DE102020202610B4

DE102020202610B4 - Verfahren und Vorrichtung zur automatisierten mikroskopischen Analyse von nervenzellhaltigen Proben

Info

Publication number: DE102020202610B4
Application number: DE102020202610.6A
Authority: DE
Inventors: Patrick Lindner; Marc Porr; Gerrit Paasche; Marvin Peter
Original assignee: Leibniz Universitaet Hannover
Current assignee: Leibniz Universitaet Hannover
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2021-09-23
Anticipated expiration: 2040-02-29
Also published as: DE102020202610A1

Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur automatisierten optischen Analyse bzw. Auswertung von mikroskopischen Bildern von Proben bereit, die Nervenzellen enthalten. Das Verfahren kann mit einheitlicher Färbung von Nervenzellen, z.B. ohne differentielle Anfärbung von Nervenzellen zur Differenzierung von Neuriten und Somata, ablaufen und kann daher die zeitintensive und schwer reproduzierbare manuelle Auswertung mikroskopischer Aufnahmen durch Automatisierung vereinfachen und beschleunigen.

Description

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur automatisierten optischen Analyse bzw. Auswertung von mikroskopischen Bildern von Proben bereit, die Nervenzellen enthalten. Das Verfahren kann mit einheitlicher Färbung von Nervenzellen, z.B. ohne differentielle Anfärbung von Nervenzellen zur Differenzierung von Neuriten und Somata, ablaufen und kann daher die zeitintensive und schwer reproduzierbare manuelle Auswertung mikroskopischer Aufnahmen durch Automatisierung vereinfachen und beschleunigen.
Das Verfahren hat den Vorteil, dass es in einer nervenzellhaltigen Probe nach einheitlicher Färbung der Zellkörper und Neuriten von Nervenzellen aus einem mikroskopischen Bild, das aus Grauwerten bestehen kann, Nervenzellen identifiziert und Zellkörper und Neuriten von Signalen des Hintergrunds und kleinerer Partikel separiert und isoliert darstellt. Es hat sich gezeigt, dass das Verfahren mikroskopische Bilder von Nervenzellen mit deutlich höherer Reproduzierbarkeit auswertet als dies menschliche Beobachter können.
Weiter betrifft die Erfindung eine Vorrichtung, die ein Mikroskop, einen gesteuert positionierbaren Tisch zur Positionierung einer Probe im Strahlengang des Mikroskops und eine Auswerteeinheit aufweist, die zur Durchführung des Verfahrens eingerichtet ist.
Stand der Technik
Die DE 600 23 905 T2 beschreibt für eine Anordnung von Nervenzellen die Analyse des Neuritenwachstums durch Fluoreszenzfärbung, zum einen spezifisch für Zellkörper, zum anderen spezifisch für das Neuritenwachstum, und automatischem Identifizieren der Zellkörper anhand der dafür spezifischen Fluoreszenzfärbung und automatischem Identifizieren der Neuriten anhand der dafür spezifischen Fluoreszenzfärbung.
Die WO 2010/133301 A1 beschreibt zur Analyse des Neuritenwachstums die Kultivierung von Nervenzellen auf Bereichen von Trägern, die an denen Nervenzellen haften können, wobei diese Bereiche von Trägerbereichen umgeben sind, an denen die Nervenzellen nicht haften können, mit optischer Erkennung von Neuritenauswüchsen, die sich in die Trägerbereiche erstrecken, an denen sie nicht haften können.
Die DE 10 2010 035 908 A1 beschreibt die Markierung von Zellen in einem Bild mit einem Rahmen, der um einzeln identifizierte Zellen gelegt wird, wobei anschließend weitere Bilder aufgenommen werden und die Ähnlichkeit der Zellen bestimmt wird, die sich in demselben Rahmen in aufeinander folgenden Bildern befinden.
Bradley und Roth, „Adaptive Thresholding using the Integral Image“, Journal of Graphics Tools 12.2, 13-21 (2007), beschreiben ein Verfahren zum Identifizieren hellerer Pixel in einem Bild.
Dijkstra, E.W. „A note on two problems in connexion with graphs“, Numerische Mathematik 1.1, 269-271 (1959) beschreibt ein mathematisches Verfahren zur Analyse von Richtungen und Längen.
O. Berezsky et al., „Regions matching algorithms analysis to quantify the image segmentation results," 2016 XIth International Scientific and Technical Conference Computer Sciences and Information Technologies (CSIT), Lviv, 2016, pp. 33-36 beschreibt Verfahren zur Bestimmung der Kontur eines Objekts in einem Bild, z.B. mittels Square Contour Tracing.
Aufgabe der Erfindung
Eine Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur optischen Analyse von Nervenzellen, das ohne differentielle Färbung neuronaler Zellkörper und Neuriten zur Unterscheidung neuronaler Zellkörper von Neuriten, insbesondere mit gleicher Anfärbung der neuronalen Zellkörper und Neuriten, und ohne besondere Probenträger die Zellkörper und die Neuriten identifizieren und bevorzugt vermessen kann.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche, insbesondere zeichnen sich das erfindungsgemäße Verfahren und eine für das Verfahren eingerichtete Vorrichtung dadurch aus, dass von einem mikroskopischen Bild, das unmittelbar in Grauwerten aufgenommen ist oder das in Farbe aufgenommen und in Grauwerte umgewandelt ist, bzw. einem mikroskopischen Bild, das aus Grauwerten besteht, in einem ersten Schwellenwertverfahren eine erste Binärmatrix erzeugt wird und in dieser mittels Square Contour Tracing erste Objekte, die mutmaßliche Zellkörper mit Fortsätzen (Neuriten) sind, mit ihrer Position im Bild bestimmt werden, in einem zweiten Schwellenwertverfahren eine zweite Binärmatrix erzeugt wird und in dieser mittels Square Contour Tracing zweite Objekte, die mutmaßliche Zellkörper sind, mit ihrer Position im Bild bestimmt werden und durch anschließendes Überlagern der Positionen der ersten Objekte und der zweiten Objekte die Zellkörper und deren Fortsätze identifiziert werden. Für diese Zellkörper werden Fortsätze, die hier als Neuriten bezeichnet werden, bestimmt und bevorzugt z.B. deren Länge und/oder Richtung. Dabei können anhand der Positionen die Zellkörper und Neuriten vermessen werden.
Das Verfahren hat den Vorteil, auch ohne differentielle Anfärbung von Zellkörpern und Neuriten, z.B. ohne spezifische Anfärbung von Zellkernen, im Graustufenbild einer Probe Nervenzellen zu identifizieren und diese von Partikeln des Zellkulturmediums, von Fremdpartikeln, bevorzugt von anderen Zelltypen, zu unterscheiden und isoliert von diesen darzustellen. Mit dem Verfahren können aus einem Graustufenbild Nervenzellen von Partikeln des Zellkulturmediums, Fremdpartikeln und anderen Zelltypen separiert und isoliert in einer Darstellung abgebildet werden, z.B. ohne einen optischen Hintergrund des Probenträgers und/oder eines die Nervenzellen umgebenden Mediums und/oder von anderen als Nervenzellen.
Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche und stellt insbesondere ein Verfahren zur optischen Analyse einer nervenzellhaltigen Probe bereit, das die Schritte

