CN109100288A - 用于血液样品中的粒子分析的鞘流体系统和方法 - Google Patents

Abstract

本公开的各方面和实施例提供了供用来分析样品中所含的粒子的粒子分析仪使用的粒子和/或细胞内细胞器配向剂。示例性粒子和/或细胞内细胞器配向剂包含水溶液、粘度改性剂和/或缓冲剂。

Description

用于血液样品中的粒子分析的鞘流体系统和方法

本申请为下述申请的分案申请，

原申请的申请日(国际申请日)：2014年3月17日，

原申请的申请号：201480012697.2(国际申请号PCT/US2014/030850)，

原申请的发明名称：用于血液样品中的粒子分析的鞘流体系统和方法。

相关专利申请的交叉引用

本专利申请是2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/799,152的非临时性申请并要求其优先权权益，所述临时专利申请的内容以引用方式并入本文。本专利申请还涉及均在2014年3月17日提交的美国专利申请No.14/215,834、14/216,533、14/216,339、14/216,811和14/217,034以及国际专利申请No.(autofocus,flowcell,dynamic range,contrast agent,hematology)(自聚焦、流通池、动态范围、对比剂、血液学)。这些提交专利中的每一者的内容均以引用方式并入本文。

背景技术

本公开涉及使用全自动化或部分自动化装置区分和定量样品中的粒子(诸如血细胞)的分析粒子(包括对流体样品中的粒子成像)的设备、系统、组合物和方法领域。本公开还涉及可用于分析得自受试者的样品中的粒子的粒子和/或细胞内细胞器配向液体(particle and/or intracellular organelle alignment liquid,PIOAL)，用于制备所述液体的方法，以及使用所述液体检测和分析粒子的方法。本发明还公开了可用于进行基于图像的生物流体样品分析的组合物、系统、装置和方法。本公开的组合物、系统、装置和方法还可用于对生物流体中的粒子(诸如红血细胞、网织红细胞、有核红血细胞、血小板)进行检测、计数和表征，以及用于基于图像和形态的白血细胞分类计数、分类、子分类、表征和/或分析。

血细胞分析是用于提供患者健康状态的概况的最常执行的医学检验之一。血液样品可从患者身体抽取并储存在含有抗凝血剂以防止凝结的试管中。全血样品通常包含三大类血细胞，包括红血细胞(红血球)、白血细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)。每一类又可分成成员亚类。例如，五大类型或亚类的白血细胞(WBC)具有不同的形状和功能。白血细胞可包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。也存在红血细胞类型的亚类。样品中粒子的外观可根据病理状况、细胞成熟度和其他原因而不同。红血细胞亚类可包括网织红细胞和有核红血细胞。

估计RBC、WBC或血小板浓度的血细胞计数可以人工方式或使用自动分析仪进行。当血细胞计数以人工方式进行时，将一滴血作为薄层涂片而施加到显微镜载片上。传统上，已将人工检查显微镜载片上的干燥、染色血涂片用来确定五种类型的白血细胞的数量或相对量。已将组织学染料和染剂用于对细胞或细胞结构染色。例如，瑞氏染剂是已用于对血涂片染色以在光学显微镜下检查的组织学染剂。全血计数(CBC)可使用自动化分析仪获得，其中一种类型基于粒子或细胞沿着小管通过感测区时的阻抗或动态光散射而对血液样品中的不同粒子或细胞的数量计数。自动化CBC可采用多种仪器或方法区分不同类型的细胞，这些细胞包括RBC、WBC和血小板(PLT)，它们可单独地进行计数。例如，要求最小粒度或体积的计数技术可用于仅对大细胞计数。血液中的某些细胞(诸如异常细胞)可能无法正确计数或鉴定。彼此粘附的小细胞可能被错误地计数为大细胞。当怀疑计数有误时，可能需要对仪器结果进行人工复查以确认和鉴定细胞。

自动化血细胞计数技术可涉及流式细胞术。流式细胞术涉及提供窄的流路，以及对单个血细胞的通过进行感测和计数。流式细胞术方法已用于检测悬浮在流体中的粒子，诸如血液样品中的细胞，以及用于分析粒子的粒子类型、尺寸和体积分布以便推断出血液样品中相应粒子类型或粒子体积的浓度。分析悬浮在流体中的粒子的合适方法的例子包括沉降、微观表征、基于阻抗的计数和动态光散射。这些工具易出现测试误差。另一方面，准确表征粒子的类型和浓度在诸如医学诊断的应用中可能至关重要。

在基于成像的计数技术中，使用耦合到数码相机的显微镜物镜镜头捕获可能正在通过观察区的制备样品的像素数据图像。像素图像数据可用数据处理技术加以分析，并且还显示在监视器上。

具有流通池的自动化诊断系统的各方面在授予Turner等人的美国专利No.6,825,926以及均授予Kasdan等人的美国专利No.6,184,978、6,424,415和6,590,646中有所公开，它们据此以引用方式并入，如同在本文完整示出一样。

使用动态光散射或阻抗的自动化系统已用于获得全血计数(CBC)：总白血细胞计数(WBC)、红血细胞总细胞体积(RBC分布)、血红蛋白HGB(血红蛋白在血液中的量)；平均细胞体积(MCV)(红细胞的平均体积)；MPV(平均PLT体积)；血细胞比容(HCT)；MCH(HGB/RBC)(每个红血细胞的血红蛋白的平均量)；和MCHC(HGB/HCT)(细胞中血红蛋白的平均浓度)。自动化或部分自动化方法已用来便于白血细胞五部分分类计数和血液样品分析。

虽然此类目前已知的粒子分析系统和方法连同相关的医学诊断技术可为医生、临床医生和患者提供实际益处，但是仍需要进一步的改进。例如，一直需要在使用自动化系统执行基于图像的样品分析时可用于粒子和/或细胞内细胞器配向的改进方法和组合物。本发明的实施例为这些待解决的需求中至少一些提供了解决方案。

发明内容

本发明的实施例涉及用于分析包含粒子的制备样品的设备、系统、组合物和方法。在一些方面，所述系统包括可以为视觉分析仪的分析仪。在一些方面，所述设备包括视觉分析仪和处理器。在一个方面，本公开涉及自动化粒子成像系统，其中使包含所关注的粒子的液体样品流过具有观察孔的流通池，高光学分辨率成像装置通过所述观察孔捕获图像。在一些方面，该高光学分辨率成像装置包括相机，诸如数码相机。在一个方面，该高光学分辨率成像装置包括物镜镜头。

流通池耦合到样品流体源，诸如制备的样品，以及粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)源。所述系统允许捕获流动样品中粒子的聚焦图像。在一些实施例中，该图像可用于自动化、高通量方法以对粒子进行分类及子分类。示例性视觉分析仪可包括便于图像的自动化分析的处理器。在一些情况下，视觉分析仪可用于本公开的方法以提供自动化的基于图像的WBC分类计数或其他血液样品粒子分析方案。在一些情况下，本公开的方法涉及形态异常的自动化鉴定以便对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断，并且监测受试者是对治疗响应还是无响应。

本发明的实施例提供可用于经粒子对比剂组合物处理过的细胞中的粒子和/或细胞内细胞器配向的系统、方法和鞘流体组合物。此类技术克服了与用于流式细胞术的常规鞘流体相关的某些难题，常规鞘流体可能存在维持细胞形态和/或不能捕获允许测定一种或多种血液组分的优化图像的缺点。

在某些实施例中，在带形样品料流与鞘流体之间的粘度差和/或速度差和/或带形样品料流的厚度，例如与变窄流路过渡区所提供的几何聚焦作用相结合，可引入剪切力而作用在流动中的粒子上，从而导致粒子在视觉分析仪中的整个成像过程中配向或保持配向。在一些实施例中，样品将为对比度增强的。在一些实施例中，鞘流体可包含最多100％的粘度剂。在另一个实施例中，鞘流体具有最多60％v/v的粘度剂。取决于所用的粘度剂的类型，在一些实施例中，鞘流体可包含约5％至7％或更具体地讲6.5％(w/v)的浓度的可以干燥形式商购获得的粘度剂。

在其他实施例中，本公开涉及可用于对样品中的粒子(诸如细胞)以及其他生物流体(诸如与特定病症相关的脑脊髓液和积液)中的其他粒子特征进行基于图像的分析的鞘流体。如所述用于血液样品的细胞分类和/或子分类计数在本公开中作为可以分析的样品的分类的非限制性例子。在一些实施例中，存在于样品中的细胞还可以包括细菌或真菌细胞以及白血细胞、红血细胞或血小板。在一些实施例中，可以分析得自组织或抽吸物的粒子悬液。

在一些实施例中，可将样品流体的料流注入穿过插管，所述插管具有平坦开口以建立具有相当大的宽度的流路。鞘流体可被引入流通池并携带样品流体穿过成像区域，然后朝排放口输运。鞘流体具有与样品流体不同的粘度，例如更高的粘度，并且任选地，在注入点与带形样品料流的不同流速导致样品流体变平成薄带形状。样品流体的薄带与鞘流体一起被携带穿过变窄流路过渡区，以在观察孔的前面通过，在观察孔中布置高光学分辨率成像装置和光源以观察带形样品料流。

在一个实施例中，鞘流体的粘度可高于样品的粘度。对鞘流体的粘度、样品材料的粘度、鞘流体的流速和样品材料的流速进行协调，例如与变窄过渡区所提供的带压缩效应相结合，从而以具有预定尺寸特性(诸如有利的带形样品料流厚度)的带形样品料流提供流动。保持有利的带形样品料流厚度提供了例如高百分比的焦距内细胞或焦距内细胞组分。

本公开的实施例至少部分地基于以下发现：在鞘流体中添加适量的粘度剂明显改善流通池中(例如具有变窄过渡区的流通池中)的粒子/细胞配向，并增加焦距内的细胞的细胞内内容物，从而与使用非粘度改性的用于流式细胞术的常规鞘流体相比产生更高质量的流动中的细胞的图像。添加粘度剂增加对细长或非球形粒子或比如红血细胞(RBC)的细胞的剪切力，然后使细胞在基本上平行于流动方向的平面中配向，这导致图像优化。对于比如白血细胞(WBC)的细胞，这还导致基本上平行于流动方向使细胞内结构、细胞器或小叶(lobe)定位、重定位和/或更好地定位。例如，白血细胞可响应于粘度剂或粘度差所赋予的剪切力而压缩或变形，从而导致粒子在剪切下伸长或压缩和配向。

直径比流动料流小的粒子的配向可通过增大鞘流体的粘度而获得。这导致那些粒子在基本上平行于流动方向的平面中改善的配向。

带形样品料流厚度可受样品流体和鞘流体的相对粘度和流速的影响，例如与流通池的变窄过渡区的几何形状相结合。样品的进料源和/或鞘流体的进料源(例如包括精密容积泵)可被配置成以稳定的流速提供样品和/或鞘流体以优化带形样品料流的尺寸，即作为至少与成像装置的视野一样宽的薄带。

示例性鞘流体实施例在流通池中用于粒子分析。样品被包封在鞘流体的料流中并穿过分析仪装置的流通池。然后，采集样品在穿过检测区时得自样品的信息，从而使得分析仪能够分析样品中所含的粒子/细胞。在这样的分析仪上使用鞘流体允许对样品中所含的细胞和/或粒子进行准确的分类及子分类和计数。

如本文所用，鞘流体可用于获得与以下细胞和/或其相关粒子有关的信息：这些细胞包括例如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、网织红细胞、有核RBC、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞和/或晚幼粒细胞。

