DE3902348A1 - Plattenfoermiger objekttraeger fuer die mikroskopie - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Objektträger für die Mikroskopie und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Objektträgers.

Aus der DE-OS 24 50 797 ist ein Objektträger für Lichtmikroskopie bekannt, der in Zusammenhang mit cytologischen Untersuchungen verwendet werden kann. Der Objektträger und/oder sein Deckglas werden mit einer Schar sichtbarer paralleler Linien mit konstantem Linienabstand versehen, die durch Ätzen oder Druck auf den Objektträger bzw. das Deckglas aufgebracht sind. Der Abstand der Linien entspricht dabei dem Durchmesser des Sichtfeldes eines Mikroskopes und beträgt bei einem Mikroskop mit einem 10-fach vergrößernden Objektiv und einem 15-fach vergrößernden Okular etwa 1 mm. Am oberen Rand des Objektträgers können zwischen den Linien noch Bezugszahlen oder Bezugsbuchstaben angebracht werden, um die einzelnen Betrachtungsstreifen zwischen jeweils zwei benachbarten Linien zu kennzeichnen.

Für solche Mikroskopiervorgänge ist es nicht notwendig, das jeweils beobachtete Objekt eindeutig hinsichtlich seiner Lage auf dem Objektträger zu bestimmen. Dies mag für die in dieser Offenlegungsschrift erwähnten cytologischen Untersuchungen noch hinzunehmen sein, jedoch gibt es eine Vielzahl von anderen Mikroskopiervorgängen, in denen eine solche eindeutige Lagebestimmung wünschenswert wäre.

Dies trifft z.B. für die Rasterelektronenmikroskopie zu. In den letzten Jahren hat sich das Auflösungsvermögen von Rasterelektronenmikroskopen ständig erhöht. Das Anwendungsgebiet für die Rasterelektronenmikroskopie wächst ebenso beständig. So ist es möglich, auch kleine und kleinste Zellbestandteile, wie Chromosomen und sogar Antikörper bei hoher Auflösung im Bereich von einem Nanometer abzubilden. Objekte dieser Größenordnung, die auf einem Objektträger abgelegt sind, sind jedoch im Rasterelektronenmikroskop nur äußerst schwierig zu finden. Sie sind nämlich sehr konstrastarm, und es müssen zu ihrer Erkennung aufgrund der geringen Größe bereits hohe Anfangsvergrößerungen, 1000- bis 20000-fach, gewählt werden. Außerdem liegen sie in für die Untersuchung geeigneter Form häufig nur in sehr geringer Anzahl vor.

Bisher wurden die enormen Suchzeiten für untersuchungsgeeignete Objekte dadurch verkürzt, da8 die Objekte auf den Objektträgern in Form von Deckgläschen präpariert wurden, so da8 eine lichtmikroskopische Voruntersuchung ermöglicht wurde. Die geeigneten Objektstellen auf dem Objektträger wurden dann z.B. durch Ritzmarkierungen mit Hilfe eines Diamanten oder durch Ritzmarkierungen mit Hilfe einer Nadel nach einer Goldbesputterung oder durch Aufbringen von Markierungsobjekten, z.B. Kupferpfeilen etc., markiert.

Diese Markierungstechniken haben jedoch Nachteile. Die Auffindung einer Einzelmarkierung im Rasterelektronenmikroskop ist oft schwierig und setzt eine Dokumentation der Markierungsstelle voraus. Außerdem sollten die Markierungen sehr nahe am zu mikroskopierenden Objekt liegen, ohne dieses jedoch zu beschädigen. Ferner sind Manipulationen unter dem Lichtmikroskop routinemäßig nur schwierig durchzuführen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Objektträger anzugeben, mit dem die Lage eines zu mikroskopierenden Objektes einfach bestimmt werden kann und mit dem es ermöglicht wird, das Objekt auch bei hohen Vergrößerungen, wie sie etwa bei der Rasterelektronenmikroskopie vorkommen, ohne Schwierigkeiten auf dem Objektträger routinemäßig wiederzufinden.

Diese Aufgabe ist gemäß der Erfindung durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruches 1 angegebenen Merkmale gelöst.

Demgemäß wird der Objektträger mit zwei ineinander verschachtelten Matrixmustern markiert, wobei das eine Matrix-Teilmuster aus jeweils gleichen Elementen, z.B. Punkten, und das andere Teilmuster aus jeweils unterschiedlichen Elementen, z.B. alphanumerischen Zeichen aufgebaut ist. Die beiden Teilmuster sind in gleicher Matrixausrichtung superponiert und so angeordnet, daß der für das Auffinden eines Objektes auf dem Objektträger unter dem Mikroskop wiederzufindende Bereich immer durch Elemente beider Teilmuster eindeutig gekennzeichnet ist.