a) Aufnehmen eines mikroskopischen Bilds der Probe in Grauwerten und/oder Erzeugen eines mikroskopischen Bilds der Probe in Grauwerten, wobei das mikroskopische Bild in Grauwerten aus Pixeln besteht, und Zuordnen der Position der Probe zu dem mikroskopischen Bild in Grauwerten, wobei bevorzugt die Position der Probe, z.B. relativ zum mikroskopischen Bild, bestimmt und gespeichert wird, optional Unterteilen des Bilds in Teilbilder und zu diesen Zuordnen der Position der Teilbilder, z.B. in Bezug zu einem zentralen Pixel des Bilds, bevorzugt mit Zuordnen der Position zu jedem Pixel, wobei zum Aufnehmen des mikroskopischen Bilds optional die Probe, die auf einem Probenträger angeordnet ist, mittels eines gesteuert verfahrbaren Tischs im Strahlengang eines Mikroskops positioniert wird,
b) mittels eines ersten Schwellenwertverfahrens Erzeugen einer ersten Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten aus Schritt a), und mittels Square Contour Tracing Bestimmen von ersten Objekten in der ersten Binärmatrix, wobei als erste Objekte nur direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundene Pixel mit einem ersten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen ersten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines ersten Fensters abweicht, wobei als erste Objekte nur solche bestimmt werden, die zumindest eine erste Anzahl Pixel aufweisen, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel, z.B. relativ zum Bild, zugeordnet werden, zur Erzeugung einer ersten Gruppe von Objekten, optional Bestimmen der Größen der Objekte der ersten Gruppe und Löschen von Objekten aus der ersten Gruppe, die eine vorgegebene Mindestgröße unterschreiten und/oder die eine vorgegebene Maximalgröße überschreiten,
c) mittels eines zweiten Schwellenwertverfahrens Erzeugen einer zweiten Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten aus Schritt a), und mittels Square Contour Tracing Bestimmen von zweiten Objekten in der zweiten Binärmatrix, wobei als zweite Objekte nur direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundene Pixel mit einem zweiten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen zweiten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines zweiten Fensters abweicht, wobei die Prozentzahl des zweiten Schwellenwerts um einen Faktor von zumindest 2, bevorzugt zumindest 3, zumindest 5 oder zumindest 10, z.B. um Faktor 7,5 höher als die Prozentzahl des ersten Schwellenwerts ist, wobei als zweite Objekte nur solche bestimmt werden, die zumindest eine zweite Anzahl von direkt nebeneinanderliegenden und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundener Pixeln aufweisen, wobei die zweite Anzahl kleiner als die erste Anzahl von Pixeln erster Objekte ist, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel zugeordnet werden, zur Erzeugung einer zweiten Gruppe von Objekten, optional Bestimmen der Größen der Objekte der zweiten Gruppe und Löschen von Objekten aus der zweiten Gruppe, die eine vorgegebene Mindestgröße unterschreiten und/oder die eine vorgegebene Maximalgröße überschreiten,
d) Bestimmen der Zentren der zweiten Objekte,
e) positionsgenaues Übereinanderlegen der ersten Gruppe von Objekten und der zweiten Gruppe von Objekten, wobei nur positionsgenau übereinanderliegende Objekte der ersten Gruppe und der zweiten Gruppe als Zellkörper, die jeweils aus Neurit und Soma bestehen, identifiziert werden und die nicht positionsgenau übereinanderliegenden Objekte, bzw. die nicht positionsgenau mit Pixeln der zweiten Objekte übereinanderliegenden Pixel der ersten Objekte, als Neuriten identifiziert werden, mit Erzeugen einer positionsgenauen Abbildung der Zellkörper und der Neuriten, optional Bestimmen derjenigen Objekte der ersten Gruppe, die nicht positionsgenau mit mindestens einem Objekt der zweiten Gruppe übereinanderliegen und Löschen dieser ersten Objekte,
f) optional Bestimmen der Anzahl von übereinanderliegenden zweiten Objekten je erstem Objekt und Durchführen einer Fallunterscheidung anhand der ermittelten Anzahl,
g) und/oder optional Bestimmen der Verhältnisse der Größen und/oder Anzahl der Zellkörper und der Neuriten, optional Bestimmen der Länge, der Richtung, der Verzweigung und/oder der Geradlinigkeit der Neuriten in Bezug auf die Zentren der Zellkörper,

