DE102021116271B4 - Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen wie Schimmelpilzen und/oder Bakterien - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen wie Schimmelpilzen und/oder Bakterien, wobei eine zu untersuchende Oberfläche mit einem Luciferase-Reagenz und einem Luciferin-Reagenz besprüht wird, wobei ein Befall der Oberfläche mittels Fluoreszenz sichtbar gemacht wird, die durch die Umsetzung des in den Zellen der Mikroorganismen vorhandenen ATP (Adenosintriphosphat) induziert wird, wobei die Fluoreszenz unter einem violetten und/oder blauem und/oder UV-Licht detektiert wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Detektion von Mikroorganismen wie Schimmelpilzen und/oder Bakterien.
  • Es sind unterschiedliche Detektions- und Messverfahren von Schimmelpilzen und/oder Bakterien bekannt. Hierbei handelt es sich hauptsächlich um drei Untersuchungsmethoden, nämlich um Schimmel-Schnelltests, die vor Ort durchgeführt werden können, Schimmeltests, die in einem Labor ausgewertet werden und Raumluftmessungen, um die von Mikroorganismen und Pilzen in die Raumluft freigesetzten Gase und/oder Sporen zu messen.
  • Es ist bekannt, die zur Untersuchung benötigten Proben entweder durch eine direkte Materialentnahme, eine Luftprobenahme oder durch eine Oberflächenbeprobung zu entnehmen.
  • Bei einer Materialentnahme handelt es sich um eine Methode, bei der das zu untersuchende Objekt durch eine direkte Materialentnahme irreversibel beschädigt wird.
  • Bei einer Oberflächenerprobung wird die Oberfläche dagegen zerstörungsfrei beprobt, ohne ein Material, wie beispielsweise Bausubstanz, Teile eines Gegenstands, wie beispielsweise eines Werkzeugs o.Ä. direkt zu entnehmen. Es ist bekannt hierfür, eine Abstrichprobe, eine Folien-Kontaktprobe oder eine Abklatschprobe für die nachfolgenden Untersuchungen zu entnehmen.
  • Die Abstrichprobe kann beispielsweise mittels eines Wattestäbchens entnommen werden, indem die zu untersuchende Oberfläche mit einem Wattestäbchen abgerieben wird. Ein kontaminiertes Wattestäbchen kann anschließend mittels eines Schnelltests ausgewertet werden.
  • Bei einer Folien-Kontaktprobe wird eine Klebefolie auf die zu untersuchende Oberfläche aufgepresst und die vorhandenen Schimmel- oder bakteriellen Partikel können entnommen werden. Anschließend wird die Probe in einem Labor einer mikroskopischen Untersuchung unterzogen. Allerdings sind reine Sporenkontaminationen auf Klebefilmen nicht sicher bis zu deren Art erfassbar, wohl aber Myzelien. Dies ist nur bei starken Kontaminationen möglich. Abklatschproben sind zur Kontrolle einer Oberfläche auf Sporenkontaminationen besser geeignet.
  • Bei einer Abklatschprobe wird ein Nährboden einer Petrischale direkt auf die zu untersuchende Oberfläche gepresst und anschließend in einem Labor kultiviert und untersucht.
  • Üblicherweise werden Schimmelpilze und/oder Bakterien auf Oberflächen von Gegenständen, beispielsweise Bauteilen, mit Hilfe von kleinen Oberflächenkontaktproben (Teststreifen) nachgewiesen. Diese werden an Speziallabore geschickt und mittels Lichtmikroskopie untersucht. Hierfür werden Folienkontaktpräparate von mehreren Bereichen der Materialoberfläche angelegt und nach Anfärbung mit einer Färbelösung lichtmikroskopisch untersucht.
  • Bei feinkörnigen Proben oder porösen Materialien ist eine derartige lichtmikroskopische Untersuchung oft nicht aussagekräftig. Deshalb werden genannte Materialien mittels Kultivierungsmethoden in Speziallaboren untersucht. Es sind zwei Kultivierungsmethoden bekannt: direkte Kultivierung und Verdünnungsuntersuchung.
