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Die Erfindung betrifft ein Sensorsystem zur Charakterisierung von in einem Kultivierungsgefäß enthaltenen Proben einer heterogenen Biomassestruktur. Heterogene Biomassestrukturen sind insbesondere pflanzliche Zell- und Gewebekulturen (Hairy roots) sowie filamentöse Mikroorganismen.
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Für die wirtschaftliche Auslegung, Optimierung und Überwachung von biotechnologischen Prozessen ist es erforderlich, Organismen durch kinetische Modelle zu beschreiben. Zur Quantifizierung von netzwerkartigen, filamentösen Biomassestrukturen, wie zum Beispiel für pflanzliche Hairy root-Kulturen, Pilze oder Makroalgen sind bisher etablierte Methoden zur Biomassebestimmung und der daraus resultierenden Wachstumskinetik nur unter hohem Zeitaufwand oder gar nicht anwendbar.
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Derzeit können netzwerkartige, heterogene Biomassestrukturen, wie z.B. filamentöse Biomassestrukturen, insbesondere die pflanzlichen Hairy-root-Kulturen nur unzureichend mit bekannten Methoden beschrieben und deren Kultivierung und deren Wachstum bewertet werden.
Bisher kamen meist indirekte Methoden zum Einsatz, da eine repräsentative Probennahme der heterogenen Biomasse nicht möglich ist. Die Zellen sind nicht homogen im Reaktorvolumen verteilt, sondern liegen als Netzwerk vor. Die Bewertung und Charakterisierung erfolgte mittels
- - Gravimetrische Bestimmung
- - Bildanalyse
- - Bestimmung der Leitfähigkeit und Substratverbrauch
- - Bestimmung der Stoffwechsel-/Atmungsaktivität/Sauerstofftransfer
- - Impedanzspektroskopie
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Diese fünf genannten Methoden zur Bestimmung von netzwerkartigen Biomassestrukturen beschreiben die Biomasse nur unzureichend. Die Bestimmung der Biomasse durch indirekte Methoden, wie die Impedanzspektroskopie, die Leitfähigkeits- und Substratverbrauchsbestimmung aus dem Nährmedium oder die Bestimmung der Atmungsaktivität setzen zum einen meist spezielle Gerätschaften voraus und zum anderen sind durch die ungenaue Bestimmung eine hohe Anzahl an Messwerten erforderlich. Dadurch sind diese Methoden meist sehr kosten- und zeitintensiv. Zudem muss zur Probennahme in das sterile Kultivierungssystem eingegriffen werden. Dies erhöht aber das Risiko einer Kontamination und verursacht einen kontinuierlichen Volumenverlust des Nährmediums.
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Bei der direkten gravimetrischen Bestimmung erfolgt eine genaue Bestimmung der Biotrockenmasse nur dann wenn eine hohe Anzahl an einzelnen Bestimmungen vorgenommen wird. Die gravimetrische Biomassebestimmung ist aber durch den Trocknungsprozess und durch die Mehrfachbestimmung sehr zeitaufwändig. Eine weitere Kultivierung der getrockneten Biomasse einer Probe ist später nicht mehr möglich. Zudem ist eine hohe Anzahl an Versuchsansätzen notwendig und der Prozess wird durch die Entnahme der Biomasse unterbrochen bzw. beendet.
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Bei der Durchführung einer Bildanalyse ist nur eine zweidimensionale Beschreibung der Biomassestruktur möglich. Eine qualitative Aussage über das gesamte Netzwerk (3-D Struktur) ist bisher mit der einfachen Bildanalyse nicht erreichbar.
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So ist aus
DE 103 50 243 A1 eine Belichtung für ein in Situ Mikroskop durch induzierte Emission mit verhinderten Beugungsstrukturen bekannt.
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WO 2010/066751 A1 betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bewegungs-, Form- und/oder Deformationsmessung von Objekten.
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Eine zeitaufgelöste Analyse und/oder Visualisierung dynamischer Prozesse in dynamischen biologischen Systemen geht aus
DE 199 30 598 A1 hervor.
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Pseudovirale Partikel und ein Verfahren zu deren Herstellung sind in
EP 0 922 105 B1 offenbart.
