DE60025504T2

DE60025504T2 - Reflektierende scheibennachweisvorrichtungen

Info

Publication number: DE60025504T2
Application number: DE60025504T
Authority: DE
Inventors: D. Peter Saint Paul WICKERT; G. Michael Saint Paul WILLIAMS; A. Christine Saint Paul BINSFIELD
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 2000-05-01
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2020-09-08
Also published as: US6900028B2; AU2000273553A1; AR028381A1; EP1278820B1; JP4748913B2; JP2003531602A; ATE315633T1; EP1278820A1; US6492133B1; US20030040034A1; WO2001083672A1; DE60025504D1

Description

Die Erfindung betrifft Scheibenuntersuchungsvorrichtungen, Systeme und Anwendungsverfahren zur Kultur biologischer Proben, um in den Proben vorkommende Mikroorganismen nachzuweisen und/oder zu spezifizieren.
Der Nachweis und die Spezifikation von Mikroorganismen wird in zahlreichen Situationen ausgeübt, einschließlich der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie (Test auf Verunreinigung von Nahrung durch Mikroorganismen wie etwa E. coli und S. aureus), der Gesundheitsvorsorgeindustrie (Test von Patientenproben und anderen klinischen Proben auf Infektion oder Verunreinigung), der Umweltkontrollindustrie, der pharmazeutischen Industrie und der kosmetischen Industrie.
Wachstumsbezogener Nachweis und Spezifikation von Mikroorganismen wird für gewöhnlich unter Verwendung entweder von flüssigen Nährmedien (Wahrscheinlichste Keimzahl-Analyse (MPN)) oder halbfesten Nährmedien (Agarpetrischalen) ausgeübt. Die Spezifikation unter Verwendung des flüssigen MPN Verfahrens wird typischerweise durch die Anordnung serieller 10-fach Verdünnungen einer interessanten Probe in Mehrfachansätzen von Röhren erreicht, welche selektive Medien und chemische Indikatoren enthalten. Die Röhren werden bei erhöhter Temperatur inkubiert (24–48 Stunden), gefolgt von einer Untersuchung auf ein Wachstum von Organismen. Eine statistische Formel, die auf dem Volumen der getesteten Probe und der Anzahl positiver und negativer Röhren für jeden Satz beruht, wird verwendet, um die Anzahl der in der anfänglichen Probe vorkommenden Organismen zu schätzen.
Diese Verfahren zur Ausführung der MPN Analyse weist mehrere Nachteile auf. Es ist arbeitsaufwendig aufgrund der vielfachen Verdünnungs- und Pipettierungsschritte, welche zur Ausführung der Analyse notwendig sind. Ferner ist es in der Praxis nur zweckmäßig Mehrfachan sätze von etwa drei bis fünf Röhren für jede Verdünnung zu verwenden. Demzufolge sind die 95 % Vertrauensgrenzen für eine MPN Schätzung auf mikrobielle Konzentration extrem breit. Beispielsweise weist eine MPN Schätzung aus drei Röhren von 20 95 % Vertrauensgrenzen zwischen 7 und 98 auf.
Im Gegensatz zu dem oben beschriebenen Verfahren kann eine Direktzählung lebender Mikroorganismen in einer Probe durch Ausbreitung der Probe über einen vorgegebenen Bereich unter Verwendung von Nährmedien, die ein Gelierungsmittel enthalten, erreicht werden. Das Gelierungsmittel (Agar) verhindert die Diffusion der Organismen während der Inkubation (24–48 Stunden), wobei eine Kolonie in dem Bereich gebildet wird, wo der ursprüngliche Organismus aufgebracht wurde. Jedoch besteht eine Grenze bezüglich der Anzahl von Kolonien, die auf einen vorgegebenen Bereich von Nährmedien passen, bevor die Fusion mit angrenzenden Kolonien das Auszählen erschwert. Dies macht üblicherweise die Ausführung mehrerer Verdünnungen für jede Probe erforderlich. Ferner sind die zur Identifikation einzelner Arten von Mikroorganismen, die in einer Mischpopulation vorkommen, verwendbaren Klassen chemischer Substanzen auf solche beschränkt, die ein Produkt erzeugen, welches in dem gelierten Medium unlöslich ist.
In einigen dieser Verfahren wird der Nachweis oder die Spezifikation eines Mikroorganismus durch Nachweis eines elekromagnetischen Signals, z.B. Fluoreszens, bestimmt, welches von einer Indikatorsubstanz auf Anregung hin abgegeben wird (wobei die Indikatorsubstanz durch das Vorkommen eines nachzuweisenden Mikroorganismus aktiviert wird). Die Anregung kann in Form elektromagnetischer Energie von z.B. einem Laser bereitgestellt werden. Ein potentielles Problem bekannter Untersuchungsvorrichtungen besteht darin, dass die zur Anregung verwendete elektromagnetische Energie auch andere im Trägermaterial oder in anderen Teilen der Vorrichtung vorkommende Materialien anregen kann, was diese zur Abgabe eines elektromagnetischen Signals veranlasst, welches dem von dem gewünschten Indikator abgegebenen ähnelt. Wenn die Untersuchung beispielsweise auf einem polymeren Trägermaterial gebildet wird, welches in denselben oder ähnlichen Wellenlängenbereichen fluoresziert wie der Indikator, kann durch das Trägermaterial ein relativ hohes Hintergrundsignal erzeugt werden, welches das Signal-zu-Hintergrund Verhältnis verringert. Ein niedrigeres Signal-zu-Hintergrund Verhältnis kann einen sorgfältigen Nachweis oder eine sorgfältige Spezifikation des gewünschten Mikroorganismus erschweren.
Die Patentschrift US-A-5,869,001 beschreibt ein Verfahren und einen Apparat zur quantitativen Analyse von Probenflüssigkeiten. Die Proben werden getrocknet und mit sichtbarem und/oder infrarotem Licht auf einem Probenträger aus Polystyrol bestrahlt, auf dem eine Metallfolie aufgebracht ist. Der Probenträger weist mehrere Kompressionen zur Unterstützung der Proben auf. Die von den getrockneten Proben reflektierte Strahlung wird reflektiert und durch eine Nachweisvorrichtung nachgewiesen. Eine an die Nachweisvorrichtung gekoppelte Analysevorrichtung analysiert die von der Nachweisvorrichtung erzeugten Abgabesignale zur quantitativen Analyse der Probe.
Die Patentschrift US-A-5,734,587 beschreibt einen Analyse- und Auswertungsvorgang für ein ähnliches wie in der Patentschrift US-A-5,869,001 offenbartes Verfahren.
Aufgabe der vorliegenden ist die Bereitstellung einer verbesserten Vorrichtung zur Kultur von Mikroorganismen sowie ein verbessertes Verfahren zur Kultur und zum Nachweis von Zielorganismen.
Zur Lösung der obigen Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung Vorrichtungen zur Kultur von Mikroorganismen bereit wie in den unabhängigen Ansprüchen 1 beziehungsweise 4 definiert, ein Verfahren zum Nachweis mindestens eines Mikroorganismus wie im unabhängigen Anspruch 14 definiert beziehungsweise ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur Kultur von Mikroorganismen wie in den unabhängigen Ansprüchen 17 und 18 definiert. Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf einzelne Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Ein Vorteil der Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die sich proximal zu jeder Scheibe befindlichen Reflektoren die auf die Scheiben gerichtete Anregungsenergie reflektieren können, nachdem diese die Scheiben passiert hat. Demzufolge wird die effektive Weglänge der Anregungsenergie durch die Scheiben im Vergleich zu Untersuchungsvorrichtungen, bei denen die Anregungsenergie nicht reflektiert wird nachdem sie die Scheiben passiert hat, verdoppelt. Die erhöhte Weglänge kann die Genauigkeit des Nachweises und/oder der Spezifikation der Mikroorganismen durch effektive Erhöhung der Intensität der Anregungsenergie verbessern.
Ein weiterer potentieller Vorteil der Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung besteht darin, dass die Reflektoren das Signal-zu-Hintergrund Verhältnis während des Nachweises und/oder der Spezifikation der Zielmikroorganismen verbessern können. In einigen Fällen verringern oder verhindern die Reflektoren vorzugsweise die Übertragung der Anregungsenergie auf das darunterliegende Trägermaterial. In anderen Fällen können die Reflektoren die Übertragung elektromagnetischer Energie ausgehend von z.B. dem Trägermaterial verringern oder verhindern, welche der elektromagnetischen Signalenergie ähnelt, das z.B. von einer Indikatorsubstanz als Reaktion auf die Anregungsenergie abgegeben wird. In jedem Fall kann in Gegenwart der Reflektoren die von der Untersuchungsvorrichtung abgegebene elektromagnetische Signalenergie mit höherer Genauigkeit das Vorkommen der Zielmikroorganismen anzeigen und nicht das darunterliegende Trägermaterial oder andere Teile der Vorrichtung.
Das Signal-zu-Hintergrund Verhältnis kann weiter verbessert werden, wenn die Reflektoren ebenso die elektromagnetische Signalenergie reflektieren, die als Folge des Vorkommens der Zielmikroorganismen innerhalb der oder auf den Scheiben erzeugt wird. Wenn sich die Reflektoren auf der dem Detektor gegenüberliegenden Seite der Scheiben befinden, kann mindestens ein Teil der elektromagnetischen Signalenergie, welche in Richtung der Reflektoren abgegeben wird, in Richtung des Detektors zurück reflektiert werden, wodurch die Intensität der abgegebenen Signalenergie potentiell verbessert wird. Erhöhungen der Intensität der abgegebenen Signalenergie können die Nachweisgenauigkeit verbessern sowie, in einigen Fällen, auch den Nachweis der Zielmikroorganismen nach kürzeren Inkubationsperioden gestatten.
Hinsichtlich der Anregungs-/Nachweissysteme der vorliegenden Erfindung, welche reflektierende Wände aufweisen, besteht ein potentieller Vorteil darin, dass die Reflektivität der Wände die Gleichmäßigkeit der Anregung der Untersuchungsvorrichtungen, von denen Proben genommen werden, verbessern kann.
Diese und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in Verbindung mit den folgenden veranschaulichenden Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.