  • Bei einer direkten Kultivierung werden Teile der Probe auf zwei Pilznährmedien (MEA, DG18) und ggf. auf ein Nährmedium für Bakterien (CASO) aufgegeben bzw. abgedrückt. Die Inkubation erfolgt bei 25°C und je nach Anforderung zusätzlich bei 36°C. Die Inkubationszeit beträgt bei 25°C bis zu 14 Tage, bei 36°C bis zu vier Tage. Nach der Inkubationszeit werden Schimmelpilze, Bakterien und Hefen auf den Nährplatten gezählt und als KBE (Kolonie bildende Einheit) angegeben. Die Methode sollte allerdings mit einer mikroskopischen Untersuchung des Materials kombiniert werden. Nur mittels Mikroskopie ist sicher nachweisbar, ob es sich um einen direkten Bewuchs oder eine Sporenkontamination auf der Oberfläche des Materials handelt oder ob Pilzstrukturen vorhanden sind, die ggfs. nicht anzüchtbar sind.
  • Bei einer Verdünnungsuntersuchung werden Proben bzw. Teile davon zerkleinert und suspendiert. In der Suspension werden anzüchtbare Pilze und Bakterien analysiert. Hierfür werden Teile der Materialprobe zerkleinert, in Pufferlösung eingewogen, geschüttelt und in Zehnerschritten verdünnt. Es werden mindestens vier Verdünnungsstufen in Parallelen ausplattiert. Aus den Verdünnungsstufen wird auf zwei verschiedene Nährmedien für Pilze und auf ein Bakterienmedium ausgestrichen, bei 25°C und zusätzlich bei 36°C inkubiert. Die Inkubationszeit beträgt bei 25°C bis zu 14 Tage, bei 36°C bis zu vier Tage. Nach der Inkubationszeit werden die Schimmelpilze, Bakterien und Hefen in den optimalen Verdünnungsstufen gezählt und die Konzentration berechnet.
  • Es ist bekannt im Bereich der Hygiene, z.B. Überprüfung der Hygiene von z.B. chirurgischem Besteck im medizinischen Bereich, oder zum Überprüfen von Bauteilen auf Schimmelbefall im Sachverständigenwesen, ATP-Tests zu verwenden. Hierfür werden kleine Flächen von ca. 3 cm x 3 cm mit einem Wattestäbchen abgerieben und das Wattestäbchen mittels eines Schnelltests in einem Lumimeter untersucht. Das in den Mikroorganismen, beispielsweise Schimmelpilzen oder Bakterien, enthaltene ATP (Adenosintriphosphat) wird mittels einer enzymatischen Reaktion von Luciferase/Luciferin nachgewiesen. Bei der enzymatischen Reaktion wird ATP zu ADP (Adenosindiphosphat) oder AMP (Adenosinmonophosphat) unter Fluoreszenzaussendung umgesetzt, welche mit Hilfe eines Fluorometers gemessen wird.
  • Die genannten Methoden sind umständlich, da z.B. nur kleine Flächen jeweils beprobt werden können. Bei der Probenentnahme können leicht Fehler passieren, die das Endergebnis verfälschen, wenn z.B. die zu beprobende Oberfläche nicht intensiv genug abgerieben wird. Außerdem können kleinste Verunreinigungen, die in eine Petrischale bei Abklatschprobenahme gelangen, die Proben unbrauchbar machen.
  • Die genannten Methoden sind kostenintensiv, zeitaufwendig und erfordern lange Inkubationszeiten.
  • Zudem kann immer nur eine kleine Fläche, beispielsweise auf Bauteilen, untersucht bzw. beprobt werden, bei größeren Flächen entsteht ein hoher Zeitaufwand zur Untersuchung. Große Oberflächen, beispielswese auf Baustellen mit vielen zu prüfenden Decken und Wänden, können mit den genannten Methoden nicht sinnvoll untersucht werden.
  • Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Detektion von Schimmelpilzen und/oder Bakterien, insbesondere auf Baustellen, bereitzustellen, das schnell, sensitiv, direkt vor Ort einsetzbar und für großflächige Untersuchungen geeignet ist und quantitative Messergebnisse liefert.
