filter eine Kolonie zu bilden. Das Membranfilterverfahren kann als ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen verwendet werden, ohne diese zu kultivieren, indem die auf dem Filter festgehaltenen Mikroorganismen in Kontakt mit einer geeigneten Färbelösung gebracht werden und die Anzahl der gefärbten Zellen mit einem Mikroskop und dergleichen gemessen wird.

Allerdings sind das Agarstempelverfahren und dergleichen, bei denen ein Agarstempel in der Regel nur einmal auf einer zu untersuchenden Fläche verwendet wird, aufgrund einer variablen Sammeleffizienz je nach Feuchtigkeitsanteil des Agarmediums hinsichtlich der Reproduzierbarkeit unterlegen, und dies ergibt Unzulänglichkeiten in Bezug auf die Effizienz des Sammelns von Mikroorganismen. Ein häufiges Problem bei dem Kultivierungsverfahren ist auch, dass Mikroorganismen gegenseitig kontaminiert sind, und die Unmöglichkeit einer Reinkultur aufgrund der gegenseitigen Aktionen unter den Mikroorganismen auf dem Medium bewirkt manchmal Unzulänglichkeiten bei der späteren Beurteilung. Außerdem könnte das Aufbringen des Agarmediums auf die zu untersuchende Fläche die zu untersuchende Fläche kontaminieren. Darüber hinaus besteht eine Einschränkung, dass das Kulturverfahren natürlich auf lebende Zellen begrenzt ist und eine bestimmte Anzahl von ausgelassenen Nachweisen beinhaltet. Da es erforderlich ist, einen Tag oder zwei Tage oder mehr für den Zellkulturzeitraum einzuräumen, war eine wichtige Einschränkung des Kulturverfahrens, dass es unmöglich war, Mikroorganismen in Echtzeit zu überwachen.

Obwohl es bei dem Membranfilterverfahren möglich ist, ein flüssiges Untersuchungsobjekt, wie beispielsweise eine flüssige Lösung, zu filtrieren, hatte auch dieses Verfahren einen Nachteil, insofern als es bei nicht flüssigen Untersuchungsobjekten erheblichen menschlichen Aufwand erfordert, um Mikroorganismen zu sammeln, einschließlich Sammeln mittels eines Applikators, Herstellen einer Waschlösung zum Freilegen der Mikroorganismen und dergleichen. Darüber hinaus bewirkten die Wasch- und Filtervorgänge ein Anschwellen der gesammelten Stoffe, bei denen es sich nicht um Mikroorganismen handelte, und dies behinderte die nachfolgenden Beobachtungen und Messungen.

Kürzlich wurde ein Mikroorganismustestverfahren vorgeschlagen, um Mikroorganismen auf der Oberfläche eines Festkörpers sofort und einfach festzustellen, bei dem eine hauptsächlich aus wasserlöslichem Polymer bestehende Haftschicht auf die zu untersuchende Oberfläche gepresst und abgezogen wird, um die auf der Oberfläche des Festkörpers gefundenen Mikroorganismen zu sammeln, dann eine wässrige Lösung, die eine oder mehrere Arten einer chromogenen Substanz oder von chromogenen Substanzen enthält, die Mikroorganismen färben können, in Kontakt mit der Oberfläche der Haftschicht gebracht wird und die Anzahl der gefärbten Zellen beobachtet und gezählt wird (Bildmessung) (siehe beispielsweise die offengelegte japanische Patentanmeldung 10-70976 ).

Dabei handelt es sich allerdings um Fälle einer Bildmessung, die mittels eines manuell fokussierten Mikroskops oder einer ähnlichen Bilderfassungsvorrichtung durchgeführt wird, und aufgrund einer geringen Fokustiefe bei Verwendung einer starken Vergrößerung dauert es häufig lange, um den Fokus einzustellen. Daher waren automatische Fokussierung und automatische Messung wünschenswert.

Was ein Verfahren der Fluoreszenzbildmessung betrifft, welches die oben erwähnte automatische Fokussierung beinhaltet, ist von einigen der Erfinder der vorliegenden Erfindung mit der japanischen Patentanmeldung 2002-30648 eine Anwendung für das Verfahren der Fluoreszenzbildmessung eingereicht worden.

1 zeigt ein Beispiel einer Vorrichtung zum Durchführen des in der japanischen Patentanmeldung 2002-30648 beschriebenen Verfahrens. Entsprechend der in 1 gezeigten Vorrichtung umfasst das Verfahren der Fluoreszenzbildmessung mit automatischer Fokussierung, die auf durch ein Bilderfassungsmittel erhaltener Bildinformation beruht, das Abstrahlen eines Auto-Fokus (AF)-Lichts, das im Wellenlängenbereich der Messung von Fluoreszenzbildern strahlt, von einer Lichtquelle 2 von derselben Seite wie die Seite der Abstrahlung eines Anregungsstrahls, wie gezeigt, bevor Probe 1 mit dem Anregungsstrahl von der Anregungsstrahlquelle 10 bestrahlt wird, wobei der Fokussierungsgrad ausgehend von der dabei erhaltenen Bildinformation beurteilt wird, wobei mindestens Eine der Proben 1 oder das Lichtaufnahmesystem als Reaktion auf den Fokussierungsgrad dazu angetrieben wird, die Position des Fokus zu suchen, wobei die Abstrahlung des Strahls zur AF angehalten wird, sobald die Position des Fokus erreicht ist, und dann Probe 1 mit dem Anregungsstrahl von Lichtquelle 10 bestrahlt wird. So kann eine Fluoreszenzbildmessung durchgeführt werden. Diese Vorrichtung, die kein durchdringendes Licht verwendet, macht es möglich, Proben zu messen, die auf der Oberfläche des Membranfilters gesammelt sind.

Als Lichtquelle 2 für AF sind eine Licht emittierende Diode oder ein Halbleiterlaser bevorzugt. Während der Abstrahlung des AF-Strahls wird das Bild von Proben durch ein Bilderfassungselement 7 durch ein Objektiv 5, einen dichromatischen Spiegel 3, einen Filter auf der Aufnahmeseite für Fluoreszenzlicht 4 und eine Bild gebende Linse 6 erfasst. Als Bilderfassungselement sind ein Element für eine CCD-Kamera oder ein Element für eine CMOS-Kamera bevorzugt. Von dem Bilderfassungselement 7 erhaltene Bilder werden zum Rechnerteil 8 gesendet, wo der Kontrast bewertet wird. Zur Kontrastbewertung wird beispielsweise der Unterschied der Luminiszenz zwischen benachbarten Pixeln berechnet und dies erfolgt mit dem allgemeinen AF-Verfahren, wobei die Position des maximalen Kontrastes als Position der Fokussierung betrachtet wird.

In 1 gibt 9 einen Plattformtransfermechanismus wieder, 11 gibt einen Kondensator des Anregungsstrahls wieder, 12 gibt einen optischen Filter wieder und 13 gibt einen optischen Filterblock für Fluoreszenzlicht wieder. Zur oben erwähnten Kontrastbewertung, obwohl in 1 nicht gezeigt, gibt die japanische Patentanmeldung 2002-30648 das Verfahren des Markierens auf der Oberfläche eines Glasobjektträgers zum Halten der Probe oder des Markierens auf der Oberfläche eines Membranfilters zum Filtern und Sammeln der Probe an (Einzelheiten siehe japanische Patentanmeldung 2002-30648 ). Entsprechend dem oben erwähnten Verfahren ermöglicht die Anwendung eines einfachen Mechanismus mit einer eingeschränkten Anzahl von Elementen, das optische Dämpfen (Quenchen) der Probe aufgrund der Strahlung des Anregungsstrahls zu vermeiden, das es unmöglich macht, dieselbe festzustellen und das Auto-Fokus (AF)-Verfahren auf Proben, die auf der Oberfläche von Membranfiltern gesammelt sind, und auf Proben mit schwachem Kontrast anzuwenden.