Der hier verwendete Begriff „Mikroorganismus" umfasst sämtliche mikroskopische lebende Organismen und Zellen, einschließlich ohne Einschränkung Bakterien, Mycoplasmen, Rickettsien, Spriochaeten, Hefen, Schimmelpilze, Protozoen sowie mikroskopische Formen eukaryotischer Zellen, beispielsweise Einzelzellen (in Kultur oder direkt aus einem Gewebe oder Organ gewonnen) oder kleine Zellklumpen. Mikroorganismen werden nicht nur nachgewiesen und/oder spezifiziert wenn ganze Zellen direkt nachgewiesen werden, sondern auch, wenn solche Zellen indirekt nachgewiesen werden, wie etwa durch Nachweis oder Quantifizierung von Zellfragmenten, aus Zellen stammenden biologischen Molekülen oder Zellnebenprodukten.
In der Folge werden einzelne Ausführungsformen erfindungsgemäßer Vorrichtungen mit Bezug auf die begleitende Zeichnung ausführlicher beschrieben. In der Zeichnung stellt
1 eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Untersuchungsvorrichtung dar,
2 eine vergrößerte Ansicht eines Teilquerschnitts der Untersuchungsvorrichtung aus 1, der entlang der Linie 2-2 in 1 führt,
3A und 3B Ansichten von Querschnitten alternativer erfindungsgemäßer Untersuchungsvorrichtungen,
4 eine perspektivische Ansicht einer weiteren erfindungsgemäßen Untersuchungsvorrichtung,
5 eine Ansicht eines Teilquerschnitts der Untersuchungsvorrichtung aus 4, der entlang der Linie 5-5 in 4 führt,
6 eine vergrößerte Aufsicht eines Teils der Untersuchungsvorrichtung aus 4 sowie
7 ein schematisches Diagramm eines Anregungs-/Nachweissystems, welches für die Untersuchungsvorrich tungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung dienlich ist.
Die Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Spezifikation von Zielmikroorganismen bereit. Die Vorrichtungen und Verfahren weisen mehrere Scheiben auf, welche auf einem Trägermaterial befestigt sind sowie einen Reflektor proximal zu einer Oberfläche jeder der Scheiben, zur Reflexion elektromagnetischer Energie ausgewählter Wellenlängen nach dem Durchtritt der Energie durch die Scheibe. Der Reflektor kann zur Verbesserung der Genauigkeit des Nachweises und/oder der Spezifikation der Zielmikroorganismen auf den Untersuchungsvorrichtungen dienlich sein. Ferner wird ein System zum Nachweis und/oder zur Spezifikation von Zielmikroorganismen auf Scheibenuntersuchungsvorrichtungen bereitgestellt. Veranschaulichende Ausführungsformen dieser unterschiedlichen Gesichtspunkte der Erfindung werden in der Folge beschrieben.
Die Untersuchungsvorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung weisen mehrere flüssigkeitsrückhaltende Scheiben auf einem Trägermaterial auf. Wo sich die vorliegende Erfindung auf „jede der mehreren Scheiben" bezieht, wird dies so verstanden, dass eine oder mehrere weitere Scheiben von der Untersuchungsvorrichtung umfasst sein können, die diese Eigenschaft nicht besitzen.
Beispiele einiger Untersuchungsvorrichtungen werden in den Patentschriften WO-A-98/45406, WO-A-99/32601 und US-A-6,174,699 beschrieben.
Eine besonders dienliche Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren besteht im auf Wachstum bezogenen Nachweis und auf Wachstum bezogener Spezifikation von Mikroorganismen in flüssigen Testproben. Ein solcher auf Wachstum bezogener Nachweis und eine solche auf Wachstum bezogene Spezifikation von Mikroorganismen ist von großer Bedeutung zur Untersuchung von Nahrung, von Umwelt-, klinischen, pharmazeutischen, kosmetischen und weiteren Proben auf Verunreinigung mit Mikroorganismen. Die Verfahren und Vorrichtungen der Erfindung gestatten eine leistungsfähige, genaue, zweckdienliche und kostengünstige Untersuchung solcher Proben. Eine bevorzugte Verwendung der Verfahren und Vorrichtungen der Erfindung bei solchen mikrobiologischen Untersuchungen kann in der Wahrscheinlichste-Keimzahlanalyse (MNP) bestehen.
In Bezugnahme auf die 1 und 2 wird eine Untersuchungsvorrichtung 10 veranschaulicht. Das Trägermaterial 20 der Untersuchungsvorrichtung 10 bezeichnet eine Trägermaterialoberfläche 22, welche eine geeignete Auflage für die auf dem Trägermaterial 20 befestigten Scheiben 40 wie in der Folge beschrieben bereitstellt. Wenngleich die in Verbindung mit den veranschaulichenden Ausführungsformen beschriebenen Trägermaterialien im allgemeinen ebene Folien darstellen, kann das Trägermaterial 20 jede geeignete Gestalt annehmen vorausgesetzt, dass eine Oberfläche des Trägermaterials die für die in der Untersuchungsvorrichtung verwendeten mehreren Scheiben erforderliche Auflage bereitstellen kann. Es kann bevorzugt sein, dass andere Teile der Untersuchungsvorrichtung 10 als die Scheiben 40 relativ hydrophob sein sollten, um die Vermeidung einer gegenseitigen Verunreinigung zwischen den Scheiben 40 zu unterstützen.
Das Trägermaterial 20 kann beispielsweise aus polymeren Folien oder anderen zweckmäßigen Materialien hergestellt sein. Zweckmäßige Polymere umfassen ohne Einschränkung Polyethylen, Polypropylen, Polyester, Polyimide, Fluoropolymere, Polycarbonate, Polyurethane und Polystyrole. Vorzugsweise waschen die als Trägermaterial 20 verwendeten Materialien keine Chemikalien aus, die das Wachstum oder den Nachweis von Zielmikroorga nismen beeinträchtigen können. Wenngleich das Trägermaterial 20 als einzelne, homogene Schicht dargestellt ist, kann es aus zwei oder mehreren verschiedenen Materialien gebildet werden, die als Schichten oder anderweitig bereitgestellt werden. Alternativ kann das Trägermaterial 20 von mehreren Schichten desselben Materials gebildet werden.
Die an dem Substrat 20 befestigten Scheiben 40 weisen erste und zweite gegenüberliegende Oberflächen 42 und 44, die in der veranschaulichenden Ausführungsform im Allgemeinen eben sind. Im allgemeinen weist die dem Trägermaterial 20 gegenüberstehende Oberfläche 42 eine Gestalt auf, die zu der Gestalt der Trägermaterialoberfläche, auf der die Scheibe 40 befestigt ist, komplementär ist.
Wenngleich die Scheiben 40 so veranschaulicht werden, dass sie eine im allgemeinen kreisförmige zylindrische Gestalt aufweisen, können die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendeten Scheiben jede geeignete Gestalt annehmen, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf kreisförmige zylindrisch gestaltete Scheiben beschränkt. Beispielsweise können die Scheiben eine kreisförmige, ovale, viereckige oder polygonale Gestalt oder andere zweckmäßige Gestalten annehmen.
Die Scheiben 40 sind vorzugsweise durch einen ausreichenden Abstand auf der Trägermaterialoberfläche 22 voneinander räumlich getrennt, um eine gegenseitige Verunreinigung zwischen den Scheiben 40 während der Kultur zu vermeiden. Der Bereich zwischen den Scheiben 40 wird hierin als Bodenbereich 14 bezeichnet. Der genaue Abstand zwischen den Scheiben 40 ist von einer Vielzahl von Faktoren abhängig, welche die Hydrophobität des Trägermaterials 20, die Hydrophilität der Scheiben 40, die Beschaffenheit der zu kultivierenden Probe, usw. umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind.
Die Scheiben 40 können auf dem Trägermaterial 20 durch zahlreiche im Stand der Technik bekannte Techniken befestigt sein, ohne Einschränkung einschließlich eines Klebstoffs 50, wie in 2 veranschaulicht. Nach Zielsetzung der Erfindung werden die Scheiben 40 als auf dem Trägermaterial 20 „befestigt" beschrieben, obgleich zahlreiche Materialien, Strukturen usw. zwischen den Scheiben 40 und dem Trägermaterial 20 eingeschoben sein können. Beispielsweise ist der Klebstoff 50 zwischen den Scheiben 40 und dem Trägermaterial 20 eingeschoben. Bevorzugte Klebstoffe können z.B. wasserunlösliche Isooctylacrylat-Klebstoffe, wie in der Patentschrift US-A-5,409,838 offenbart, umfassen. Der Klebstoff 50 kann einzeln bereitgestellt werden, oder er kann auf einem Baumwollstoff oder einer anderen Stützschicht in Form z.B. eines doppelseitigen druckempfindlichen Klebebands bereitgestellt werden.
Die Untersuchungsvorrichtung 10 weist ferner einen Reflektor 30 auf, der sich proximal zu der Oberfläche 42 der Scheiben 40 und dem Trägermaterial 20 befindet. Der Reflektor 30 reflektiert elektromagnetische Energie ausgewählter Wellenlängen nach dem Durchtritt der Energie durch die Scheiben 40. Unter „reflektiert" (und dessen Variationen) wird verstanden, dass der Reflektor 30 die Übertragung der ausgewählten Wellenlängen elektromagnetischer Strahlung im Wesentlichen vermindert oder verhindert. In bevorzugten Ausführungsformen reflektiert der Reflektor 30 im Wesentlichen sämtliche elektromagnetische Strahlung von zumindest einigen ausgewählten Wellenlängen. Die Verminderung der Übertragung sollte beträchtlich genug sein, um das von der resultierenden Untersuchungsvorrichtung bereitgestellte Signal-zu-Hintergrund Verhältnis wirksam zu erhöhen.
Der Reflektor kann in bestimmten Fällen elektromagnetische Energie außerhalb der ausgewählten Wellenlängen übertragen. Beispielsweise kann der Reflektor 30 eine Undurchlässigkeit für Wellenlängen von Anregungsenergie zeigen, die hoch genug ist, dass wenig oder keine Anregungsenergie durch den Reflektor 30 zum Trägermaterial 20 dringt. Demzufolge wird im Wesentlichen verhindert, dass die Anregungsenergie Materialien im Trägermaterial 20 anregt.