  • Die Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
  • Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den hiervon abhängigen Unteransprüchen gekennzeichnet.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren sieht vor, die zu untersuchende Oberfläche mit einem Luciferin-Reagenz, insbesondere einer Luciferin-Lösung zu besprühen. Anschließend wird auf die gleiche Oberfläche ein Luciferase-Reagenz, insbesondere eine Luciferase-Lösung oder Luciferase-Suspension aufgesprüht. Bevorzugt werden hoch verdünnte Lösungen aufgesprüht, z.B. 0,0001, 0,001 bis hin zu 0,01 %-ige Lösungen, bevorzugt alkoholische Lösungen. Es ist vorteilhaft, wenn die Reagenzien und insbesondere Lösungen großflächig, bevorzugt fein, aufgesprüht werden.
  • Es ist ebenfalls möglich, erst das Luciferase-Reagenz, insbesondere die Luciferase-Lösung und im nachfolgenden Schritt das Luciferin-Reagenz, insbesondere die Luciferin-Lösung aufzusprühen.
  • Sind auf den besprühten Oberflächen Schimmelpilze, Bakterien oder andere Mikroorganismen enthalten (tot oder lebend), die noch genügend ATP in ihren Körperzellen enthalten, kommt es zu einer enzymatischen Reaktion und Aussendung von Fluoreszenzlicht.
  • Bei der enzymatischen Reaktion setzt das Enzym Luciferase das Substrat Luciferin, vorzugsweise D-Luciferin (LH2), unter Verbrauch von Sauerstoff und ATP um. Hierbei fungiert das in den Zellen der zu detektierenden Mikroorganismen, beispielsweise Schimmelpilzen oder Bakterien, enthaltene ATP (Adenosintriphosphat) als Cofaktor. ATP wird während der Reaktion zu AMP (Adenosinmonophosphat) und Pyrophosphat (PPi) umgesetzt und ein Lichtquant (h v) abgegeben. LH 2 + O 2 + ATP → Luciferase oxy − L + CO 2 + AMP + PP i + h v
    Figure DE102021116271B4_0001
  • Das ausgesendete Fluoreszenzlicht ist für das menschliche Auge nicht erkennbar. Um die Fluoreszenz sichtbar zu machen, werden die zu untersuchenden Oberflächen, insbesondere Bauteiloberflächen mit Licht bestrahlt. Hierbei kann violettes, blaues oder insbesondere UV-Licht verwendet werden. Das blaue Licht kann eine Wellenlänge von 445 nm aufweisen. Das violette Licht kann eine Wellenlänge von 405 nm aufweisen. Das UV-Licht kann eine Wellenlänge von 365 nm aufweisen.
  • Sind Mikroorganismen wie beispielsweise Schimmelpilze oder Bakterien, selbst Milben oder Protozoen vorhanden, so emittieren sie unter den vorgenannten Bedingungen im eingestrahlten Licht Fluoreszenz durch das in ihren Zellen vorhandene ATP. Mit speziellen roten, gelben oder orangefarbenen Brillen, insbesondere UV-Brillen, lässt sich das Fluoreszenzlicht vom menschlichen Auge detektieren. Auf diese Weise können die von Schimmel oder Bakterien befallenen Flächen schnell identifiziert werden, da nur diese Fluoreszenz emittieren. Hierbei handelt es sich um eine qualitative Detektion.
  • Zudem kann das Ausmaß des Schimmel- oder Bakterienbefalls mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch quantitativ untersucht werden. Die Konzentration bzw. Dichte der Mikroorganismen auf einer Oberfläche wird mittels Emissionsintensitätsmessungen bestimmt. Stärker befallene Oberflächen haben eine höhere Fluoreszenzemission. Ein schwächerer Befall ist an einer geringeren Fluoreszenz erkennbar. Somit korreliert die Emissionsintensität mit der Schimmel- oder Bakteriendichte auf der zu untersuchenden Oberfläche. Die Korrelation wird für die quantitative Bestimmung als eine Kalibriergerade dargestellt. Die Werte der Kalibriergerade werden mittels empirischer Untersuchungen festgestellt.
  • Auf diese Weise kann die gemessene Emissionsintensität für eine quantitative Bestimmung des Schimmel- oder Bakterienbefalls in die Konzentration bzw. Dichte der Mikroorganismen pro Fläche umgerechnet werden.
  • Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen wie Schimmelpilzen und/oder Bakterien, wobei eine zu untersuchende Oberfläche mit einem Luciferase-Reagenz und einem Luciferin-Reagenz besprüht wird, wobei ein Befall der Oberfläche mittels Fluoreszenz sichtbar gemacht wird, die durch die Umsetzung des in den Zellen der Mikroorganismen vorhandenen ATP (Adenosintriphosphat) induziert wird, wobei die Fluoreszenz unter einem violetten und/oder blauem und/oder UV-Licht detektiert wird.