Generell kann Schritt d) nach Schritt e) durchgeführt werden, wobei die Zentren der Objekte bestimmt werden, die positionsgenau übereinanderliegen.
Ein Probenträger ist generell geeignet, die nervenzellhaltige Probe in dem Strahlengang eines Mikroskops zu positionieren und kann z.B. eine Petrischale, ein Objektträger, eine Zellkulturflasche oder ein Napf einer Zellkulturplatte mit mehreren Näpfen sein.
Generell bevorzugt zeigt das aufgenommene Bild und/oder das Bild in Grauwerten die Nervenzellen, insbesondere gefärbte Nervenzellen, in einer Helligkeit, die vom Hintergrund abweicht, d.h. heller oder dunkler als der Hintergrund, der z.B. vom Probenträger und/oder einem die Nervenzellen umgebenden Medium und/oder von anderen als Nervenzellen gebildet sein kann. Generell wird das Verfahren bevorzugt mittels eines Computers durchgeführt, insbesondere die Schritte b) bis g).
Generell sind Pixel an gemeinsamen Kanten und Ecken miteinander verbundene, rechteckige, bevorzugt quadratische Elemente, aus denen das mikroskopische Bild zusammengesetzt ist. Generell bevorzugt weist ein Objekt eine Anzahl von mindestens 2 direkt nebeneinanderliegenden und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundenen Pixeln auf. Zwei Objekte überlappen bzw. liegen positionsgenau übereinander, wenn sie beide auf einer Fläche von zumindest 1 Pixel, bevorzugt zumindest 2 Pixeln, zumindest 3 Pixeln, zumindest 4 oder zumindest 5 Pixeln, z.B. zumindest 10 Pixeln, die jeweils die gleiche Position aufweisen, für sowohl erste Objekte als auch zweite Objekte bestimmt werden. Zwei Objekte liegen auf derjenigen Fläche bzw. auf den über zumindest eine gemeinsame Kante und/oder Ecke verbundenen Pixeln übereinander, deren Helligkeit um zumindest den zweiten Schwellenwert von der Helligkeit der durchschnittlichen Helligkeit des zweiten Fensters abweicht.
Das Bestimmen der Zentren der zweiten Objekte bzw. das Bestimmen der Zentren der übereinanderliegenden ersten und zweiten Objekte kann bevorzugt durch sogenanntes Ellipse-Fitting, d.h. Einpassen einer Ellipse, deren umfängliche Kante den geringsten summierten Abstand zur Kante des Objekts aufweist, in jeweils ein zweites Objekt und Berechnen des Ellipsenschwerpunkts erfolgen, oder z.B. durch Bestimmen des graphischen Schwerpunkts des zweiten Objektes erfolgen. Generell bevorzugt ist der Ellipsenschwerpunkt der Schnittpunkt aus langer und kurzer Achse der Ellipse.
Optional wird in Schritt a) eine Probe, die Nervenzellen enthält oder daraus besteht, auf einem Probenträger angeordnet, dessen Position zu einem Mikroskop reproduzierbar eingestellt wird. Bevorzugt ist der Probenträger auf einem Tisch angeordnet, der zumindest in einer Ebene im Strahlengang des Mikroskops gesteuert positionierbar ist. Der Tisch kann z.B. in einer Ebene senkrecht zum Strahlengang des Mikroskops gesteuert positionierbar sein. Die Position des Probenträgers bzw. des Tischs, auf dem der Probenträger angeordnet ist, wird dem vom Mikroskop aufgenommenen Bild zugeordnet, so dass die Position des Bilds und jedes Bildelements (Pixel) darin gespeichert wird. Bevorzugt wird der Tisch gesteuert bewegt und vom Strahlengang des Mikroskops abgerastert, wobei die nacheinander aufgenommenen Bilder jeweils mit ihrer zugeordneten Position gespeichert werden. Die Positionen sind relativ zueinander bestimmt, bevorzugt ist die absolute Position des Probenträgers bzw. des Tischs zum Strahlengang des Mikroskops bestimmt.
In den Schritten, die nach Schritt a) durchgeführt werden, bilden bei Unterteilung des Bilds in Teilbilder in den nachfolgenden Schritten, insbesondere in Schritten b) und c), die Teilbilder das Bild.
Die nervenzellhaltige Probe kann bevorzugt eine Probe mit einer nicht differenziellen Färbung nach Fixierung der Zellen sein. Die nicht differenzielle Färbung färbt sowohl Zellkörper als auch Neuriten der Nervenzellen bevorzugt in einheitlicher Farbe mit demselben Färbemittel, ggf. unterschiedlich intensiv, z.B. eine durch Antikörper unterstützte DAB-Färbung einer fixierten Probe.
Im ersten Schwellenwertverfahren von Schritt b) kann ein erstes binäres Bild (Binärmatrix) erzeugt werden, in dem Pixel der Objekte der ersten Gruppe, von der bevorzugt die Objekte gelöscht sind, die eine vorgegebene Mindestgröße von Objekten unterschreiten und/oder die eine vorgegebene Maximalgröße von Objekten überschreiten, unterschiedlich dargestellt werden, z.B. weiß sind und die übrigen Pixel schwarz sind.
Im ersten Schwellenwertverfahren von Schritt b) ist der erste Schwellenwert bevorzugt die durchschnittliche Helligkeit der Pixel, die in dem ersten Fenster liegen, das bevorzugt eine vorgegebene Größe aufweist. Das an das erste Schwellenwertverfahren anschließende Square Contour Tracing bestimmt in der ersten Binärmatrix als erste Objekte daher direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Ecke verbundene Pixel, die eine erste Helligkeit aufweisen, die um zumindest den ersten Schwellenwert von der durchschnittlichen Helligkeit der Pixel innerhalb des ersten Fensters abweichen. Der erste Schwellenwert ist ein Helligkeitswert, der um eine Prozentzahl von zumindest 1 %, 2 %, 3 %, bevorzugt zumindest 4 %, zumindest 8 %, z.B. zumindest 14 % oder zumindest 20 % von der durchschnittlichen Helligkeit der Pixel innerhalb des ersten Fensters abweicht. Dabei wird die Helligkeit der Pixel in Bezug zum ersten Schwellenwert jeweils innerhalb des ersten Fensters bestimmt.
Für Nervenzellen kann eine Größe von z.B. 30 bis 250 Pixeln eine vorbestimmte Größe sein. Die vorgegebene Mindestgröße von Objekten in Schritt b) ist bevorzugt die vorbestimmte Größe von Nervenzellen abzüglich zumindest 20 %, zumindest 30 %, z.B. bis maximal 50 % der Pixelanzahl. Die vorgegebene Maximalgröße von Objekten ist bevorzugt die vorbestimmte Größe von Nervenzellen zuzüglich zumindest 20 %, zumindest 30 %, z.B. bis maximal 50 % der Pixelanzahl. Das Löschen von Objekten aus der ersten Gruppe, die eine vorgegebene Mindestgröße von Objekten unterschreiten oder die eine vorgegebene Maximalgröße von Objekten überschreiten, entfernt solche Objekte aus der ersten Gruppe, die eine Größe aufweisen, die außerhalb des Größenbereichs von Nervenzellen der Probe liegt.
Generell ist eine Größe bzw. eine Fläche eine Anzahl von Pixeln.
Die vorgegebene Größe des Fensters in Schritt b) ist durch eine erste Fensterbreite festgelegt, welche z.B. bei einer mittleren Größe erster Objekte von ca. 30 bis ca. 250 Pixeln zumindest 1 Pixel, bevorzugt zumindest 2, zumindest 3, zumindest 5, zumindest 7 Pixel, bevorzugt bis zu 27, bis zu 30, bis zu 40, bis zu 50 oder bis zu 250 Pixel, bevorzugt zwischen 5 und 50 Pixel, bevorzugter 7 bis 27 Pixel, z.B. 17 Pixel, für Objekte der ersten Gruppe betragen kann. Bevorzugt ist die erste Fensterbreite so gewählt, dass ein im Zentrum eines ersten Objekts zentriertes Fenster zu weniger als 50 % der Fläche aus den ein erstes Objekt darstellenden Pixeln besteht. Die Pixel, die das erste Fenster bilden, sind z.B. kreisförmig oder rechteckig, bevorzugt quadratisch angeordnet.
Generell ist jedes Fenster rechteckig, bevorzugt quadratisch, oder kreisförmig mit einer Fensterbreite einer Anzahl an Pixeln, die einer Kantenlänge des Fensters bei dessen rechteckiger Pixelanordnung entspricht, bzw. die Anzahl an Pixeln, die dem Kreisdurchmesser des Fensters bei kreisförmiger Anordnung entspricht.
Im zweiten Schwellenwertverfahren von Schritt c) kann eine zweite Binärmatrix erzeugt werden, in der Pixel der Objekte der zweiten Gruppe, von der bevorzugt die Objekte gelöscht sind, die eine vorgegebene Mindestgröße von Objekten unterschreiten und/oder die eine vorgegebene Maximalgröße von Objekten überschreiten, unterschiedlich dargestellt werden, z.B. weiß sind und die übrigen Pixel schwarz sind.
Im zweiten Schwellenwertverfahren von Schritt c) ist der zweite Schwellenwert eine größere Helligkeitsabweichung als der erste Schwellenwert, so dass mit dem zweiten Schwellenwertverfahren in Schritt c) in ihrer Helligkeit im Vergleich zum Hintergrund stärker abweichende Objekte als in Schritt b) bestimmt werden. Das an das zweite Schwellenwertverfahren anschließende Square Contour Tracing bestimmt als zweite Objekte daher direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundene Pixel, die eine zweite Helligkeit aufweisen, die um zumindest den zweiten Schwellenwert von der durchschnittlichen Helligkeit der Pixel innerhalb des zweiten Fensters abweicht. Der zweite Schwellenwert ist eine Helligkeit, die um eine Prozentzahl von zumindest 10 %, bevorzugt zumindest 20 %, zumindest 30 %, z.B. zumindest 40 % oder zumindest 60 % von der durchschnittlichen Helligkeit der Pixel innerhalb des zweiten Fensters abweicht. Dabei wird die Helligkeit der Pixel in Bezug zum zweiten Schwellenwert jeweils innerhalb des zweiten Fensters bestimmt, mit dessen durchschnittlicher Helligkeit der zweite Schwellenwert gebildet ist. Der zweite Schwellenwert ist z.B. eine Helligkeitsabweichung, deren Prozentzahl zumindest das 2-Fache, bevorzugt zumindest das 3-Fache, zumindest das 5-Fache oder zumindest das 10-Fache, z.B. das 7,5-Fache der Prozentzahl des ersten Schwellenwerts von Schritt b) beträgt.
