DE3902348C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen plattenförmigen Objektträger für die Rasterelektronenmikroskopie und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Objektträgers.

Ein gattungsgemäßer Objektträger ist aus der US 41 83 614 bekannt. Der dort beschriebene Objektträger ist für die übliche Lichtmikroskopie geeignet und weist auf einer Glasplatte ein Muster aus zwei matrixartigen Teilmustern auf, nämlich einmal ein Matrixmuster aus qudratischen Linien und zum anderen ein Matrixmuster aus jeweils zwei Großbuchstaben. Mit zwei derart ineinander verschachtelten Teilmustern können zu mikroskopierende Gegenstände relativ einfach aufgefunden werden. Die Linien des ersten Teilmusters dienen im wesentlichen zum Vermessen von zu mikroskopierenden Objekten, wohingegen die Buchstaben zur Identifizierung einzelner Bereiche auf dem Objektträger dienen. Die einzelnen Bereiche des Linienmusters, aber auch die einzelnen Buchstaben sind bei diesem bekannten Objektträger derart klein, daß sie mit bloßem Auge praktisch nicht zu sehen sind, so daß auch eine grobe Abschätzung der Lage von Objekten kaum möglich ist. Für die Rasterelektronenmikroskopie sind derartige Objektträger zudem auch nicht geeignet, da die beiden Teilmuster im Elektronenmikroskop nur ganz schwache Kontraste liefern, so daß das Auffinden von Objekten auf dem Objektträger sehr erschwert ist. Ebenso können bei diesem bekannten Objektträger beim Einsatz in einem Rasterelektronenmikroskop nur schwer gut zu vermessende Stereoaufnahmen angefertigt werden, da das Muster keinen Hinweis auf den Betrachtungswinkel und die aktuelle Vergrößerung gibt.

Aus der GB 21 25 183 A ist ein Objektträger für herkömmliche Lichtmikroskopie bekannt, bei dem vorhandene Markierungen, nämlich Striche, Kreise, Buchstaben und Zahlen, aufgedruckt bzw. eingebrannt werden können. Mit derartigen direkten Drucktechniken und auch mit Umdrucktechniken ist jedoch eine hochgenaue Positionierung der einzelnen Markierungen nicht möglich, insbesondere dann nicht, wenn der Objektträger nur relativ kleine Dimensionen im Bereich von wenigen Zentimetern aufweist.

Aus der DE 33 33 674 A1 ist schließlich ein Objektträger für ein sogenanntes Hämozytometer bekannt, mit der die Verteilung von feinteiligen Stoffen in einer Flüssigkeit quantitativ analysiert werden kann. Vorzugsweise dient ein derartiger Objektträger zur quantitativen Analyse von Blut. Der Objektträger ist hierbei aus zwei Platten geformt, deren Oberflächen räumlich so gestaltet sind, daß sich eine Vielzahl von kleinen Bereichen bilden, in denen die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe im dünnen Raum zwischen der Oberfläche der beiden Platten durch Kapillarwirkung zurückgehalten wird. Eine derartige Formung einer Objektträgeroberfläche bringt für die Rasterelektronenmikroskopie keinerlei Verbesserungen hinsichtlich der Erkennung von Objekten oder der Identifizierung von deren Lage.

Eine solche eindeutige Lagebestimmung ist für die Rasterelektronennmikroskopie wünschenswert und für ein rasches Arbeiten notwendig.

In den letzten Jahren hat sich das Auflösungsvermögen von Rasterelektronenmikroskopen ständig erhöht. Das Anwendungsgebiet für die Rasterelektronenmikroskopie wächst ebenso beständig. So ist es möglich, auch kleine und kleinste Zellbestandteile, wie Chromosomen und sogar Antikörper bei hoher Auflösung im Bereich von einem Nanometer abzubilden. Objekte dieser Größenordnung, die auf einem Objektträger abgelegt sind, sind jedoch im Rasterelektronenmikroskop nur äußerst schwierig zu finden. Sie sind nämlich sehr konstrastarm, und es müssen zu ihrer Erkennung aufgrund der geringen Größe bereits hohe Anfangsvergrößerungen, 1000- bis 20 000fach, gewählt werden. Außerdem liegen sie in für die Untersuchung geeigneter Form häufig nur in sehr geringer Anzahl vor.