Dennoch hat selbst die in der oben beschriebenen, japanischen Patentanmeldung 2002-30648 beschriebene Erfindung das folgende Problem.

Da die AF-Markierung auf der Oberfläche des Glasobjektträgers zum Halten der Probe oder auf der Oberfläche des Membranfilters zum Filtern und Sammeln der Probe vorgesehen ist, stellt der Marker dicht bei den Mikroorganismen und anderen Proben eine optische Störung dar, welche bewirkt, dass die Genauigkeit der Messung abnimmt, wenn ein Anregungsstrahl abgestrahlt wird, um eine Fluoreszenzbildmessung vorzunehmen.

In anderen Worten wird der Marker auf der Oberfläche des Membranfilters, der die Probe trägt, beim Betrachten des Bilds von Mikroorganismen oder Zellen auf dem Bild gespiegelt und stellt eine Hintergrundstörung dar, die genaue Messungen verhindert. Die oben erwähnte Störung ist vor allem beim Betrachten von schwachem Licht, das von Mikroorganismen oder Zellen abgestrahlt wird, ein erhebliches Problem. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf für ein Verfahren zum Verhindern der Reflektion von Markern auf Probenhaltern (Fokusmarkern) und zum Unterdrücken von Störungen.

Die in der oben erwähnten japanischen Patentanmeldung 2002-30648 beschriebene Erfindung betraf auch hauptsächlich flüssige Proben und beruht auf dem Prinzip, dass Mikroorganismen und dergleichen, die auf der Oberfläche von Festkörpern vorkommen, mit einem Applikator und dergleichen wie oben beschrieben als Probe abgenommen werden und in Proben von Flüssigkeit überführt werden, in welcher sie verteilt werden. Es ist daher unmöglich, Mikroorganismen, die auf der Oberfläche von Festkörpern vorkommen, in Echtzeit einfach zu überwachen und sie automatisch zu fokussieren und zu messen.

Die vorliegende Erfindung wurde umgesetzt, indem die obigen Gesichtspunkte in Betracht gezogen wurden und es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen bereit zu stellen, das Mikroorganismen, die auf der Oberfläche von Festkörpern vorkommen, in Echtzeit einfach überwachen kann und konzipiert ist, um die Genauigkeit automatischer Fokussierung und Messung zu verbessern.

Offenbarung der Erfindung

Um die oben erwähnten Aspekte zu lösen, umfasst die vorliegende Erfindung in dem Vorgang des Markierens von Mikroorganismen oder Zellen in einer Probe (einschließlich des Falles des gemeinsamen Vorhandenseins der beiden) mit einem Färbereagenz und deren Feststellen durch Bildmessung die folgenden Schritte (Erfindung von Anspruch 1 hiervon).

1) Einen Schritt des Festhaltens von Mikroorganismen oder Zellen in der oben erwähnten Probe auf der Haftschicht eines Sammelblattes, das aus einer Substratschicht, die auf ihrer Oberfläche mindestens einen Fokusmarker zur Autofokussierung hat, und einer Haftschicht mit einer vorbestimmten Dicke, die auf der Oberfläche dieser Substratschicht angeordnet ist, zusammengesetzt ist.
2) Einen Schritt des Färbens der Mikroorganismen oder Zellen, die wie oben erwähnt festgehalten sind, mit einem Färbereagenz.
3) Einen Schritt des Autofokussierens des oben erwähnten, fokussierenden Markers.
4) Einen Schritt des relativen Bewegens von mindestens einem aus Licht empfangendem, optischen System für die Bildmessung und Sammelblatt um die Strecke, die äquivalent ist zur vorbestimmten Dicke der Haftschicht, von der Fokusposition durch die oben erwähnte Autofokussierung aus als Bezugspunkt, und Fokussieren auf die Mikroorganismen oder Zellen, die auf der oben erwähnten Haftschicht gefunden werden, und
5) Einen Schritt des Strahlens von Licht auf die Oberfläche der Haftschicht, die in Fokus gebracht worden ist, Messen der Bilder und Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen.

Entsprechend dem oben beschriebenen Nachweisverfahren ist es möglich, auf der Oberfläche von Festkörpern vorhandene Mikroorganismen auf der oben erwähnten Haftschicht des Sammelblattes einfach festzuhalten. Aufgrund des Vorhandenseins einer Haftschicht zwischen dem Fokusmarker auf der Substratoberfläche und den Mikroorganismen oder Zellen erzeugt der Fokusmarker auf der Substratoberfläche bei Bildmessungen außerdem keine optischen Störungen, und es können deutliche Bilder der festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen erhalten werden, und daher können die Mikroorganismen oder Zellen mit hoher Genauigkeit gemessen werden. Der oben erwähnte Fokusmarker auf der Substratoberfläche kann außerdem durch Sandstrahlen, Drucken oder andere Oberflächenbehandlungen oder durch Erzeugen optischer Muster durch Mischen von Quarz und anderen unlöslichen Körnern geformt werden. Die Einzelheiten dieser Maßnahmen sind unten beschrieben.

Nach Anspruch 1 umfasst die Erfindung das Festhalten von Mikroorganismen oder Zellen auf der Haftschicht und nachfolgendes Färben derselben. Sie können jedoch auch, wie unten beschrieben, vor ihrem Festhalten gefärbt werden. Mit anderen Worten umfasst der in Anspruch 1 beschriebene Nachweisvorgang anstelle der oben beschriebenen Schritte 1) und 2) die folgenden Schritte (Erfindung nach Anspruch 2).

1) Einen Schritt des Färbens der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen oder Zellen im Voraus mit einem Färbereagenz.
2) Einen Schritt des Festhaltens der vorab mit dem Färbereagenz gefärbten, in der Probe vorhandenen Mikroorganismen oder Zellen auf der Haftschicht eines Sammelblattes, das aus einer Substratschicht, die auf ihrer Oberfläche mindestens einen Fokusmarker zur Autofokussierung hat, und einer Haftschicht mit einer vorbestimmten Dicke, die auf der Oberfläche dieser Substratschicht abgeschieden ist, zusammengesetzt ist.

Und in dem Fall, in dem die Fluoreszenzbeobachtungsbilder von Mikroorganismen oder Zellen erhalten werden, wie in der Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, ist die Erfindung nach Anspruch 3, der unten beschrieben ist, bevorzugt. Mit anderen Worten ist in dem Nachweisvorgang nach Anspruch 1 oder 2 das oben erwähnten Fluoreszenzreagenz als ein Färbereagenz gewählt und das Anregungslicht wird auf die oben erwähnte Haftschicht gestrahlt, um Fluoreszenzbildmessungen durchzuführen, und darüber hinaus ist das Strahlungslicht zum Autofokussieren beim Autofokussieren auf den oben erwähnten Fokusmarker ein Licht, das im optischen Wellenlängenband eine Wellenlänge für die oben erwähnte Fluoreszenzbildmessung enthält (Erfindung nach Anspruch 3).