本公开提供用于进行粒子分析的新型组合物及其使用方法。具体地讲，本公开涉及用在分析仪中以分析样品中的粒子的粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)。术语鞘流体和PIOAL在此整个公开内容中可互换使用。本公开还提供用于产生PIOAL的方法以及使用PIOAL分析粒子的方法。本发明的PIOAL可例如用于样品中粒子的自动化分类及子分类方法。

在一个方面，本发明的实施例涵盖使用粒子分析系统对多个粒子成像的方法。该系统可被配置成用于组合式粘度和几何流体聚焦。粒子可包含在具有样品流体粘度的血液流体样品中。示例性方法可包括使鞘流体沿着流通池的流路流动，而鞘流体可具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘流体粘度。方法还可以包括将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中以便提供被鞘流体包封的样品流体料流。另外，方法可包括使样品流体料流和鞘流体穿过流路尺寸的缩减段流向成像位点，使得与粘度差相关的鞘流体和样品流体料流之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸的缩减段相关的鞘流体和样品流体料流之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，有效地在成像位点在多个粒子的至少一些中提供靶成像状态，而鞘流体中的粘度剂保持样品流体料流中细胞的活力，从而当细胞从样品流体料流延伸到流动鞘流体中时使细胞的结构和内容物完整。而且，方法可包括在成像位点对多个粒子成像。在一些情况下，鞘流体的折射率n＝1.3330。在一些情况下，鞘流体的折射率与水的折射率相同。在一些情况下，与流路尺寸的缩减段相关的鞘流体和样品流体料流之间的相互作用通过沿着样品和鞘流体料流的界面产生剪切力而有助于提供靶成像状态。在一些情况下，靶成像状态包括流动中的一个或多个靶粒子相对于在成像位点用来获取图像的成像装置的焦平面的靶取向。

根据一些实施例，在成像位点的流路限定基本上平行于焦平面的平面。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶配向。在一些情况下，靶配向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子配向。在一些情况下，靶配向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构配向。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶位置。在一些情况下，靶位置对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子位置。在一些情况下，靶位置对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构位置。在一些情况下，靶位置在焦平面内。在一些情况下，靶位置处于离焦平面的一定距离处，该距离对应于位置公差。在一些情况下，靶取向对应于相对于焦平面的靶配向和相对于焦平面的靶位置。在一些情况下，靶成像状态对应于流动中的一个或多个靶粒子内结构相对于在成像位点用来获取图像的成像装置的焦平面的靶取向。在一些情况下，在成像位点的流路限定基本上平行于焦平面的平面。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶配向。在一些情况下，靶配向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子配向。在一些情况下，靶配向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构配向。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶位置。在一些情况下，靶位置对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子位置。在一些情况下，靶位置对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构位置。在一些情况下，靶位置在焦平面内。在一些情况下，靶位置处于离焦平面的一定距离处，该距离对应于位置公差。在一些情况下，靶取向对应于相对于焦平面的靶配向和相对于焦平面的靶位置。在一些情况下，靶成像状态对应于一个或多个靶粒子或一个或多个靶粒子内结构的靶变形。

根据一些实施例，注入血液流体样品的过程通过将血液流体样品的料流以样品流体速度引导通过样品注入管而进行。注入管可在流路内具有端口。该端口可限定宽度、厚度以及沿着流路延伸的流动轴线。该宽度可大于厚度以使得样品料流具有横向于成像位点附近的成像路径的相对主表面。在一些情况下，沿着流通池的流路流动的鞘流体沿着样品料流的主表面延伸，并具有不同于样品流体速度的鞘流体速度。在一些情况下，与不同速度相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用，与和不同粘度相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用相结合，提供靶成像状态。根据一些实施例，所述多个粒子可包括红血细胞、白血细胞和/或血小板。根据一些实施例，所述多个粒子可包括具有粒子内结构的细胞。在一些情况下，粒子内结构可以为细胞内结构、细胞器或小叶。

在一些实施例中，鞘流体的粘度在1至10厘泊(cP)之间。在一些情况下，预定粘度差具有约0.1至约10厘泊(cP)范围内的绝对值。在一些情况下，预定粘度差具有约1.0至约9.0厘泊(cP)范围内的绝对值。在一些情况下，预定粘度差具有约1.0至约5.0厘泊(cP)范围内的绝对值。在一些情况下，预定粘度差具有约3.0厘泊(cP)的绝对值。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含甘油、甘油衍生物、乙二醇、丙二醇(二羟基丙烷)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素(CMC)、水溶性聚合物和/或葡聚糖。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含约1至约50％(v/v)之间的浓度的甘油。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含5％(v/v)浓度的甘油以及1％(w/v)浓度的甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含在操作条件下以约3％至约30％(v/v)之间的最终浓度存在的甘油。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含在操作条件下以约30％(v/v)的最终浓度存在的甘油。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含在操作条件下以约6.5％v/v的最终浓度存在的甘油。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含在操作条件下以约5％(v/v)的最终浓度存在的甘油以及以约1％(w/v)的浓度存在的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

根据一些实施例，在成像位点的血液流体样品具有20至200mm/s范围内的线速度。在一些情况下，在成像位点的血液流体样品具有50至150mm/s范围内的线速度。在一些情况下，血液流体样品在成像位点具有最多7μm的样品料流厚度和500至3000μm范围内的样品料流宽度。在一些情况下，血液流体样品在成像位点具有2至4μm范围内的样品料流厚度和1000至2000μm范围内的样品料流宽度。在一些情况下，所述多个粒子包含一组非球形粒子，所述血液流体样品在成像位点具有流动方向，并且所述一组非球形粒子中的75％以上基本上在平行于所述流动方向的平面内配向，使得各配向的非球形粒子的主表面与平行于所述流动方向的平面平行。在一些情况下，所述多个粒子包含一组非球形粒子，所述血液流体样品在成像位点具有流动方向，并且所述一组非球形粒子中的至少90％在基本上平行于所述流动方向的平面的20度内配向。在一些情况下，所述多个粒子包含粒子内结构，所述血液流体样品在成像位点具有流动方向，并且所述粒子内结构的至少92％基本上平行于所述流动方向。

在另一方面，本发明的实施例涵盖用于对具有样品流体粘度的血液流体样品中的多个粒子进行成像的系统。该系统可被配置成与鞘流体一起使用，所述鞘流体具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘流体粘度。示例性系统可包括：具有流路和样品流体注入管的流通池，所述流路具有流路尺寸的缩减段；与流通池的流路流体连通以便沿着流通池的流路传递鞘流体流的鞘流体输入口；以及与流通池的注入管流体连通以便将血液流体样品流注入流通池内的流动鞘流体中的血液流体样品输入口，使得当鞘流体和样品流体穿过流路尺寸的缩减段流向成像位点时，与粘度差相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸的缩减段相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点在所述多个粒子的至少一些中提供靶成像状态，而鞘流体中的粘度剂保持样品流体料流中细胞的活力，从而当细胞从样品流体料流延伸到流动鞘流体中时使细胞的结构和内容物完整。系统还可以包括在成像位点对所述多个粒子成像的成像装置。

根据一些实施例，靶成像状态对应于流动中的一个或多个靶粒子相对于在成像位点用来获取图像的成像装置的焦平面的靶取向。在一些情况下，所述多个粒子包括选自红血细胞、白血细胞和血小板的成员。在一些情况下，所述多个粒子包括具有粒子内结构的细胞。细胞内结构可以为细胞内结构、细胞器或小叶。在一些情况下，预定粘度差具有约0.1至约10厘泊(cP)范围内的绝对值。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含甘油、甘油衍生物、乙二醇、丙二醇(二羟基丙烷)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素(CMC)、水溶性聚合物和/或葡聚糖。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含约1至约50％(v/v)之间的浓度的甘油。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含5％(v/v)浓度的甘油以及1％(w/v)浓度的甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

根据一些实施例，所述多个粒子包含一组非球形粒子，所述血液流体样品在成像位点具有流动方向，并且所述一组非球形粒子中的至少90％在基本上平行于所述流动方向的平面的20度内配向。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子取向。粒子在一些实施例中可以是红血细胞、白血细胞或血小板。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构取向。(例如，粒子内结构可以为细胞内结构、细胞器或小叶)。在一些情况下，在成像位点的流路限定基本上平行于焦平面的平面。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶配向。在一些情况下，靶配向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子配向。在一些情况下，靶配向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构配向。在一些情况下，靶取向对应于相对于成像位点处的焦平面的靶位置。在一些情况下，靶位置对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子位置。在一些情况下，靶位置对应于相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构位置。在一些情况下，靶位置在焦平面内。在一些情况下，靶位置处于离焦平面的一定距离处，该距离对应于位置公差。在一些情况下，靶取向对应于相对于焦平面的靶配向和相对于焦平面的靶位置。在一些情况下，靶成像状态对应于成像位点的靶变形。

根据一些实施例，血液流体样品源可被配置成为血液流体样品提供进入流动鞘流体中的样品流体速度，使得鞘流体具有与样品流体速度不同的鞘流体速度。在一些情况下，与不同速度相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用，与和不同粘度相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用相结合，提供靶成像状态。

根据一些实施例，流通池的流路包括具有流路尺寸变化的区，并且与流路尺寸变化相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用，与和不同粘度相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用相结合，提供靶成像状态。在一些情况下，与流路尺寸变化相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用通过产生侧向流体压缩力而有助于提供靶成像状态。在一些情况下，所述多个粒子包括红血细胞、白血细胞和/或血小板。在一些情况下，所述多个粒子包括具有粒子内结构的细胞，并且所述结构可以是细胞内结构、细胞器或小叶。

根据一些实施例，预定粘度差具有约0.1至约10厘泊(cP)范围内的绝对值。在一些情况下，预定粘度差具有约1.0至约9.0厘泊(cP)范围内的绝对值。在一些情况下，预定粘度差具有约1.0至约5.0厘泊(cP)范围内的绝对值。在一些情况下，预定粘度差具有约3.0厘泊(cP)的绝对值。在一些情况下，鞘流体包含粘度剂，所述粘度剂可包括甘油、甘油衍生物、乙二醇、丙二醇(二羟基丙烷)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素(CMC)、水溶性聚合物和/或葡聚糖。在一些情况下，鞘流体包含约1至约50％(v/v)之间的浓度的甘油。

根据一些实施例，在成像位点的血液流体样品具有20至200mm/s范围内的线速度。在一些情况下，在成像位点的血液流体样品具有50至150mm/s范围内的线速度。在一些情况下，血液流体样品在成像位点具有最多7μm的样品料流厚度和超过500μm的样品料流宽度。在一些情况下，血液流体样品在成像位点具有2至4μm范围内的样品料流厚度和1000至2000μm范围内的样品料流宽度。在一些情况下，所述多个粒子包含一组非球形粒子，所述血液流体样品在成像位点具有流动方向，并且所述一组非球形粒子中的至少90％基本上在平行于所述流动方向的平面中配向和/或定位。在一些情况下，所述多个粒子包含一组非球形粒子，所述血液流体样品在成像位点具有流动方向，并且所述一组非球形粒子中的至少95％在基本上平行于所述流动方向的平面的20度内配向。在一些情况下，所述多个粒子包含粒子内结构，所述血液流体样品在成像位点具有流动方向，并且所述粒子内结构的至少92％基本上平行于所述流动方向。