Bisher wurden die enormen Suchzeiten für untersuchungsgeeignete Objekte dadurch verkürzt, daß die Objekte auf den Objektträgern in Form von Deckgläschen präpariert wurden, so daß eine lichtmikroskopische Voruntersuchung ermöglicht wurde. Die geeigneten Objektstellen auf dem Objektträger wurden dann z. B. durch Ritzmarkierungen mit Hilfe eines Diamanten oder durch Ritzmarkierungen mit Hilfe einer Nadel nach einer Goldbesputterung oder durch Aufbringen von Markierungsobjekten, z. B. Kupferpfeilen etc., markiert.

Diese Markierungstechniken haben jedoch Nachteile. Die Auffindung einer Einzelmarkierung im Rasterelektronenmikroskop ist oft schwierig und setzt eine Dokumentation der Markierungsstelle voraus. Außerdem sollten die Markierungen sehr nahe am zu mikroskopierenden Objekt liegen, ohne dieses jedoch zu beschädigen. Ferner sind Manipulationen unter dem Lichtmikroskop routinemäßig nur schwierig durchzuführen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen gattungsgemäßen Objektträger auch für die Rasterelektronenmikroskopie verwendbar zu gestalten und dort ein rasches Auffinden gewünschter Bereiche zu gewährleisten. Außerdem soll ein Herstellungsverfahren angegeben werden, mit dem die Markierungselemente auf dem Objektträger präzise gesetzt werden können.

Diese Aufgaben sind für einen Objektträger bzw. für ein Herstellungsverfahren für einen Objektträger durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruchs 1 bzw. des Patentanspruchs 7 gelöst.

Demgemäß werden die Markierungselemente beider matrixförmigen und ineinander verschachtelten Teilmuster als separate Erhebungen ausgebildet, wobei die Markierungselemente des ersten Teilmusters gleich hoch sind und dabei über sämtliche Markierungselemente des zweiten Teilmusters hinausragen. Zudem bestehen die Markierungselemente beider Teilmuster aus einem Elektronen rückstreuenden und/oder Sekundärelektronen emittierenden Material.

Der für das Auffinden eines Objekts auf dem Objektträger unter dem Mikroskop wiederzufindende Bereich ist auf diese Weise immer durch Markierungselemente beider Teilmuster eindeutig gekennzeichnet.

Der einfachste Aufbau eines solchen Musters ist ein in einem bestimmten Rasterabstand aufgebautes Punktmuster als erstes Teilmuster, wobei jeweils in einem rechtwinkligen bzw. vorzugsweise quadratischen, durch die Eckpunkte des Rasters definierten Bereich, ein alphanumerisches Zeichen als Markierungselement des zweiten Teilmusters gesetzt ist, so daß die beiden matrixförmigenn Teilmuster jeweils um einem halben Rasterabstand in zwei zueinander senkrechten Richtungen gegeneinander verschoben sind. Innerhalb dieser Einzelmatrixbereiche kann das Punktmuster noch durch weitere Zusatzpunkte unterteilt sein.