Die Bedeutung der Auswahl eines Lichts, das im optischen Wellenlängenband eine Wellenlänge für die oben erwähnte Fluoreszenzbildmessung enthält, als das Strahlungslicht für das oben erwähnte Autofokussieren ist, dass es beabsichtigt ist, etwaige Fokussierungsfehler zu begrenzen während des Fokussierens auf den Fokusmarker und des Fokussierens auf Mikroorganismen oder Zellen.

In dem Nachweisvorgang nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst die oben erwähnte Haftschicht darüber hinaus ein nicht wasserlösliches Haftmittel (Erfindung nach Anspruch 4). Diese Anordnung kann verhindern, beispielsweise wenn Mikroorganismen oder Zellen mit einer fluoreszierenden Substanz markiert sind, dass die fluoreszierende Substanz beim Durchdringen der Haftschicht Schwierigkeiten hat, dass die Haftschicht sich auflöst, was eine Bewegung der festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen bewirkt, und dass sich die Dicke und die Abmessungen der Haftschicht dadurch verändern.

In dem Nachweisvorgang nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oben sollte die vorbestimmte Dicke der Haftschicht darüber hinaus größer als die Fokustiefe des optischen Systems sein (Erfindung nach Anspruch 5). Dadurch wird es möglich, so zu messen, dass der Fokusmarker während der Betrachtung von Mikroorganismen oder Zellen nicht als Hintergrundstörung reflektiert wird.

Als eine Ausführungsform, die sich von der Erfindung des oben erwähnten Fokusmarkers unterscheidet, ist es möglich, Dinge wie in der Erfindung nach Anspruch 6, der unten beschrieben ist, anzuordnen. In dem Nachweisvorgang nach einem der Ansprüche 1 bis 5 sollte insbesondere der Fokusmarker "auf der Rückseite oder innerhalb der Substratschicht" anstelle von "auf der Oberfläche der Substratschicht" bereit gestellt sein und "der Schritt des Bewegens um eine Strecke, die äquivalent zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht ist" in Schritt 4) oben sollte durch "den Schritt des Bewegens um eine Strecke, die äquivalent zum Wert der Strecke ist, die erhalten wird, indem der Wert der Strecke von der Oberfläche der Substratschicht bis zu der Position des Fokusmarkers zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht addiert wird" ersetzt werden (Erfindung nach Anspruch 6).

Der Fokusmarker auf der Rückseite des Substrats sollte gedruckt oder mit anderen Mitteln der Oberflächenbehandlung behandelt sein und wenn er sich innerhalb der Substratschicht befindet, kann er durch Erzeugen eines optischen Musters durch Mischen von Siliziumoxid und anderen unlöslichen Körnern geformt sein. Im Falle der Erfindung nach Anspruch 6 ist es aufgrund des Vorhandenseins der zwei unterschiedlichen Materialien von Haftschicht und Substratschicht und einem relativ größeren Wert der optischen Strecke allerdings wünschenswert, die Strecke der Bewegung in Abhängigkeit vom Brechungsindex eines jeden der unterschiedlichen Materialien gegebenenfalls zu korrigieren, insbesondere in der optischen Passage von der Oberfläche der Haftschicht zum Fokusmarker. Was die Tiefenschärfe anbelangt, ist es lediglich erforderlich, die Strecke, die durch Addieren des Wertes der Strecke von der Oberfläche der Substratschicht zu der Position des Fokusmarkers zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht erhalten wird, größer als den Wert der Fokustiefe des optischen Systems zu machen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine Abbildung, die ein Beispiel einer Anordnung einer Fluoreszenzbildmessungsvorrichtung zeigt, welche eine Autofokussierung beinhaltet, die in der japanischen Patentanmeldung 2002-30648 beschrieben ist.

Die beste Art und Weise der Durchführung der Erfindung Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Sammelblatt umfasst eine Haftschicht, die hauptsächlich aus einer auf der Substratschicht aufgebrachten Polymerverbindung zusammengesetzt ist, und beinhaltet einen Fokusmarker aus unlöslichen Körnern in oder auf der Oberfläche (einschließlich der Grenzschicht zwischen der Substratschicht und der Haftschicht) oder auf der Rückseite der Substratschicht oder ein Reliefmuster auf der Oberfläche der Substratschicht.

Als ein Verfahren zum Erzeugen eines Fokusmarkers auf der Oberfläche oder der Rückseite der Substratschicht können das Verfahren des Pressens, um ein Relief zu erzeugen, oder des Gießens zum Zeitpunkt des Herstellens des Films für die Substratschicht, das Verfahren des Sandstrahlens oder das Durchführen ähnlicher Behandlungen der Oberfläche der Substratschicht, das Verfahren des Druckens auf die Oberfläche der Substratschicht und dergleichen erwähnt werden. Wenn die Oberfläche der Substratschicht in ein Relief gebracht wird, indem die Substratschicht zum Zeitpunkt des Formens des Films für die Substratschicht stranggepresst, gegossen, sandgestrahlt oder anders behandelt wird, ist die bevorzugte Tiefe des Reliefs zwischen 0,5 und 20 μm.

Was das Druckverfahren des Fokusmarkers angeht und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass der Bildkontrast zum Zeitpunkt des Fokussierungsvorgangs beurteilt wird, ist ein flacher, überall vorhandener Druck nicht geeignet und lineare, karierte oder Punktmuster sind bevorzugt. Und zum Zeitpunkt des Erhaltens der Bilder ist ein Muster mehr bevorzugt, von dem mindestens eine Grenzlinie im Sichtfeld sichtbar ist oder das eine sich verändernde Farbe hat.

Und wenn ein Fokusmarker in dem Substrat bereit gestellt ist, kann das Harz, das den Film der Substratschicht ausmacht, durch Mischen unlöslicher Körner hergestellt sein. Als unlösliche Körner sind Körner aus Kalziumcarbonat, Titanoxid, Ruß, Quarz, Polystyrol, Talk, Asbest, Glimmer, Ton, Cellulose, Stärke und dergleichen angezeigt, und es werden bevorzugt Körner mit einem durchschnittlichen Korndurchmesser von 0,5 bis 20 μm verwendet. Diese unlöslichen Körner können durch Luftblasen oder Kohlendioxidblasen ersetzt werden.

Solch ein Fokusmarker kann innerhalb der Substratschicht, auf der Oberfläche oder auf der Rückseite der Substratschicht des Sammelblattes abgelegt sein und diese können verdoppelt sein. Beispielsweise können gemischte unlösliche Quarzkörner auf der Oberfläche der Substratschicht verteilt sein, um auf der Oberfläche der Substratschicht als Fokusmarker zu dienen.

Die oben erwähnte Haftschicht ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, sie hat ausreichende Kraft, um Mikroorganismen oder Zellen auf der zu untersuchenden Oberfläche festzuhalten, und dass es sich dabei um eine Schicht mit einer ebenen Oberflächenstruktur handelt, von der sich das Haftmittel nicht ablöst, selbst wenn es zum Färben von Mikroorganismen oder Zellen in eine wässrige Lösung eingetaucht wird. Wenn jedoch Mikroorganismen oder Zellen mit einer fluoreszierenden Substanz markiert sind, damit es für die fluoreszierende Substanz schwierig wird, in die Haftschicht einzudringen, oder um zu verhindern, dass sich die Haftschicht ablöst, was bewirkt, dass sich die festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen bewegen, und auch um zu verhindern, dass sich der Wert der Dicke der Haftschicht ändert, ist es bevorzugt, ein wasserunlösliches Haftmittel als hauptsächlichen Bestandteil der Haftschicht zu wählen.