Bevorzugt ist das zweite Fenster, für das in Schritt c) die durchschnittliche Helligkeit bestimmt wird, größer als das erste Fenster, für das in Schritt b) die durchschnittliche Helligkeit bestimmt wird. Die zweite Fensterbreite in Schritt c) kann z.B. um einen Faktor von zumindest 1,2, zumindest 1,5 oder zumindest 2 größer als die erste Fensterbreite in Schritt b) sein.
Die vorgegebene Größe des Fensters in Schritt c) ist durch eine zweite Fensterbreite festgelegt, welche unabhängig von der ersten Fensterbreite unterschiedlich oder gleich, z.B. bei einer mittleren Zellkörper-Fläche von ca. 30 bis ca. 250 Pixeln mindestens 1 Pixel, bevorzugt mindestens 2, mindestens 3, mindestens 5, mindestens 7, mindestens 15 Pixel, bevorzugt bis zu 41, bis zu 50, bis zu 70, bis zu 90 oder bis zu 250 Pixel, bevorzugt zwischen 10 und 100 Pixel, bevorzugter zwischen 21 und 41 Pixel, z.B. 31 Pixel für Objekte der zweiten Gruppe betragen kann. Bevorzugt ist die zweite Fensterbreite so gewählt, dass ein im Zentrum eines Zellkörpers zentriertes zweites Fenster zu weniger als 50 % der Fläche aus Zellkörper darstellenden Pixeln besteht. Die Pixel, die das erste und zweite Fenster bilden, sind jeweils unabhängig voneinander, rechteckig, kreisförmig oder bevorzugt quadratisch angeordnet.
Die vorgegebene Mindestgröße von Objekten in Schritt c) ist bevorzugt die vorbestimmte Größe von Zellkörpern von Nervenzellen abzüglich zumindest [20 %, zumindest 30 %, z.B. bis maximal 50 % der Pixelanzahl. Die vorgegebene Maximalgröße von Objekten ist bevorzugt die vorbestimmte Größe von Zellkörpern von Nervenzellen zuzüglich zumindest 20 %, zumindest 30 %, z.B. bis maximal 50 % der Pixelanzahl. [Pi] Das Löschen von Objekten aus der zweiten Gruppe, die eine vorgegebene Mindestgröße von Objekten unterschreiten oder die eine vorgegebene Maximalgröße von Objekten überschreiten, entfernt solche Objekte aus der zweiten Gruppe, die eine Größe aufweisen, die außerhalb des Größenbereichs von Zellkörpern von Nervenzellen der Probe liegt.
Bevorzugt werden im zweiten Schwellenwertverfahren in Schritt c) als zweite Objekte solche kleinerer Pixelanzahl als in Schritt b) bestimmt. Durch Schritt c) kann z.B. ein zweites binäres Bild erzeugt werden, in dem Pixel der Objekte der zweiten Gruppe weiß sind und die übrigen Pixel schwarz.
In Ausführungsformen, in denen in dem Graustufenbild gefärbte Nervenzellen oberhalb eines ersten und/oder zweiten Schwellenwerts bestimmt werden, der ein vom Durchschnittswert der Pixel eines jeden Pixel enthaltenden Fensters abweichender Helligkeitswert ist, erscheinen Nervenzellen in dem Graustufenbild um mindestens einen ersten und/oder zweiten Schwellenwert heller als der Hintergrund und/oder Nervenzellen erscheinen in dem Graustufenbild um mindestens einen ersten und/oder zweiten Schwellenwert dunkler als der Hintergrund. Die einzelnen Schwellenwertverfahren sind bevorzugt das von Bradley und Roth in, „Adaptive Thresholding using the Integral Image“, Journal of Graphics Tools 12.2, 13-21 (2007) beschriebene Verfahren.
Das Bestimmen von ersten Objekten in der ersten Binärmatrix bzw. von zweiten Objekten in der zweiten Binärmatrix erfolgt generell mittels Square Contour Tracing in einem mathematischen Verfahren nach O. Berezsky et al., „Regions matching algorithms analysis to quantify the image segmentation results," 2016 XIth International Scientific and Technical Conference Computer Sciences and Information Technologies (CSIT), Lviv, 2016.
Optional werden in Schritt e) des Verfahrens diejenigen Objekte der ersten Gruppe bestimmt und gelöscht, die nicht positionsgenau mit mindestens einem Objekt der zweiten Gruppe übereinanderliegen. Es hat sich gezeigt, dass durch das Bestimmen und Löschen wirksam diejenigen ersten Objekte von der Auswertung ausgeschlossen werden können, die keine Nervenzellen sind.
In Abhängigkeit der Anzahl von Objekten der zweiten Gruppe, die mit demselben Objekt der ersten Gruppe übereinanderliegen, wird in Schritt f) eine Fallunterscheidung vorgenommen: Für den Fall, dass genau 1 zweites Objekt mit einem ersten Objekt übereinander liegt (n=1), können die unter Schritt g) aufgelisteten Berechnungen zu Länge, Richtung und/oder Geradlinigkeit störungsfrei durchgeführt werden.
Für den Fall eines geringen Überlappungsgrades, d.h. eine geringe Anzahl, z.B. weniger als 3 (n<3), zweite Objekte liegen mit einem ersten Objekt übereinander, sind Berechnungen z.B. der Neuritenlänge nur unter Anwendung vereinfachender Annahmen möglich. Bevorzugt werden sämtliche Pixel des ersten Objekts zu allen übereinanderliegenden zweiten Objekten zugeordnet. Daher kann beispielsweise die Berechnung des längsten Neuriten für jeden Zellkörper anhand des gesamten ersten Objekts erfolgen, so dass der längste Neurit z.B. aus dem Abstand zwischen dem Zentrum eines zweiten Objekts und dem entferntesten Pixel des übereinanderliegenden ersten Objekts berechnet wird.
Im Fall eines hohen Überlappungsgrades, d.h. eine hohe Anzahl (z.B. n > 3) zweiter Objekte liegt mit jeweils einem ersten Objekt übereinander, ist die Berechnung der zellulären Parameter nicht zweifelsfrei möglich. In diesem Fall werden lediglich Zellzahlen, d.h. die Anzahl nicht übereinanderliegender zweiter Objekte, bestimmt.
Generell bevorzugt wird für jedes erste Objekt eine separate und von anderen ersten Objekten unabhängige Fallunterscheidung vorgenommen.
Das Bestimmen der Länge, der Richtung, der Verzweigung und/oder der Geradlinigkeit der ersten Objekte in Bezug auf die Zentren der zweiten Objekte kann z.B. nach dem Verfahren von Dijkstra, E.W. „A note on two problems in connexion with graphs“, Numerische Mathematik 1.1, 269-271 (1959) erfolgen. Im Einzelnen wird hierbei durch das von Dijkstra beschriebene mathematische Verfahren eine sogenannte Dijkstra-Map erzeugt. Ausgehend von dem in Schritt d) bestimmten Zentrum eines zweiten Objekts kann mit Hilfe der Dijkstra-Map der kürzeste Pfad zu jedem einzelnen Pixel eines übereinanderliegenden ersten Objekts bestimmt werden, die innerhalb des ersten Objekts verlaufen. Die Geradlinigkeit der Neuriten, der Verzweigungsgrad sowie die Richtung der Neuriten wird mit gängigen Methoden der Vektorrechnung und der Geometrie bestimmt.
In der Probe sind die Nervenzellen nicht differentiell gefärbt, d.h. die Nervenzellen sind nicht mit Farbstoffen gefärbt, die z.B. spezifisch für einzelne Zellorganellen sind, sondern die Zellkörper und Neuriten der Nervenzellen weisen die gleiche Färbung bzw. den gleichen Farbstoff auf. Alternativ können die Zellkörper und Neuriten von Nervenzellen jeweils spezifisch gefärbt sein. Bevorzugt ist das 200 kDa Neurofilament von Nervenzellen mittels eines für das 200 kDa Neurofilament spezifischen Antikörpers und einer indirekten DAB-basierten Immunfärbung, oder einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt.
Durch die Zuordnung der Position zu dem Bild bzw. zu den Teilbildern ist das positionsgenaue Übereinanderlegen der ersten Objekte und der zweiten Objekte in Schritt e) und das Erzeugen einer positionsgenauen Abbildung der Zellkörper und der Neuriten möglich, in der Zellkörper und Neuriten mit gleichen oder unterschiedlichen Grauwerten oder Farben dargestellt sein können.
Die Bilder können Bilder derselben Probe sein, die zu verschiedenen Zeitpunkten aufgenommen wurden.
Generell bevorzugt weist die Probe keinen zugesetzten Farbstoff oder einen nicht differentiellen Farbstoff für Nervenzellen auf. Bevorzugt ist das Bild ein mikroskopisches Phasenkontrastbil d.
In Schritt a) kann von zumindest einem Abschnitt der Probe ein Teilbild in höherer Vergrößerung aufgenommen werden. Ein solches Teilbild wird bevorzugt mit denselben Verfahrensschritten bearbeitet, wobei die Größen, z.B. für die ersten und zweiten Objekte, entsprechend der Vergrößerung angepasst werden können, oder es können dieselben Größen wie bei der kleineren Vergrößerung im Verfahren eingesetzt werden. Weiter optional kann ein Teilbild im Anschluss an das Aufnehmen eines Bilds in Schritt a) und dessen Bearbeitung in Schritten b) bis e), bis f) oder bis g) aufgenommen werden, wobei z.B. der verfahrbare Tisch die auf dem Probenträger angeordnete Probe erneut in den Strahlengang des Mikroskops positioniert.
Generell kann ein Bild in Schritt a) so aufgenommen sein, dass bevorzugt die Zellkörper im Bild eine Größe von 30 bis 250 Pixel aufweisen, abhängig von der bzw. eingestellt durch die Auflösung der verwendeten Kamera und Objektivvergrößerung des Mikroskops.
Eine Vorrichtung, die ein Mikroskop, einen zur Positionierung der Probe im Strahlengang des Mikroskops eingerichteten gesteuert verfahrbaren Tisch und eine Auswerteeinheit aufweist, ist zur Verwendung bei der Durchführung des Verfahrens dadurch eingerichtet, dass die Auswerteeinheit für die Schritte des Verfahrens eingerichtet ist. So ist die Vorrichtung eingerichtet, die Schritte des Verfahrens durchzuführen, insbesondere zum