Die einzelnen Markierungselemente, z. B. die Punkte oder die alphanumerischen Zeichen, sind als Erhebungen ausgebildet und vorzugsweise mit Hilfe eines Siebdruckverfahrens auf den vorzugsweise transparenten Objektträger aufgebracht. Die verwendeten Materialien für die Markierungen sind Farbstoffe, die inert gegen organische Lösungsmittel, Säuren und Laugen und auch gegen Chromschwefelsäure sind. Bei einer Verwendung des Objektträgers in Rasterelektronenmikroskopen werden diesen Farbstoffen Elektronen rückstreuende und oder Sekundärelektronen emittierende Materialien, insbesondere Bleiverbindungen beigemischt. Die Farbstoffe bilden auf dem Objektträger Erhebungen, wobei durch das Siebdruckverfahren die Höhe der aufgedruckten Markierungselemente eines Teilmusters entweder insgesamt gleich ist oder zumindest wesentliche Punkte, etwa der Punktmatrix, auf gleicher Höhe gehalten werden. Diese Höhe beträgt etwa 50 µm. Diese Höhe kann je nach Bedarf variiert werden. Dies hat den Vorteil, daß die erhabenen Markierungselemente deutlich erkannt werden und zum Vermessen der Lage des Objektträgers und zum Bestimmen des Vergrößerungsmaßstabes herangezogen werden können. Ein weiterer Vorteil ist, daß beim Auflegen eines Deckglases auf den Objektträger dieses von dem Deckglas durch einen geringen Abstand getrennt ist, so daß druckempfindliche zu mikroskopierende Objekte, z. B. Zellen, wie Protoplasten oder Gewebszellen bzw. Zellstrukturen, durch das Auflegen des Deckglases nicht zerstört werden. Ebenso können dadurch zwischen dem Objektträger und dem Deckglas Lösungen, die zu mikroskopierende Objekte enthalten, "durchgesaugt" werden.

Zur Mikroskopierung werden Präparate auf einem Objektträger in herkömmlicher Weise angefertigt und geeignete Objektstellen im Lichtmikroskop ausgesucht. Diese Objektstellen, die durch die beiden Teilmuster hinsichtlich ihrer Lage eindeutig identifiziert werden können, werden z. B. auf einer vergrößerten Fotokopie des gesamten Markierungsmusters des Objektträgers eingetragen. Die Objekte können dann nach dieser Lageidentifizierung auch bei höheren Vergrößerungsfaktoren eindeutig wiedergefunden und untersucht werden. Für die Rasterelektronenmikroskopie werden die Objektträger anschließend auf die handelsüblichen Präparathalter mit Leitsilber oder Leitkohlenstoff aufgeklebt. Nach einer Besputterung, z. B. mit Gold, können die Objektstellen im Rasterelektronenmikroskop sehr schnell aufgefunden werden, da die Markierungen als Erhebungen deutlich erkennbar sind. Insbesondere die der Druckfarbe bei dem Siebdruckverfahren zugemischten Bleiverbindungen liefern im Gegensatz zum transparenten Untergrund des Objektträgers, allgemein Glas, eine hohe Elektronenrücksteuerung bzw. Sekundärelektronenemission, so daß selbst nach der Aufbringung dünnster Sputter-Schichten oder nach Bedampfung mit Kohlenstoff die Markierungen des Matrixmusters mit hohem Kontrast abgebildet werden.

Objektträger gemäß der Erfindung sind insbesondere vorteilhaft bei vergleichenden Untersuchungen einer größeren Anzahl unterschiedlicher Präparate. Die Größe des Objektträgers erlaubt es, gleichzeitig bis zu ca. 50 Proben, z. B. Samen, Pollen, ganze Versuchsserien mit Mikroorganismen oder verschiedenste Zellfraktionen auf den Objektträger aufzubringen und unter identischen Bedingungen zu behandeln und zu untersuchen. Die zu mikroskopierenden Objekte werden schnell aufgefunden und identifiziert, so daß sich Objektträger gemäß der Erfindung für die definierte Auffindung und Abbildung von Objekten und/oder Strukturdetails sowohl in der Lichtmikroskopie wie in der Rasterelektronenmikroskopie, insbesondere aber in der Kombination beider Methoden eignen. Durch die erwähnte Kombination von Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie wird eine routinemäßige Auffindung verschiedenster Objekte bis in den Mikrometerbereich ermöglicht.

Üblicherweise wird als Objektträger ein für sichtbares Licht transparenter Träger verwendet. Hiermit ist es möglich, dasselbe Objekt vergleichend mit verschiedenen Abbildungsverfahren zu untersuchen. Im Lichtmikroskop sind Durchlichtverfahren, Verfahren im Hinblick auf den Phasenkontrast, den Interferenzkontrast, die Auflicht­ fluoreszenz, ein Laser-Scanning- und Polarisations­ verfahren möglich. Für das Rasterelektronenmikroskop seien beispielhaft die Sekundärelektronenabbildung, die Rückstreuelektronenabbildung, die Kathodenlumineszenz und die Elementanalyse genannt.