Als das wasserunlösliche Haftmittel können beispielsweise Acrylhaftmittel, Gummihaftmittel und Silikonhaftmittel verwendet werden. Vom Standpunkt des Reduzierens der Einflüsse auf optische Merkmale zum Zeitpunkt des Erhaltens von Fluoreszenzbildern ist die Verwendung eines hoch transparenten und nicht fluoreszierenden Acrylhaftmittels oder Silikonhaftmittels für die Substratschicht und die Haftschicht bevorzugt.

Als Acrylhaftmittel können solche genannt werden, die als Monomer hauptsächlich aus einem Alkylester von (Meth)acrylsäure, wie beispielsweise Ethyl(meth)acrylat, Propyl(meth)acrylat, Butyl(meth)acrylat, Hexyl(meth)acrylat, Octyl(meth)acrylat, 2-Ethylhexyl(meth)acrylat, Nonyl(meth)acrylat oder Decyl(meth)acrylat, zusammengesetzt sind und damit copolymerisiert sind, eines oder mehr hydrophile Monomere wie beispielsweise (Meth)acrylsäure, Itaconsäure, Maleinsäure, Hydroxyethyl(meth)acrylat, Methoxyethyl(meth)acrylat, Ethoxyethyl(meth)acrylat, Butoxyethyl(meth)acrylat oder Ethyleneglycol(meth)acrylat. Und es ist bevorzugt, eine solche Haftschicht durch eine Behandlung mit einem thermisch quervernetzenden Mittel, wie beispielsweise einer Isocyanatverbindung, einem organischen Peroxid, einer epoxidgruppenhaltigen Verbindung oder einer Metallchelatverbindung, oder eine Behandlung mit ultravioletter Strahlung, Gammastrahlen, Elektronenstrahl oder dergleichen querzuvernetzen, um seine Hafteigenschaften zu verstärken.

Als Gummihaftmittel können solche genutzt werden, die als Hauptpolymer Naturkautschuk, Polyisobutylen, Polyisopren, Polybuten, Styrolisopren-Block-Copolymer, Styrolbutadien-Block-Polymer und dergleichen und darin eingebaut ein Harz zum Klebrigmachen umfassen, wie beispielsweise ein Kolophoniumharz, ein Terpenharz, ein Coumaron-Inden-Harz, Terpen-Phenol-Harz, ein Petroleumharz und so fort. Für das Silikonhaftmittel kann als Beispiel ein Haftmittel genannt werden, das hauptsächlich aus Dimethylpolysiloxan zusammengesetzt ist.

Aus der Sicht der Haftfähigkeit auf der zu untersuchenden Oberfläche, der Verfolgbarkeit und Sammelbarkeit von Mikroorganismen ist es bevorzugt, dass die Dicke einer solchen Haftschicht in einem Bereich von 5 bis 100 μm liegt. Und zum Zeitpunkt des Erhaltens der Fluoreszenzbilder der festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen ist es bevorzugt, dass die Glattheit (Abstand von der Spitze der konvexen Form bis zum Boden der konkaven Form) der Oberfläche der Haftschicht 20 μm oder weniger beträgt. Wenn die Rauheit 20 μm oder weniger beträgt, ist der Fokussierungsbereich des Mittels zum Erfassen des Fluoreszenzbilds erweitert, was es möglich macht, Bilder mit einer größeren Genauigkeit zu behandeln. Rauheit kann bestimmt werden, indem der Abschnitt des Haftblattes mit einem Oberflächenrauheitsmesser oder einem Elektronenmikroskop betrachtet wird und der Höhenunterschied von der Spitze der konvexen Form bis zum Boden der konkaven Form der Oberfläche des Haftmittels gemessen wird.

Das Material des Substrats des Sammelblattes ist nicht besonders eingeschränkt, solange es wasserunlöslich ist, keine wesentliche Rauheit auf der Oberfläche bildet, und es ein flexibles Material ist, das mit Druck auf einer gekrümmten Fläche oder einer Fläche von beispielsweise einem engen Raum frei fixiert werden kann. Im Speziellen sind Blätter, Filme, Gewebe, Vliesgewebe, Papier, das aus Polyester, Polyethylen, Polyurethan, Polyvinylchlorid zusammengesetzt ist, und Polyethylenpapierlaminat als Beispiele angezeigt. Als das Substrat sind insbesondere glatte Blätter und Filme, die aus Polyester, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Polyurethan, etc. zusammengesetzt sind, bevorzugt. Und auch die Dicke des Substrats ist nicht besonders eingeschränkt, solange es als Trägerkörper ausreichend fest ist, aber eine Dicke etwa im Bereich von 5 bis 200 μm ist bevorzugt.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Sammelblatt kann mit bereits bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise wird es hergestellt, indem eine Lösung, die eine in der Haftschicht verwendete makromolekulare Verbindung enthält, auf das Substrat aufgetragen wird und dieselbe bei einer Temperatur, die von Raumtemperatur bis 200°C reicht, getrocknet wird. Außerdem können auch das Kalendrierverfahren, das Gießverfahren und das Strangpressverfahren verwendet werden. wenn in dem Substrat ein Fokusmarker bereit gestellt ist, wird das Substrat hergestellt, indem die oben erwähnte Oberflächenbehandlung durchgeführt wird oder unlösliche Körner zugegeben werden und es ist bevorzugt, den Fokusmarker auf dem Substrat bereit zu stellen, bevor die Haftschicht aufgetragen wird. Das so erhaltene Blatt kann für die Verwendung in eine frei wählbare Form geschnitten werden.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist es möglich, das Sammelblatt durch Bestrahlung mit Strahlen wie beispielsweise Elektronenstrahlen oder Gammastrahlen zu sterilisieren und gleichzeitig die in der Haftschicht verwendeten Polymerverbindungen zu vernetzen. Und es ist auch möglich, das Sammelblatt mittels Ethylenoxid und anderen ähnlichen Gasen zu sterilisieren und den sterilen Zustand zu erhalten, indem das Sammelblatt in dem sterilisierten Zustand in einem Verpackungsmaterial, das Mikroorganismen abschirmt, eingeschlossen wird.

Für den Zweck der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Mikroorganismen" wie oben beschrieben Prokaryonten, wie beispielsweise Mikroben und Actinomyceten, Eukaryonten wie beispielsweise Hefen und Schimmelpilze, Algen, Viren und dergleichen, und der Begriff "Zellen" umfasst kultivierte Zellen, die von Tieren und Pflanzen abstammen, sowie Pollen von der japanischen Sicheltanne (Cryptomeria japonica) und der Hinoki-Scheinzypresse.