a) Aufnehmen eines mikroskopischen Bilds der Probe und/oder Erzeugen eines mikroskopischen Bilds der Probe in Grauwerten und Zuordnen der Position der Probe zu dem mikroskopischen Bild in Grauwerten, optional Unterteilen des Bilds in Teilbilder und zu diesen Zuordnen der Position der Teilbilder, z.B. in Bezug zu einem zentralen Pixel des Bilds, bevorzugt mit Zuordnen der Position zu jedem Pixel, und Übermitteln des Bilds und der Position an eine Auswerteeinheit, optional Positionieren einer Probe, die auf einem Probenträger angeordnet ist, mittels eines gesteuert verfahrbaren Tischs im Strahlengang des Mikroskops, wobei die Position der Probe bestimmt und gespeichert wird, zum Aufnahmen eines mikroskopischen Bilds der Probe eingerichtet,
b) wobei die Auswerteeinheit eingerichtet ist, mittels eines ersten Schwellenwertverfahrens eine erste Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten aus Schritt a) zu erzeugen und in dieser mittels Square Contour Tracing erste Objekte zu bestimmen, wobei als erste Objekte nur direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundene Pixel mit einem ersten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen ersten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines ersten Fensters abweicht, wobei als erste Objekte nur solche bestimmt werden, die zumindest eine erste Anzahl Pixel aufweisen, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel, z.B. relativ zum Bild, zugeordnet werden, zur Erzeugung einer ersten Gruppe von Objekten, wobei optional die Größen der Objekte der ersten Gruppe bestimmt werden und Objekte aus der ersten Gruppe, die eine vorgegebene Mindestgröße unterschreiten und/oder die eine vorgegebene Maximalgröße überschreiten, aus der ersten Gruppe gelöscht werden,
c) wobei die Auswerteeinheit eingerichtet ist, mittels eines zweiten Schwellenwertverfahrens eine zweite Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten aus Schritt a) zu erzeugen und in dieser mittels Square Contour Trancing zweite Objekte zu bestimmen, wobei als zweite Objekte nur direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundene Pixel mit einem zweiten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen zweiten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines zweiten Fensters abweicht, wobei die Prozentzahl des zweiten Schwellenwerts um einen Faktor von zumindest 2, bevorzugt zumindest 3, zumindest 5 oder zumindest 10, z.B. um Faktor 7,5 höher als die Prozentzahl des ersten Schwellenwerts ist, wobei als zweite Objekte nur solche bestimmt werden, die zumindest eine zweite Anzahl von direkt nebeneinanderliegenden und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante und/oder Ecke verbundenen Pixeln aufweisen, wobei die zweite Anzahl kleiner als die erste Anzahl von Pixeln erster Objekte ist, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel zugeordnet werden, zur Erzeugung einer zweiten Gruppe von Objekten, optional die Größen der Objekte der zweiten Gruppe zu bestimmen und Objekte aus der zweiten Gruppe zu löschen, die eine vorgegebene Mindestgröße unterschreiten und/oder die eine vorgegebene Maximalgröße überschreiten,
d) wobei die Auswerteeinheit eingerichtet ist, die Zentren der zweiten Objekte zu bestimmen,
e) wobei die Auswerteeinheit zum positionsgenauen Übereinanderlegen der ersten Gruppe von Objekten und der zweiten Gruppe von Objekten eingerichtet ist, wobei nur positionsgenau übereinanderliegende Objekte der ersten Gruppe und der zweiten Gruppe als Zellkörper identifiziert werden und die nicht positionsgenau übereinanderliegenden Objekte, bzw. die nicht positionsgenau mit Pixeln der zweiten Objekte übereinanderliegenden Pixel der ersten Objekte, als Neuriten identifiziert werden, mit Erzeugen einer positionsgenauen Abbildung der Zellkörper und der Neuriten, und optional eingerichtet ist, diejenigen ermittelten Objekte der ersten Gruppe, die nicht positionsgenau mit mindestens einem Objekt der zweiten Gruppe übereinanderliegen, zu bestimmen und zu löschen,
f) wobei bevorzugt die Auswerteeinheit eingerichtet ist, anhand der Anzahl von übereinanderliegenden zweiten Objekten je erstem Objekt eine Fallunterscheidung zur weiteren Verarbeitung der binären Bilder durchzuführen,
g) wobei die Auswerteeinheit optional eingerichtet ist, die Verhältnisse der Größen und/oder Anzahl der Zellkörper und der Neuriten zu bestimmen, optional die Länge, Richtung, Verzweigung und/oder Geradlinigkeit der Neuriten in Bezug auf die Zentren der Zellkörper zu bestimmen.