Es kann bevorzugt sein, dass der Reflektor 30 einen beträchtlichen Anteil oder im Wesentlichen sämtliche Wellenlängen der Anregungsenergie und/oder der elektromagnetischen Signalenergie reflektiert. Wenn der Reflektor 30 die Anregungsenergie reflektieren kann, kann die tatsächliche Weglänge der Anregungsenergie durch die Scheiben 40 effektiv verdoppelt werden, da die Anregungsenergie nach Reflexion durch den Reflektor 30 ein zweites Mal durch die Scheiben 40 zurück reflektiert wird.
Wenn der Reflektor 30 die Energie des als Folge des Vorkommens der Zielmikroorganismen in oder auf den Scheiben 40 erzeugten elektromagnetischen Signals reflektieren kann, dann kann jede beliebige derartige Signalenergie, welche in Richtung des Trägermaterials 20 abgegeben wird, reflektiert werden, wodurch sich die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die abgegebene Signalenergie durch einen Detektor nachgewiesen werden kann, der sich oberhalb der zweiten Oberfläche 44 der Scheibe 40 befindet.
Der proximal zu der Oberfläche 42 jeder der Scheiben 40 befindliche Reflektor 30 kann eine Vielzahl unterschiedlicher Formen annehmen. Ungeachtet dessen kann jedoch bevorzugt werden, dass der Reflektor 30 keine Chemikalien auswäscht, die das Wachstum oder den Nachweis der Zielmikroorganismen beeinträchtigen können.
In einer Ausführungsform kann der sich proximal zu der Oberfläche 42 jeder der Scheiben 40 befindliche Reflektor 30 in Form einer reflektierenden Schicht bereitgestellt werden, welche elektromagnetische Energie ausge wählter Wellenlängen reflektiert. Die reflektierende Schicht kann aus einem beliebigen Material aufgebaut sein, vorausgesetzt, dass es die gewünschte elektromagnetische Energie reflektiert. Beispielsweise kann die reflektierende Schicht in Form einer metallischen Schicht zur Bereitstellung des Reflektors 30 vorgesehen sein. Die metallische Schicht kann durch eine beliebige Technik zur Abscheidung von Metallen auf Trägerschichten gebildet werden, z.B. Aufdampfung, Zerstäubung, usw. Alternativ kann eine beliebige andere geeignete Technik zur Bereitstellung einer Metallschicht mit ausreichender Reflektivität für elektromagnetische Energie ausgewählter Wellenlängen verwendet werden. Beispielsweise kann eine Metallschicht in Form einer metallhaltigen Matrix bereitgestellt werden.
Eine Metallschicht kann ein oder mehrere Metalle, eine oder mehrere Metallverbindungen oder Kombinationen von einem oder mehreren Metallen mit einer oder mehreren Metallverbindungen umfassen. Beispiele geeigneter Metalle für eine Metallschicht umfassen Aluminium, Titan, Chrom, Zinn, Gold, Eisen, Platin, Palladium, Silber und Kombination von zwei oder mehreren dieser, sind auf diese jedoch nicht beschränkt. Es können zur Bildung einer Metallschicht auch Metallverbindungen verwendet werden. Beispielsweise kann die den Reflektor 30 bildende Metallschicht, entweder anstelle von Metallen oder zusätzlich zu Metallen, ein oder mehrere Metalloxide, z.B. Titandioxid, umfassen. In einigen Fällen kann bevorzugt werden, dass die Metallschicht des Reflektors 30 im Wesentlichen aus einem oder mehreren Metallen, einer oder mehreren Metallverbindungen oder Kombinationen eines oder mehrerer Metalle und einer oder mehrerer Metallverbindungen besteht.
Eine weitere Alternative für die Metallschicht des Reflektors 30 ist, dass diese einen oder mehrere Farbstoffe enthalten kann. Es kann bevorzugt sein, dass der Farbstoff in Form eines härtbaren Farbstoffs vorliegt, z.B. ein durch ultraviolette Strahlung härtbarer Farbstoff, wie etwa 100 % Festfarbe. Der Farbstoff oder die Farbstoffe, welche für den Reflektor 30 verwendet werden, können Pigmente, chemische Farbstoffe, synthetische Harze oder eine beliebige Kombination derer oder weiterer Materialien umfassen, vorausgesetzt, dass die gewünschten Wellenlängen des Lichts reflektiert werden. Wenn der Farbstoff chemische Farbstoffe umfasst, sind diese vorzugsweise nicht fluoreszierend oder fluoreszieren bei Wellenlängen, welche die Untersuchungswellenlängen nicht beeinträchtigen, auf die sich der Nachweis des Vorkommens der ausgewählten Mikroorganismen stützt.
Wo eine reflektierende Schicht zur Bereitstellung des zu den Oberflächen 42 der Scheiben 40 proximalen Reflektors 30 verwendet wird und sich diese reflektierende Schicht auf dem Trägermaterial 20 befindet, kann die reflektierende Schicht im wesentlichen koextensiv mit der Trägermaterialoberfläche 22 sein, wie in den 1 und 2 veranschaulicht. Alternativ kann die reflektierende Schicht nur auf Teilen des Trägermaterials 20 vorhanden sein. Jedoch wird im Minimum ein Reflektor 30 proximal zu der Oberfläche 42 jeder der Scheiben 40 bereitgestellt.
Unter Bezugnahme auf 3A wird eine Untersuchungsvorrichtung 110 veranschaulicht, bei der sich ein Reflektor 130 nur zwischen der Scheibe 140 und dem Träger 120 befindet. Die Bodenbereiche 114 zwischen angrenzenden Scheiben 140 können vorzugsweise im wesentlichen frei von einem Reflektor 130 sein.
Ein weiteres in der Ausführungsform von 3A veranschaulichtes Merkmal besteht in der Position des Reflektors 130 direkt auf der Oberfläche 142 der Scheibe 140 anstatt auf dem Trägermaterial (wie in den Ausführungsformen der 1 und 2 gesehen). Der Reflektor 130 und die Scheibe 140 können an dem Trägermaterial 120 unter Verwendung eines Klebstoffs 150 oder einer beliebigen anderen geeigneten Technik befestigt sein.
Unter Bezugnahme auf 3B wird eine weitere Untersuchungsvorrichtung 110' veranschaulicht, bei der ein Reflektor 130' proximal der Oberfläche 144' befestigt ist, die dem Trägermaterial 120' abgewandt ist. Bei einer solchen Ausführungsform kann die Scheibe 140' durch das Trägermaterial 120' hindurch angeregt und ausgewertet werden, wobei der Reflektor 130' vorzugsweise elektromagnetische Signalenergie reflektiert, die in Richtung der Oberfläche 144' der Scheibe 140' und zurück in Richtung der Oberfläche 142' und des Trägermaterials 120' wandert. Der Reflektor 130' reflektiert ferner vorzugsweise die darauf einfallende Anregungsenergie, so dass die tatsächliche Weglänge der Anregungsenergie durch die Scheibe 140' erhöht werden kann. Bei dieser Ausführungsform kann es auch bevorzugt sein, dass das Trägermaterial 120' aus Materialien aufgebaut ist, welche die Anregung und/oder den Nachweis im wesentlichen nicht beeinträchtigen.
Die in den erfindungsgemäßen Untersuchungsvorrichtungen verwendeten flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben können aus einer Vielzahl von Materialien aufgebaut sein. Es kann bevorzugt sein, dass mindestens ein Teil der in den Scheiben verwendeten Materialien relativ hydrophil ist. Alternativ kann bevorzugt sein, dass die Struktur der Scheiben derart ist, dass Flüssigkeit innerhalb der Scheiben durch z.B. kapillare Saugkräfte usw. gespeichert werden kann. Bei solchen Bauarten können die in den Scheiben verwendeten Materialien hydrophil sein oder nicht.
Die in den Scheiben verwendeten Materialien können faserartig sein, d. h. aus mehreren Fasern aufgebaut und die Fasern können zur Bildung des Scheibenmaterials verwoben oder nicht verwoben sein. Die Scheibenmaterialien können Zellulosestoffe, Polyolefine, Polyester, Polyamide usw. umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Geeignete Zellulosestoffe können Papier, Zellstoff und Rayon umfassen und können chemisch veränderte Zellulosestoffe, wie etwa Zelluloseester, umfassen. Geeignete Polyolefine können hydrophile Polyethylen- oder hydrophile Polypropylenfasern umfassen. Geeignete Polyamide können Nylon umfassen. Geeignete Polyester können Polymilchsäure umfassen.
Es kann ferner bevorzugt sein, dass die für die Scheiben verwendeten Materialien einen beträchtlichen Anteil sowohl jeglicher elektromagnetischer Anregungsenergie als auch elektromagnetischer Signalenergie übertragen. Beide Energieformen können jedoch beim Durchdringen der Scheiben einer Ablenkung oder anderer Diffusion unterliegen, insbesondere, wenn die Scheiben von faserartigem Material gebildet werden.
Die Dicke der Scheiben (wie z.B. zwischen den Oberflächen 42 und 44 in 2 gemessen) kann bezogen auf eine Anzahl von Faktoren variieren. Es kann jedoch bevorzugt sein, dass die Scheiben eine Dicke von mindestens etwa 0,1 Millimeter oder mehr, vorzugsweise mindestens etwa 0,3 Millimeter oder mehr aufweisen. Am oberen Ende kann bevorzugt sein, dass die Scheiben eine Dicke von etwa 1 Millimeter oder weniger, insbesondere etwa 0,8 Millimeter oder weniger aufweisen.
Wie oben erörtert, weisen die für die erfindungsgemäßen Untersuchungsvorrichtungen verwendeten Scheiben vorzugsweise eine Kapazität zur Rückhaltung von Flüssigkeit auf, d. h. sie speichern eine darauf oder darin befindliche Flüssigkeitsmenge. Am unteren Ende kann bevorzugt sein, dass jede der Scheiben eine Kapazität zur Rückhaltung von Flüssigkeit von mindestens etwa 0,5 Mikrolitern, vorzugsweise mindestens etwa 1 Mikroliter und insbesondere mindestens etwa 2 Mikrolitern aufweist. Am oberen Ende kann bevorzugt sein, dass jede der Scheiben eine Kapazität zur Rückhaltung von Flüs sigkeit von mindestens etwa 100 Mikrolitern oder weniger, oder alternativ etwa 25 Mikrolitern oder weniger aufweist. Ein bevorzugter Bereich der Kapazität zur Rückhaltung von Flüssigkeit der Scheiben kann zwischen etwa 1 Mikroliter und etwa 20 Mikrolitern liegen.