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EP 2 134 642 B1 betrifft ein Verfahren zur spektroskopischen Erkennung von Tumoren.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten für eine einfache, kostengünstige Charakterisierung von heterogenen Biomassestrukturen anzugeben, die in situ durchführbar sind und bei denen kein Eingriff in das steril zu haltende Kultivierungssystem während der Kultivierung von außen genommen werden muss.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einem Sensorsystem, das die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist, gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung können mit in untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen realisiert werden.
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Die Laser-Speckle-Photometrie (LSP) zur Charakterisierung heterogener Biomassestrukturen ist ein dafür neues, schnelles und innovatives Verfahren. Es existieren bisher keine Anwendungen und Systeme, die eine einfache Detektion der heterogenen Biomassestrukturen mit Hilfe der LSP ermöglichen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Sensorsystem sind an einem Kultivierungsgefäß fluiddicht ein steril befestigbarer Adapter, mindestens eine monochromatische Lichtquelle und ein optischer Detektor, der zur ortsaufgelösten Erfassung von elektromagnetischer Strahlung, die von Oberflächen der Probe ausgebildet ist, angeordnet.
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In einer zweiten erfindungsgemäßen Alternative ist ein optischer Detektor, der zur ortsaufgelösten Erfassung von elektromagnetischer Strahlung, die von Oberflächen einer jeweiligen Probe reflektiert wird, ausgebildet ist, am Adapter befestigbar und mehrere Lichtquellen sind an der Außenwand des Kultivierungsgefäßes um eine im Kultivierungsgefäß angeordnete Probe angeordnet. Die mehreren Lichtquellen können an einem ring- oder rahmenförmigen Adapter fixiert sein. Die Lichtquellen sollten dabei so angeordnet werden können, dass von ihnen emittierte elektromagnetische Strahlung in mindestens einer Ebene emittiert wird, in der eine Probe angeordnet ist. Das Kultivierungsgefäß sollte dabei zumindest in Bereichen, in den elektromagnetische Strahlung in das Innere des Kultivierungsgefäßes emittiert wird, für die elektromagnetische Strahlung transparent sein.
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Mehrere Lichtquellen sollten in einem Abstand zueinander angeordnet sein.
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Die jeweilige Probe sollte möglichst vollständig oder zumindest in einem partiellen Bereich erfolgen und eine Aufnahme von Speckle-Bildern in oberflächennahen Bereichen und Tiefenbereichen der Probe ermöglichen. Die elektromagnetische Strahlung sollte auch das Innere der jeweiligen Probe erreichen können.
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Der Detektor ist an eine elektronische Auswerteeinheit angeschlossen, die zur orts- und zeitaufgelösten Erfassung und Auswertung vom Detektor erfassten von den Oberflächen der Probe reflektierten Licht bzw. zu detektierenden Speckle-Bildern aus denen die jeweiligen zeitlichen Unterschiede in deren Skaleneigenschaften und der Speckle-Kontrast k bestimmbar sind, ausgebildet ist.
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Als Lichtquellen können bevorzugt Laserdioden und als Detektor eine Reihen- und Spaltenanordnung von Einzeldetektoren, insbesondere eine CMOS oder CCD Kamera eingesetzt werden.
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Der Adapter sollte mit mindestens einem standardisierten Befestigungselement am Kultivierungsgefäß befestigt werden können und/oder autoklavierbar ausgebildet sein. Bevorzugt ist dabei eine Schraubverbindung, wie sie üblicherweise bereits an herkömmlichen Laborgefäßen und/oder Bioreaktoren vorhanden ist, die zu einer Kultivierung von biologischen Proben bereits genutzt werden.
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Vor einem Detektor kann mindestens eine, die Abbildung der von Oberflächen der jeweiligen Probe reflektierten elektromagnetischen Strahlung, verbessernde optische Linse angeordnet sein. Mindestens eine optische Linse sollte zwischen der Probe und dem Detektor, bevorzugt an der Öffnung des Kultivierungsgefäßes angeordnet und besonders in der Öffnung passgenau fixierbar sein. Dadurch kann mit der mindestens einen optischen Linse ein steriler Verschluss des Kultivierungsgefäßes erreicht werden. Die mindestens eine optische Linse kann vor der Montage am Kultivierungsgefäß sterilisiert, bevorzugt dampfsterilisiert werden. Zur verbesserten Abdichtung kann die mindestens eine optische Linse in einem zumindest teilweise elastisch verformbaren und sterilisierbaren Rahmen am äußeren Rand eingefasst und der jeweilige Rahmen in die Öffnung passgenau einsetzbar sein.