Entsprechend dem Nachweisvorgang der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Mikroorganismen oder Zellen, die nachgewiesen werden, mit einem oder mehreren Typen von chromogenen Substanzen oder Substanzen zu färben. Die chromogenen Substanzen sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie Farben entwickeln, indem sie mit den in den Mikroorganismen, die Gegenstand der Untersuchung sind, enthaltenen Zellkomponenten reagieren. Als Vertreter können Fluoreszenzfarbstoffe genannt werden, die Nukleinsäuren und Protein färben. Wenn generell Mikroorganismen Gegenstand der Untersuchung sind, können als spezifische chromogene Substanzen fluoreszierende Nukleinsäurebasenanaloga, Fluoreszenzfarbstoffe zum Färben von Nukleinsäure, Färbelösung zum Färben von Protein, bei der Gewebeanalyse von Protein verwendete, fluoreszierende Sonden, bei der Analyse von Zellmembran und Membranpotenzial verwendete Färbelösung, zum Markieren fluoreszierender Antikörper verwendete Färbelösung und dergleichen erwähnt werden, wenn aerobe Bakterien Gegenstand der Untersuchung sind, werden Färbelösungen und dergleichen erwähnt, die Farbe durch die Zellatmung entwickeln; wenn Eukaryonten Gegenstand der Untersuchung sind, werden eine Färbelösung zum Färben von Mitochondrien, eine Färbelösung zum Färben von Golgi-Körperchen, eine Färbelösung zum Färben des endoplasmatischen Retikulums erwähnt; wenn eine Färbelösung, die mit intrazellulärer Esterase und deren Modifikationsverbindungen reagiert, gegen weiterentwickelte, tierische Zellen gerichtet ist, werden eine Färbelösung, die für die Betrachtung von Knochengeweben genutzt wird, eine als Nervenzell-Tracer verwendete Färbelösung und dergleichen erwähnt, und durch diese Färbelösungen gefärbte Mikroorganismen oder Zellen können mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden.

Durch Auswahl der Art dieser chromogenen Substanzen lassen sich diese in einem sehr breiten Gebiet anwenden, welches einschließt die Messung der Gesamtanzahl von Zellen zum Feststellen aller Mikroorganismen, den Test des Färbens und Zählens nur der Mikroorganismen mit Atmungsaktivität, den Test des Färbens und Zählens nur der Mikroorganismen mit Esteraseaktivität oder den Test des Färbens und Zählens spezifischer Gattungen und Arten von Mikroorganismen durch Verwendung des Doppelbandenverfahrens, in dem eine Mehrzahl chromogener Substanzen verwendet wird, und so weiter.

In der vorliegenden Erfindung werden die Mikroorganismen oder Zellen, die an der zu untersuchenden Fläche haften, wirksam kopiert und festgehalten, indem das Sammelblatt auf die zu untersuchenden Flächen, einschließlich Boden, Wände, Nahrungsmittel, etc. gepresst wird. Wenn das Sammelblatt auf zu untersuchende Flächen gepresst wird, wo relativ wenige Mikroorganismen oder Zellen vorhanden zu sein scheinen, kann dieselbe Oberfläche des Sammelblattes mehrere Male darauf gepresst werden. Da der Vorgang der vorliegenden Erfindung keine Kultur wie im Fall des Agarstempelverfahrens erfordert, spielen die Kontamination von Kolonien und etwaige mögliche Veränderungen der Zellphase während der Zellkultur keine Rolle und daher können Mikroorganismen viele Male festgehalten werden. Es können daher viele Mikroorganismen oder Zellen festgehalten werden, indem die Anzahl der Pressvorgänge auf dieselbe Art und Weise erhöht wird, wie beim Filtern und Kondensieren der Mikroorganismen oder Zellen, die beim Membranfilterverfahren in Wasser verteilt werden.

Die Sammelblätter, auf denen Mikroorganismen oder Zellen gesammelt sind, werden dann wie erforderlich auf eine vorbestimmte Größe geschnitten, und die Oberfläche, auf der Mikroorganismen oder Zellen gesammelt sind, wird in eine wässrige Lösung getaucht, die eine chromogene Substanz zum Färben der Mikroorganismen oder Zellen enthält. Sollte es erforderlich sein, überschüssige chromogene Substanz zu entfernen, wird die Oberfläche, auf der Mikroorganismen oder Zellen gesammelt sind, mit sterilisiertem Wasser gewaschen und abgespült. Sollte es erforderlich sein, die Oberfläche, auf der Mikroorganismen oder Zellen gesammelt sind, zu trocknen, nachdem sie gefärbt worden sind, können sie durch Lufttrocknen, natürliches Trocknen oder Trocknung bei reduziertem Druck getrocknet werden.

Mikroorganismen oder Zellen werden gezählt und gemessen, indem ihre optischen Bilder mit einem optischen Mikroskop mit einer automatischen Fokussierungsfunktion, einem Lasermikroskop, einem Laser-Scanning-Site-Messgerät oder anderen geeigneten optischen Geräten erhalten und gemessen werden. Nun kommt die Leistung des Sammelblatts der vorliegenden Erfindung zur Geltung und ermöglicht die sofortige Bildmessung. In anderen Worten ist es möglich, die festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen zu fokussieren, indem der Fokus auf den Fokusmarker in dem Sammelblatt eingestellt wird, indem die automatische Fokussierungsfunktion genutzt und der Fokus von der Fokusposition innerhalb des Sammelblattes um die Dicke des Sammelblattes bis zur Oberfläche der Haftschicht verlagert wird. Da diese Vorgehensweise keine Kultivierung erfordert, können die auf der Haftfläche des Sammelblattes gefundenen Mikroorganismen wirksam innerhalb von mehreren Minuten oder von zehn oder einigen Minuten mehr nachgewiesen werden.

Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise auf Umweltuntersuchungen angewandt werden, um sofort die Reinheit der untersuchten Gegenstände zu messen, da die Sammelfläche auf die zu untersuchende Fläche aufgebracht wird, die auf der zu untersuchenden Fläche vorhandenen Mikroorganismen kopiert, die Mikroorganismen ohne vorherige Kultivierung gefärbt und die Mikroorganismen auf Einzelzellebene betrachtet werden können. Es ist ferner möglich und praktisch durchführbar, Mikroorganismen festzuhalten, indem das Sammelblatt mehrere Male auf die zu untersuchende Fläche aufgebracht wird, und sie zu konzentrieren, da sie auf Einzelzellebene festgehalten werden. Dieses Verfahren kann auf die Anwendungsgebiete der Umweltuntersuchung auf Mikroorganismen am Ort von medizinischen Behandlungen und Lebensmittelverarbeitung angewandt werden.

Das Folgende ist ein Beispiel einer Ausführungsform, in welcher die fluoreszierenden Betrachtungsbilder von Mikroorganismen oder Zellen, die mit dem oben beschriebenen Verfahren fluoreszierend gefärbt wurden, erhalten werden. Im Speziellen wird ein Reagenz, das durch die Esteraseaktivität der von dem Sammelblatt festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen fluoresziert, beispielsweise Carboxyfluoresceindiacetat (hiernach als "CFDA" bezeichnet), umgesetzt. Um die Fluoreszenzbilder der Mikroorganismen oder Zellen, die durch CFDA fluoreszierend gefärbt sind, zu erhalten, wird ein Autofokussierungslicht, das die Fluoreszenzwellenlänge von CFDA emittiert (beispielsweise 500 – 550 nm), auf das Sammelblatt gestrahlt. Nach dem Fokussieren auf den Marker auf dem Sammelblatt wird der Abstand zwischen dem Nachweisteil des optischen Systems und der Probe von dieser Position aus um eine Strecke bewegt, die der Dicke zwischen dem Fokusmarker und der Oberfläche der Haftschicht (beispielsweise 20 μm) entspricht, und der Fokus wird auf die Oberfläche der Haftschicht eingestellt. Ein Licht mit einer Wellenlänge, die CFDA anregen kann (beispielsweise 450 – 500 nm), wird auf das fokussierte Sammelblatt gestrahlt, um das Fluoreszenzbild der Oberfläche der Haftschicht zu erhalten. Von den dort erhaltenen Fluoreszenzbildern werden Mikroorganismen oder Zellen erkannt und festgestellt.