Die Anzahl der Scheiben auf der Untersuchungsvorrichtung kann in Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Probengröße, Scheibengröße usw. variieren. Am unteren Ende kann bevorzugt sein, dass die Vorrichtung mindestens etwa zwei oder mehr Scheiben, vorzugsweise mindestens etwa 10 oder mehr Scheiben und insbesondere etwa 25 oder mehr Scheiben aufweist. Am oberen Ende kann bevorzugt sein, dass die Vorrichtungen mindestens etwa 10000 Scheiben oder weniger, vorzugsweise mindestens etwa 1000 Scheiben oder weniger und insbesondere etwa 600 Scheiben oder weniger aufweisen. In anderen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, etwa 100 bis etwa 200 Scheiben auf jeder Untersuchungsvorrichtung bereit zu stellen.
Es kann bevorzugt sein, dass sämtliche Scheiben eine einheitliche Kapazität zur Rückhaltung von Flüssigkeit aufweisen. Es kann ferner bevorzugt sein, dass sämtliche Scheiben auch denselben Oberflächenbereich auf der Untersuchungsoberfläche einnehmen. Durch die Verwendung von Scheiben, die eine einheitliche Kapazität zur Rückhaltung von Flüssigkeit und eine einheitliche Größe aufweisen, kann die Genauigkeit sowohl der Kulturergebnisse als auch des Nachweises dieser Ergebnisse im Vergleich zu Vorrichtungen, die Scheiben verschiedener Kapazität und/oder Größe aufweisen, verbessert werden.
Eine solche Vorrichtung mit Scheiben, die sowohl in Flüssigkeitskapazität und Größe einheitlich sind, kann insbesondere im Zusammenhang mit dem Testen einer flüssigen Probe auf die Konzentration von Mikroorganismen unter Verwendung der MPN Analyse dienlich sein. Bestimmte regulatorische Anforderungen können vor schreiben, dass ein Testverfahren in der Lage sein muss, einen Mikroorganismus in einer ein-bis-fünf Milliliter Probe nachzuweisen. Eine solche Probengröße ist Standard in der Nahrungsmittel verarbeitenden Industrie zum mikrobiologischen Testen. Somit wäre beispielsweise eine Untersuchungsvorrichtung, die 500 flüssigkeitsrückhaltende Scheiben aufweist, wobei jede Scheibe eine Kapazität von 2 Mikrolitern aufweist, zum Testen einer 1-ml Probe sehr dienlich. Eine flüssigkeitsrückhaltende Scheibe mit einer Kapazität von 2 Mikrolitern kann erfindungsgemäß die schnelle Entstehung eines nachweisbaren Signals ermöglichen, und die Verwendung von etwa 400 bis etwa 600 Scheiben kann eine genügend große Anzahl von Datenpunkten bereitstellen, um das Vertrauensintervall einer MPN Analyseberechnung wesentlich zu verbessern. Zusätzlich ist es möglich eine manuelle Auszählung flüssigkeitsrückhaltender Scheiben vorzunehmen, die positiv auf den Mikroorganismus getestet werden. Die Verwendung von Vorrichtungen, welche wesentlich mehr als 400 flüssigkeitsrückhaltende Scheiben aufweisen, können praktischerweise eine durch Instrumente unterstützte oder automatisierte Zählung erfordern.
In einer alternativen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, Scheiben bereit zu stellen, die eine unterschiedliche Kapazität zur Rückhaltung von Flüssigkeit auf derselben Vorrichtung aufweisen. Zusätzlich zu oder anstelle von unterschiedlicher Kapazität, kann es wünschenswert sein, Scheiben bereit zu stellen, die einen unterschiedlichen Oberflächenbereich der Untersuchungsoberfläche einnehmen. In vielen Fällen jedoch nehmen die Scheiben unterschiedlicher Kapazität auch einen unterschiedlichen Oberflächenbereich auf der Untersuchungsoberfläche ein.
Es kann ferner bevorzugt sein, dass die flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben in zwei oder mehreren Sätzen bereitgestellt werden, wobei jeder Satz Scheiben aufweist, die sowohl in Flüssigkeitskapazität als auch Größe einheitlich sind. Die Kapazitäten und Größen der Scheibensätze sind vorzugsweise unterschiedlich, und es kann ferner bevorzugt sein, dass die Kapazitäten und Größen in aufsteigender Weise über die unterschiedlichen Scheibensätze variieren. Beispielsweise kann die Untersuchungsvorrichtung in einer Ausführungsform insgesamt einhundert Scheiben aufweisen, wobei fünfzig Scheiben ein Volumen von etwa zwanzig Mikrolitern aufweisen und fünfzig Scheiben ein Volumen von etwa zwei Mikrolitern aufweisen.
In den 4–6 wird eine Untersuchungsvorrichtung 210 veranschaulicht, die zwei Scheibensätze 240a und 240b aufweist, welche unterschiedliche flüssigkeitsrückhaltende Kapazitäten und unterschiedliche Größen aufweisen. Es kann bevorzugt sein, dass die größeren Scheiben 240a die kleineren Scheiben 240b im wesentlichen umgeben, wie etwa in 4 veranschaulicht. Die größeren Scheiben 240a sind im Allgemeinen zwischen den kleineren Scheiben 240b und dem äußeren Rand der Untersuchungsoberfläche 212 angeordnet. Die Anordnung der Scheiben auf diese Art und Weise kann das Trocknen der kleineren Scheiben 240b verringern oder verhindern, da die größeren Scheiben 240a den Bereich der kleineren Scheiben 240b befeuchten können, als auch die kleineren Scheiben 240b teilweise von einer Luftströmung abschirmen können, welche die kleineren Scheiben 240b austrocknen könnte, wie es bei Inkubation unter erhöhten Temperaturen vorkommen kann. Zum Erhalt dieses Vorteils kann es nicht erforderlich sein, dass die größeren Scheiben 240a die kleineren Scheiben 240b vollständig umgeben, entweder bezüglich der kleineren Scheiben 240b selbst oder des äußeren Randes der Untersuchungsoberfläche 212.
Die Untersuchungsvorrichtung 210 weist wahlweise einen Inokulationsträger 260 auf. Der Inokulationsträger 260 ist in der Lage, Probe für nachfolgende Inokulationen der Scheiben 240a und 240b zurück zu behalten. Beispiele möglicher Inokulationsträger 260 umfassen ohne Einschränkung Saugkissen, thermogeformte Platten, Reservoire usw.
Der Inokulationsträger 260 in der veranschaulichten Ausführungsform kann vorzugsweise so an der Untersuchungsvorrichtung 210 befestigt sein, dass der Träger 260 in Kontakt mit den Scheiben 240a und 240b kommen kann. Ein bevorzugtes Verfahren kann es sein, den Inokulationsträger 260 entlang einer Perforation 262 zu befestigen. Bei dieser Anordnung kann der Inokulationsträger 260 nach der Anwendung einfach durch Abreißen entlang der Perforation 262 von der Vorrichtung 210 entfernt werden. Der Träger 260 bedeckt vorzugsweise im Wesentlichen den Anteil der Untersuchungsoberfläche 212, auf welchem sich die Scheiben 240a und 240b befinden.
Zur Verteilung der Probe auf die Scheiben wird die Probe zunächst auf den Inokulationsträger 260 geladen. Nach Beladen des Inokulationsträgers 260 wird dieser in Kontakt mit den Scheiben 240a und 240b gebracht. Die Probe überträgt sich vorzugsweise vom Träger 260 und auf die Scheiben 240a und 240b in einem Vorgang, der vorzugsweise praktisch gleichzeitig und einheitlich abläuft.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Inokulationsträger 260 um ein Saugkissen 264 mit einer daran befestigten Unterlage 266. Das Kissen 264 kann aus einer beliebigen Anzahl von Materialien hergestellt sein, z.B. solche die im obigen für das Scheibenmaterial aufgezählt sind. Aus Herstellungsgründen kann es wünschenswert sein, dass das Kissen 264 aus demselben Material wie die Scheiben 240a und 240b aufgebaut ist. Das Kissen 264 kann von beliebiger Größe und Gestalt sein. Vorzugsweise bedeckt das Kissen 264 mehr der Untersuchungsoberfläche 212 als den Bereich, in dem sich die Scheiben 240a und 240b befinden, so dass das Kissen 264 sämtliche Scheiben 240a und 240b bedeckt, um sicher zu stellen, dass sämtliche Scheiben inokuliert werden können, wenn das Kissen 264 in Kontakt mit den Scheiben 240a und 240b gebracht wird.
Die Unterlage 266 kann so an der Vorrichtung 210 befestigt werden, dass jede Vorrichtung 210 bei Auslieferung an einen Anwender vorzugsweise einen Inokulationsträger 260 aufweist. Es kann bevorzugt sein, dass die Unterlage 266 in abnehmbarer Weise, wie etwa entlang einer Perforation 262, befestigt wird. Es kann ebenso bevorzugt sein, dass die Unterlage 266 relativ dünn ist und dass sie keine Chemikalien auswäscht, die das Wachstum oder den Nachweis von Zielmikroorganismen beeinträchtigen können. Aus Herstellungsgründen kann die Unterlage 266 aus demselben Material oder denselben Materialien wie der Träger 220 hergestellt sein.
Das Kissen 264 kann auf der Unterlage 266 auf beliebige im Stand der Technik bekannte Arten befestigt sein, wie etwa durch einen Klebstoff 268. Vorzugsweise sind das Kissen 264 und die Unterlage 266 auf eine Weise befestigt, die nicht zum Auswaschen von Chemikalien führt.