Die Erfindung ist in einem Ausführungsbeispiel anhand der Zeichnung näher erläutert. In dieser stellen dar:

Fig. 1 eine Aufsicht auf einen Objektträger gemäß der Erfindung;

Fig. 2 einen Schnitt längs II-II in Fig. 1;

Fig. 3 einen Schnitt durch ein Detail eines Objektträgers gemäß der Erfindung mit einem aufgebrachten Deckglas;

Fig. 4 und 5 Aufsichten auf jeweils einen Teil eines Objektträgers gemäß der Erfindung mit darauf präparierten Objekten.

Ein Objektträger 1 besteht aus einer dünnen Glasplatte 2 mit Kantenlängen von z. B. 30×25 mm, auf der ein Rahmen 3 und ein regelmäßiges 5-zeiliges und 6-spaltiges Matrixmuster aus Punkten 4 mit einem horizontalen und vertikalen Rasterabstand D und alphanumerische Zeichen 5 (0, 1, . . ., 5, A, D, . . ., W, X) aufgebracht sind, wobei die einzelnen Bereiche des Punktrasters noch durch kleinere Punkte 6 regelmäßig unterteilt sind. Die alphanumerischen Zeichen 5 sind jeweils in der Mitte eines durch vier Punkte bestimmten Rasterbereichs angeordnet, so daß auch diese Zeichen ein regelmäßiges Muster aus einer Matrix mit dem Rasterabstand D bilden, das gegenüber dem Matrixmuster aus den Punkten 4 um den halben Rasterabstand horizontal und vertikal verschoben ist. Der Rahmen 3, die Rasterpunkte 4 und 6 sowie die alphanumerischen Zeichen 5 werden mit Hilfe einer Glas-Email-Farbe mit Zuschlägen von Bleiverbindungen in einem Siebdruckverfahren auf den Objektträger in regelmäßigen Abständen aufgebracht. Solche Farben sind im Handel etwa unter der Bezeichnung Carmina gelb/rot erhältlich. Vorzugsweise wird zunächst eine transparente dünne Kunststoffolie mit der Farbe im Siebdruckverfahren bedruckt, wonach die Folie auf die Glasplatte aufgebracht wird. In einem Trockenofen wird die Farbe bei Temperaturen von etwa 600°C eingebrannt, wobei der Kunststoff rückstandsfrei verdampft. Die eingebrannte Farbe ist inert gegen organische Lösungsmittel, Säuren und Laugen und auch gegen Chromschwefelsäure. Eine beliebige Reinigung bzw. Vorbehandlung der Objektträger vor einer Präparation ist daher möglich; ebenso eine Wiederverwendung nach entsprechender Reinigung. Die derart erzeugten Musterzeichen ragen über die Oberfläche der Glasplatte 2 geringfügig heraus. Die Höhe der Rasterpunkte 4 beträgt etwa 50 µm. Die Rasterpunkte 6 sowie die alphanumerischen Zeichen 5 sind vorzugsweise weniger hoch. Hiermit ergibt sich die Möglichkeit, wie aus Fig. 3 hervorgeht, auf den Objektträger 1 ein Deckglas 7 aufzulegen, so daß dann zwischen der Oberfläche der Glasplatte 2 und der Unterseite des Deckglases 7 ein Zwischenraum 8 verbleibt.