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Vorteilhaft sollte der Detektor allein oder der Detektor in Verbindung mit mindestens einer optischen Linse so ausgebildet sein, dass die Bewegungs- und Beschaffenheitseigenschaften der jeweiligen Probe zumindest partiell, bevorzugt vollständig auf dem sensitiven Bereich des Detektors abgebildet werden können.
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Vorteilhaft kann die Position der Lichtquelle(n) und/oder die Ausrichtung der optischen Achse der Lichtquelle(n) am Adapter verändert werden, so dass eine Anpassung an die Größe, geometrische Form oder der Position einer im Kultivierungsgefäß angeordneten Probe besser berücksichtigt werden kann. Dabei kann der Abstand und/oder der Winkelabstand der Lichtquellen zwischen den Lichtquellen verändert werden. Dazu kann beispielsweise für jede Lichtquelle eine entsprechende abgedichtete Langlochführung am Adapter ausgebildet sein, in der eine Lichtquelle bewegt und somit positioniert werden kann. Die Langlochführungen können geradlinig oder gekrümmt ausgebildet sein.
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Die Ausrichtung der optischen Achsen, der von den Lichtquellen emittierten elektromagnetischen Strahlung, kann mittels Gelenken, beispielsweise Kugelgelenken, verändert und dementsprechend an die momentanen Verhältnisse innerhalb des Kultivierungsgefäßes angepasst werden.
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Mehrere Lichtquellen können jeweils einzeln ein- und ausgeschaltet werden. Dabei ist aber gleichzeitig während einer Charakterisierung mindestens eine Lichtquelle eingeschaltet. Dabei kann eine jeweilige Probe bevorzugt homogen beleuchtet werden.
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Die Erfindung bietet ein einfaches Adaptersystem an Kultivierungsgefäßen zur Anwendung der Laser-Speckle-Photometrie an biologischen Objekten. Durch die Erfindung kann eine schnelle, kostengünstige, nichtinvasive, online Messung und Bewertung erfolgen. Die Erfindung nutzt ein Sensorsystem mit einem modular aufgebauten Adapter. Der Adapter weist einen modifizierten, autoklavierbaren, genormten Verschluss, insbesondere einen Schraubverschluss, mindestens eine optische Linse und eine Halterung für die Lichtquelle(n) (insbesondere Laserdioden) und eine Kamera (Detektor) auf.
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Das Sensorsystem kann an bestehende Kultivierungssysteme einfach adaptiert werden und erfordert zur Anwendung der Laser-Speckle-Photometrie keinen erheblichen Mehraufwand oder das Eingreifen in den Kultivierungsprozess.
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Zur Charakterisierung der Biomassestruktur werden von der jeweiligen zu untersuchenden Probe, während des laufenden Kultivierungsprozesses, Speckle-Bilder aufgenommen. Die Speckle-Bilder werden durch die Bestrahlung des Objektes von mindestens einer, im Adapter montierten Lichtquelle, bevorzugt mindestens einer monochromatischen Laserdiode erzeugt. Die von den Oberflächen der Probe reflektierte elektromagnetische Strahlung wird auf eine im Adapter justierte Kamera als Detektor abgebildet und orts- und zeitaufgelöst erfasst. Die orts- und zeitaufgelöst erfassten Daten können über eine spezielle Software mit Hilfe von Auswertealgorithmen mittels einer elektronischen Auswerteeinheit analysiert und die jeweiligen Parameter dem Anwender ausgegeben oder angezeigt werden.
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Durch die mögliche Verwendung von standardisierten Passungen und Gewinden aus dem Laborbereich (GL), sowie des modularen Aufbaus des Sensorsystems, ist es möglich, das Sensorsystem beispielsweise sowohl zur Anwendung an Schüttelkolben als auch an Bioreaktoren einzusetzen. Da die Beleuchtungsrichtung insbesondere mit Laserstrahlung zur erfolgreichen Anwendung der LSP notwendig und nicht für jedes Kultivierungssystem gleich ist, kann die Anordnung der Lichtquellen (Laserdioden) nicht fest vorgegeben werden. Das Sensorsystem sollte also mit einem Lasermodul, mit dem die Laserdioden an das bestehenden biologischen Kultivierungssystem angepasst werden können, erweitert werden, wie dies beispielhaft vorab bereits erläutert worden ist.