Die Erfindung wird nun genauer anhand eines Beispiels und mit Bezug auf die Figuren beschrieben, die in

- 1 das Verfahren schematisch,
- 2 eine schematische Darstellung des Square Contour Tracing,
- 3a) ein lichtmikroskopisches Bild einer Probe,
- 3b) ein beispielhaftes Ergebnis von Schritt b) des auf das Bild von 3a) angewandten Verfahrens,
- 3c) ein beispielhaftes Ergebnis von Schritt c) des auf das Bild von 3a) angewandten Verfahrens,
- 4 eine schematische Übersicht über die Fallunterscheidung im Anschluss an Schritt e) des Verfahrens

Die 1 zeigt das Verfahren, bei dem das Verfahren gemäß der Schritte a) bis g) angewendet wird. Ein mikroskopisches Bild 1 einer Nervenzellen enthaltenden Probe wird in Graustufen umgewandelt 2 und das erste Schwellwertverfahren 3 des Schritts b) wird angewendet, um eine erste Binärmatrix zu erzeugen. Mittels Square Contour Tracing 4 werden in der ersten Binärmatrix erste Objekte 5 bestimmt, die Zellkörper und Neuriten darstellen. Auf das in Graustufen umgewandelte mikroskopische Bild 2 wird das zweite Schwellenwertverfahren 6 des Schritts c) angewendet, um eine zweite Binärmatrix zu erzeugen. Mittels Square Contour Tracing 7 werden in der zweiten Binärmatrix zweite Objekte 9 bestimmt, die Zellkörper darstellen. Mittels Ellipse-Fitting 8 werden die Schwerpunkte der Zellkörper bestimmt. Nach dem Zusammenführen beider Binärmatrices durch positionsgenaues Übereinanderlegen 10 wird die Anzahl der Zellkörper je Neurit (n) bestimmt und hernach eine Fallunterscheidung 11 getroffen. Für den Fall, dass genau 1 zweites Objekt 9 mit einem ersten Objekt 5 übereinander liegt (n = 1) 12, können die unter Schritt g) aufgelisteten Berechnungen der Zellparameter 14 störungsfrei durchgeführt werden, z.B. mittels des Verfahrens nach Dijkstra 13. Für den Fall eines geringen Überlappungsgrades (z.B. n < 3) 15 sind Berechnungen z.B. der Neuritenlänge nur unter Anwendung vereinfachender Annahmen 16 möglich. Im Fall hohen Überlappungsgrades (z.B. n > 3) 17 ist die Berechnung der zellulären Parameter nicht zweifelsfrei möglich. In diesem Fall werden lediglich Zellzahlen 18 bestimmt.
In 2 ist das Verfahren des Square Contour Tracing nach Berezsky et al. gezeigt. Durch Anwendung des Verfahrens wird jedes Pixel der Objektkante mindestens 1x erfasst und kartiert. In der Folge ist es möglich, Berechnungen zu weiteren Zellparametern durchzuführen, z.B. Berechnungen zu Flächen, Entfernungen usw.
Beispiel: Optische Analyse einer nervenzellhaltigen Probe
In einer Petrischale kultivierte Nervenzellen wurden fixiert, mit einer DAB-basierten nicht differentiellen Nervenzellfärbung gefärbt, durch einen kontrolliert positionierbaren Probentisch in den Strahlengang eines inversen Mikroskops (BZ-9000, Keyence) gebracht und es wurde ein Phasenkontrastbild bei einer 10-fachen Vergrößerung aufgenommen. Das Bild hatte eine Auflösung von 3485 x 3596 Pixeln und wurde in Graustufen konvertiert. Wie generell bevorzugt wurde jedem Pixel seine Position, die von der Stellung des Probentischs abgenommen wurde, zugeordnet.
Die Schwellenwertverfahren wurden generell nach dem von Bradley und Roth (2007) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Entsprechend Schritt b) wurde das erste Schwellenwertverfahren auf das Bild angewandt, wobei die Parameter waren:

Untergrenze bzw. erster Schwellenwert für den ersten Helligkeitsvergleich: 0 % bis 14 %, bevorzugt 4 %, abweichend von der durchschnittlichen Helligkeit in jedem ersten Fenster. Der erste Schwellenwert bzw. die Untergrenze für eine Helligkeitsabweichung von Pixeln, die noch Nervenzellen sein können, erfasste auch erste Objekte, die keine Nervenzellen waren, z.B. andere Zellen oder Artefakte so wie Partikel des Zellkulturmediums. Das erste Fenster hatte eine Fensterbreite von 7 bis 27 Pixeln, bevorzugt 17 Pixeln, die quadratisch angeordnet waren. Erste Objekte, die kleiner als oder gleich 104 Pixeln, bevorzugt kleiner oder gleich 84 Pixeln, oder die kleiner oder gleich 64 Pixeln waren, wurden aus der ersten Gruppe von Objekten gelöscht. Diese Größe war für Objekte vorbestimmt worden, die keine Zellkörper von Nervenzellen waren, sondern z.B. Partikel des Zellkulturmediums, andere Zellen oder Artefakte.

In 3a) ist ein mikroskopisches Graustufenbild der kultivierten Nervenzellen gezeigt und in 3b) ist das Ergebnis von Schritt b), der auf das Bild von 3a) angewendet wurde, als Bild der ausgewählten Zellen dargestellt. Die 3b) zeigt, dass mit dem Verfahren bis Schritt b) alle gefärbten Nervenzellen als erste Objekte erkannt werden. Die isolierte Darstellung der Nervenzellen wird auch auf Basis eines Bilds in Graustufen erreicht, das von ungefärbten Nervenzellen aufgenommen wurde.
Für Schritt c) wurde das zweite Schwellenwertverfahren auf das ursprüngliche Graustufenbild der 3a) angewendet, wobei die folgenden Parameter verwendet wurden:

Untergrenze bzw. zweiter Schwellenwert 20 % bis 40 %, bevorzugt 30 %, abweichend von der durchschnittlichen Helligkeit in jedem zweiten Fenster, was einem Faktor von 7,5 zur Prozentzahl des ersten Schwellenwerts von 4 % entspricht. Das zweite Fenster hatte eine Fensterbreite 21 bis 41 Pixeln, bevorzugt 31 Pixeln, die quadratisch angeordnet waren. Zweite Objekte, die kleiner als oder gleich 43 Pixeln, bevorzugt kleiner oder gleich 23 Pixeln, oder die kleiner oder gleich 3 Pixeln waren, wurden aus der zweiten Gruppe von Objekten gelöscht. Diese Größe war für Objekte vorbestimmt worden, die keine Zellkörper von Nervenzellen waren, sondern z.B. Partikel des Zellkulturmediums, andere Zellen oder Artefakte.

In 3c) ist das Ergebnis von Schritt c) des Verfahrens gezeigt, der auf das Bild von 3a) angewendet wurde. Die 3c) zeigt, dass mit dem Verfahren Teilflächen der mutmaßlichen Zellkörper mit Neuriten, die in 3b) isoliert dargestellt sind, als zweite Objekte erkannt wurden.
In 4 ist das schematische Verfahren im Anschluss an den Verfahrensschritt e) gezeigt. In Abhängigkeit des Überlappungsgrades der ersten Objekte mit den zweiten Objekten werden 3 Szenarien unterschieden:

Für den Fall, dass genau ein zweites Objekt mit einem ersten Objekt übereinanderliegt (n = 1), können sämtliche Berechnungen zu Fläche, Neuritenlänge, Geradlinigkeit usw. störungsfrei durchgeführt werden.

Im Fall geringen Überlappungsgrades (z.B. n < 3) ist die Berechnung z.B. der Neuritenlänge nur unter Anwendung vereinfachender Annahmen möglich. So kann beispielsweise die Berechnung des längsten Neuriten für jeden Zellkörper nur anhand der gesamten zusammenhängenden Fläche des ersten Objekts durchgeführt werden.
Im Fall hohen Überlappungsgrades (z.B. n > 3) ist die Berechnung der zellulären Parameter nicht möglich. In diesem Fall wird lediglich die Anzahl der Zellkörper bestimmt.