在另一方面，本发明的实施例涵盖用于组合式粘度和几何流体聚焦分析仪的粒子和细胞内细胞器配向液体(PIOAL)。PIOAL可引导被注入视觉分析仪的变窄流通池过渡区中的给定粘度的血液样品流体的流动，以便产生被PIOAL包封的样品流体料流。PIOAL可包含粘度比血液样品流体的粘度更高的流体。与粘度差相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和变窄流通池过渡区相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，有效地在视觉分析仪的成像位点在多个粒子的至少一些中提供靶成像状态，而PIOAL中的粘度剂保持样品流体料流中细胞的活力，从而当细胞从样品流体料流延伸到流动鞘流体中时使细胞的结构和内容物完整。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含甘油、甘油衍生物、乙二醇、丙二醇(二羟基丙烷)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素(CMC)、水溶性聚合物和/或葡聚糖。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含约1至约50％(v/v)之间的浓度的甘油。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些情况下，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的浓度为1％(w/v)。在一些情况下，鞘流体的粘度剂还包含甘油。在一些情况下，鞘流体的粘度剂包含5％(v/v)浓度的甘油以及1％(w/v)浓度的甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些情况下，PIOAL具有约1-10厘泊(cP)之间的粘度。

在又一个方面，本发明的实施例涵盖用于被配置成引导给定粘度的样品在流路中流动的视觉分析仪的粒子和细胞内细胞器配向液体(PIOAL)。PIOAL可包含粘度比样品的粘度更高的流体。PIOAL可有效支持样品的流动以及使粒子配向并增加在流路中流动的粒子和细胞的细胞内细胞器的焦距内内容物，于是可以对配向的粒子和细胞的细胞内细胞器成像。在一些情况下，PIOAL还包含粘度剂。在一些情况下，PIOAL还包含缓冲剂、pH调节剂、抗微生物剂、离子强度改性剂、表面活性剂和/或螯合剂。在一些情况下，粒子和细胞内细胞器配向液体为等渗的。在一些情况下，粒子和细胞内细胞器配向液体包含氯化钠。在一些情况下，其中氯化钠以约0.9％的浓度存在。在一些情况下，PIOAL样品的pH在操作条件下在约6.0至约8.0之间。在一些情况下，PIOAL样品混合物的pH在操作条件下在约6.5至约7.5之间。在一些情况下，PIOAL包含用于将操作条件下的pH调到约6.8至约7.2之间的pH调节剂。在一些情况下，PIOAL液体在操作条件下具有约1-10厘泊之间的目标粘度。

在再一个方面，本发明的实施例涵盖浓缩的PIOAL的储备液。在一些情况下，浓缩的储备液可稀释以达到目标粘度。在一些情况下，储备液的浓度以操作条件下PIOAL的至少约1.1x至至少约100x存在。在一些情况下，粘度剂选自甘油、甘油衍生物；PVP、CMC、乙二醇；丙二醇(二羟基丙烷)；聚乙二醇；水溶性聚合物和葡聚糖中的至少一种。在一些情况下，粘度剂包含甘油。在一些情况下，粘度剂包含甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些情况下，粘度剂包含甘油和羧甲基纤维素(CMC)。在一些情况下，粘度剂包含甘油和硫酸葡聚糖。在一些情况下，粘度剂包含甘油衍生物。在一些情况下，粘度剂包含PVP。在一些情况下，粘度剂包含丙二醇(二羟基丙烷)。在一些情况下，粘度剂包含聚乙二醇。在一些情况下，粘度剂包含水溶性葡聚糖。在一些情况下，甘油在操作条件下以约1至约50％(v/v)之间的最终浓度存在。在一些情况下，所述甘油在操作条件下以约3至约30％(v/v)之间的最终浓度存在。在一些情况下，所述甘油在操作条件下以约30％(v/v)的最终浓度存在。在一些情况下，所述甘油在操作条件下以约6.5％v/v的最终浓度存在。在一些情况下，在操作条件下所述甘油以约5％v/v的最终浓度存在而PVP以约1％w/v的浓度存在。在一些情况下，所述PVP在操作条件下以约1％w/v的最终浓度存在。在一些情况下，本发明的实施例涵盖包含如本文所公开的PIOAL的试剂盒。

在另一方面，本发明的实施例涵盖用于分析具有样品流体粘度的血液流体样品中的多个细胞的方法，所述细胞具有相对的主表面。示例性方法可包括使鞘流体沿着流通池的流路流动。鞘流体可具有比样品流体粘度更高的鞘流体粘度。方法还可以包括将血液流体样品注入流通池内的流动鞘流体中。所述多个细胞可包括第一亚组，其具有横向于成像路径的取向而取向的主表面。方法还可以包括沿着成像位点的成像路径对粒子进行成像，而所述多个细胞包括第二亚组，其具有横向于成像路径而取向的主表面，第二亚组的数量比第一亚组更多。方法还可以包括引导流体血液样品和鞘流体穿过流路尺寸的缩减段，使得与不同粘度相关的鞘流体和样品流体之间的相互作用使所述多个细胞中的至少一些重新取向，以使得第二亚组的数量比第一亚组更多。

在另一方面，本发明的实施例涵盖用于对具有样品流体粘度的血液流体样品中的多个细胞进行成像的系统。系统可被配置成与具有比样品流体粘度更高的鞘流体粘度的鞘流体一起使用，所述细胞具有相对的主表面。示例性系统可包括具有流路和样品流体注入管的流通池，与流通池的流路流体连通以便沿着流通池的流路传递鞘流体流的鞘流体输入口，以及与流通池的注入管流体连通以便将血液流体样品流注入流通池内的流动鞘流体中的血液流体样品输入口，使得所述多个注入的细胞包括第一亚组，其具有横向于成像路径的取向而配向的主表面。在一些情况下，流通池的流路可具有流路尺寸变化的区，其被配置成使得与不同粘度相关的鞘流体与血液样品流体之间的相互作用使粒子中的至少一些重新取向。系统还可以包括沿着成像位点的成像路径对所述多个粒子成像的成像装置，而所述多个细胞的第二亚组的主表面横向于成像路径取向。

在一个方面，本发明涉及对粒子进行成像的方法，其包括：使用本公开的粒子对比剂组合物对样品中的粒子进行处理；在包括流通池和自聚焦设备的视觉分析仪中用光照射染色的粒子；获得包封在粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)中的粒子的数字化图像；以及基于图像信息分析样品中的粒子。在一些实施例中，粒子选自以下至少一者：中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、网织红细胞、有核红血细胞(RBC)、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、红血细胞(RBC)、血小板、细胞、细菌、颗粒物、细胞团块或细胞碎片或组分。例如，在一些实施例中，所述设备可用于自动化的基于图像的白血细胞(WBC)分类计数，以及形态异常的自动化鉴定，其可用于对受试者是健康还是具有疾病、病症或感染和/或对治疗有响应还是无响应进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断。

当结合附图来考虑时通过参考下文的具体实施方式，本发明实施例的上述特征和许多其他特征以及伴随的优点将会变得显而易见和得到进一步地理解。

附图说明

图1是以部分截面表示的且未按比例绘制的示意图，显示了用于使用数字图像处理进行样品图像分析的示例性流通池、自聚焦系统和高光学分辨率成像装置的各操作方面。

图2是根据示例性实施例的流通池的透视图。

图3是沿着图2所示的流通池的线3-3的纵向正中截面图。

图3A和图3B提供了根据本发明实施例的流通池的附加截面图。

图4描绘了根据本发明实施例的分析仪系统的各方面。

图4A、图4B-1和图4B-2描绘了根据本发明实施例的流通池的各方面。

图4A-1和图4A-2分别描绘了根据本发明实施例在插管出口和图像捕获位点的流通池内的鞘流体(例如PIOAL)包层和样品流体料流尺寸的横截面视图。

图4C-4G和图4D-1描绘了根据本发明实施例的插管构形的各方面。

图4H、图4I和图4J描绘了根据本发明实施例使用鞘流体组合物、方法和/或系统得到的结果的各方面。

图4K和图4L描绘了根据本发明实施例在图像捕获位点的流通池内的鞘流体和样品流的各方面。

图4K-1、图4K-2和图4K-3描绘了根据本发明实施例在图像捕获位点的流通池内的鞘流体和样品流的各方面。

图4L-1描绘了根据本发明实施例的流通池内的流体流动速度的各方面。

图4M和图4N描绘了根据本发明实施例的细胞内配向和成像的各方面。

图4O描绘了根据本发明实施例的PIOAL对粒子和/或细胞内粒子配向和成像的影响的各方面。在使用PIOAL获得的图像与使用非PIOAL鞘流体获得的图像的该比较中，可以看出，使用PIOAL导致了更多的焦距内细胞内容物，诸如小叶、细胞质和/或颗粒。

图4P和图4Q显示了使用PIOAL获得的图像与使用标准鞘流体获得的图像的比较。可以看出，使用PIOAL导致了改善的RBC配向。

图4R示出了根据本发明实施例使用流通池构形和鞘流体组合物获得的某些粒子配向结果。

图5A和图5B示出了根据本发明实施例的鞘流体和样品流体流动特性的各方面。

图6描绘了根据本发明实施例的粒子成像方法的各方面。

图7和图8描绘了根据本发明实施例的流动料流应变速率的各方面。

具体实施方式

本公开涉及用于分析包含粒子的样品的设备、系统、组合物和方法。在一个实施例中，本发明涉及包括分析仪(可以为例如视觉分析仪)的自动化粒子成像系统。在一些实施例中，视觉分析仪还可以包括便于图像的自动化分析的处理器。

根据本公开，提供了包括视觉分析仪的系统以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。该系统可用于例如表征生物流体中的粒子，诸如检测和定量红血球、网织红细胞、有核红血细胞、血小板和白血细胞，包括白血细胞分类计数、分类及子分类和分析。本发明的实施例也涵盖其他类似的用途，诸如表征来自其他流体的血细胞。通常，将血液流体样品引入流动鞘流体中，并将合并的鞘流体和样品流体通过变窄的流路过渡区压缩，所述过渡区降低样品带形流体流的厚度。因此，诸如细胞的粒子可在血液流体样品内通过周围的粘性鞘流体例如与变窄过渡区所提供的几何聚焦作用相结合而取向和/或压缩。相似地，血细胞内的内部特征可因样品流体与鞘流体之间的粘度差例如与变窄过渡区所提供的几何聚焦作用相结合而取向配向。

为了提高对诸如细胞的粒子进行分类和/或子分类的能力、速度和有效性，有利的是提供清晰的高质量血细胞图像以通过数据处理系统进行自动化分析。根据本公开，将制备的样品料流以在流通池的相对壁之间具有稳定位置的薄带形式布置。样品料流的定位且其变平成薄带形状可通过引入流通池的PIOAL的层之间的流动而实现，所述PIOAL与样品流体的粘度不同并流过流动通道的对称变窄过渡区。

血液学-粒子分析系统

现在转到附图，图1示意性地显示了用于输送样品流体通过高光学分辨率成像装置24的观察区23的示例性流通池22，该成像装置被配置成用于使用数字图像处理而对样品流动料流32中的微观粒子成像。流通池22耦合到可经受处理(诸如与粒子对比剂组合物接触并加热)的样品流体源25。流通池22还耦合到一个或多个粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)源27，诸如粘度大于样品流体的粘度的透明甘油溶液。

样品流体被注入通过样品进料管29的远端28的变平开口，并在一定的点进入流通池22的内部，在所述点已基本上确立了PIOAL流，从而在带形样品料流的上方和下方(或在其相对侧上)产生稳定和对称的PIOAL层流。样品和PIOAL料流可由精密计量泵提供，该泵使PIOAL与注入的样品流体一起沿着基本上变窄的流路移动。PIOAL在流路变窄的区21中包封并压缩样品流体。因此，在区21的流路厚度降低可有助于样品料流32的几何聚焦。样品流体带32被包封并与PIOAL一起被携带到变窄区21的下游，从而在高光学分辨率成像装置24的观察区23前面通过或以其他方式穿过观察区23，在所述成像装置中例如使用CCD 48采集图像。处理器18可接收来自CCD 48的像素数据作为输入。样品流体带与PIOAL一起流向排放口33。