Ausführungsform
Die vorliegende Erfindung ist unten eingehender beschrieben, indem auf eine Mehrzahl von Ausführungsformen Bezug genommen wird. Diese sind jedoch lediglich Beispiele und schränken den Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise ein.
Ausführungsform 1
1) Fertigung eines Sammelblattes
Eine Toluollösung eines Copolymers mit einem Gelanteil von 40 (Gew./Gew.) wird erhalten, indem Isononylacrylat, 2-Methoxyethylacrylat und Acrylsäure (Eingabegewichtsverhältnis: 65/30/5) polymerisiert werden, wobei Azoisobutyronitril als ein Polymerisationsauslöser verwendet wird.
Auf einen Film eines 25 μm dicken transparenten Polyesters mit nicht haftender Oberfläche, die mit einem Sandpapier Nr. 1200 bis zu einer Tiefe von etwa 1 μm aufgeraut wird, und auf einen Polyesterfilm mit einer Dicke von 26 μm, zu dem pulverförmiges Quarz mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 5 μm gemischt wird, wird diese Lösung so aufgetragen, dass die Dicke, wenn trocken, 20 μm beträgt, und diese Filme werden für fünf (5) Minuten bei 130°C getrocknet.
Dann werden diese Filme mit Gammastrahlen mit einer Dosis mit 25 kGrey sterilisiert, um ein Sammelblatt herzustellen. Dabei stellt der Fall der Verwendung des pulverförmigen Quarzes als Fokusmarker die unten eingehender beschriebene Ausführungsform 1-1, und der Fall der Verwendung der Behandlung der Oberfläche des Substrates mit einem Sandpapier als Fokusmarker die unten eingehender beschriebene Ausführungsform 1-2 dar.
2) Festhalten und Färben von Mikroorganismen
0,1 ml Lösung, die erhalten wird, indem das Kulturmedium von Staphylococcus epidermidis IF03762 100 Mal mit sterilisiertem Wasser verdünnt wird, wird durch eine Polycarbonatmembran mit geraden Öffnungen mit einem Durchmesser von 0,4 μm gefiltert, und die auf der flachen Membran gefundenen und mit einem sterilisierten Phosphatpuffer gewaschenen Mikroorganismen werden als die Untersuchungsgegenstände herangezogen, und das nach Schritt 1) oben hergestellte Sammelblatt wird auf die Filteroberfläche gepresst und abgezogen. Dann wird ein Phosphatpuffer, der 0,1% 6-Carboxyfluoresceindiacetat enthält, als Färbelösung auf die Oberfläche getropft, wo die Mikroorganismen gesammelt sind. Nachdem die Oberfläche, auf der die Mikroorganismen festgehalten sind, drei (3) Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und gefärbt wurde, wird sie nochmals mit einem Phosphatpuffer gewaschen.
3) Zählen
Die Probenbilder werden mit einem optischen System erhalten, das mit einer CCD-Kamera als Bilderfassungsvorrichtung mit einer 10-fachen Vergrößerung ausgestattet ist. Diese Bildinformation diente als Basis für die Weiterbewegung mindestens einer der Spiegelzylinders des Lichtempfangssystems oder der Probenplattform durch den Rechner (Personal Computer) und zum Suchen der Fokusposition. Dafür ist es geeignet, einen Schrittmotor zu verwenden, der Positionen mit einer Auflösungsstärke von etwa 0,5–1 μm steuern kann. Durch Herstellen einer optischen Vorrichtung mit einem solchen Mechanismus (hiernach als "die Messvorrichtung" bezeichnet) wird die Anzahl der Mikroorganismen auf der Oberfläche, auf der Mikroorganismen auf dem Sammelblatt gesammelt sind, gezählt, wobei die gesammelten Mikroorganismen gefärbt sind.
Vor allem wird zunächst mindestens eine Röhre des optischen Systems oder die Probenplattform in Richtung einer Entfernung aus der Nähe des Substrats weiterbewegt und der Fokuspunkt, bei dem der Fokusmarker in Form des pulverförmigen Quarzes und dergleichen das erhaltene fokussierte Bild anzeigt, wird gespeichert. Nach weiterem Bewegen um eine vorbestimmte Strecke, beispielsweise 20 μm, bis zu dem Punkt, an dem die Fokussierung auf der Oberfläche der Haftschicht abgeschlossen ist, wird das Probenbild erhalten. In dem Falle einer Fluoreszenzbetrachtung ist es möglich, die Mikroorganismen oder Zellen als leuchtende Flecken auf dem Fluoreszenzbild zu identifizieren, indem ein Anregungsstrahl mit einer vorbestimmten Wellenlänge abgestrahlt wird.
Es ist ferner möglich zu messen, ohne dass der Fokusmarker zum Zeitpunkt des Betrachtens der Mikroorganismen oder Zellen als Hintergrundstörung reflektiert wird, indem der Wert des Abstands zwischen dem Fokusmarker und der Oberfläche der Haftschicht größer als die Tiefenschärfe des optischen Systems gemacht wird. Die Tiefenschärfe richtet sich nach der Blendeneinstellung des optischen Systems und bei einer normalen mikroskopischen Betrachtung beträgt diese einige μm. Demzufolge ist es möglich zu verhindern, dass der Fokusmarker auf dem erhaltenen Bild reflektiert wird und Hintergrundstörungen darstellt, indem der Abstand zwischen dem Fokusmarker und der Oberfläche der Haftschicht auf 20 μm eingestellt wird.
Die Anzahl von Mikroorganismen oder Zellen, die im Sichtfeld gefunden werden, können gezählt werden, indem das erhaltene Bild vermessen wird. Es ist ferner möglich, statistische Abweichungen zu verringern und genauer zu messen, indem entweder eine der Spiegeltrommeln oder die Probenplattform weiterbewegt werden, wobei verschiedene Positionen auf der Probe betrachtet und die Anzahl von Mikroorganismen oder Zellen in einer Mehrzahl von Sichtfeldern gezählt werden. In der vorliegenden Ausführungsform wurde die Probenplattform weiterbewegt, es wurden Bilder von insgesamt 70 Sichtfeldern erhalten und es wurde die dort vorhandene Anzahl von Bakterien gezählt. Anstelle einer verdünnten Kulturbrühe wurde außerdem eine sterilisierte Lösung als Untersuchungsgegenstand gewählt und die Haftoberflächen auf Sammelblättern, auf denen keine Mikroorganismen festgehalten wurden, wurden auf dieselbe Weise gemessen.
4) Datenanalyse
Dieselben Proben wie die in den oben erwähnten Messungen Verwendeten wurden mit dem Kulturverfahren gemessen, um sie mit der mit der vorliegenden Erfindung gemessenen Anzahl von Bakterien zu vergleichen. Mit dem Kulturverfahren wurden insgesamt 3.028/mm² gemessen. Das Messergebnis des Kulturverfahrens das als Bezugswert diente, wurde mit dem Messwert für die Anzahl von Zellen auf der Basis der vorliegenden Erfindung verglichen, mit anderen Worten, das Bakterien-Wiederfindungsverhältnis wurde ermittelt. Derselbe Wert wurde mit dem unten beschriebenen Fall verglichen, in dem kein Fokusmarker verwendet wurde (Vergleichsbeispiel 1).
Vergleichsbeispiel 1
Das Sammelblatt wurde auf dieselbe Weise wie Ausführungsform 1 hergestellt, außer, dass ein transparenter Polyesterfilm mit einer Dicke von 25 μm, der nicht behandelt wurde, auf dem Substrat vorhanden war, und Mikroorganismen wurden festgehalten, gefärbt und gewaschen.
In Tabelle 1 sind die Messergebnisse der Ausführungsformen und des Vergleichsbeispiels 1 gezeigt. In der Vermerkspalte von Tabelle 1 ist wie oben angegeben der Fall der Verwendung von pulverförmigem Quarz als Fokusmarker als die Ausführungsform 1-1 gezeigt, der Fall der Verwendung der Sandpapierbehandlung der Substratoberfläche als Fokusmarker ist als die Ausführungsform 1-2 gezeigt und die mit einem Suffix "a" markierten Fälle zeigen Fälle, in denen kein Mikroorganismus für die Untersuchung verfügbar war. Dasselbe gilt für das Vergleichsbeispiel 1. Tabelle 1
Wie Tabelle 1 eindeutig zeigt, arbeitete die automatische Fokussierungsfunktion auf dem Fokusmarker des Sammelblattes und S. epidermidis konnte in der Ausführungsform 1-1 und der Ausführungsform 1-2 gemessen werden. Der Grund, warum die Sammelblätter, die überhaupt keine Mikroorganismen festhalten (Ausführungsform 1-1a und Ausführungsform 1-2a), eine kleine Anzahl von Mikroorganismen nachweisen, ist, dass sich die Mikroorganismen und eine Störung durch Fluoreszenzkörner in der Umgebung der Messung eingeschlichen haben und dass diese sich als Fehler in der Bildverarbeitung bemerkbar gemacht haben. Die Messungen von 3.149/mm² und 2.846/mm² in Tabelle 1 scheinen Fehler einer ähnlichen Größenordnung zu enthalten.
In dem Fall von Vergleichsbeispiel 1, in dem kein Fokusmarker bereit gestellt war, wurde keine Fokussierung vorgenommen und es konnte keine Messung durchgeführt werden. Selbst wenn kein Fokusmarker verfügbar ist, werden die Proben selbst (beispielsweise festgehaltenes S. epidermidis) fälschlicherweise für Pseudo-Fokusmarker gehalten, die Gegenstand einer automatischen Fokussierung sein können.
In einem solchen Fall wird jedoch ein Probenbild an einer Position erhalten, die erzwungenermaßen um eine vorbestimmte Strecke (beispielsweise 20 μm) von der Fokussierungsposition entfernt verlagert ist, Mikroorganismen können nicht genau fokussiert werden und die Leuchtpunkte, die von den Mikroorganismen stammen, können im Bild nicht identifiziert werden. Wenn wie hier in dem Sammelblatt kein Fokusmarker bereit gestellt ist, kann auf den Proben keine geeignete Fokussierung vorgenommen werden und es wurde daher deutlich, dass es als Messsystem unvollständig ist.