Claims

Verfahren zur optischen Analyse einer nervenzellhaltigen Probe mit den Schritten a) Aufnehmen eines mikroskopischen Bilds (1) der Probe und Erzeugen eines mikroskopischen Bilds der Probe in Grauwerten (2) und Zuordnen der Position der Probe zu dem mikroskopischen Bild in Grauwerten (2), b) mittels eines ersten Schwellenwertverfahrens (3) Erzeugen einer ersten Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten (2) aus Schritt a), und mittels Square Contour Tracing Bestimmen von ersten Objekten (5) in der ersten Binärmatrix, wobei als erste Objekte (5) nur direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante oder bevorzugt Kante und Ecke verbundene Pixel mit einem ersten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen ersten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines ersten Fensters abweicht, wobei als erste Objekte (5) nur solche bestimmt werden, die zumindest eine erste Anzahl Pixel aufweisen, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel zugeordnet werden, zur Erzeugung einer ersten Gruppe von Objekten, c) mittels eines zweiten Schwellenwertverfahrens (6) Erzeugen einer zweiten Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten (2) aus Schritt a), und mittels Square Contour Tracing Bestimmen von zweiten Objekten (9) in der zweiten Binärmatrix, wobei als zweite Objekte (9) nur direkt nebeneinanderliegende und durch zumindest eine gemeinsame Kante oder bevorzugt Kante und Ecke verbundene Pixel mit einem zweiten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen zweiten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines zweiten Fensters abweicht, wobei die Prozentzahl des zweiten Schwellenwerts um einen Faktor von zumindest 2 höher als die Prozentzahl des ersten Schwellenwerts ist, wobei als zweite Objekte (9) nur solche bestimmt werden, die zumindest eine zweite Anzahl von direkt nebeneinanderliegenden und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante oder bevorzugt Kante und Ecke verbundenen Pixeln aufweisen, wobei die zweite Anzahl kleiner als die erste Anzahl von Pixeln erster Objekte ist, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel zugeordnet werden, zur Erzeugung einer zweiten Gruppe von Objekten, d) Bestimmen der Zentren der zweiten Objekte (9), e) positionsgenaues Übereinanderlegen (10) der ersten Gruppe von Objekten und der zweiten Gruppe von Objekten, wobei nur positionsgenau übereinanderliegende Objekte der ersten und zweiten Gruppe als Zellkörper identifiziert werden und die nicht positionsgenau übereinanderliegenden Objekte, bzw. die nicht positionsgenau mit Pixeln der zweiten Objekte (9) übereinanderliegenden Pixel der ersten Objekte (5), als Neuriten identifiziert werden, mit Erzeugen einer positionsgenauen Abbildung der Zellkörper und der Neuriten, f) Bestimmen der Anzahl von übereinanderliegenden zweiten Objekten (9) je erstem Objekt (5) und Durchführen einer Fallunterscheidung (11) anhand der ermittelten Anzahl.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die Probe, die auf einem Probenträger angeordnet ist, zum Aufnehmen eines mikroskopischen Bilds (1) der Probe mittels eines gesteuert verfahrbaren Tischs im Strahlengang eines Mikroskops positioniert wird, wobei die Position der Probe bestimmt und gespeichert wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) das Bild in Teilbilder unterteilt wird und zu diesen die Position der Teilbilder zugeordnet wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Zuordnen der Position zu jedem Pixel.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Größe der Objekte der ersten Gruppe bestimmt wird und Objekte aus der ersten Gruppe gelöscht werden, die eine durch die vorbestimmte Größe von Nervenzellen abzüglich zumindest 20 % der Pixelanzahl vorgegebene Mindestgröße unterschreiten und/oder die eine durch die vorbestimmte Größe von Nervenzellen zuzüglich zumindest 20 % der Pixelanzahl vorgegebene Maximalgröße überschreiten.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) die Größe der Objekte der zweiten Gruppe bestimmt wird und Objekte aus der zweiten Gruppe gelöscht werden, die eine durch die vorbestimmte Größe von Nervenzellen abzüglich zumindest 20 % der Pixelanzahl vorgegebene Mindestgröße unterschreiten und/oder die eine durch die vorbestimmte Größe von Nervenzellen zuzüglich zumindest 20 % der Pixelanzahl vorgegebene Maximalgröße überschreiten.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) diejenigen Objekte der ersten Gruppe, die nicht positionsgenau mit mindestens einem Objekt der zweiten Gruppe übereinanderliegen, bestimmt und gelöscht werden.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verhältnisse der Größen und/oder die Anzahl der Zellkörper und der Neuriten bestimmt werden und/oder die Länge, Richtung, Verzweigung und/oder die Geradlinigkeit der Neuriten in Bezug auf die Zentren der Zellkörper bestimmt werden.
Vorrichtung mit einem Mikroskop, einem zur Positionierung einer Probe im Strahlengang des Mikroskops eingerichteten, gesteuert verfahrbaren Tisch und einer Auswerteeinheit, die für die Schritte des Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche eingerichtet ist, zum a) Aufnehmen eines mikroskopischen Bilds (1) der Probe und Erzeugen eines mikroskopischen Bilds der Probe in Grauwerten (2) und Zuordnen der Position der Probe zu dem mikroskopischen Bild in Grauwerten (2), und Übermitteln des Bilds und der Position an eine Auswerteeinheit eingerichtet ist, b) wobei die Auswerteeinheit eingerichtet ist, mittels eines ersten Schwellenwertverfahrens (3) eine erste Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten (2) aus Schritt a) zu erzeugen und in dieser mittels Square Contour Tracing erste Objekte (5) zu bestimmen, wobei als erste Objekte (5) nur direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante oder bevorzugt Kante und Ecke verbundene Pixel mit einem ersten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen ersten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines ersten Fensters abweicht, wobei als erste Objekte (5) nur solche bestimmt werden, die zumindest eine erste Anzahl Pixel aufweisen, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel, z.B. relativ zum Bild, zugeordnet werden, zur Erzeugung einer ersten Gruppe von Objekten, c) wobei die Auswerteeinheit eingerichtet ist, mittels eines zweiten Schwellenwertverfahrens (6) eine zweite Binärmatrix aus dem mikroskopischen Bild in Grauwerten (2) aus Schritt a) zu erzeugen und in dieser mittels Square Contour Tracing zweite Objekte (9) zu bestimmen, wobei als zweite Objekte (9) nur direkt nebeneinanderliegende und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante oder bevorzugt Kante und Ecke verbundene Pixel mit einem zweiten Helligkeitswert bestimmt werden, der ein Helligkeitswert ist, der um zumindest einen zweiten Schwellenwert vom Durchschnittswert der Pixel innerhalb eines zweiten Fensters abweicht, wobei die Prozentzahl des zweiten Schwellenwerts um einen Faktor von zumindest 2 höher als die Prozentzahl des ersten Schwellenwerts ist, wobei als zweite Objekte (9) nur solche bestimmt werden, die zumindest eine zweite Anzahl von direkt nebeneinanderliegenden und mittels zumindest einer gemeinsamen Kante oder bevorzugt Kante und Ecke verbundenen Pixeln aufweisen, wobei die zweite Anzahl kleiner als die erste Anzahl von Pixeln erster Objekte ist, wobei diesen Objekten die Positionen der Pixel zugeordnet werden, zur Erzeugung einer zweiten Gruppe von Objekten, d) wobei die Auswerteeinheit eingerichtet ist, die Zentren der zweiten Objekte (9) zu bestimmen, e) wobei die Auswerteeinheit zum positionsgenauen Übereinanderlegen (10) der ersten Gruppe von Objekten und der zweiten Gruppe von Objekten eingerichtet ist, wobei nur positionsgenau übereinanderliegende Objekte der ersten Gruppe und der zweiten Gruppe nun gemeinsam als auszuwertende Zelle, bestehend aus Soma und Neurit, identifiziert werden und vom Algorithmus weiter verarbeitet werden. Erste Objekte die somit nicht mit einem oder mehreren zweiten Objekten positionsgenau übereinanderliegen, werden aus der Gruppe der ersten Objekte entfernt, f) wobei die Auswerteeinheit eingerichtet ist, anhand der Anzahl von übereinanderliegenden zweiten Objekten (9) je erstem Objekt (5) eine Fallunterscheidung (11) zur weiteren Verarbeitung der binären Bilder durchzuführen.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinheit eingerichtet ist, die Verhältnisse der Größen und/oder die Anzahl der Zellkörper und der Neuriten zu bestimmen und/oder die Länge, Richtung, Verzweigung und/oder die Geradlinigkeit der Neuriten in Bezug auf die Zentren der Zellkörper zu bestimmen.