如这里所示，变窄区21可具有近侧流路部分21a和远侧流路部分21b，近侧流路部分具有近侧厚度PT而远侧流路部分具有远侧厚度DT，使得远侧厚度DT小于近侧厚度PT。样品流体可因此在位于近侧部分21a远侧和远侧部分21b近侧的位置注入通过样品管29的远端28。因此，样品流体可在PIOAL料流被区21压缩时进入PIOAL包层。

具有物镜镜头46的数字高光学分辨率成像装置24被沿着与带形样品料流32相交的光轴引导。物镜46和流通池33之间的相对距离可通过操作电机驱动器54而改变，以便在光传感器阵列上分辨和采集聚焦的数字化图像。

根据一些实施例，系统可以操作而对样品流体带32进行流体聚焦。术语流体聚焦可指受鞘流体与样品流体之间的粘度差、流通池的几何变窄过渡区以及鞘流体与样品流体之间的速度差影响的聚焦作用。流体动力流因样品流体料流与鞘流体料流之间的速度差而产生，其影响流带厚度和形状。

流通池

流通池22的实践实施例进一步在图2和图3中描绘出。如这里所示，流通池22可以与样品源25耦合并且还可以耦合到PIOAL材料源27。样品流体经由插管29例如通过插管29的远侧出口31而注入流通池22。通常，PIOAL鞘流体在其通过流通池中的弯曲通道段41从源27向观察区23行进时不处于层流状态。然而，流通池22可被配置成使得PIOAL鞘流体在流过将样品流体引入流动鞘流体中的远侧出口31时为层流或变成层流，或显示出平坦的速度剖面(velocity profile)。样品流体和PIOAL可以大致如箭头A所示的方向沿着流通池22流动，然后经由排放口33流出流通池22。流通池22限定以流动方向A对称变窄(例如，在过渡区21)的内部流路20。流路的对称性有助于样品料流稳健而居中的流动。流通池22被配置成引导被PIOAL包封的样品流32通过流通池中的观察区23，即在观察孔57背后。与观察孔57相关联的是自聚焦光栅44。流通池22还具有被配置成接受或接纳显微镜物镜(未示出)的倒圆或凹陷座58。

根据一些实施例，自聚焦光栅44可具有相对于流通池22固定的且位于离带形样品料流32平面一定位移距离的位置。在这里所示的实施例中，自聚焦光栅(靶44)在高光学分辨率成像装置(未示出)通过观察孔57采集的图像中可见的位置直接施加到流通池22。流通池22可由单件材料构成。或者，流通池22可由第一或上部区段或层22a和第二或下部区段或层22b构成。如这里所示，玻璃或透明窗格60附接到第一区段22a或与第一区段一体化。窗格60可限定流通池内的样品流路的至少一部分。来自光源42的光可穿过自聚焦光栅44的孔隙或通路行进，以便照明在流动料流32内流动的样品粒子。

在一些情况下，窗格60的厚度可具有约150μm至约170μm范围内的值。如上所述，窗格60可限定或形成流路或鞘流体(例如PIOAL)通道的一部分。通过使用薄窗格60，可以将显微镜物镜置于非常靠近样品流体带的位置，并因此得到沿着流路流动的粒子的高倍放大图像。

图3A描绘了流通池实施例的各方面，其中成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约8.24mm。远侧过渡区部分316与插管出口331之间的距离为约12.54mm。插管出口331与鞘流体入口301之间的距离为约12.7mm。插管出口331与近侧过渡区部分318之间的距离为约0.73mm。图3B描绘了流通池实施例的各方面，其中与图3A实施例相比，插管出口已移动到相对于过渡区的更远侧位置。如这里所示，插管远端向流通池的变窄过渡区推进，并且成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离在约16mm至约26mm的范围内。在一些情况下，成像轴355与远侧过渡区部分316之间的距离为约21mm。

返回参照图1，可调整流通池内部轮廓(例如，在过渡区21处)以及PIOAL和样品流速以使得样品形成带形料流32。料流可与包封在带形样品料流中的粒子大约一样薄或甚至更薄。白血细胞可具有例如约10μm的直径。通过提供厚度小于10μm的带形样品料流，当带形样品料流被鞘流体或PIOAL拉伸时细胞可以取向。令人惊讶的是，带形样品料流沿着变窄流路在粘度与带形样品料流不同(诸如更高粘度)的PIOAL层内的拉伸有利地往往会使非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向，并对细胞施加力，从而改善细胞的细胞内结构的焦距内内容物。高光学分辨率成像装置24的光轴基本上正交(垂直)于带形样品料流的平面。带形样品料流在成像点的线速度可为例如20-200mm/s。在一些实施例中，带形样品料流的线速度可为例如50-150mm/s。

带形样品料流厚度可受样品流体和PIOAL的相对粘度和流速的影响。样品源25和/或PIOAL源27(例如，包括精密容积泵)可被配置成以可控的流速提供样品和/或PIOAL以优化带形样品料流32的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像装置24的视野一样宽的薄带。

在一个实施例中，PIOAL源27被配置成以预定的粘度提供PIOAL。该粘度可与样品的粘度不同，并且可以高于样品的粘度。对PIOAL的粘度和密度、样品材料的粘度、PIOAL的流速和样品材料的流速进行协调以在离自聚焦光栅的位移距离处维持带形样品料流，并具有预定的尺寸特性，诸如有利的带形样品料流厚度。

在实践实施例中，PIOAL具有比样品更高的线速度和比样品更高的粘度，从而将样品拉伸成平带。PIOAL粘度可为最高10厘泊。

另参见图2和图3，流通池的内部流路在带形样品料流注入PIOAL的点的下游变窄，从而产生例如最高7μm的带形样品料流厚度，和/或内部流路产生500-3,000μm的带形样品料流宽度。在示例性实施例中，如图1中所描绘，流通池的内部流路始于样品料流注入PIOAL的点的上游的变窄过渡区。

在另一个实施例中，内部流路变窄以产生厚度为2-4μm的带形样品料流厚度，和/或内部流路形成宽度为2000μm的带形样品料流。这些尺寸尤其可用于血液学。料流在此情况下的厚度小于一些粒子(诸如处于其松弛状态的红血细胞)的直径。因此，这些粒子可变成重新取向，以使其更宽的尺寸面向成像轴，这可有助于展现出区别特性。

带形样品料流的线速度可被充分限制以防止在光传感器阵列的图像曝光时间数字化图像的运动模糊。光源可任选地为闪烁以短时间施加高入射振幅的闪光灯。因为自聚焦光栅44和图像处于相同的视野中，所以光源被配置成同时照明带形样品料流和自聚焦光栅。然而，在其他实施例中，成像和自聚焦的视野可以不同，例如单独地照明和/或成像。

主题开发具有方法以及设备方面。聚焦视觉分析仪的方法包括在相对于流通池22固定的自聚焦光栅44上聚焦高光学分辨率成像装置24，其可以为数字高光学分辨率成像装置或数字图像捕获装置，其中自聚焦光栅44位于离带形样品料流32的位移距离52处。数字高光学分辨率成像装置24具有物镜，其光轴与带形样品料流32相交。物镜与流通池22之间的相对距离通过操作电机驱动器54而改变，而沿着光轴在高光学分辨率成像装置与最佳聚焦点之间的距离是已知的。数字高光学分辨率成像装置被配置成在光传感器阵列上分辨和收集数字化图像。操作电机驱动器以在自聚焦过程中在自聚焦光栅上聚焦。然后在所述位移距离上操作电机驱动器，从而在带形样品料流上聚焦高光学分辨率成像装置。

所述方法还可以包括使带形样品料流形成带形。呈现带形以使得高光学分辨率成像装置的光轴基本上垂直于带形样品料流，即与带形料流的平面正交。

图4描绘了用于对血液流体样品中的粒子成像的系统400的各方面。如这里所示，系统400包括样品流体注入系统410、流通池420和图像捕获装置430以及处理器440。流通池420提供任选地与样品料流相结合而传递鞘流体流的流路422。根据一些实施例，样品料流注入系统410可包括插管或管412或与插管或管412耦合。样品流体注入系统410可与流路422流体连通(例如，经由样品流体入口402)，并且可以操作而将样品流体424注入穿过插管412的远侧出口413并进入流通池420内的流动鞘流体426中以便提供样品流体料流428。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使样品流体注入系统410将样品流体424注入流动鞘流体426中。如这里所示，鞘流体426可通过鞘流体注入系统450(例如，经由鞘流体入口401)而引入流通池420。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使鞘流体注入系统450将鞘流体426注入流通池420中。如图4中所描绘，插管412的远侧出口413可定位在沿着变窄过渡区419的长度的中心位置。在一些情况下，远侧出口可定位在更靠近过渡区419的开始处(近侧部分)。在一些情况下，远侧出口可定位在更靠近过渡区419的末端处(远侧部分)。在一些情况下，远侧出口413可完全定位在过渡区419之外，例如如图3A中所描绘(其中远侧出口331设置在变窄过渡区的近侧)。

样品流体料流428具有邻近注入管412的第一厚度T1。流通池的流路422具有流路尺寸的缩减段使得样品流体料流428的厚度从初始厚度T1减小到邻近图像捕获位点432的第二厚度T2。图像捕获装置430与图像捕获位点432配向以便在流通池420的图像捕获位点432对来自第一样品流体的第一多个粒子成像。

处理器440与样品流体注入系统410、图像捕获装置430以及任选鞘流体注入系统450耦合。处理器440被配置成终止第一样品流体向流动鞘流体426中的注入并开始第二样品流体向流动鞘流体426中的注入，使得引发样品流体瞬变。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使样品流体注入系统410将第二样品流体注入流动鞘流体426中，使得引发样品流体瞬变。

另外，处理器440被配置成在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的4秒内引发在流通池420的图像捕获位点432捕获来自第二样品流体的第二多个粒子的图像。例如，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成在样品流体瞬变后并在对第一多个粒子成像的四秒内使图像捕获装置430引发在流通池420的图像捕获位点432捕获来自第二样品流体的第二多个粒子的图像。

因此，本发明的实施例涵盖用于对具有样品流体粘度的血液流体样品424中的多个粒子成像的系统400。系统400可与鞘流体426一起使用，该鞘流体具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘流体粘度。系统400可包括具有流路422和样品流体注入管412的流通池420。流路422可具有流路尺寸的缩减段或变窄过渡区。另外，系统400可包括与流通池420的流路422流体连通的鞘流体输入口401，以便沿着流通池420的流路422传递鞘流体流。系统400还可以包括与流通池420的注入管412流体连通的血液流体样品输入口402，以便将血液流体样品的流或料流428注入流通池420内的流动鞘流体428中。例如，样品流体424可离开插管412的远侧出口423并进入流动鞘流体426的包层中以在其中形成样品带428。

当鞘流体426与由样品流体424所形成的样品流体带428一起穿过流路尺寸的缩减段419流向成像位点432时，与粘度差相关的鞘流体426和样品流体424之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸的缩减段相关的鞘流体426和样品流体424之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点432在多个粒子的至少一些中提供靶成像状态。如这里所示，系统400还包括在成像位点432对多个粒子成像的成像装置430。