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Mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Sensorsystems kann die Laser-Speckle-Photometrie, als ein neues, nichtinvasives Verfahren, zur Charakterisierung von Biomassestrukturen in biotechnologischen Prozessen, eingesetzt werden. Dadurch können heterogene Biomassestrukturen direkt und nichtinvasiv mittels der Laser-Speckle-Photometrie charakterisiert werden, was in kurzer Zeit und kostengünstig, ohne Störung im Kultivierungsgefäß oder am jeweiligen Organismus einer Probe möglich wird. Das Sensorsystem ist zudem mit geringem technischem Aufwand an bestehende Kultivierungssysteme adaptierbar.
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Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden.
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Dabei zeigt:
- 1 in schematischer Form den Aufbau eines Beispiels eines erfindungsgemäßen Sensorsystems;
- 2 zwei perspektivische Darstellungen eines Adapters mit zwei Lichtquellen, einem Detektor und einer optischen Linse und
- 3 eine perspektivische Darstellung eines an der Außenwand eines Kultivierungsgefäßes anordenbaren ringförmigen Adapters mit mehreren Lichtquellen.
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Dabei ist in einem Kultivierungsgefäß 1, hier ein herkömmlicher 500 ml Weithalsschüttelkolben, eine Probe 2 in einem Kultivierungsmedium aufgenommen. Das Kultivierungsmedium sollte für die von den bei diesem Beispiel zwei Laserdioden 3, als Lichtquellen, emittierte elektromagnetische Strahlung zu mindestens 50 % transparent sein.
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Am Kultivierungsgefäß 1 ist ein Adapter 4 mit einem Schraubverschluss fluiddicht befestigt, es handelt sich dabei um einen genormten Schraubverschluss. Das Kultivierungsgefäß 1 wird mit einer optischen Linse 7 steril verschlossen. Dazu kann die ggf. in einem äußeren Rahmen eingefasste optische Linse 7 in die Öffnung des Kultivierungsgefäßes 1 passgenau eingesetzt und mit dem Schraubverschluss und dem Adapter 4 dort fixiert sowie die Öffnung des Kultivierungsgefäßes während der Charakterisierung steril verschlossen gehalten werden.
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Zwischen den Laserdioden als Lichtquellen 3 ist eine CCD-Kamera als Detektor 5 angeordnet und an eine elektronische Auswerteeinheit 6, in diesem Fall einen Personal Computer angeschlossen. Ganz rechts in 1 sind zwei verschiedene Perspektiven eines mit den Laserdioden als Lichtquellen 3 und einer Kamera als Detektor 5 bestückten Adapters 4 gezeigt. Der Adapter 4 besteht aus einem wärmebeständigen Polymer beispielsweise Polyethylen und hat ein Gewinde für eine Verschraubung an der Öffnung des Kultivierungsgefäßes. Im Bereich der Öffnung des Kultivierungsgefäßes 1 ist außen ein komplementäres Gewinde ausgebildet. Im Adapter 4 ist eine Dichtung im Bereich, der mit der Stirnfläche des Kultivierungsgefäßes 1 an deren Öffnung im aufgeschraubten Zustand in Kontakt steht und eine fluiddichte Abdichtung bildet.
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Die Justierung des Adapters 4 am jeweiligen Kultivierungssystem erfolgt also über eine Schraubkappe mit einem genormten Gewinde (GL) und genormten Passungen für den Laborbereich. Dadurch wird eine einfache Adaptierung und Anwendung des Sensorsystems an verschiedene, bereits bestehende Kultivierungssysteme ermöglicht.
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Der Adapter 4 ist modular aufgebaut und unterteilt sich in einen modifizierten, autoklavierbaren Schraubverschluss, mit einer am Adapter 4 in Bezug zum Detektor 5 positionierten optischen Linse und einer Halterung für Laserdioden als Lichtquellen 3, der Kamera als Detektor 5 und nicht hitzebeständiger Bauteile.