Ausführungsform 2
Es wurde eine Vorgehensweise erwogen, die ähnlich zu der von Ausführungsform 1 war, außer, dass der zu testende Mikroorganismus Escherichia coli K-12 war und dass ein Sammelblatt einschließlich eines Substrats, in das Quarz gemischt wurde, verwendet wurde. Die Ergebnisse sind zusammen mit dem Vergleichsbeispiel 2 in Tabelle 2 gezeigt.
Kontrolle 2
Das Sammelblatt wurde auf dieselbe Weise wie Ausführungsform 2 hergestellt, außer, dass ein transparenter Polyesterfilm mit einer Dicke von 25 μm, der nicht behandelt wurde, auf dem Substrat vorhanden war, und es wurden Mikroorganismen festgehalten, gefärbt und gewaschen. Tabelle 2
In der Ausführungsform 2 funktionierte die automatische Fokussierungsform mit dem Fokusmarker des Sammelblattes und die Anzahl der E. coli K-12 Bakterien konnte gemessen werden. Allerdings variiert das Bakterien-Wiederfindungsverhältnis je nach Art der Bakterien aufgrund von Unterschieden in der Färbbarkeit durch das Reagenz (in der obigen Ausführungsform 2 6-Carboxyfluoresceindiacetat) und dem Einfluss des Probenzustandes und je nach Mikroorganismus. Im Falle von S. epidermidis der oben erwähnten Ausführungsform 1 hatte es einen Wert von fast 100%. Im Falle von E. coli K-12 der Ausführungsform 2 und dem unten beschriebenen Fall von E. coli 0157 war es fast 60%. In diesem Fall kann der Messwert der vorliegenden Erfindung durch das Bakterien-Wiederfindungsverhältnis in den echten Wert umgewandelt werden.
In dem Fall des Vergleichsbeispiels 2 ohne jeden Fokusmarker konnte die Fokussierung nicht beendet und keine Messung durchgeführt werden. Wenn also in dem Sammelblatt kein Fokusmarker bereit gestellt ist, ist das gesamte System als Messsystem ungeeignet, da keine Fokussierung möglich ist.
Ausführungsform 3
Es wurde der Mikroorganismus E. coli 0157 als zu testender Mikroorganismus gewählt und diese Ausführungsform auf dieselbe Weise wie Ausführungsform 2 untersucht. Was die Färbung anbelangte, wurde für die Bakterien FITC-markierter Antikörper gegen E. coli 0157 (hergestellt von KPL Inc., mit Phosphatpuffersalzlösung auf 0,05 mg/ml verdünnt) ausgewählt und nach fünf (5) Minuten Färben die Bakterien mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Die Ergebnisse sind zusammen mit dem folgenden Vergleichsbeispiel 3 in Tabelle 3 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 3
Das Sammelblatt wurde auf dieselbe Weise wie Ausführungsform 3 hergestellt, außer, dass ein transparenter Polyesterfilm mit einer Dicke von 25 μm, der nicht behandelt wurde, auf dem Substrat vorhanden war, und es wurden Mikroorganismen festgehalten, gefärbt und gewaschen. Tabelle 3
In der Ausführungsform 3 funktionierte die automatische Fokussierungsfunktion mit dem Fokusmarker des Sammelblattes und die Anzahl der E. coli O157-Bakterien konnte gemessen werden. Obgleich sich der Färbemechanismus der Mikroorganismen von dem in Ausführungsform 1 und Ausführungsform 2 unterschied, gab es bei der Feststellung keine Probleme.
In dem Fall des Vergleichsbeispiels 3 ohne jeden Fokusmarker konnte keine Fokussierung und daher auch keine Messung durchgeführt werden.
Ausführungsform 4
Die Kulturbrühe E. coli K-12 wurde angefärbt, gemessen und die Zeit, die zum Zählen einer frei gewählten Anzahl von Bakterien erforderlich war, wurde entsprechend dem in Ausführungsform 2 beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind zusammen mit dem unten gezeigten Vergleichsbeispiel 4 in Tabelle 4 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 4
Die Kulturbrühe von E. coli K-12 wurde wie erforderlich mit einem Phosphatpuffer verdünnt und es wurde 6- Carboxyfluoresceindiacetat dazu gegeben, so dass seine Enddichte 0,1% war, und es wurde für drei Minuten bei Raumtemperatur eine Färbung durchgeführt. Diese Lösung wurde durch eine Polycarbonatmembran gefiltert, um die Bakterien zu sammeln. Die Membran, welche die Bakterien sammelte, wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop unter einem blauen Anregungsstrahl bei einer 400-fachen Vergrößerung betrachtet und die Anzahl der fluoreszierenden Zellen wurden gezählt. Tabelle 4
Das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung benötigt nur 10 Minuten, um 20.000 oder mehr Bakterien zu analysieren.
Das in Vergleichsbeispiel 4 verwendete Verfahren erforderte andererseits 45 Minuten, um etwa 3.000 Bakterien zu zählen. Dies ist nicht der Schwierigkeit des Zählens von Hand zuzuschreiben, sondern der Notwendigkeit, das Sichtfeld des Fluoreszenzmikroskops während des Zählens zu ändern, und darüber hinaus der Zeit, die jedes Mal für die Durchführung des Fokussierens erforderlich ist.
Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum schnellen und einfachen Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen wirksam ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie oben entsprechend der vorliegenden Erfindung beschrieben werden die in Proben enthaltenen Mikroorganismen oder Zellen auf der Oberfläche der Haftschicht eines Sammelblattes festgehalten, das eine Substratschicht, welche auf der Oberfläche, der Rückseite oder innerhalb des Substrat einen Fokusmarker zum Autofokussieren enthält, eine Haftschicht mit einer vorbestimmten Dicke, die auf der Oberfläche dieser Substratschicht aufgetragen ist, umfasst; die Mikroorganismen werden vor oder nach ihrem Festhalten mit einem Färbereagenz gefärbt, und nachdem sie mithilfe des Fokusmarkers automatisch in Fokus gebracht worden sind, wird entweder mindestens eines aus Licht aufnehmendem optischen System zur Bildmessung und Sammelblatt durch diese Autofokussierung relativ um eine Strecke von der Fokussierungsposition als Bezugspunkt bewegt, die äquivalent zu der Strecke ist, welche erhalten wird, indem der Wert des Abstands von der Oberfläche der Substratschicht zur Position des Fokusmarkers zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht addiert wird (wenn der Fokusmarker auf der Oberfläche der Substratschicht bereit gestellt ist, ist der addierte Wert Null), die Mikroorganismen oder Zellen auf der Haftschicht werden in Fokus gebracht und ein Licht wird auf die Oberfläche der fokussierten Haftschicht gestrahlt, um Bilder zu messen und die Mikroorganismen oder Zellen festzustellen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es daher insbesondere, auf der Oberfläche von Festkörpern vorhandene Mikroorganismen einfach und in Echtzeit zu überwachen, und bietet darüber hinaus ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen mit einer verbesserten Genauigkeit des Messens einer automatischen Fokussierung.
ZUSAMMENFASSUNG
Ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen mit einer verbesserten Messgenauigkeit der automatisch fokussierten Messung, wobei in einer Probe vorhandene Mikroorganismen oder Zellen auf der Oberfläche der Haftschicht eines Sammelblattes, umfassend eine Substratschicht, die auf der Oberfläche, der Rückseite oder innerhalb des Substrats einen Fokusmarker enthält, eine Haftschicht, die eine vorbestimmte Dicke hat und auf der Oberfläche dieser Substratschicht aufgebracht ist, festgehalten werden, die Mikroorganismen oder Zellen vor oder nach ihrem Festhalten mit einem Färbereagenz gefärbt werden und, nachdem sie durch den Fokusmarker automatisch in Fokus gebracht worden sind, mindestens Eines des Licht empfangenden, optischen Systems für die Bildmessung oder des Sammelblattes um ausgehend von der Fokusposition als einen Bezugspunkt relativ um eine Strecke bewegt wird, die erhalten wird, indem der Wert der Strecke von der Oberfläche der Substratschicht zu der Position des Fokusmarkes zum Wert der Dicke der Haftschicht addiert wird, um die Mikroorganismen oder Zellen auf der oben erwähnten Haftschicht zu fokussieren. Die Mikroorganismen oder Zellen auf der Haftschicht werden automatisch fokussiert und ein Licht wird auf die Oberfläche der fokussierten Haftschicht gestrahlt, um das Bild zu messen und die Mikroorganismen oder Zellen nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es daher insbesondere, Mikroorganismen, die auf der Oberfläche von Festkörpern vorhanden sind, einfach und in Echtzeit zu überwachen, und bietet darüber hinaus ein Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen oder Zellen mit einer verbesserten Genauigkeit der automatischen Fokussierungsmessung.