如图4A中所描绘的流通池实施例中所示，流路尺寸的缩减段(例如，在过渡区419a)可由流路422a的相对壁421a、423a限定。相对壁421a、423a可沿着流路422a径向向内成一角度，通常围绕将样品流体料流428a二等分的横向平面451a对称。平面451a可将样品料流428a二等分，其中样品料流在样品料流428a离开插管或样品注入管412a的远侧部分427a的位置处具有第一厚度T1。相似地，平面451a可将样品料流428a二等分，其中样品料流在样品料流428a经过图像捕获位点432a的位置处具有第二厚度T2。根据一些实施例，第一厚度T1具有约150μm的值，而第二厚度T2具有约2μm的值。在此类情况下，样品带料流的压缩比为75:1。根据一些实施例，第一厚度T1具有约50μm至约250μm范围内的值，而第二厚度T2具有约2μm至约10μm范围内的值。当样品料流流体流过流通池时，带在加速和被拉伸时变薄。流通池的两个特征可有助于样品流体带的变薄。首先，鞘流体包层与样品流体带之间的速度差可起到降低带的厚度的作用。其次，过渡区的渐缩几何形状可起到降低带的厚度的作用。如图4A中所描绘，插管412a的远侧出口413a可定位在沿着变窄过渡区419a的长度的中心位置处。在一些情况下，远侧出口可定位在更靠近过渡区419a的开始处(近侧部分415a)。在一些情况下，远侧出口可定位在更靠近过渡区419a的末端处(远侧部分416a)。在一些情况下，远侧出口413a可完全定位在过渡区419a之外，例如如图3A中所描绘(其中远侧出口331设置在变窄过渡区的近侧)。

如图4A中(以及图4和图4B-1中)所描绘，过渡区419a可由近侧(415a)和远侧(416a)部分的成角度过渡部分限定。还应当理解的是，过渡区419a可替代地在近侧(415a)和远侧(416a)部分呈现出平滑或弯曲过渡部分，类似于如图1、图3、图3A、图3B和图4B-2中所描绘的平滑或弯曲过渡部分。

通常，第一厚度T1远大于样品粒子的尺寸，因此粒子被完全包含在样品带料流内。然而，第二厚度T2可小于某些样品粒子的尺寸，因此那些粒子可延伸到样品流体之外并进入周围的鞘流体中。如图4A中所示，样品带料流可大致沿着与其离开插管并向图像捕获位点行进的相同平面流动。

流通池还可以在远侧插管部分427a与图像捕获位点432a之间提供分隔距离430a。根据一些实施例，样品流体注入管412a的远侧部分427a可定位在离图像捕获位点432a的轴向分隔距离430a处，其中轴向分隔距离432a具有约21mm的值。在一些情况下，轴向分隔距离430a具有约16mm至约26mm范围内的值。

插管出口与图像捕获位点之间的轴向分隔距离430a可影响样品流体从出口向图像捕获位点行进时流体的传递时间。例如，相对更短的轴向分隔距离430a可有助于更短的传递时间，而相对更长的轴向分隔距离430a可有助于更长的传递时间。

插管远侧部分427a处的出口相对于流路过渡区419a或相对于流路过渡区419a的近侧部分415a的位置也可推断出样品流体从出口向图像捕获位点行进时流体的传递时间。例如，鞘流体可在近侧部分415a具有相对更慢的速度，而在近侧部分415a与远侧部分416a之间的位置具有相对更快的速度。因此，如果将远侧部分427a处的插管出口定位在近侧部分415a，则样品流体到达图像捕获位点将花费更长的时间，这不仅因为行进距离更长，还因为样品流体在离开插管远侧端口后的初始速度更慢(由于更慢的鞘流体速度)。换句话说，样品流体存在于流通池的较厚部分(例如，靠近近侧部分415a)的时间越长，则样品到达图像捕获位点所花的时间越长。反之，如果将远侧部分427a的插管出口定位在近侧部分415a的远侧(例如，在近侧部分415a与远侧部分416a之间的中心位置，如图4A中所描绘)，则样品流体到达图像捕获位点所花的时间将更短，这不仅是因为行进距离更短，还因为样品流体在离开插管远侧端口后的初始速度更快(由于更快的鞘流体速度)。如本文其他地方所讨论，鞘流体在穿过过渡区419a流动时因区419a的变窄横截面积而被加速。

根据一些实施例，传递时间越短，图像捕获位点处采集图像可用的时间越多。例如，随着从插管远侧顶端到成像区域的传递持续时间缩短，可以在特定的时长内处理更多的样品，并相关地可以在特定的时长内获得更多的图像(例如，每分钟的图像数)。

虽然存在与将插管远侧部分427a的出口定位在更靠近图像捕获位点432a的位置相关的优点，但在所述出口与捕获位点之间维持一定的距离也是可取的。例如，如图3中所描绘，成像装置的光学物镜或前透镜可定位在流通池22的座58中。如果插管的出口31太靠近座58，则样品流体在被注入鞘流体中后可能不够稳定，而不能在图像捕获位点提供所需的成像性质。相似地，可能有利的是将渐缩过渡区21保持在离观察区23一定的距离处，以使得渐缩区不干扰接纳图像捕获装置物镜的座58的定位。

继续参照图4A，样品流体注入管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的近侧部分415a的远侧。相关地，样品流体注入管412a的下游端427a可定位在流路过渡区419a的远侧部分416a的近侧。因此，根据一些实施例，样品流体可从注入插管412a在过渡区419a内的某一位置注入流通池。

根据一些实施例，流路尺寸的缩减段(例如，在流路过渡区419a)的对称性起到限制血液流体样品中的粒子不良配向的作用。例如，这种对称性可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到小于约20％。

根据一些实施例，本文所公开的方法可起到使血液计数分析期间的标记率(flagging rate)低于样品的30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％的作用。

根据一些实施例，图像捕获位点432a具有约150μm×150μm与400μm×400μm之间的视野433a。在一些情况下，图像捕获位点432a具有约275μm×275μm的视野433a。在一些情况下，视野可根据长度乘以宽度加以限定。如果表示为表面积，则275μm×275μm视野具有75,625μm²的面积。根据一些实施例，视野可由成像装置物镜及其放大倍数确定。在一些情况下，视野可对应于由采集光学元件(例如，物镜、镜筒透镜和相机)成像的场(区域)范围。在一些情况下，视野远小于图像捕获位点处的透明区的观察孔。

图4A-1和图4A-2示出了当样品料流从插管出口向图像捕获位点行进时流体聚焦对样品料流的影响。如图4A-1中所示，样品料流可具有约150μm的高度H(S)和约1350μm的宽度W(S)。另外，PIOAL鞘料流可具有约6000μm的高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。在流体聚焦之后，如图4A-2中所示，样品料流可具有约2μm的高度H(S)和约1350μm的宽度W(S)。另外，PIOAL鞘料流可具有约150μm的高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。在一个实施例中，PIOAL鞘料流在插管出口处的横截面积是图像捕获位点附近的横截面积的40倍。

根据一些实施例，其可用于确定图像捕获位点处的流通池通道的横截面。这可对应于如图4A-2中所描绘的约150μm的PIOAL鞘料流高度H(P)和约4000μm的宽度W(P)。其还可用于确定在图像捕获位点处流过流通池的合并样品和鞘流体的体积流速。当已知横截面积和流速时，可以确定图像捕获位点处的合并样品和鞘流体的速度。

根据一些实施例，样品和鞘流体穿过流通池的流动可用平行板轮廓模型估算。相关地，样品流体料流的中心的流速(例如，如图4A-2中所描绘)可为合并样品和鞘流体料流的平均流速的约1.5倍。

根据一些实施例，在插管出口处的样品流的横截面积(例如，图4A-1中的W(S)×H(S))为成像位点处的样品流的横截面积(例如，图4A-2中的W(S)×H(S))的40倍。在成像区域处的鞘流体的体积流速可为约45μL/s。在成像区域处的样品流体的体积流速可为约0.232μL/s。在一些情况下，在成像位点处的合并鞘料流和样品料流的横截面积为600,000μm²。在一些情况下，在成像位点处的平均流动料流速度为75mm/s。

流速或速度可作为产生清晰和聚焦的细胞图像的速率而确定。示例性流速和速度基于据观察在成像位点实现一定样品流动料流带形或特性的两个样品的流速而发现。例如，在约75mm/s(或20-200mm/s范围内)的流速下，细胞不会流动得过慢以使得在连续图像中存在细胞的重叠，也不会流动得过快以使得形成幻影效应(模糊的图像)。相关地，通过避免过高的流速，可以节省更多的试剂和样品。根据一些实施例，最佳的或所需的线速度可通过改变体积流量(泵速)或插管形状而实现。

穿过图像捕获区的样品料流的流动速度也可与图像捕获装置相对于流通池功能的性能相关。例如，如果样品料流流动得过快，则可能难以获得样品中所含的粒子的清晰图像(例如，图像捕获装置的快门速度可能过慢，从而产生模糊的图像)。相似地，如果样品料流流动得过慢，则图像捕获装置可能获得同一粒子的连续图像(例如，同一粒子保持在两次图像捕获期间的捕获帧中)。在一些实施例中，样品带的速度可相对于图像捕获速率进行调节(例如，通过调整多个流通池操作参数中的任何一个)，以使得在帧捕获之间存在最少的流动，并因此能对高百分比的样品成像。

根据一些实施例，粒子分析系统和相关部件可被配置成使得当鞘流体和流体样品流过流通池时，鞘流体可以45μL/s的鞘流体体积速率流动，而流体样品可以0.232μL/s(或在0.2至0.35μL/s的范围内)的流体样品体积流速流动。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约200。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率具有约70至200范围内的值。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约193。在一些情况下，鞘流体流速与样品流体流速的比率为约70。在一些情况下，在流通池内流动的鞘流体体积与流体样品体积的比率可在25:1至250:1的范围内。

根据一些实施例，所述系统和相关部件可被配置成使得当鞘流体和流体样品流过流通池420时，鞘流体可以75mm/s的鞘流体速度在成像区域前流动，而流体样品可以130mm/s的流体样品速度在成像区域前流动。在一些情况下，在流通池内流动的鞘流体体积与流体样品体积的比率可在100:1至200:1的范围内。

在一些情况下，流通池可具有约50:1的最小压缩比和约125:1的最大压缩比。在一些情况下，最小压缩比可为约30:1或20:1。该压缩比是指当将图4A-1与图4A-2比较时的流动料流厚度的比率H(S):H(S)。该压缩比可受几何压缩(例如，当将图4A-1与图4A-2比较时的鞘流体厚度的比率H(P):H(P)，其也可大致对应于图4A中所示的流通池变窄渐缩过渡区419a的尺寸)和流体动力压缩(例如，也对应于速度差)的组合的影响。根据一些实施例，几何压缩比为约40:1。

对应于过渡区的流路尺寸的缩减段可由近侧流路部分和远侧流路部分限定，近侧流路部分具有近侧厚度或高度，而远侧流路部分具有比近侧厚度或高度小的远侧厚度或高度。例如，如图4B-1和图4B-2的局部视图所示，流路的过渡区419b可在近侧部分415b与远侧部分416b之间具有长度L，其中近侧部分415b具有近侧高度417b，而远侧部分416b具有远侧高度418b。如图4B-2中所描绘，并如本文其他地方所述，过渡区的形状或轮廓可以为弯曲的或平滑的，并例如以S形曲线、反曲形曲线或正切曲线的形状提供。根据一些实施例，近侧高度417b具有约6000μm的值。在一些情况下，近侧高度417b具有约3000μm至约8000μm范围内的值。根据一些实施例，远侧高度418b具有约150μm的值。在一些情况下，远侧高度418b具有约50μm至约400μm范围内的值。

过渡区419a的几何形状可提供在第一流路边界403b与二等分横向平面451b之间的第一角度α1，和在第二流路边界404b与二等分横向平面451b之间的第二角度α2。在一些情况下，角度α1为约45度而角度α2为约45度。在一些情况下，角度α1具有约10度至约60度范围内的值。在一些情况下，角度α2具有约10度至约60度范围内的值。根据一些实施例，角度α1和α2具有相同的值。可对角度α1和α2进行选择以便在样品流体从近侧部分415b向远侧部分416b行进时维持样品流体的层流或最大程度降低样品流体的湍流，继而可增强样品内的粒子沿着横向平面451b的配向。如上文参照图4A所述，过渡区的远侧和近侧边界或部分可以为弯曲的或平滑的，而不是成角度的。