In den 4–6 wird auch eine wahlweise Deckplatte 218 veranschaulicht, die mit der Untersuchungsvorrichtung 210 bereitgestellt werden kann. Die Deckplatte 218 kann zum Schutz der Scheiben 240a und 240b vor Verunreinigung oder Austrocknung dienen, sowie der Vorrichtung 210 eine Probe zugegeben wurde. Die Deckplatte 218 kann aus einer beliebigen Anzahl von Materialien aufgebaut sein. Es kann bevorzugt sein, dass die Deckplatte 218 eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: Flexibilität, Durchlässigkeit bis zu dem Grade, wie eine Anregung und/oder ein Nachweis durch die Deckplatte 218 durchgeführt wird, Verträglichkeit mit wachsenden Mikroorganismen und dem in der Vorrich tung zu verwendenden Anregungs- und/oder Nachweissystem (z.B. zeigt keine Lumineszens oder Fluoreszens oder Undurchsichtigkeit in einem Ausmaß, dass der Nachweis wesentlich beeinträchtigt würde) sowie chemische Stabilität (d.h. keine Auswaschung unerwünschten Chemikalien nach in Kontakt treten mit der flüssigen Probe), usw.
Die Deckplatte 218 kann so an der Vorrichtung 210 befestigt werden, dass sie im Wesentlichen sämtliche Scheiben 240a und 240b, insbesondere sämtliche Scheiben 240a und 240b bedeckt. Es kann bevorzugt sein, dass die Deckplatte 218 und die Untersuchungsoberfläche 212 in solch einer Größe vorliegen, die es der Deckplatte 218 gestattet, die Untersuchungsoberfläche 212 bei der Verwendung zu berühren und zu versiegeln. Für die Zwecke dieser Anmeldung erfordert „versiegeln" nicht, dass die Verbindung zwischen der Untersuchungsoberfläche 212 und der Deckplatte 218 luftdicht ist. Statt dessen kann die Deckplatte 218 das Trägermaterial 212 nur überdecken und damit in dauerhafte Berührung kommen, um eine Verunreinigung während der Verwendung sowie übermäßige Verdunstung von den Scheiben 240a und 240b zu verringern oder zu verhindern.
In einer Ausführungsform können die Deckplatte 218, das Trägermaterial 220 und der Inokulationsträger 260 alle miteinander an einem Ende der Vorrichtung 210 zur Bildung eines Scharniers 216 befestigt sein. In dieser Anordnung kann der Inokulationsträger 260 vorzugsweise zwischen der Deckplatte 218 und dem Trägermaterial 220 befestigt sein.
In weiteren Ausführungsformen kann die Deckplatte 218 der Untersuchungsvorrichtung 210 nach der Inokulation der Scheiben 240a und 240b hinzugefügt werden. Die Deckplatte 218 kann durch eine beliebige Technik, z.B. Klebstoffe usw., befestigt werden.
Die in den erfindungsgemäßen Untersuchungsvorrichtungen verwendeten Scheiben können eine Vielzahl von Untersuchungsreagenzien zur Förderung des Wachstums, des Nachweises und/oder der Zählung der ausgewählten Mikroorganismen aufweisen. Ein Untersuchungsreagens ist Nährwachstumsmedium, welches als Beschichtung oder als andere Ablagerung innerhalb oder auf den flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben bereitgestellt werden kann, in Mengen, die ausreichen, um die erwünschten Konzentrationen zu erhalten, wenn eine flüssige Testprobe in die Scheiben verteilt wird. Es kann bevorzugt sein, dass die Wachstumsmedien eine Selektivität für eine bestimmte Gruppe von Mikroorganismen zeigen, deren Wachstum durch die Wachstumsmedien ermöglicht oder differenziert wird.
Die Nährwachstumsmedien können beispielsweise durch Auftragen oder Verteilen einer Lösung oder Suspension des Nährmediums auf die Scheiben und Trocknung bereitgestellt werden, um eine Beschichtung oder Ablagerung der Wachstumsmedien auf den Scheiben erzeugen. Alternativ können Bestandteile der Wachstumsmedien im Klebstoff oder einer anderen Substanz vorkommen, welche die Scheiben am Trägermaterial befestigt (gegebenenfalls). Ungeachtet seiner genauen Position vor der Inokulation der Scheiben, wird das Wachstumsmedium vorzugsweise in einer Weise bereitgestellt, dass es schlussendlich in das Scheibenmaterial diffundiert, um für das Wachstum der Zielmikroorganismen (falls vorhanden) zu sorgen.
Die Scheiben der Untersuchungsvorrichtungen der vorliegenden Erfindung können auf oder in den Scheiben auch andere Untersuchungsreagenzien aufweisen. Solche Untersuchungsreagenzien können, ohne Einschränkung, Geliermittel, Indikatorsubstanzen usw. umfassen. Ein Geliermittel kann die „Verkapselung" der wachsenden Mikroorganismen fördern. Solche Geliermittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen ein beliebiges Wasser absorbierendes Material, welches nach Zugabe einer wässrigen Flüssigkeit zu einem Gel wird.
Im Zusammenhang mit der Erfindung verwendbare Indikatorsubstanzen umfassen eine beliebige Substanz, die ein Signal in Anwesenheit eines wachsenden Mikroorganismus erzeugt. Beispiele einiger Indikatorsubstanzen umfassen chromogene, fluoreszierende, fluorogene, lunineszente, elektrochemische und andere Indikatoren, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
In der vorliegenden Erfindung können fluorogene Indikatorsubstanzen bevorzugt sein, da diese in relativ niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden können. Geeignete fluorogene Indikatorsubstanzen können, ohne Einschränkung, 4-Methylumbelliferylphosphat und 4-Methylumbelliferyl-beta-D-glucopyranosid, L-Phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin umfassen. Andere können 4-Methylumbelliferylacetat und 4-Methylumbelliferylsulfat umfassen.
Die Untersuchungsreagenzien können in den Scheiben durch eines von zahlreichen dem Fachmann bekannten Verfahren zur Immobilisierung von Untersuchungsreagenzien auf festen Trägermaterialien immobilisiert werden. Solche Verfahren können beispielsweise das Antrocknen von Untersuchungsreagenzien enthaltenden Flüssigkeiten in den Scheiben sowie weitere Verfahren zur nichtkovalenten Befestigung von Biomolekülen und anderen Untersuchungsreagenzien auf einem festen Trägermaterial umfassen. Alternativ können verschiedene Verfahren zur kovalenten Befestigung von Untersuchungsreagenzien auf den Scheiben durch dem Fachmann bekannte Verfahren eingesetzt werden. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass lösliche Untersuchungsreagenzien verwendet werden können, da eine Diffusion vorzugsweise durch Beschränkung der wässrigen biologischen Probenflüssigkeit auf die flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben verringert oder verhindert wird.
Die flüssigen Testproben, die in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Untersuchungsvorrichtungen und Verfahren verwendet werden, können beliebige Proben von Interesse aus beliebigen Quellen darstellen. Die Probe kann direkt auf die flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben verteilt werden, oder die Probe kann vor der Verteilung auf die Scheiben verdünnt werden. Die Bestimmung ob eine Probenverdünnung erforderlich ist, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie etwa die Probenquelle und das Probenalter, und eine solche Bestimmung ist eine Routineangelegenheit für den Fachmann.
Als Alternative zum Vorlegen der gewünschten Untersuchungsreagenzien in den Scheiben vor der Inokulation kann bevorzugt werden, dass ein oder mehrere der gewünschten Untersuchungsreagenzien, z.B. ein Wachstumsmedium, Indikatorsubstanz, Geliermittel usw. von der flüssigen Testprobe selbst umfasst werden.
Es können diverse Verfahren zur Verteilung einer flüssigen Testprobe auf die flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben eingesetzt werden. Es kann mehr als ein Verfahren auf eine bestimmte Vorrichtung anwendbar sein, wenngleich das bevorzugte Verfahren in gewissem Maße von der Anordnung einer bestimmten Untersuchungsvorrichtung abhängen kann. Die Probe kann auf die Vorrichtung geschüttet oder pipettiert werden, und über die flüssigkeitrückhaltenden Scheiben kann die Probe durch Schwenken oder Schütteln der Vorrichtung verteilt werden. Alternativ kann die Untersuchungsvorrichtung oder ein Anteil der Untersuchungsvorrichtung in die Probe getaucht werden. Nach Entfernen aus der flüssigen Probe kann Flüssigkeit in hydrophilen flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben zurückgehalten und im Wesentlichen von einem hydrophoben Bereich zwischen den Scheiben abgesondert werden.
Nachdem die Probe auf die flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben der Untersuchungsvorrichtung verteilt worden ist, können in Abhängigkeit von den erwünschten Verwen dungen diverse Untersuchungen durchgeführt werden. Zum mikrobiellen Nachweis oder zur mikrobiellen Zählung kann die Untersuchungsvorrichtung für einen Zeitraum inkubiert werden, der ausreicht, mindestens einen Zellteilungszyklus des Mikroorganismus zu gestatten. Zu diesem Zweck wird die Vorrichtung im Allgemeinen bei etwa 25 °C bis etwa 45 °C, insbesondere bei etwa 30 °C bis etwa 37 °C inkubiert. Die Inkubationszeit zum mikrobiellen Nachweis variiert. Auch die Nachweiszeit variiert in Abhängigkeit von der Wachstumsrate und der Anzahl der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen kann die Nachweiszeit zum Zwecke der Zählung nur etwa 10 Stunden betragen. Diese relativ kurze Inkubationszeit stellt einen deutlichen Vorteil gegenüber derzeit verwendeten Verfahren dar, die typischerweise Inkubationszeiten von etwa 24 Stunden oder mehr erfordern.
Nach Inkubation der Untersuchungsvorrichtung wird das Vorhandensein oder Fehlen von Mikroorganismen in den Scheiben (und somit in der flüssigen Testprobe) nachgewiesen. Die Art und Weise des Nachweises hängt von dem im Verfahren verwendeten Typ der Indikatorsubstanz ab. Es kann jede beliebige Indikatorsubstanz verwendet werden, die ein nachweisbares Signal bereitzustellen in der Lage ist. Solche Indikatoren umfassen fluoreszierende, chromogene, lumineszente und elektrochemische Indikatoren, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Das Vorhandensein oder Fehlen eines Mikroorganismus in einer Scheibe kann visuell, mit dem bloßen Auge oder mikroskopisch, nachgewiesen werden, wenn ein chromogener oder lumineszenter Indikator verwendet wird. Der Indikator kann beschichtet oder anderweitig in die Scheiben integriert werden.