Der einfachste Aufbau eines solchen Musters ist ein in einem bestimmten Rasterabstand aufgebautes Punktmuster, wobei jeweils in einem rechtwinkligen, bzw. vorzugsweise quadratischen, durch die Eckpunkte des Rasters definierten Bereich, ein alphanumerisches Zeichen gesetzt ist, so daß die beiden Matrixmuster jeweils um einem halben Rasterabstand in zwei zueinander senkrechten Richtungen gegeneinander verschoben sind.

Innerhalb dieser Einzelmatrixbereiche kann das Punktmuster noch durch weitere Zusatzpunkte unterteilt sein.

Diese einzelnen Elemente, z.B. die Punkte oder die alphanumerischen Zeichen, sind als Erhebungen ausgebildet und vorzugsweise mit Hilfe eines Siebdruckverfahrens auf den vorzugsweise transparenten Objektträger aufgebracht. Die verwendeten Materialien für die Markierungen sind Farbstoffe, die inert gegen organische Lösungsmittel, Säuren und Laugen und auch gegen Chromschwefelsäure sind. Bei einer Verwendung des Objektträgers in Rasterelektronenmikroskopen werden diesen Farbstoffen Sekundärelektronen emittierende Materialien,

insbesondere Bleiverbindungen beigemischt. Die Farbstoffe bilden auf dem Objektträger Erhebungen, wobei durch das Siebdruckverfahren die Höhe der aufgedruckten Markierungselemente entweder insgesamt gleich ist oder zumindest wesentliche Punkte, etwa der Punktmatrix, auf gleicher Höhe gehalten werden. Diese Höhe beträgt etwa 50 µm. Diese Höhe kann je nach Bedarf variiert werden. Dies hat den Vorteil, daß beim Auflegen eines Deckglases auf den Objektträger dieses von dem Deckglas durch einen geringen Abstand getrennt ist, so daß druckempfindliche zu mikroskopierende Objekte, z.B. Zellen, wie Protoplasten oder Gewebszellen bzw. Zellstrukturen, durch das Auflegen des Deckglases nicht zerstört werden. Ebenso können dadurch zwischen dem Objektträger und dem Deckglas Lösungen, die zu mikroskopierende Objekte enthalten, "durchgesaugt" werden.

Zur Mikroskopierung werden Präparate auf einem Objektträger in herkömmlicher Weise angefertigt und geeignete Objektstellen im Lichtmikroskop ausgesucht. Diese Objektstellen, die durch die beiden Teilmuster hinsichtlich ihrer Lage eindeutig identifiziert werden können, werden z.B. auf einer vergrößerten Fotokopie des gesamten Markierungsmusters des Objektträgers eingetragen. Die Objekte können dann nach dieser Lageidentifizierung auch bei höheren Vergrößerungsfaktoren eindeutig wiedergefunden und untersucht werden. Für die Rasterelektronenmikroskopie werden die Objektträger anschließend auf die handelsüblichen Präparathalter mit Leitsilber oder Leitkohlenstoff aufgeklebt. Nach einer Besputterung, z.B.

mit Gold, können die Objektstellen im Rasterelektronenmikroskop sehr schnell aufgefunden werden, da die Markierungen als Erhebungen deutlich erkennbar sind. Insbesondere die der Druckfarbe bei dem Siebdruckverfahren zugemischten Bleiverbindungen liefern im Gegensatz zum transparenten Untergrund des Objektträgers, allgemeim Glas, eine hohe Sekundärelektronenemission, so daß selbst nach der Aufbringung dünnster Sputter-Schichten oder nach Bedampfung mit Kohlenstoff die Markierungen des Matrixmusters mit hohem Kontrast abgebildet werden.

Objektträger gemäß der Erfindung sind insbesondere vorteilhaft bei vergleichenden Untersuchungen einer größeren Anzahl unterschiedlicher Präparate. Die Größe des Objektträgers erlaubt es, gleichzeitig bis zu ca. 50 Proben, z.B. Samen, Pollen, ganze Versuchsserien mit Mikroorganismen oder verschiedenste Zellfraktionen auf den Objektträger aufzubringen und unter identischen Bedingungen zu behandeln und zu untersuchen. Die zu mikroskopierenden Objekte werden schnell aufgefunden und identifiziert, so daß sich Objektträger gemäß der Erfindung für die definierte Auffindung und Abbildung von Objekten und/oder Strukturdetails sowohl in der Lichtmikroskopie wie in der Rasterelektronenmikroskopie, insbesondere aber in der Kombination beider Methoden eignen. Durch die erwähnte Kombination von Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie wird eine routinemaßige Auffindung verschiedenster Objekte bis in den Mikrometerbereich ermöglicht.