Auf den solcher Art hergestellten und gereinigten Objektträger werden, wie in Fig. 4 gezeigt, in herkömmlicher Weise Objekte, in diesem Falle z. B. Samen 9, aufgebracht. Der derart präparierte Objektträger wird dann in ein Lichtmikroskop eingeführt und hinsichtlich interessanter Objekte abgesucht. Die interessierenden Objekte können dann auf einer vergrößerten Fotokopie des Objektträgers markiert werden, so z. B. die beiden in Fig. 4 mit 9 bezeichneten Samen rechts oben von dem alphanumerischen Zeichen X bzw. rechts unten von dem alphanumerischen Zeichen Q, wobei das Punktemuster zu einer genaueren Lokalisierung dient. Der durchmusterte Objektträger kann dann in herkömmlicher Weise mit einer dünnen Goldschicht 10 besputtert werden, was in Fig. 5 angedeutet ist. Dieser Objektträger wird dann in ein Rasterelektronenmikroskop eingeführt, in dem der Objektträger zunächst bei geringer Vergrößerung gemustert wird, um die auf der Fotokopie des Objektträgers eingetragenen zu mikroskopierenden Objekte 9 wiederzufinden. Die Punkte 4 und 6 des Punktmusters sowie die alphanumerischen Zeichen erscheinen dabei deutlich auf dem Bild des Rasterelektronenmikroskopes, da der Farbstoff, wie erwähnt, eine hohe Sekundärelektronenemission aufweist. Ist das Objekt wiedergefunden, so wird die Vergrößerung gesteigert und das Objekt in herkömmlicher Weise untersucht.

Durch das regelmaßige Punktmuster können somit unterschiedliche Präparate oder verschiedene Stellen eines Präparates auf dem Objektträger eindeutig lokalisiert werden. Es können quantitative Aussagen über die Verteilung einzelner Objekte auf der Objektträgerfläche gewonnen werden. Aus fotographischen Aufnahmen, auch bei verschiedenen Kippwinkeln um eine Achse des Objektträgers kann sowohl die Vergrößerung als auch der Kippwinkel aus Abstandsmessungen errechnet werden. Für Stereoaufnahmen sind die Betrachtungswinkel durch Ausmessen der präzise gesetzten Punkte leicht zu überprüfen.

Claims (9)

1. Plattenförmiger Objektträger für die Rasterelektronenmikroskopie, mit einem Rastermuster von Markierungselementen zum Kennzeichnen einzelner Bereiche auf der Tragseite des Objektträgers, welches aus zwei regelmäßigen, matrixförmigen und ineinander verschachtelten Teilmustern besteht, wobei das eine, erste Teilmuster aus jeweils gleichen und das andere, zweite Teilmuster aus jeweils unterschiedlichen Markierungselementen aufgebaut ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungselemente (4, 5, 6) beider Teilmuster als separate Erhebungen ausgebildet sind, daß alle Markierungselemente (4) des ersten Teilmusters gleich hoch sind und dabei über sämtliche Markierungselemente (5, 6) des zweiten Teilmusters hinausragen, und daß die Markierungselemente (4, 5, 6) beider Teilmuster aus einem Elektronen rückstreuenden und/oder Sekundärelektronen emittierenden Material bestehen.

2. Objektträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Teilmuster aus alphanumerischen Zeichen gebildet ist.

3. Objektträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Höhe der Markierungselemente (4) des ersten Teilmusters einheitlich bei fünfzig Mikrometer liegt.

4. Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Material der Markierungselemente (4, 5, 6) Bleiverbindungen aufweist.

5. Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Teilmuster durch weitere Markierungselemente weiter unterteilt ist, die ebenfalls als separate Erhebungen ausgebildet und regelmäßig in Form einer Matrix angeordnet sind und bezüglich des ersten und zweiten Teilmusters ein drittes Teilmuster definieren, wobei die Höhen der Markierungselemente des dritten Teilmusters geringer sind als die einheitliche Höhe der Markierungselemente des ersten Teilmusters.

6. Objektträger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Objektträger als transparente Glasplatte ausgebildet ist und sämtliche Markierungselemente auf dieser Glasplatte angeordnet sind.

7. Verfahren zum Herstellen eines Objektträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Reihe nach eine Farbe im Siebdruck auf eine Kunstoffolie gedruckt und anschließend die bedruckte Kunststoffolie auf eine transparente Glasplatte aufgebracht wird und schließlich die Farbe auf die Glasplatte eingebrannt wird, wobei die Markierungselemente aufgebaut werden und der Kunststoff der Kunststoffolie verdampft.

8. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbe eine Glas/Email-Farbe mit metallischen Zuschlägen, insbesondere mit Bleiverbindungen, verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Einbrenntemperatur bei etwa 870 Kelvin liegt.