Es kann bevorzugt sein, dass die Nachweisart die Emission elektromagnetischer Signalenergie umfasst, welche durch die in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltene Metallschicht reflektiert werden kann. Es kann ferner oder alternativ bevorzugt sein, dass die Nachweisart auf einer Anregung durch elektromagnetische Energie beruht, die am Erreichen des darunterliegenden Trägermaterials durch die in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltene Metallschicht gehindert wird (und vorzugsweise reflektiert wird).
Falls eine fluoreszierende Indikatorsubstanz verwendet wird, können zum Nachweis Ausrüstung und Verfahren zum Nachweis eines fluoreszierenden Signals eingesetzt werden. Im Stand der Technik sind diverse Indikatorsubstanzen und Signalnachweissysteme, einschließlich Systeme zum Nachweis elektrochemischer Veränderungen, zum Nachweis von Mikroorganismen bekannt und jede beliebige dieser Substanzen und Verfahren kann erfindungsgemäß Verwendung finden.
Der Nachweis von Mikroorganismen in der flüssigen Probe kann ferner die Auszählung der Mikroorganismenzahl in der flüssigen Testprobe einbeziehen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Auszählung durch MPN ausgeführt. Sowie die Anzahl der flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben, welche den Mikroorganismus des Interesses enthalten, bestimmt worden ist, kann unter Verwendung bekannter MPN Techniken eine MPN Kalkulation aufgemacht werden. Falls erwünscht kann daraufhin die Anzahl von Mikroorganismen in einer einzelnen Scheibe unter Verwendung bekannter Techniken bestimmt werden, zum Beispiel durch die Signalintensität im Vergleich zu einem bekannten Standardwert oder durch Ausplattieren des Scheibeninhalts. Vorteilhafterweise gestattet die große Anzahl von flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, engere Intervalle (z.B. im Vergleich zu den standardisierten 3-Röhren oder 10-Röhren MPN Verfahren) für die 95 % Vertrauensgrenzen bei einer MPN Analyse einer flüssigen Testprobe.
Aufgrund der hohen Anzahl von flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben, die bei einer einzelnen Vorrichtung angefertigt werden können, ist es möglich, eine einzelne Vorrichtung zum Nachweis und zur Auszählung mehrerer Mikroorganismen des Interesses zu verwenden, während die erfindungsgemäßen Vorteile erhalten bleiben. Beispielsweise kann eine einzelne flüssige Testprobe auf das Vorhandensein oder die Konzentration von E. coli und S. aureus getestet werden. Ein Teil einer Untersuchungsvorrichtung kann Scheiben zum Nachweis und zur Auszählung eines dieser Mikroorganismen enthalten, während ein zweiter Satz von Scheiben auf den Nachweis und die Auszählung eines weiteren Mikroorganismus des Interesses ausgerichtet sein kann. Dies wird beispielsweise durch Aufnahme von für die Mikroorganismen spezifischen Nahrungs- und/oder Indikatorsubstanzen in die jeweiligen Sätze flüssigkeitsrückhaltender Scheiben erreicht. Alternativ können sämtliche flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben Untersuchungsreagenzien enthalten, die für einen gleichzeitigen Nachweis mehrerer Mikroorganismen ausgelegt sind. Beispielsweise kann E. coli mittels einer fluoreszenten Indikatorsubstanz nachgewiesen werden, während gleichzeitig andere Coliforme mit z.B. einer chromogenen oder einer anderen Indikatorsubstanz nachgewiesen werden.
Es können nachfolgende Tests ausgeführt werden. Beispielsweise können die Scheiben aus der Vorrichtung entnommen und in eine Teströhre überführt werden, um die darauf wachsenden spezifischen Mikroorganismen zu unterscheiden.
In einer weiteren Ausführungsform können aliquote Teile einer flüssigen Testprobe auf mehrere flüssigkeitsrückhaltende Scheiben einer Untersuchungsvorrichtung verteilt werden, wobei die Untersuchungsvorrichtung mehrere Scheibensätze aufweist. Jeder Satz weist Scheiben einheitlicher Größe auf, und die Vorrichtung weist mindestens zwei Scheibensätze auf. Beispielsweise kann die Untersuchungsvorrichtung mehrere Spuren aufweisen, wobei die flüssigkeitsrückhaltenden Scheiben in einer bestimmten Spur dieselben Kapazitäten zum Speichern von Flüssigkeit aufweisen. Dieses Merkmal gestattet die Verteilung der flüssigen Testprobe in verschiedenen Testvolumengrößen innerhalb einer einzelnen Untersuchungsvorrichtung. Bei MPN stellt dieses Merkmal einen beträchtlichen Vorteil dadurch bereit, dass bei einer hochkonzentrierten Probe eine geeignete Volumengröße ausgewählt und eine MPN Analyse unter Verwendung eines einzelnen Verteilungschritts in einer einzelnen Vorrichtung ohne den Bedarf an seriellen Verdünnungen durchgeführt werden kann.
7 ist eine schematische Darstellung eines Systems, welches im Zusammenhang mit dem Nachweis und/oder der Auszählung ausgewählter Mikroorganismen, die in den Scheiben auf den oben beschriebenen Untersuchungsvorrichtungen vorhanden sind, verwendet werden kann. Es versteht sich, dass das System ebenso mit anderen Untersuchungsvorrichtungen verwendet werden kann – seine Verwendung und Vorteile sind nicht notwendigerweise auf die Verwendung der wie oben beschriebenen reflektierenden Scheibenuntersuchungsvorrichtungen beschränkt.
Das System 70 weist mindestens eine Anregungsquelle 72, insbesondere zwei oder mehrere Quellen 72 auf, welche einer Untersuchungsvorrichtung 10, die sich innerhalb der Nachweiskammer 74 befindet, die elektromagnetische Anregungsenergie ausgewählter Wellenlängen liefern. Die Nachweiskammer 74 wird hauptsächlich durch mindestens eine Wand 76 bestimmt, welche, in einer Form, in Gestalt eines genau kreisförmigen Zylinders bereitgestellt werden kann. Falls die Nachweiskammer 74 nicht von zylindrischer Gestalt ist, kann sie mehrere Wände aufweisen.
Die Anregungsquelle 72 kann jede beliebige Form annehmen unter der Bedingung, dass die Quelle 72 genügend Energie in den zum Arbeitsablauf der Untersuchungsvor richtung 10 erforderlichen Anregungswellenlängen abgibt. Beispielsweise kann die Quelle 72 ultraviolettes Licht mit einer Wellenlänge von 365 Nanometern abgeben, das für eine Anzahl von fluorogenen Indikatorsubstanzen verwendbar sein kann. Die Anregungsquelle 72 kann kohärente oder nicht-kohärente elektromagnetische Strahlung erzeugen.
Das System 70 weist auch einen Detektor 78 auf, der so angeordnet ist, dass er die von der Untersuchungsvorrichtung 10 als Reaktion auf die elektromagnetische Anregungsenergie ausgestrahlte elektromagnetische Signalenergie nachweisen kann. Der Detektor 78 kann durch jede beliebige geeignete Vorrichtung oder Vorrichtungen bereitgestellt werden, die in der Lage sind, die elektromagnetische Signalenergie nachzuweisen, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf eine CCD Kamera, Fotodioden usw.
Die Wand 76 der Nachweiskammer 74 ist aus Materialien aufgebaut, die einen beträchtlichen Anteil des darauf wirkenden elektromagnetischen Singalenergieereignisses reflektieren. Durch Reflexion der Anregungsenergie anstatt diese zu absorbieren oder zu übertragen, kann die Menge an Energie, welche die Untersuchungsvorrichtung erreicht, gesteigert werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Reflexionen zu einer verbesserten Einheitlichkeit der Anregungsintensität führen. Es kann bevorzugt sein, dass die Wand 76 mindestens etwa 80 % (besonders bevorzugt mindestens etwa 90 %) des darauf wirkenden elektromagnetischen Signalenergieereignisses reflektiert (wobei die Energie entlang einer Achse auf die Wand trifft, die senkrecht zu der Wandoberfläche steht). In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, dass die Wand 76 die elektromagnetische Signalenergie nicht reflektiert, um zu verhindern, dass Reflexionen dieser Energie den Detektor 78 erreichen. Diese Energie kann statt dessen absorbiert werden oder aus der Nachweiskammer 74 abgeführt werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um dem Verständnis der vorliegenden Erfindung zu dienen und sollten nicht zur Einschränkung deren Umfangs ausgelegt werden. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentangaben pro Gewichtseinheit zu verstehen.
Beispiel 1: Scheibenvorrichtungen mit dampfbeschichteter Metalloberfläche
Absorbierende Scheibenuntersuchungsvorrichtungen, die eine dampfbeschichtete Metalloberfläche aufweisen und zum Nachweis und der Auszählung von Mikroorganismen in einer flüssigen Testprobe verwendet werden können, wurden wie in diesem Beispiel beschrieben hergestellt.
Eine Platte von absorbierendem nicht verwobenem zellulosischem Material (Produktgrad 903, 0,52 mm dick, 179 g/m², Schleicher und Schuell, Keene, NH) wurde auf eine Polyesterfolie (Rexam „D" Liner, Rexam Release, West Chicago, IL) mittels eines Isooctylacrylat/acrylamid (96/4 Gewichtsverhältnis) druckempfindlichen Klebstoffs (PSA) laminiert. Daraufhin wurden kreisförmige Scheiben (8 mm Durchmesser) in das getrocknete Laminat geschnitten unter Verwendung eines tiefenkontrollierten Gewindeschneiders, der nur durch das nicht verwobene Material und die Klebstoffschichten schnitt. Das Nicht-Scheibenmaterial wurde daraufhin vom Laminat entfernt und verworfen. Es wurden mit einer Pinzette vorsichtig 40 Scheiben von der Folie gelöst und auf eine 105 mm x 115 mm Platte von 2 mil (0,05 mm) dicker Polyesterfolie (Grad NAT 2,0 PET Silox H6G/0, Akrosil International Paper, Purchase, NY) zur Bildung einer 8 × 5 Anordnung kreisförmiger Scheiben mit annähernd 3–5 mm zwischen den Scheiben überführt.