Üblicherweise wird als Objektträger ein für sichtbares Licht transparenter Träger verwendet. Hiermit ist es möglich, dasselbe Objekt vergleichend mit verschiedenen Abbildungsverfahren zu untersuchen. Im Lichtmikroskop sind Durchlichtverfahren, Verfahren im Hinblick auf den Phasenkontrast, den Interferenzkontrast, die Auflicht­ fluoreszenz, ein Laser-Scanning- und Polarisations­ verfahren möglich. Für das Rasterelektronenmikroskop seien beispielhaft die Sekundärelektronenabbildung, die Rückstreuelektronenabbildung, die Kathodenlumineszenz und die Elementanalyse genannt.

Die Erfindung ist in einem Ausführungsbeispiel anhand der Zeichnung näher erläutert. In dieser stellen dar:

Fig. 1 eine Aufsicht auf einen Objektträger gemäß der Erfindung;

Fig. 2 einen Schnitt längs II-II in Fig. 1;

Fig. 3 einen Schnitt durch ein Detail eines Objektträgers gemäß der Erfindung mit einem aufgebrachten Deckglas;

Fig. 4 und 5 Aufsichten auf jeweils einen Teil eines Objektträgers gemäß der Erfindung mit darauf präparierten Objekten.

Ein Objektträger 1 besteht aus einer dünnen Glasplatte 2 mit Kantenlängen von z.B. 30×25 mm, auf der ein Rahmen 3 und ein regelmäßiges 5-zeiliges und 6-spaltiges Matrixmuster aus Punkten 4 mit einem horizontalen und vertikalen Rasterabstand D und alphanumerische Zeichen 5 (0, 1, ..., 5, A, D, ..., W, X) aufgebracht sind, wobei die einzelnen Bereiche des Punktrasters noch durch kleinere Punkte 6 regelmäßig unterteilt sind. Die alphanumerischen Zeichen 5 sind jeweils in der Mitte eines durch vier Punkte bestimmten Rasterbereichs angeordnet, so daß auch diese Zeichen ein regelmaßiges Muster aus einer Matrix mit dem Rasterabstand D bilden, das gegenüber dem Matrixmuster aus den Punkten 4 um den halben Rasterabstand horizontal und vertikal verschoben ist. Der Rahmen 3, die Rasterpunkte 4 und 6 sowie die alphanumerischen Zeichen 5 werden mit Hilfe einer Glas-Email-Farbe mit Zuschlägen von Bleiverbindungen in einem Siebdruckverfahren auf den Objekttrager in regelmaßigen Abständen aufgebracht. Solche Farben sind im Handel etwa unter der Bezeichnung Carmina gelb/rot erhältlich. Vorzugsweise wird zunächst eine transparente dünne Kunststoffolie mit der Farbe im Siebdruckverfahren bedruckt, wonach die Folie auf die Glasplatte aufgebracht wird. In einem Trockenofen wird die Farbe bei Temperaturen von etwa 600°C eingebrannt, wobei der Kunststoff rückstandsfrei verdampft. Die eingebrannte Farbe ist inert gegen organische Lösungsmittel, Säuren und Laugen und auch gegen Chromschwefelsäure. Eine beliebige Reinigung bzw. Vorbehandlung der Objektträger vor einer Präparation ist daher möglich; ebenso eine Wiederverwendung nach entsprechender Reinigung. Die derart erzeugten Musterzeichen ragen über die Oberfläche der Glasplatte 2 geringfügig heraus. Die Höhe der Rasterpunkte 4 beträgt etwa 50 µm. Die Rasterpunkte 6 sowie die alphanumerischen Zeichen 5 sind vorzugsweise weniger hoch. Hiermit ergibt sich die Möglichkeit, wie aus Fig. 3 hervorgeht, auf den Objekttrager 1 ein Deckglas 7 aufzulegen, so daß dann zwischen der Oberfläche der Glasplatte 2 und der Unterseite des Deckglases 7 ein Zwischenraum 8 verbleibt.