  • Es ist vorteilhaft, wenn das blaue Licht eine Wellenlänge von 445 nm, das violette Licht eine Wellenlänge von 405 nm und das UV-Licht eine Wellenlänge von 365 nm aufweisen.
  • Vorteilhafterweise werden die Luciferin- und Luciferase-Reagenzien auf die zu untersuchende Oberfläche vollflächig aufgesprüht.
  • Es ist vorteilhaft, wenn als Luciferase-Reagenz eine 0,0001 %-ige bis 0,01 %-ige Lösung verwendet wird.
  • Zudem ist es vorteilhaft, wenn als Luciferin-Reagenz eine 0,0001 %-ige bis 0,01 %-ige Lösung verwendet wird.
  • Vorteilhafterweise wird eine alkoholhaltige Lösung verwendet.
  • Weiterhin vorteilhafterweise wird die von den Mikroorganismen emittierte Fluoreszenz unter Verwendung eines transparenten Mediums, vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff, für das menschliche Auge sichtbar gemacht, wobei das transparente Medium derart ausgebildet wird, dass es rotes, gelbes, orangenfarbenes oder UV-Licht transmittiert, so dass die Fluoreszenz mit dem menschlichen Auge detektiert wird.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Oberfläche quantitativ untersucht, wobei die Intensität der von den Mikroorganismen emittierten Fluoreszenz gemessen wird, wobei die gemessenen Werte anhand einer Kalibriergeraden in eine Besiedlungsdichte umgerechnet werden.
  • In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird die von den Mikroorganismen emittierte Fluoreszenz mittels einer Kamera mit einem Farbfilteraufsatz fotografiert, wobei der Farbfilteraufsatz ein rotes, orangenfarbenes, gelbes oder UV-Glas umfasst.
  • In einer weiterhin vorteilhaften Ausführungsform ist es möglich, schwarze Schimmelpilze zu detektieren. Schwarze Schimmelpilze sind durch Einlagerung von Melanin schwarz gefärbt und absorbieren somit das eingestrahlte violette oder gelbe Licht. Hierbei wird das Licht nicht reflektiert und eine Fluoreszenz findet nicht statt. Demzufolge sind die schwarzen Schimmelpilze, insbesondere in kleinen Mengen, für das menschliche Auge nicht erkennbar. Aus diesem Grund werden sie üblicherweise mit Klebefilmabrissproben beprobt und nachgewiesen.
  • Werden die schwarzen Schimmelpilze erfindungsgemäß mit den Luciferase- und Luciferin-Reagenzien oder -Lösungen besprüht, wird Fluoreszenz emittiert, so dass auch kleinste Mengen an schwarzem Schimmelpilz detektiert werden können.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein Schimmel- oder Bakterienbefall, insbesondere ein geringer Schimmel- oder Bakterienbefall, auf Holzoberflächen nachgewiesen werden. Ein derartiger Nachweis ist mit den konventionellen Methoden besonders schwierig, weil Holz selbst unter violettem oder blauem Licht Fluoreszenz emittiert. Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden jedoch Schimmelpilze und Bakterien zur Fluoreszenz stärker angeregt als das Holz, so dass ihre Fluoreszenz eine stärkere Intensität als die des Holzes aufweist. Somit kann ein Schimmel- oder Bakterien befall sogar auf Holzoberflächen sofort nach dem Besprühen mit den beiden Lösungen unter violettem, blauem oder insbesondere UV-Licht detektiert werden.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform können sogar Schimmel- oder Bakterien-Altschäden detektiert werden. Hierfür muss lediglich eine ATP-Aktivität in den Zellen der zu untersuchenden Mikroorganismen (Schimmelpilze, Bakterien, Protozoen, Milben o.Ä.) vorhanden sein. Das noch vorhandene ATP wird mit den erfindungsgemäßen Reagenzien zu AMP unter Fluoreszenzemission umgesetzt. Die emittierte Fluoreszenz kann qualitativ unter violettem, blauem oder UV-Licht detektiert werden. Zudem kann sie bei Bedarf quantitativ ausgewertet werden.