Eine 105 mm × 115 mm Platte biaxial ausgerichteter Polypropylenfolie (0,04 mm dick, 3M Co.) wurde daraufhin mit doppelseitigem Klebeband auf den scheibenseitigen Rand der untersten Platte geklebt, um als Deckplatte für die Vorrichtung zu dienen. Die Vorrichtung wurde auf einen ebenen Tisch gelegt, und es wurde ein Tapetenroller über die geschlossene Deckplatte gerollt, um die Scheiben gegen die unterste Platte zu drücken. Die daraus resultierende Scheibenvorrichtung IA, eine Vergleichsvorrichtung ohne dampfbeschichtete Metalloberfläche, wurde zu Auswertungen fluoreszierender Signale in Beispiel 2 verwendet.
Eine weitere Scheibenvorrichtung wurde wie für Scheibenvorrichtung IA beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Grad NAT 2,0 PET Silox Polyesterfolie durch 7-mil (0,18 mm) dicke Polyesterfolie (3M Co., St. Paul, MN) ersetzt wurde, die mit geschätzten 70 bis 150 nm Aluminiummetall auf der Seite dampfbeschichtet wurde, auf welche die Scheiben geklebt wurden. Die daraus resultierende Vorrichtung, als Scheibenvorrichtung 1B bezeichnet und mit einer dampfbeschichteten Metalloberfläche versehen, wurde mit Scheibenvorrichtung 1A in Beispiel 2 verglichen.
Scheibenuntersuchungsvorrichtungen zur Verwendung zum Nachweis von Mikroorganismen wurden wie folgt hergestellt. Eine Platte von absorbierendem nicht verwobenem zellulosischem Material (Dextergrad 10201, 0,415 mm dick, 48,5 g/m², Dexter Nonwovens, Winsor Locks, CT) wurde auf eine Polyesterfolie (Rexam „D" Liner) wie oben beschrieben laminiert, mit der Ausnahme, dass das Material mit einer wässrigen Brühe gesättigt wurde, welche die in Tabelle 1 aufgelisteten Wachstumsnährstoffe und Indikatorchemikalien enthielt und vor der Laminierung getrocknet wurde. Daraufhin wurden kreis förmige Scheiben (8 mm Durchmesser) in das getrocknete Laminat geschnitten unter Verwendung eines tiefenkontrollierten Gewindeschneiders, der nur durch das nicht verwobene Material und die Klebstoffschichten schnitt. Das Nicht-Scheibenmaterial wurde daraufhin vom Laminat entfernt und verworfen. Es wurde daraufhin eine sterile Pinzette verwendet, um 15 Scheiben von der Vorrichtung zu lösen, und die Scheiben wurden auf eine 105 mm × 115 mm Bodenplatte aus Polyesterfolie (0,12 mm dick, 3M Co., St. Paul, MN) in einem 3 auf 5 räumlichen Muster mit annähernd 1 cm zwischen den Scheiben überführt. Eine 105 mm × 115 mm Platte biaxial ausgerichteter Polypropylenfolie (0,04 mm dick, 3M Co.) wurde daraufhin mit doppelseitigem Klebeband auf den scheibenseitigen Rand der untersten Platte geklebt, um als Deckplatte für die Vorrichtung zu dienen. Die Vorrichtung wurde auf einen ebenen Tisch gelegt, und es wurde ein Tapetenroller über die geschlossene Deckplatte gerollt, um die Scheiben gegen die unterste Platte zu drücken.
Die daraus resultierende Vorrichtung, eine Vergleichsvorrichtung ohne dampfbeschichtete Metalloberfläche, wurde als Scheibenvorrichtung 1C bezeichnet und wurde zum Nachweis von Bakterien, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet. Eine weitere Scheibenvorrichtung wurde wie für Scheibenvorrichtung 1C beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass die 0,12 mm dicke Polyesterfolie durch 7-mil (0,18 mm) dicke Polyesterfolie (3M Co.) ersetzt wurde, die wie oben beschrieben mit Aluminiummetall auf der Seite dampfbeschichtet wurde, auf welche die Scheiben geklebt wurden. Die daraus resultierende Vorrichtung, als Scheibenvorrichtung 1D bezeichnet und mit einer dampfbeschichteten Metalloberfläche versehen, wurde mit Scheibenvorrichtung 1C in Beispiel 3 verglichen. Beide Scheibenvorrichtungen 1C und 1D wurden bis zu einem Niveau von etwa 10 kGy gammabestrahlt, bevor sie in Beispiel 3 verwendet wurden.
Beispiel 2: Messung des Fluoreszenssignals von Scheibenvorrichtungen
Das Ziel dieses Beispiels war es, die Intensität der Fluoreszenssignale, die von einer in dem nicht verwobenen Material der Scheibenvorrichtungen 1A und 1B vorkommenden Verbindung abgegeben werden, zu messen und zu vergleichen.
Jeder der nicht verwobenen Scheiben von Scheibenvorrichtung 1A (ohne Metalloberfläche) und Scheibenvorrichtung 1B (welche eine Metalloberfläche aufweist) wurden, nach vorsichtigem Abheben der Deckfolie, 15 Mikroliter einer Lösung zugefügt, die von 0 bis 500 mmol/ml 4-Methylumbelliferon enthielt. Die Deckfolie wurde daraufhin sacht abgesenkt, um die Vorrichtungen zu verschließen. (Es wird bemerkt, dass 4-Methylumbelliferon das Endprodukt der Reaktion von beispielsweise 4-Umbelliferylphosphat und dem mikrobiellen Enzym Phosphatase ist. Diese Reaktion ist dienlich zum Nachweis des Vorkommens von Bakterien, da 4-Methylumbelliferon unter ultraviolettem Licht fluoresziert.) Es wurden bei jeder Kozentration von 4-Methylumbelliferon vier Messungen mit einem auf die Bedürfnisse zugeschnittenen Fluoreszensdetektor durchgeführt. Die CCD Kamerablende war bei allen Messungen konstant, und die Belichtungszeit betrug 10, 20, 40 und 60 msec. Die unbearbeiteten Bilder wurden unter Verwendung der Adobe Photoshop v. 5.0 Bildanalysesoftware (Adobe Systems Inc., San Jose, CA) analysiert. Das elliptische Auswahlwerkzeug mit einem eingeschränkten Verhältnis von Bildbreite zu Bildhöhe wurde verwendet, um einen Bereich innerhalb jeder Scheibe auszuwählen, der in etwa mindestens 70–80 % des Scheibenbilds entsprach. Innerhalb des ausgewählten Bereiches wurde die durchschnittliche Pixelfluoreszens bestimmt und die Ergebnisse werden in relativen Fluoreszenseinheiten (RFU) in Tabelle 2 angegeben.
Der auf die Bedürfnisse zugeschnittene Fluoreszensdetektor bestand aus einer CCD Kamera (entworfen mit einem schwarzweiß CCD Chip, Produkt Nr. ICX084AK, Sony Corp., Japan), ultravioletter Beleuchtung (365 nm), reflektierenden Wänden und einer flachen Oberfläche, die eine Scheibenvorrichtung halten konnte. Die Kamera wurde so aufgestellt, dass sie den Scheiben in einem Abstand von annähernd 20 cm gegenüber stand, und ein 1mm dicker Filter (GG420, Schott Glas, Deutschland) wurde vor der Kamera platziert. Die Scheiben wurden von zwei ultravioletten Lampen (Produkt Nr. BF3160UV1, JKL Co., Pacoima, CA) beleuchtet, welche auf beide Seiten der Kamera platziert wurden. Ein 1 mm dicker Filter (UG11, Schott Glas) wurde vor den Lampen platziert. Die Wände des Detektors waren reflektierend, um die Bereitstellung einer einheitlichen Beleuchtung der Scheiben zu fördern. Wenn Fluoreszens auftrat, wies die Kamera das resultierende sichtbare Licht nach.
Die Daten in Tabelle 2 zeigen, dass die Scheibenvorrichtung 1A (ohne dampfbeschichtete Metalloberfläche) einen höheren Grad an Hintergrundfluoreszens erzeugte als die Scheibenvorrichtung 1B (welche eine dampfbeschichtete Metalloberfläche aufweist) (51,5 RFU gegenüber 32,3 RFU bei 0 mmol/ml 4-Methylumbelliferon). Die Daten zeigen ferner, dass die Scheibenvorrichtung B auf allen Konzentrationsniveaus von 4-Methylumbelliferon ein höheres Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erzeugte als die Scheibenvorrichtung A. Beispielsweise betrug das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis von Scheibenvor richtung B bei 500 mmol/ml 4-Methylumbelliferon 3,1 gegenüber 1,5 bei Scheibenvorrichtung A. Daraus wird geschlossen, dass die Verwendung einer Scheibenvorrichtung mit einer dampfbeschichteten Metalloberfläche die Vorteile sowohl einer verringerten Hintergrundfluoreszens als auch erhöhter Fluoreszenssignal-zu-Hintergrund Niveaus bieten.
Beispiel 3: Nachweis von Bakterien mit Scheibenvorrichtungen
Das Ziel dieses Beispiels war es, die Intensität der Fluoreszenssignale, die von den in dem nicht verwobenen Material der Scheibenvorrichtungen 1C (ohne Metalloberfläche) und 1D (welche eine Metalloberfläche aufweist) vorkommenden wachsenden E. coli Bakterien abgegeben werden, zu messen und zu vergleichen.
Eine Übernachtklultur von E. coli Bakterien [(QC Stamm P6), über Nacht in tryptischer Sojabrühe (Remel, Inc., Lenexa, KS) angezogen] wurde in Butterfield's Phosphatpuffer (Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA) verdünnt, um Verdünnungsfaktoren von 10^–3, 10^–4, 10^–5 und 10^–6 zu erhalten. Steriler Butterfield's Phosphatpuffer wurde als Negativkontrolle verwendet. Diese Verdünnungsfaktoren entsprechen Zelldichten von annähernd 10⁵, 10⁴, 10³ beziehungsweise 10² Kolonie bildenden Einheiten pro ml.