Auf den solcher Art hergestellten und gereinigten Objektträger werden, wie in Fig. 4 gezeigt, in herkömmlicher Weise Objekte, in diesem Falle z.B. Samen 9, aufgebracht. Der derart präparierte Objektträger wird dann in ein Lichtmikroskop eingeführt und hinsichtlich interessanter Objekte abgesucht. Die interessierenden Objekte können dann auf einer vergrößerten Fotokopie des Objektträgers markiert werden, so z.B. die beiden in Fig. 4 mit 9 bezeichneten Samen rechts oben von dem alphanumerischen Zeichen X bzw. rechts unten von dem alphanumerischen Zeichen Q, wobei das Punktemuster zu einer genaueren Lokalisierung dient. Der durchmusterte Objektträger kann dann in herkömmlicher Weise mit einer dünnen Goldschicht 10 besputtert werden, was in Fig. 5 angedeutet ist. Dieser Objektträger wird dann in ein Rasterelektronenmikroskop eingeführt, in dem der Objektträger zunächst bei geringer Vergrößerung gemustert wird, um die auf der Fotokopie des Objektträgers eingetragenen zu mikroskopierenden Objekte 9 wiederzufinden. Die Punkte 4 und 6 des Punktmusters sowie die alphanumerischen Zeichen erscheinen dabei deutlich auf dem Bild des Rasterelektronenmikroskopes, da der Farbstoff, wie erwähnt, eine hohe Sekundärelektronenemission aufweist. Ist das Objekt wiedergefunden, so wird die Vergrößerung gesteigert und das Objekt in herkömmlicher Weise untersucht.

Durch das regelmaßige Punktmuster können somit unterschiedliche Präparate oder verschiedene Stellen eines Präparates auf dem Objektträger eindeutig lokalisiert werden. Es können quantitative Aussagen über die Verteilung einzelner Objekte auf der Objektträgerfläche gewonnen werden. Aus fotographischen Aufnahmen, auch bei verschiedenen Kippwinkeln um eine Achse des Objektträgers kann sowohl die Vergrößerung als auch der Kippwinkel aus Abstandsmessungen errechnet werden. Für Stereoaufnahmen sind die Betrachtungswinkel durch Ausmessen der präzise gesetzten Punkte leicht zu überprüfen.

Claims (13)

1. Plattenförmiger Objektträger für die Mikroskopie, insbesondere Rasterelektronenmikroskopie, mit einem Muster zum Kennzeichnen einzelner Bereiche des Objektträgers während des Mikroskopiervorganges, dadurch gekennzeichnet, daß das Muster aus zwei Teilmustern besteht, die beide in Form einer rechtwinkligen Matrix aufgebaut sind, wobei das erste Teilmuster aus jeweils gleichen und das zweite Teilmuster aus jeweils unterschiedlichen Elementen (4, 6 bzw. 5) aufgebaut ist, und daß die beiden Teilmuster mit gleicher Matrixorientierung ineinander verschachtelt sind.

2. Objektträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Teilmuster eine Matrix aus Punkten (4) in jeweils gleichen Rasterabständen (D) ist.

3. Objektträger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Punktmuster in den durch die Rasterabstände (D) definierten rechtwinkligen, insbesondere quadratischen Bereichen durch weitere Punkte (6) regelmäßig unterteilt ist.

4. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Teilmuster ein Muster aus alphanumerischen Zeichen (5) ist.

5. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Muster um einen halben Rasterabstand (D/2) gegeneinander in zwei zueinander senkrechten Richtungen verschoben sind.

6. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente (4, 5, 6) der Teilmuster als Erhebungen auf dem Objektträger (1) ausgebildet sind.

7. Objektträger nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Teil der Elemente (4) als gleich hohe und über die anderen Elemente (5, 6) hinausragende Erhebungen ausgebildet ist.

8. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente (4, 5, 6) auf einer transparenten Glasplatte (2) angeordnet sind.

9. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente (4, 5, 6) der beiden Teilmuster aus einem Sekundärelektronen emittierenden Material sind.

10. Objektträger nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Material Bleiverbindungen aufweist.

11. Verfahren zum Herstellen eines Objektträgers nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine transparente Glasplatte (2) mit einem Siebdruckverfahren mit Farbe bedruckt wird, die anschließend durch Wärmezufuhr eingebrannt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbe eine Glas-Email-Farbe mit metallischen Zuschlagen, insbesondere Bleiverbindungen verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbe zunächst auf eine Kunststoffolie gedruckt, anschließend diese Kunststoffolie auf die transparente Glasplatte aufgebracht wird und schließlich die Farbe eingebrannt wird, wobei der Kunststoff der Folie verdampft.