图4C描绘了根据本发明实施例的示例性插管或样品进料管400c的特征，其中插管具有长度L。图4D描绘了插管400d的纵向横截面。如这里所示，插管400d包括远侧变平区段410d、中心渐缩区段420d和近侧管状部分430d。如图4C-1中所描绘，示例性插管或样品进料管400c-1可具有远侧部分410c-1和近侧部分430c-1。在一些情况下，远侧部分410c-1具有约1.359mm的长度和约1.43mm的宽度。在一些情况下，远端的出口具有约1.359mm的出口宽度W(E)。根据一些实施例，插管可具有与图4C和图4D中所描绘的不同的内部流路几何形状。例如，如图4D-1中所示，插管400d-1不包括具有扩展流动区横截面的渐缩中心区段。如图4D-1中所描绘，插管400d-1具有远侧区段410d-1、内径渐缩的中心渐缩区段420d-1以及近侧区段430d-1。对应于中心区段420d-1的渐缩内径，410d-1的内部横截面积小于430d-1的内部横截面积。

根据本发明实施例的血液学系统可处理体积为约150μL的血液样品。抽吸的血液体积可为约120-150μL。在一些情况下，样品管中的最低可用血液体积对于自动采样模式为约500μL，而对于人工采样模式为约250μL。图4D中所示的插管或注入管400d具有约13μL的内部体积。根据一些实施例，插管或注入管具有小于约30μL的内部体积。

图4E示出了远侧变平区段410e的横截面。如这里所示，远侧区段410e具有样品料流从中流过的内部宽度W(I)和内部高度H(I)。另外，远侧区段410e具有外部宽度W(O)和外部高度H(O)。如图4D和图4E合在一起所描绘，样品流体注入管的远侧部分410e具有出口P，其具有高度H(I)和宽度W(I)，其中高度H(I)小于宽度W(I)。根据一些实施例，远侧部分410e的出口P的高度H(I)(或远侧部分410d的内部高度)可具有约150μm的值。在一些情况下，高度H(I)可在约50μm至约250μm的范围内。根据一些实施例，远侧部分410e的出口P的宽度W(I)(或远侧部分410d的内部宽度)可具有约1350μm的值。在一些情况下，宽度为约1194μm。在一些情况下，宽度W(I)可具有约500μm至约3000μm范围内的值。在一些情况下，远侧变平区段410d可通过向管或导管施加夹持力而制成。

图4F示出了中心渐缩区段420f的横截面。如这里所示，中心渐缩区段420f具有样品料流从中流过的内径D(I)。另外，中心渐缩区段420f具有外径D(O)。图4G示出了近侧区段430g的横截面。如这里所示，近侧区段430g具有样品料流从中流过的内径D(I)。另外，远侧区段430g具有外径D(O)。

如图4D中所描绘，注入管或插管400d可具有近侧部分430d、远侧部分410d和设置在近侧部分430d与远侧部分410d之间的第三部分420d，近侧部分具有第一流动横截面积(例如，图4G中所示的π*(D/2)²)，远侧部分具有比第一流动横截面积小的第二流动横截面积(例如，图4E中所示的W(I)*H(I))。第三部分420d可具有大于第一和第二流动横截面的第三流动横截面(例如，图4F中所示的π*(D/2)²)。在一些情况下，近侧部分430g的外径D(O)为约1067μm，而近侧部分430g的内径D(I)为约813μm。

细胞结构、内容物和配向

根据一些实施例，为实现白血细胞的染色和可视化，有用的是裂解样品中的红血细胞并透化白血细胞以便允许染剂结合于白血细胞。通常希望在细胞形态很少改变或不改变的情况下获得白血细胞的染色。另外，通常希望获得类似于瑞氏染剂的染色性质。此外，通常希望获得高红细胞配向(例如，目标>90％)。

图4H(上部)描绘了使用不含戊二醛的染剂配方得到的结果。据观察，细胞因流通池中遇到的剪切力而破碎。虽然实现了细胞核的良好染色，但细胞核本身看起来发生了变形，并且细胞膜看起来发生了损坏。总之，当成像时，细胞看起来因细胞内容物和结构的破坏而毁坏。

图4H(下部)描绘了使用含有戊二醛的染剂配方得到的WBC结果。如这里所示，细胞膜是完整的，且细胞为圆的。因此，据观察，未使用戊二醛的染色方案(例如，图4H上部中所示)导致了变弱的WBC。虽然在图4H(下部)中WBC更完整，但细胞核部分受到损坏。

用于获得图4H(下部)图像的鞘流体(PIOAL)包含30％甘油。相比之下，用于获得图4I(上部)图像的鞘流体(PIOAL)包含6.5％甘油。较低浓度的甘油产生了更好的形态，其中细胞核大部分无变化。因此，据观察，图4I(上部)中的细胞膜甚至比图4H(下部)中的细胞膜更完整。图4I(上部)中的较低甘油浓度可起到降低粘度差的作用，从而减小剪切力。如果存在过大的剪切力，则该力可破坏细胞膜。甘油可具有某些与细胞不相容的性质，因此较高的甘油浓度也可破坏细胞膜。因此，可以得出结论：图4H(上部)中所描绘的细胞核损坏可能是鞘流体中30％甘油的结果。

然而，当甘油浓度降低到如图4I(上部)中所描绘的6.5％时，观察到样品流体中红血细胞配向的削弱。

尝试了将各种替代PIOAL配方用于获得改善的红血细胞配向，但是这些替代配方并未提供令人满意的结果。例如，尝试了若干不同的粘度增强剂，但其中许多表现出与较高的30％甘油配方相似的行为，以致于细胞内容物受到损坏。

据观察，通过使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和5％甘油作为粘度剂组分，可以在不产生破坏细胞核的负面作用的情况下得到粘度与30％甘油配方的粘度相匹配的鞘流体(并因此实现改善的配向结果)。图4I(下部)描绘了使用具有5％甘油和1％PVP的PIOAL得到的结果。因此，可以看出，鞘流体中的粘度剂保持了样品流体料流中细胞的活力，从而例如当细胞流过流通池并暴露于流动鞘流体时，使细胞的结构和内容物完整。根据一些实施例，甘油的浓度百分比以(v/v)表示，而PVP的浓度百分比以(w/v)表示。

图4J描绘了与根据本发明实施例的流通池技术(右列)相比的基于传统显微镜湿法封片技术(左列)的图像捕获结果。湿法封片程序可被视为图像清晰度和质量的目标标准。据观察，涉及如本文所公开而设计的鞘流体和流通池的技术有效实现了与湿法封片程序相当的图像清晰度和质量。

根据一些实施例，当样品流体与鞘流体之间的粘度差超过特定阈值时，流动料流带可发生分离。根据一些实施例，当使用包含60％的甘油的鞘流体时，观察到了流动料流带分离。

如图4K中所示，穿过流通池420k的图像捕获位点432k流动的样品料流带R可具有约2μm的厚度T。在一些情况下，样品料流带的厚度T可最多为约3μm。通常，小于样品料流厚度的细胞或粒子将被包含在带内。示例性红血细胞(RBC)可呈现为双面凹陷的圆盘并可具有约6.2μm与约8.2μm之间的直径D。另外，示例性红血细胞可具有约2μm与约2.5μm之间的最大厚度T1和约0.8μm与约1μm之间的最小厚度T2。在一些情况下，红血细胞可具有最多约3μm的厚度。示例性人类血小板在尺寸上可以变化，并且也可具有约2μm的厚度或直径。虽然这里未按比例示出，但是流通池可在图像捕获位点处限定值为约150μm的流路厚度H。在一些情况下，流路厚度F具有50μm与400μm之间的值。该流路厚度F还可对应于图4B-1和图4B-2中所描绘的远侧部分461b的远侧高度418b。

如图4K中所示，样品流体料流的厚度T与粒子(红血细胞)的厚度的比率为约1:1。根据一些实施例，在图像捕获位点处的样品流体料流的厚度T与粒子之一的尺寸的比率在0.25至25的范围内。在一些情况下，厚度T可具有0.5μm至5μm范围内的值。可对鞘流体与样品流体之间的粘度差进行选择以便实现带形样品料流在流通池内的所需定位。

样品带R的流体与鞘流体之间的粘度差可起到使样品料流中的粒子(例如红血细胞)沿着流动方向配向或取向的作用。当如此配向时，如图4K中所示，成像装置或相机可获取红血细胞的图像使得它们看起来为圆的，因为血细胞的主表面面向相机。这样，红血细胞呈现的配向展示出相对于流动的低阻力。因此，鞘流体和样品流体的相对粘度特性可有助于高百分比或数量的红血细胞面向相机，从而增强粒子分析系统的评估能力。

根据一些实施例，鞘流体的粘度特性起到限制血液流体样品中的粒子不良配向的作用。例如，粘度差可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到小于约10％。也就是说，样品中的100个红血细胞中的90个或更多个红血细胞可配向以使得其主表面面向成像装置。对称的变窄过渡区可提供20％的值。如本文其他地方所讨论，例如参照图4R，可以将得自涉及对称变窄流通池过渡区和粘性鞘流体的分析仪构形的配向结果与得自涉及对称变窄流通池过渡区而不使用粘性鞘流体的分析仪构形的配向结果进行比较。使用粘性鞘流体可降低不良配向细胞的百分比。根据一些实施例，鞘流体具有类似于水的折射率(即n＝1.3330)。在一些情况下，鞘流体的水含量为约89％。除了因粘度差而观察到的配向作用外，还因双侧渐缩过渡区观察到了配向作用。在一些情况下，据观察，双侧(即，对称)渐缩过渡区是相比于不对称渐缩过渡区设计在配向粒子时的有效性的两倍。

红血细胞的有效配向可有助于改善诊断。在一些情况下，可将成像的红血细胞的形状用于确定从其获取样品的患者是否具有特定的生理状况或疾病。例如，具有镰形细胞病的患者存在形状异常(即，镰形形状)的血细胞。因此，通过获得配向红血细胞的高质量图像，可以确保准确的诊断。红血细胞的其他形状变化，例如具有薄周边区域和大平坦中心区域因而看起来具有自行车轮胎轮廓的红血细胞，可使用本发明的配向技术有效地成像。相似地，可出于诊断目的对具有小中心部分和厚周边区域因而红血细胞看起来具有卡车轮胎轮廓的红血细胞成像。本文所公开的改进的成像技术还可用于评估其他红血细胞特性，诸如血红蛋白含量、铁含量等。

不受任何特定理论的束缚，据信，鞘流体的粘度与样品流体的粘度之间的粘度差产生改变的抛物线剖面，其中该剖面大致为抛物线的，并具有对应于加速度增大的流动中心区域的中心隆起，并且该中心隆起有助于样品粒子或粒子内细胞器的配向。根据一些实施例，鞘流体与样品带之间的速度差和粘度差生成剪切力以增加细胞器或细胞内粒子的配向。鞘流体抛物线剖面的示例性方面在2014年3月17日提交的共同未决的美国专利申请No.14/215,834中有所讨论，该专利申请的内容以引用方式并入本文。

白血细胞通常大于红血细胞和血小板。例如，示例性中性粒细胞和嗜酸性粒细胞可具有约10μm与约12μm之间的直径。示例性嗜碱性粒细胞可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性淋巴细胞(小)可具有约7μm与约8μm之间的直径，而示例性淋巴细胞(大)可具有约12μm与约15μm之间的直径。示例性单核细胞可具有约12μm与约20μm之间的直径。粒子分析系统的构形(包括鞘流体和流体样品带在穿过流通池时它们之间的相互作用)可起到在白血细胞穿过图像捕获位点432l行进时压缩白血细胞的作用，如图4L中所指示。因此，例如，白血细胞(WBC)的中心部分可定位于样品流体带R内，而白血细胞的周边部分可定位于鞘流体内。因此，当带使白血细胞穿过流通池传输时，白血细胞的侧面可延伸到鞘流体中。如上文关于图4K所讨论的样品料流带R的厚度T和流路的厚度F的数值或范围相似地适用于图4L。