Die Deckfolie der Scheibenvorrichtungen 1C und 1D (2 Replikate/Vorrichtung) wurde vorsichtig abgehoben und jede Scheibe einer jeden Vorrichtung wurde mit 15 Mikrolitern jeder Verdünnung (jeweils 3 Replikate) oder der Lösung der Negativkontrolle (3 Replikate) inokuliert. Die Deckfolie wurde sacht abgesenkt, um die Vorrichtungen zu verschließen, und diese wurden in „GLADLOCK ZIPPER" Aufbewahrungsbeuteln (First Brands Corporation, Danbury, CT), von denen jeder ein mit Wasser angefeuchtetes Papierhandtuch enthielt, eingeschlossen. Die verschlossenen Beutel wurden in einen Inkubator bei 35 °C überführt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Fluoreszensbilder der Vorrichtungen unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen auf die Bedürfnisse zugeschnittenen CCD Kamera erhalten. Es wurde eine Belichtungszeit von 5 Millisekunden verwendet und die Blende der CCD Kamera blieb bei allen Bildern konstant.
Die unbearbeiteten Bilder des Detektors wurden unter Verwendung der Adobe Photoshop v. 5.0 Bildanalysesoftware wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert, und die daraus resultierenden Daten werden in Tabelle 3 dargestellt.
Die Daten in Tabelle 3 zeigen, dass die Scheibenvorrichtung 1D (die eine dampfbeschichtete Metalloberfläche aufweist) bei allen Verdünnungsgraden ein höheres Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erzeugt als die Schei benvorrichtung 1C (ohne dampfbeschichtete Metalloberfläche). Beispielsweise betrug bei einem Verdünnungsfaktor von 10^–3 das Signal-zu-Hintergrund-Niveau der Scheibenvorrichtung D 5,4 gegenüber 3,1 bei der Scheibenvorrichtung C. Die Daten zeigen ferner, dass die Signal RFU jeder Vorrichtung im Wesentlichen nicht von der E. coli Verdünnung abhängig waren. Dieses Ergebnis erklärt sich aus der 24 Stunden Wachstumsperiode, nach der sämtliche Scheiben annähernd dieselbe Anzahl von Bakterien enthalten sollten. Aus diesem Beispiel wird geschlossen, dass die Verwendung einer Scheibenvorrichtung mit dampfbeschichteter Metalloberfläche den Vorteil erhöhter Fluoreszenssignal-zu-Hintergrund Niveaus bietet.

Claims

Vorrichtung zur Kultur von Mikroorganismen aufweisend: ein Substrat (20; 120; 120'; 220); mehrere dem Substrat (20; 120; 120'; 220) beigefügte flüssigkeitsrückhaltende Scheiben (40; 140; 140'), wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') erste und zweite gegenüberliegende Flächen (42, 44; 142, 144; 142', 144') aufweist und wobei mindestens eine der Scheiben (40; 140; 140') Nährmedien zur Steigerung des Wachstums von Mikroorganismen aufweist; sowie einen Reflektor (30; 130; 130') proximal zu der ersten Fläche (42; 142; 144') jeder der Scheiben (40; 140; 140'), wobei elektromagnetische Energie ausgewählter Wellenlängen nach dem Durchtritt durch die Scheibe (40; 140; 140') von dem Reflektor (30; 130; 130') reflektiert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') ein Nachweisreagenz und/oder einen fluorogenen Indikator aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') faserartiges Material aufweist.
Vorrichtung zur Kultur von Mikroorganismen aufweisend: ein Substrat (20; 120, 120'; 220); mehrere dem Substrat (20; 120, 120'; 220) beigefügte flüssigkeitsrückhaltende Scheiben (40; 140; 140'), wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') erste und zweite gegenüberliegende Flächen (42, 44; 142, 144; 142', 144') aufweist und jede der Scheiben (40; 140; 140') faserartiges Material aufweist; sowie einen Reflektor (30; 130; 130') proximal zu der ersten Fläche (42; 142; 144') jeder der Scheiben (40; 140; 140'), wobei elektromagnetische Energie ausgewählter Wellenlängen nach dem Durchtritt durch die Scheibe (40; 140; 140') von dem Reflektor (30; 130; 130') reflektiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') ein Nachweisreagenz und/oder einen fluorogenen Indikator und/oder Nährmedien aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Substrat (20; 120; 120') elektromagnetische Energie der ausgewählten Wellenlängen reflektiert und wobei ferner der Reflektor (30; 130) proximal zu der ersten Fläche (42; 142) jeder der Scheiben (40; 140) das Substrat (20; 120; 220) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Reflektor (30; 130) proximal zu der ersten Fläche (42; 142) jeder der Scheiben (40; 140) eine reflektierende Schicht aufweist, die sich zwischen jeder der Scheiben (40; 140) und dem Substrat (20; 120; 220) befindet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Substrat (20) eine Substratfläche aufweist und der Reflektor (30) proximal zu der ersten Fläche (42) jeder der Scheiben (40) eine reflektierende Schicht aufweist, die sich zwischen jeder der Scheiben (40) und der Substratfläche (22) befindet und wobei ferner die reflektierende Schicht im Wesentlichen mit der Substratfläche (22) koextensiv ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Reflektor (30; 130) proximal zu der ersten Fläche (42; 142) jeder der Scheiben (40; 140) eine reflektierende Schicht aufweist, die sich zwischen jeder der Scheiben (40; 140) und dem Substrat (20; 120; 220) befindet und wobei ferner die Scheiben (40; 140) auf dem Substrat (20; 120; 220) voneinander abgetrennt sind, wobei der Raum zwischen den Scheiben (40; 140) einen Bereich (14;114) auf dem Substrat (20; 120; 220) definiert, wobei mindestens ein Teil des Bereichs (14, 114) im Wesentlichen frei von der reflektierenden Schicht ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Reflektor (30; 130; 130') proximal zu der ersten Fläche (42; 142; 144') jeder der Scheiben (40; 140; 140') im Wesentlichen ausgewählte Wellenlängen elektromagnetischer Energie übertragen kann.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die ferner einen Klebstoff (50; 150) zwischen jeder der Scheiben (40; 140) und dem Substrat (20; 120) aufweist, wobei der Klebstoff (50; 150) eine Indikatorsubstanz zum Nachweis von Mikroorganismen in den Scheiben (40; 140) aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Scheiben mindestens erste und zweite Scheibensätze (240a; 240b) aufweisen, wobei jeder der Sätze (240a; 240b) mehrere Scheiben von einheitlicher Größe aufweist und wobei ferner die Scheiben im ersten Satz (240a) größer als die Scheiben im zweiten Satz (240b) sind.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Reflektor (30; 130) proximal zu der ersten Fläche (42; 142) jeder der Scheiben (40; 140) eine metallische Schicht aufweist, die sich zwischen jeder der Scheiben (40; 140) und dem Substrat (20; 120) befindet.
Verfahren zum Nachweis mindestens eines Zielmikroorganismus aufweisend: Bereitstellung einer Scheibenanalysevorrichtung aufweisend ein Substrat (20; 120; 120'; 220), mehrere dem Substrat (20; 120; 120'; 220) beigefügte flüssigkeitsrückhaltende Scheiben (40; 140; 140'), wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') erste und zweite gegenüberliegende Flächen (42,44; 142, 144; 142', 144') aufweist sowie einen Reflektor (30; 130; 130') proximal zu der ersten Fläche (42; 142; 144') jeder der Scheiben (40; 140; 140'), und wobei mindestens eine der Scheiben (40; 140; 140') ferner Nährmedien zur Steigerung des Wachstums von Mikroorganismen, eine Indikatorsubstanz und einen Zielmikroorganismus aufweist; Nachweis von Anregungsenergie an der Scheibenanalysevorrichtung sowie Nachweis von Signalenergie, die von jeder der Scheiben (40; 140; 140'), welche den Zielmikroorganismus aufweist, als Reaktion auf die Anregungsenergie abgegeben wird, wobei mindestens ein Teil der Signalenergie von dem Reflektor (30; 130; 130') reflektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14 ferner aufweisend: Zusammenführung der Scheiben (40; 140; 140') mit einer flüssigen Probe, die den Zielmikroorganismus aufweist, wobei mindestens ein Teil der flüssigen Probe innerhalb mindestens einer der Scheiben (40; 140; 140') gespeichert wird und Inkubierung der gespeicherten flüssigen Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, wobei der Reflektor (30; 130) proximal zu der ersten Fläche (42; 142) jeder der Scheiben (40; 140) eine metallische Schicht aufweist, die sich zwischen jeder der Scheiben (40; 140) und dem Substrat (20; 120) befindet.
Verfahren zur Herstellung einer Scheibenanalysevorrichtung aufweisend: Bereitstellung eines Substrats (20; 120; 120'; 220); Anordnung mehrerer flüssigkeitsrückhaltender Scheiben (40; 140; 140') auf dem Substrat (20; 120; 120'; 220), wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') erste und zweite gegenüberliegende Flächen (42, 44; 142, 144; 144', 142') aufweist und wobei mindestens eine der Scheiben (40; 140; 140') Nährmedien zur Steigerung des Wachstums von Mikroorganismen aufweist; sowie Bereitstellung eines Reflektors (30; 130; 130') proximal zu der ersten Fläche (42; 142; 144') jeder der Scheiben (40; 140; 140'), wobei elektromagnetische Energie ausgewählter Wellenlängen nach dem Durchtritt durch die Scheibe (40; 140; 140') von dem Reflektor (30; 130; 130') reflektiert wird.
Verfahren zur Herstellung einer Scheibenanalysevorrichtung aufweisend: Bereitstellung eines Substrats (20; 120; 120'; 220); Anordnung mehrerer flüssigkeitsrückhaltender Scheiben (40; 140; 140') auf dem Substrat (20; 120; 120'; 220), wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') erste und zweite gegenüberliegende Flächen (42, 44; 142, 144; 144', 142') aufweist und wobei jede der Scheiben (40; 140; 140') faserartiges Material aufweist sowie Bereitstellung eines Reflektors (30; 130; 130') proximal zu der ersten Fläche (42; 142; 144') jeder der Scheiben (40; 140; 140'), wobei elektromagnetische Energie ausgewählter Wellenlängen nach dem Durchtritt durch die Scheibe (40; 140; 140') von dem Reflektor (30; 130; 130') reflektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Bereitstellung des Reflektors (30; 130) proximal zu der ersten Fläche (42; 142) jeder der Scheiben (40; 140) die Bereitstellung einer metallischen Schicht aufweist, die sich zwischen jeder der Scheiben (40; 140) und dem Substrat (20; 120) befindet.