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Die Speckle-Bilder werden bei dieser Anordnung als reflektierte Abbildungen der Oberfläche einer Probe 2 aufgenommen und orts- bzw. zeitaufgelöst erfasst und ausgewertet.
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Die Auswahl, Anzahl, insbesondere die Anzahl der gleichzeitig eingeschalteten Lichtquellen unter Berücksichtigung ihrer jeweiligen Ausrichtung und Anordnung sollte zur erfolgreichen Anwendung der LSP auf den jeweiligen Einzelfall angepasst werden können, da sie nicht für jedes Kultivierungssystem für eine optimierte Untersuchung gleich sind. Das Sensorsystem kann mit einem Lasermodul, mit dem die Laserdioden, dem bestehenden biologischen Kultivierungssystem angepasst werden, erweitert werden.
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Für eine optimale Ausleuchtung insbesondere von Proben 2 als Flüssigkulturen kann eine ringförmige Anordnung mehrerer Laserdioden als Lichtquellen 8 und reflektierenden Elementen oder Licht diffus streuenden Elementen 9 um den optisch transparenten Boden des Kultivierungsgefäßes 1 angeordnet werden. Bei diesem Beispiel sind es vier Laserdioden 8 und reflektierende Elemente 10. Mit den reflektierenden Elementen 10 kann das von den Laserdioden 8 als Lichtquellen emittierte Licht in Richtung der im Kultivierungsgefäß 1 enthaltenen Probe 2 gerichtet werden. Von dort reflektierte elektromagnetische Strahlung kann dann auf der Kamera als Detektor 5 abgebildet und wie bereits beschrieben, die erfassten Speckle-Bilder ausgewertet werden. Die Laserdioden 8 können an einem ringförmigen Adapter 11 fixiert sein, der an der Außenwand des Kultivierungsgefäßes 1 so angeordnet und dort ggf. befestigt werden kann, dass die von den Laserdioden 8 emittierte elektromagnetische Strahlung in einer Ebene emittiert wird, in der eine Probe 2 angeordnet ist. Ein Beispiel eines ringförmigen Adapters 11 ist in 3 gezeigt.
Um das biotechnologische, sterile Arbeiten zu gewährleisten werden zunächst die Kultivierungsgefäße 1 mit dem Schraubverschluss separat ohne Halterung autoklaviert. Anschließend wird der Adapter 4 mit Laserdioden als Lichtquellen 3 und CCD-Kamera als Detektor 5 auf das Kultivierungsgefäß 1 gesteckt und fixiert. Um eine Kondensation an der Oberfläche der optischen Linse (nicht gezeigt), während der Messungen zu vermeiden, kann zusätzlich ein Heizelement (ebenfalls nicht gezeigt) angebracht bzw. vorhanden sein. Das Sensorsystem wurde für die Kolbenkultivierung auf Feststoffmedium und Schüttelkolbenkultivierung mit flüssigem Medium konstruiert.
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Das beschriebene Sensorsystem kann aber ebenfalls an Bioreaktoren als eine mögliche Form eines Kultivierungsgefäßes 1 eingesetzt werden. Dabei werden genormte Gewinde und Passungen aus dem Laborbereich zur Konstruktion der Schraubkappen als Adapter 4 verwendet. Die Lichtquellen 3, insbesondere Laserdioden können, je nach Bedarf, individuell angepasst werden Die Auswahl der Wellenlänge, der von den Lichtquellen 3 emittierten elektromagnetischen Strahlung kann unter Berücksichtigung des jeweiligen im Kultivierungsgefäß 1 enthaltenen Kultivierungsmedium und/oder der jeweiligen zu untersuchenden Probe 2 getroffen werden.
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Die Algorithmen zur Charakterisierung der Biomasse sollten für inline-Messungen angepasst sein. Die Aufnahme der von einer Probe 2 reflektierten Speckle-Bilder sollte bei hohen Frequenzen im Bereich 200 bis 1000 kHz und ohne Störeffekte, wie z.B. direkte Reflexion von Wänden eines Kultivierungsgefäßes 1, sowie ohne Unterbrechung der Schüttelbewegung eines Kultivierungsgefäßes realisiert werden. Darüber hinaus beinhaltet der Algorithmus die mathematische Lösung die orts- und zeitaufgelöst erfassten Messwerte/Daten auszuwählen und zu bewerten.