  • Um die Befunde festzuhalten und zu dokumentieren, kann eine Kamera mit Farbfilteraufsätzen verwendet werden. Die Farbfilteraufsätze können beispielsweise rote, orangenfarbene, gelbe oder UV-Filtergläser aufweisen. Die Fluoreszenz der befallenen Oberflächen können nach dem Besprühen mit beiden Reagenzien unter Verwendung einer Kamera mit derartigen Farbfiltergläsern fotografiert werden. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn Sachverständigenberichte erstellt werden. Zudem ist dies besonders bei der Bestimmung des Ausmaßes von Schimmelbefall nach beispielsweise einem Wasserschaden vorteilhaft.
  • Bei der Erfindung ist von Vorteil, dass eine Nachweismethode für Schimmel oder Bakterien bereitgestellt wird, mit deren Hilfe sich schnell vor Ort, insbesondere auf Baustellen, bevorzugt Baustellen mit Wasser- oder Feuchteschäden, Fäkalschäden, Überschwemmungsschäden Schimmel oder Bakterien großflächig nachweisen lassen.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können große Flächen rasch untersucht werden.
  • Die rasche Untersuchung kann qualitative und quantitative Aussagen zum Schimmel- oder Bakterienbefall liefern.
  • Bei der Erfindung ist es weiterhin von Vorteil, dass zeitaufwendige und kostenintensive Einzelbeprobungen (z. T. in Laboren) von kleinen Teilflächen nicht nötig sind.
  • Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Schimmelbefälle abgrenzen und so der Sanierungsbereich eingrenzen. Ein unnötiges Entfernen von nicht-befallenen Bauteilen entfällt somit und eine Schimmelpilzsanierung lässt sich wesentlich kostengünstiger durchführen.

Claims (9)

  1. Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen wie Schimmelpilzen und/oder Bakterien, dadurch gekennzeichnet, dass eine zu untersuchende Oberfläche mit einem Luciferase-Reagenz und einem Luciferin-Reagenz besprüht wird, wobei ein Befall der Oberfläche mittels Fluoreszenz sichtbar gemacht wird, die durch die Umsetzung des in den Zellen der Mikroorganismen vorhandenen ATP (Adenosintriphosphat) induziert wird, wobei die Fluoreszenz unter einem violetten und/oder blauem und/oder UV-Licht detektiert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das blaue Licht eine Wellenlänge von 445 nm, das violette Licht eine Wellenlänge von 405 nm und das UV-Licht eine Wellenlänge von 365 nm aufweisen.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die Luciferin- und Luciferase-Reagenzien auf die zu untersuchende Oberfläche vollflächig aufgesprüht werden.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass als Luciferase-Reagenz eine 0,0001 %-ige bis 0,01 %-ige Lösung verwendet wird.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass als Luciferin-Reagenz eine 0,0001 %-ige bis 0,01 %-ige Lösung verwendet wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine alkoholhaltige Lösung verwendet wird.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Mikroorganismen emittierte Fluoreszenz unter Verwendung eines transparenten Mediums, vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff für das menschliche Auge sichtbar gemacht wird, wobei das transparente Medium derart ausgebildet wird, dass es rotes, gelbes, orangenfarbenes oder UV-Licht transmittiert, so dass die Fluoreszenz mit dem menschlichen Auge detektiert wird.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche quantitativ untersucht wird, wobei die Intensität der von den Mikroorganismen emittierten Fluoreszenz gemessen wird, wobei die gemessenen Werte anhand einer Kalibriergerade in eine Besiedlungsdichte umgerechnet wird.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von den Mikroorganismen emittierte Fluoreszenz mittels einer Kamera mit einem Farbfilteraufsatz fotografiert wird, wobei der Farbfilteraufsatz ein rotes, orangenfarbenes, gelbes oder UV-Glas umfasst.
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GHOSE, A.: Study of the photophysical properties of oxyluciferin derivatives and their applicationsbto the characterization of interactions between biomolecules. Biological Physics [physics.bio-ph]. Thesis. Université de Strasbourg, 2015.
SANNA, T. [u.a.]: ATP bioluminescence assay for evaluating cleaning practices in operating theatres: applicability and limitations. BMC Infect. Dis. (2018) 18:583, Druckseiten 1-7

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