根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可起到配向存在于诸如白血细胞的细胞内的细胞器或其他细胞内特征的作用。不受任何特定理论的束缚，据信，与鞘流体和样品流体之间的粘度差相关的剪切力可作用于白血细胞而配向细胞内特征。在一些情况下，与鞘流体和样品流体之间的速度差相关的剪切力可有助于这种配向。这些配向作用也可受粒子与样品流体带之间的尺寸差异的影响。例如，如果粒子的部分延伸到样品流体带之外并进入周围的鞘流体中，则与粘度差相关的剪切力可对细胞内特征配向具有明显的影响。

如图4L中所描绘，细胞(诸如白血细胞)的部分可延伸到鞘流体中。本发明的实施例涵盖鞘流体组合物，该鞘流体组合物在细胞暴露于鞘流体时不裂解或破碎细胞或者说是影响外部细胞膜的完整性。该鞘流体中的粘度剂可起到保持样品流体料流中的细胞的活力的作用，从而在细胞膜或细胞壁横穿样品流体带与鞘流体包层之间的界面时或者说是从样品流体料流延伸到流动鞘流体中时使细胞的结构(例如，形状)和内容物(例如，细胞核)保持完整。

通常，当细胞或粒子沿着流通池在样品流体带内流动时存在作用于细胞或粒子的压缩力。因此，细胞可与鞘流体接触，同时细胞因变窄过渡区而处于压缩状态或者说是经受压缩力。鞘流体的粘度剂可起到保护被压缩的细胞免于在从薄样品流体带出现并暴露于粘性鞘流体时(至少在细胞到达图像捕获位点之前)破碎或毁坏的作用。因此，鞘流体的粘度剂组合物可充当细胞保护剂，同时还增强粒子或粒子内内容物的配向。

参照图4K和图4L，在一些情况下，细胞或粒子的部分可延伸到薄样品流体带R之外并进入周围的鞘流体中。如在共同未决的美国专利申请No.__中所讨论，鞘流体可包含抑制或防止鞘流体破坏或裂解细胞或粒子的细胞保护剂。例如，鞘流体可包含当将细胞暴露于鞘流体的化学环境时维持细胞壁的结构完整性的细胞保护剂。相似地，细胞保护剂也可在细胞经历流通池几何形状所引起的任何剪切力和样品流体与鞘流体之间的速度和/或粘度差时起到维持细胞壁的结构完整性的作用。相关地，保护剂可保护细胞或粒子免受样品流体与鞘流体之间的速度差所引起的力的影响。这样，细胞在到达图像捕获位点时保持其活力。

剪切力在样品流体带与鞘流体包层之间的界面处可能是显著的。根据一些实施例，流通池流路内的流动可由抛物线流动剖面表征。图4L-1描绘了抛物线流动剖面400l-1a和400l-1b的示例性方面。上部中的抛物线剖面400l-1a是存在于本发明的某些流通池实施例内的流动中的典型速度剖面(例如，其中在被包封在鞘流体流动料流内的样品流体流动料流之间存在很小的粘度差或不存在粘度差)。如可以看出的是，在流体料流的中间观察到了最高的线速度，并在流通池壁附近观察到了较慢的线速度。剖面400l-1a也可在鞘流体与样品流体之间具有轻微粘度差的流体料流中观察到。在鞘流体与流体料流之间存在高粘度差的情况下，观察到了如剖面400l-1b中所示的中心隆起，其中存在具有放大的线速度的局部中心区域。根据一些实施例，尺寸足够大的粒子将经受一定量的剪切力，甚至在此类粒子被完全容纳在单一流体相内时(即，在鞘流体包层内或者在样品流体带内)。

在一些情况下，鞘流体的速度可与样品流体的速度不同。例如，鞘流体可以80mm/s行进而样品流体可以60mm/s行进。因此，在一些情况下，样品流体以慢于周围包层的鞘流体速度的样品流体速度离开远侧插管端口。因此，鞘流体可起到沿着插管的流路拖动样品流体的作用，从而加速样品流体并降低样品流体带的厚度。样品流体带保持总体积和质量不变，因此当其行进得越快时变得越薄。根据一些实施例，鞘流体和样品流体在图像捕获位点处具有约20与200mm/s之间的速度。

通常，当样品流体从插管出口向图像捕获位点行进时，样品流体的速度增加。在一些情况下，在图像捕获位点处样品流体的速度是样品流体离开插管远侧部分的插管端口时的速度的40倍。根据一些实施例，样品带的横截面积的减小与速度的增加呈线性关系。根据一些实施例，如果在插管出口处的鞘流体速度高于样品带速度，则这将增大成像区域处的最终样品带速度。

鞘流体可起到对样品流体带和样品流体带内的粒子施加显著的剪切力的作用。一些力平行于流动方向，而粒子也可能遇到垂直于流动方向的力。通常，当鞘流体和样品流体接近图像捕获位点或区时，鞘流体和样品流体以相同的速度或接近相同的速度行进。因此，当鞘流体和样品流体通过图像捕获位点时在它们之间的边界或界面可呈现出与远侧插管出口处或渐缩过渡区处的边界或界面相比更低的剪切力。例如，在渐缩过渡区处，鞘流体包层与样品流体带之间的边界或界面可处于过渡中，以使得最初较慢较厚的样品带变得更快更薄，并且样品流体中的粒子变得更配向。换句话说，剪切力在渐缩过渡区可能是突出的，并可向图像捕获位点耗散。在图像捕获位点处的剪切力可由抛物线剖面表示，并可远低于渐缩过渡区处的剪切力。因此，细胞或粒子可在通过过渡区时经受更高的剪切力，并在通过图像捕获位点时经受更低的剪切力。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可使红血细胞配向并从而聚焦。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的粘度差可使白血细胞配向并从而聚焦。相关地，可得到因料流的几何变窄和鞘流体与样品流体之间的速度差而配向并聚焦的细胞和细胞器组分的增强的成像结果。

如本文其他地方所述，并参照图4K和图4L，当鞘流体和样品流体R流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向成像位点432k或432l时，与鞘流体粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点432k或432l处在多个粒子的至少一些中提供靶成像状态。

在一些情况下，靶成像状态是相对于成像位点处的焦平面F的靶取向。例如，如图4K-1中所描绘，粒子(RBC)可位移到离焦平面F一定的距离处。在一些情况下，靶取向涉及相对于成像位点432k-1的焦平面F的靶粒子取向。粒子可以是血细胞，诸如红血细胞、白血细胞或血小板。如这里所示，成像位点432k-1处的流路可限定基本上与焦平面F平行或共面的P平面。在一些情况下，粒子的一部分可沿着焦平面F定位，而粒子的中心部分则可从焦平面F偏置。在一些情况下，靶取向涉及相对于成像位点432k-1的焦平面F的靶位置。例如，靶位置可涉及对粒子进行定位以使得粒子的至少一部分沿着焦平面F设置。在一些情况下，靶位置可涉及对粒子进行定位以使得粒子与焦平面F之间的距离不超过特定阈值。在一些情况下，靶位置涉及相对于成像位点432k-1的焦平面F的靶粒子位置。在一些情况下，靶位置处于离焦平面F的距离D或不到距离D处，其中距离D对应于位置公差。可对鞘流体与样品流体之间的粘度差进行选择以便在流通池内实现带形样品料流的所需定位(例如，相对于流路平面P和/或焦平面F)。在一些情况下，可对粘度差进行选择以便实现处于位置公差D或不到位置公差D的靶粒子位置。

在一些情况下，焦平面F具有如4K-2中所指示的视野厚度或深度，而粒子(RBC)具有相对于焦平面厚度的靶成像状态。例如，粒子的靶位置可在焦平面F内或至少部分地在焦平面F内。在一些情况下，高光学分辨率成像装置或相机可具有约7μm的视野深度或焦平面厚度。在一些情况下，视野深度或焦平面厚度具有约2μm至约10μm范围内的值。在一些情况下，相机的视野深度类似于或等于图像捕获位点处的样品带厚度。

在一些情况下，靶取向可涉及相对于成像位点处的焦平面F的靶配向。例如，靶配向可指示由粒子限定的平面与焦平面F配向，不超过如图4K-3所示的相对于图像捕获位点432k-3的焦平面F的特定角度α。在一些情况下，靶成像状态可涉及对样品中的不良配向粒子的数量或百分比的限制。例如，鞘流体与样品流体R之间的粘度差可有效将血液流体样品中的红血细胞成像取向不良配向限制到小于约10％。也就是说，样品中的100个红血细胞中的90个或更多个红血细胞可配向以使得其主表面面向成像装置(如图4K-1和图4K-2中所描绘)或使得那90个或更多个RBC的配向在基本上平行于流动方向的平面的20度内(例如，RBC配向角度α为20度或更小)。如本文其他地方所讨论，在一些情况下，至少92％的非球形粒子(诸如RBC)可在基本上平行于流动方向的平面中配向。在一些情况下，至少75％与95％之间的非球形粒子(诸如RBC)可基本上配向，即，在基本上平行于流动方向的平面的20度内(例如，配向角度α为20度或更小)。根据一些实施例，90％或更多的某些粒子(例如，红血细胞和/或血小板)可横向于成像装置的成像轴取向。

在一些情况下，本发明的实施例包括与如本文所述的血液学系统一起使用的组合物，诸如鞘流体或粒子和细胞内细胞器配向液体(PIOAL)。此类鞘流体或PIOAL适用于组合式粘度和几何流体聚焦视觉分析仪。PIOAL可起到引导或促进给定粘度的血液样品流体流过视觉分析仪的变窄流通池过渡区的作用。PIOAL可包含粘度比样品的粘度更高的流体。与粘度差相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和变窄流通池过渡区相关的PIOAL流体和样品流体之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，可有效地在视觉分析仪的成像位点在多个粒子的至少一些中提供靶成像状态，同时维持血液样品流体中的细胞的活力。

图4M描绘了具有内部细胞器(诸如小叶410m)的示例性中性粒细胞400m(一种类型的白血细胞)。因样品流体与鞘流体之间的粘度差，内部细胞器可在细胞内配向，如图4N所指示。因此，内部细胞器可通过图像捕获装置430m有效地成像，而细胞器不彼此重叠。也就是说，不是如图4M中所描绘的小叶彼此堆叠，当从图像捕获装置的成像轴或光轴观察时，小叶配向和并排，如图4N中所描绘。因此，可在捕获的图像中更有效地看见小叶。内部细胞器配向是样品流体与鞘流体之间的粘度差令人惊讶且出人意料的结果。因此，使用粘度差、流体动力流和几何压缩特征实现了对应于细胞配向和处于焦距内的增强的成像结果。

如本文其他地方所述，并参照图4M和图4N，当鞘流体和样品流体R流过流通池的流路尺寸缩减段或过渡区并流向图像捕获装置430m或430n的成像位点时，与鞘流体粘度和样品流体粘度之间的粘度差相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用，与和流路尺寸缩减段或过渡区相关的鞘流体和样品流体R之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用相结合，在成像位点处在多个粒子的至少一些中提供靶成像状态。根据一些实施例，靶成像状态可对应于成像状态的分布。