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Die bestrahlten Oberflächen der Biomasse der jeweiligen Probe werden zunächst mittels dynamischen, zeitlichen Abfolgen der erfassten Speckle-Bilder (bzw. der Videos) durch eine orts- und zeitaufgelöste Auswertung charakterisiert. Aus den jeweiligen zeitlichen Unterschieden lassen sich die Skaleneigenschaften (wie Fraktalität) und der Speckle-Kontrast k berechnen.
Die Biomasse kann außerdem durch statische Abbildungen (bzw. Einzelbilder) anhand der räumlichen Auswertung evaluiert werden. Für die räumliche Auswertung sollten alle unten beschriebenen Auswerteparameter berechnet werden.
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Folgende Auswertealgorithmen zur Bewertung des Biomassezustands einer Probe 2 können genutzt werden:
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• Die fraktale Dimension:
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Zur Bewertung der aktuellen Biomassekonzentration einer Probe
2 erfolgt die Bestimmung der Skaleneigenschaften der erfassten Speckle-Bilder. Die Validierung der Skaleneigenschaften erfolgt mittels des Verfahrens der Differenz-Autokorrelationsfunktion (
DAKF) nach Gleichung (1). Es wird jeweils der Zusammenhang derselben Messgröße zu verschiedenen Zeitpunkten t und t + τ untersucht und als Funktion der Differenz τ dargestellt.
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N ist dabei die Anzahl der Zeitwerte t
i der Reihe S(t
i) und τ
m ein diskreter Zeitversatz. Das fraktale Verhalten der Zeitreihe drückt sich dann im algebraischen Zeitverhalten von C(τ) aus:
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Bei einer räumlichen Auswertung wird die DAKF nach Gleichung (3) zur Bewertung des graphischen Zusammenhangs der mittleren Varianz zweier Werte in Abhängigkeit von ihrem Abstand herangezogen. Es wird jeweils der Zusammenhang derselben Messgröße an verschiedenen Positionen in einer Grauwertabbildung Z
τ(x,y) untersucht. Die Distanzen x und y sind die Koordinaten des Gauwertes Z
τ in der Abbildung.
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N
x und N
y sind die Anzahl der Grauwerte in
x- bzw.
y-Richtung der Abbildung. Die DAKF wird zeilenweise berechnet und dabei ρ waagerecht verändert. Das fraktale Verhalten drückt sich dann im algebraischen Zeitverhalten von C(p) ¤ aus:
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Die Bewertung der Aktivität der jeweiligen Probe 2 kann durch die Berechnung des Speckle-Kontrasts k erfolgen. Bei der Darstellung der zeitaufgelösten Kontrastwerte sind immer die Bereiche mit der höchsten Änderung bzw. dem größten Wachstum der jeweiligen Probe 2 mit einem niedrigen Kontrast versehen.
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Der Kontrast der orts- und zeitaufgelöst erfassten Messwerte, als Eigenschaft der erfassten einzelnen Speckle-Bilder, ergibt sich aus dem Quotienten der Intensitätsstreuung, in Bezug auf die Mittelintensität, entsprechend Gleichung (5). Dabei kann die Mittelintensität ebenfalls zeit- und ortsaufgelöst berechnet werden. Der Speckle-Kontrast k quantifiziert die durch die infolge Speckle-Bewegung entstehende Unschärfe der Aufnahmen.
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Neben der fraktalen Analyse und der Auswertung des Speckle-Kontrasts k des Zeitsignals und der statischen Abbildung kann die Biomasse der jeweiligen Probe
2 mithilfe von Bildverarbeitungsmethoden zur Texturanalyse (cooccurrence matrix bzw. Grauwertübergangsmatrix) charakterisiert und zur Bewertung des Wachstumszustands der Biomasse der jeweiligen Probe
2 verwendet werden. Dazu gehören die folgenden Kenngrößen:
Energie. | (6) |
| |
Homogenität: | (7) |
mit
| |
Kontrast:
| (8) |
Korrelation
mit-1 ≤ R ≤ 1 | (9) |
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Zusätzlich kann die Entropie des Histogramms einer statischen Abbildung nach Gleichung (10) ausgewertet werden:
wobei h(i) die Häufigkeit und g der Grauwert sind.