1: Probe
2: Lichtquelle zum Autofokussieren
3: Dichromatischer Spiegel
4: Optischer Filter auf der Eingangsseite des
: Fluoreszenzlichts
5: Objektiv
6: Bildlinse
7: Bilderfassungselement
8: Rechnerteil
9: Plattformbewegungsmechanismus
10: Lichtquelle zum Anregen
11: Kondensatorlinse für Anregungsstrahl
12: Optischer Filter
13: Fluoreszenzfilterblock

Claims

Verfahren zum Markieren von Mikroorganismen oder Zellen, die in einer Probe enthalten sind, mit einem Färbemittel und Nachweis derselben durch Bildmessung, umfassend: 1) einen Schritt des Festhaltens der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen oder Zellen auf der Haftschicht eines Sammelblattes, das aus einer Substratschicht, die mindestens auf ihrer Oberfläche einen Fokusmarker zur Autofokussierung hat, und einer Haftschicht mit einer vorbestimmten Dicke, die auf der Oberfläche dieser Substratschicht aufgebracht ist, zusammengesetzt ist, 2) einen Schritt des Färbens der festgehaltenen Mikroorganismen oder Zellen mit einem Färbereagenz, 3) einen Schritt des Autofokussierens des Fokusmarkers, 4) einen Schritt des Bewegens mindestens Eines aus Licht empfangendem, optischen System für die Bildmessung oder Sammelblatt, ausgehend von der Fokusposition als einen Bezugspunkt durch die oben erwähnte Autofokussierung, um relativ die Strecke, die äquivalent ist zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht, um die Mikroorganismen oder Zellen auf der oben erwähnten Haftschicht zu fokussieren, und 5) einen Schritt des Strahlens von Licht auf die Oberfläche der Haftschicht, die in Fokus gebracht worden ist, und Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen durch Bildmessung.
Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte anstelle von Schritt 1) und 2). 1) Einen Schritt des Färbens der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen oder Zellen im Voraus mit einem Färbereagenz. 2) Einen Schritt des Festhaltens der im Voraus mit dem Färbereagenz gefärbten, in der Probe vorhandenen Mikroorganismen oder Zellen auf der Haftschicht eines Sammelblattes, das aus einer Substratschicht, die auf ihrer Oberfläche mindestens einen Fokusmarker zur Autofokussierung hat, und einer Haftschicht mit einer vorbestimmten Dicke, die auf der Oberfläche dieser Substratschicht aufgebracht ist, zusammengesetzt ist.
Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Färbereagenz ein fluoreszierendes Reagenz ist, bei dem ein Anregungslicht auf die Oberfläche der Haftschicht gestrahlt wird, um Fluoreszenzbildmessungen durchzuführen, und das Strahlungslicht zum Autofokussieren auf den oben erwähnten Fokusmarker ein Licht ist, das eine Wellenlänge im optischen Wellenlängenband für die oben erwähnte Fluoreszenzlicht-Bildmessung enthält.
Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Haftschicht ein wasserunlösliches Haftmittel umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht größer ist als die Tiefenschärfe des optischen Systems.
Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Fokusmarker "auf der Rückseite der Substratschicht oder innerhalb der Substratschicht" anstelle von "auf der Oberfläche der Substratschicht" bereit gestellt ist und das "Bewegen um eine Strecke, die äquivalent zu der Strecke ist, die erhalten wird, indem der Wert der Strecke von der Oberfläche der Substratschicht bis zu der Position des Fokusmarkers zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht addiert wird" anstelle von "Bewegen um eine Strecke, die äquivalent zum Wert der vorbestimmten Dicke der Haftschicht ist" in dem Schritt 4) verwendet wird.