在一些情况下，靶成像状态可涉及相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构取向(例如，配向和/或位置)。例如，如图4N中所描绘，内部结构410m(例如，细胞内结构、细胞器、小叶等)可相对于焦平面F取向。在一些情况下，靶配向涉及相对于成像位点处的焦平面F的靶粒子内结构配向，类似于图4K-3中所描绘的粒子配向关系。在一些情况下，靶位置涉及相对于成像位点处的焦平面的靶粒子内结构位置，类似于图4K-1中所描绘的粒子位置关系。在一些情况下，粒子内结构的靶取向既可包括相对于焦平面的靶配向也可包括相对于焦平面的靶位置。在一些情况下，靶成像状态可涉及成像位点处的靶变形。例如，如图4N中所描绘，粒子400m具有与图4M中所描绘的粒子形状相比压缩的形状。因此，可以看出的是，流通池的运行可对粒子形状产生侧向压缩作用。相关地，粒子内特征可在粒子本身的形状被压缩时在位置或方向上取向(例如，相对于焦平面F和/或带形流平面配向)。根据一些实施例，鞘流体与样品流体之间的速度差可在流动料流内产生摩擦，而鞘流体与样品流体之间的粘度差可放大该流体动力摩擦。

实例

可使用流过流通池的样品流体的图像执行多种血液学或血液粒子分析技术中的任一种。通常，图像分析可涉及确定某些细胞或粒子参数，或测量、检测或评价某些细胞或粒子特征。例如，图像分析可涉及评价细胞或粒子尺寸、细胞核特征、细胞质特征、细胞内细胞器特征等。相关地，分析技术可涵盖某些计数或分类方法或诊断测试，包括白血细胞(WBC)分类。在一些情况下，使用流通池得到的图像可支持5分法WBC分类测试。在一些情况下，使用流通池得到的图像可支持9分法WBC分类测试。相关地，参照图4，处理器440可包括存储介质或与之有效地关联，所述存储介质具有计算机应用程序，当由处理器执行时，所述计算机应用程序被配置成使系统400基于得自图像捕获装置的图像区分不同类型的细胞。例如，诊断或测试技术可用于区分各种细胞(例如，中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞)。

本文提供的实例仅用于举例说明的目的，并且本发明不限于这些实例，而是涵盖因本文所提供的教导而显而易见的所有变型形式。

在本文所述的实验之前，还没有公开的方案考虑到如本文所公开的用于配向粒子和重定位细胞内内容物的包括PIOAL的开发和使用方法。这可用于体液(例如，血液)样品中的粒子的基于图像的分析和差异分类及子分类。本文所公开的方法和组合物可任选地以适于实现白细胞染色、网织红细胞染色和血小板染色的方式对粒子染色和/或使粒子裂解，类似于在全血涂片上所见的瑞氏染剂染色细胞。

本文所述的示例性组合物允许在相对低的血液与试剂稀释度下发生染色，并且染色可快速地发生(例如，在30秒内)。如果需要，示例性方法可联合使用表面活性剂和热来实现红细胞裂解。可对示例性配方进行修改以保持RBC完整性，并仍实现WBC、网织红细胞和血小板染色效力。

本公开的各方面和实施例基于以下令人惊讶且出人意料的发现：某些PIOAL组合物在用于执行基于图像的粒子/细胞分析时具有出人意料的配向细胞和重定位细胞内结构的性质。

以举例的方式，开发了若干示例性PIOAL配方及其使用方法。以下是具有所需性质的PIOAL配方的一些示例。

图4O显示了使用PIOAL得到的图像与使用非PIOAL鞘流体得到的图像的比较。使用PIOAL产生了更多的焦距内细胞内容物，诸如小叶、细胞质和/或颗粒。在该实例中，将包含粘度剂(约30％甘油)的PIOAL用于处理样品。将pH调节到约6.8至7.2的pH，并通过(0.9％氯化钠)使样品混合物为等渗的。这里所示的结果证实了用在图像分析仪上的示例性PIOAL配向细胞和细胞内细胞器的效力。

图4P和图4Q显示了使用标准鞘流体得到的图像(图P的上下部)与使用示例性PIOAL流体得到的图像(图4Q上下部)的比较。如这里所示，使用PIOAL导致了改善的RBC配向，例如通过使红血细胞的主表面取向从而面向相机或成像装置。使用仪器聚焦方案(对如图1中所描绘的示例性靶44)分析样品，并通过视觉分析仪使靶聚焦。然后使聚焦系统偏置位移距离52，从而使带形样品料流中的粒子处于焦距内。血液样品之前用样品稀释剂进行了稀释。样品流过插管并沿着流通池的流路流动，从而产生在两层PIOAL或标准鞘流体(在对照中)之间的带形样品料流(例如，2微米厚)。视觉分析仪然后生成待用于分析的带形样品料流中的粒子的聚焦图像(例如，以每秒约60帧)。血液样品得自受试者并进行处理以通过血液分析仪进行分析。在使用标准鞘流体或PIOAL处理样品的同时，捕获流通池中RBC的图像。基于成像数据(例如，4P和4Q)，相对百分比展示了配向RBC的数量的显著提高。结果证实了：使用如本文所述的聚焦仪器/方案，PIOAL有效地增加了带形样品料流中处于流动中的RBC的配向百分比。

另据观察，基于在对称和不对称流通池中使用浓度渐增的甘油(gly)，PIOAL的具体实施导致了改善的配向。

图4R中的图表显示了对称与不对称流通池相比时在PIOAL中使用0％-30％甘油得到的未配向细胞的百分比。在PIOAL中使用30％甘油并使用对称流通池使不良配向细胞的百分比降低到仅8％。注意，在PIOAL中没有甘油并使用不对称池时，不良配向细胞的百分比增至87％。因此，该图表证实了甘油百分比和流通池几何形状对粒子(例如，RBC)配向的作用。在使用对称或不对称流通池几何形状时，添加甘油降低了不良配向RBC细胞的百分比。未配向RBC％在不对称池中从87％降至15％，在对称池中从46％降至8％。因此，该图表提供了以下两种不良配向结果的比较：得自涉及对称变窄流通池过渡区和粘性鞘流体的分析仪构形的不良配向结果(8％)，和得自涉及对称变窄流通池过渡区而不使用粘性鞘流体的分析仪构形的不良配向结果(46％)。

这些结果为以下令人惊讶且出人意料的发现提供了证据：某些PIOAL组合物在用于执行基于图像的粒子/细胞分析时具有出人意料的配向细胞和重定位细胞内结构的性质。

以举例的方式，开发了若干示例性PIOAL配方及其使用方法。以下是具有所需性质的PIOAL配方的一些示例。PIOAL包含稀释剂和至少一种粘度改性剂。

示例性PIOAL配方A包含具有300mL甘油的30％(v/v)甘油溶液，并用稀释剂适量定量到1L(足量或使最终体积达到1L的量)，所述稀释剂包含9.84g硫酸钠、4.07g氯化钠、0.11g盐酸普鲁卡因、0.68g磷酸二氢钾、0.71g磷酸氢二钠和1.86g乙二胺四乙酸二钠。然后将初始混合物用去离子水适量定量到1L，同时用氢氧化钠将pH调至7.2。

示例性PIOAL配方B包含具有65mL甘油的6.5％(v/v)甘油溶液，并用合适的示例性稀释剂适量定量到1L，所述稀释剂包含9.84g硫酸钠、4.07g氯化钠、0.11g盐酸普鲁卡因、0.68g磷酸二氢钾、0.71g磷酸氢二钠和1.86g乙二胺四乙酸二钠。然后将初始混合物用去离子水适量定量到1L，同时用氢氧化钠将pH调至7.2。

示例性PIOAL配方C包含在缓冲液中具有1％PVP(w/v)的5％甘油(v/v)溶液，其具有50mL甘油、10g PVP(分子量：360,000)、1包Sigma PBS粉末，pH为7.4(0.01M磷酸盐缓冲盐水；0.138M氯化钠；0.0027M氯化钾)，并用去离子水适量定量到1L。

示例性PIOAL配方D包含1.6％PVP(w/v)溶液，其具有16g PVP(分子量：360,000)和1包Sigma PBS粉末，pH为7.4(0.01M磷酸盐缓冲盐水；0.138M氯化钠；0.0027M氯化钾)，并用去离子水适量定量到1L。

图5A和图5B描绘了与剪切力、侧向压缩、取向、差异粘度、鞘流体与样品流体之间的相对运动等相关的示例性流动料流特性。

方法

图6描绘了根据本发明实施例使用被配置用于组合式粘度和几何流体聚焦的粒子分析系统对多个粒子进行成像的示例性方法600的各方面。粒子可包含在具有样品流体粘度的血液流体样品610中。如这里所示，该方法可包括如步骤630所指示使鞘流体620沿着流通池的流路流动。鞘流体620可具有与样品流体粘度相差一个处于预定粘度差范围内的粘度差的鞘流体粘度。该方法还可以包括如步骤630所指示将血液流体样品610注入流通池内的流动鞘流体中，以便提供被鞘流体包封的样品流体料流。另外，该方法可包括如步骤640所指示使样品流体料流和鞘流体流过流路尺寸缩减段流向成像位点。当样品料流和鞘流体穿过流路尺寸的缩减段或变窄过渡区时，与粘度差相关的鞘流体和样品流体料流之间的相互作用所引起的粘度流体聚焦作用(如步骤650中所描绘)，与和流路尺寸的缩减段相关的鞘流体和样品流体料流之间的相互作用所引起的几何流体聚焦作用(如步骤660中所描绘)相结合，有效地在成像位点在多个粒子的至少一些中提供靶成像状态，而鞘流体中的粘度剂保持样品流体料流中细胞的活力，从而当细胞从样品流体料流延伸到流动鞘流体中时使细胞的结构和内容物完整(如步骤670中所描绘)。方法还可以包括在成像位点对多个粒子成像，如步骤680中所描绘。

剪切应变速率

图7和图8描绘了在根据本发明实施例的流通池中某些流动条件下的剪切应变速率值的各方面。在这些附图的每一个中，使用30％甘油鞘流体。在一些情况下，粘度可具有2.45×10^-3的值。剪切应力值可等于粘度值乘以应变速率值得到的乘积。参照图7，样品可具有0.3μL/s的流速，而鞘流体可具有21μL/s的流速。参照图8，样品可具有1μL/s的流速，而鞘流体可具有70μL/s的流速。在这些图的每一个中，可以看出，流动展示出朝向中心(C)的更低的应变值和朝向周边(P)的更高的应变值。此类应变值在一些实施例中可对应于不对称流通池构形。

如图7中所描绘，根据一些实施例，朝向流动料流的中心(C)部分的更低的应变速率可具有约500(1/s)或更低的值，而朝向流动料流的周边(P)的更高的应变速率可具有约3000(1/s)或更高的值。如图8中所描绘，根据一些实施例，朝向流动料流的中心(C)部分的更低的应变速率可具有约1000(1/s)或更低的值，而朝向流动料流的周边(P)的更高的应变速率可具有约9000(1/s)或更高的值。

因此，可以看出，更低的样品和鞘流体速率(例如，图7)对应于更低的应变速率，而更高的样品和鞘流体速率(例如，图8)对应于更高的应变速率。应当理解，本发明的实施例涵盖使用对应于各种粘度值、各种应变速率值和/或各种剪切应力值的样品和/或鞘流体。

根据一些实施例，PIOAL具有合适的粘度和密度，并且在引入样品流通池的点处的流速使得样品流体变平形成薄带。带形样品料流与PIOAL一起被携带通过观察孔的前面，其中物镜镜头和光源被布置成允许观察带形样品料流。将样品流体引入，例如，在PIOAL的流路对称变窄的点处注入。因此，样品流体料流变平并被拉伸成薄带。本公开的PIOAL可作为鞘流体与本公开的任何视觉分析仪一起使用。在一个实施例中，可将PIOAL引入流通池的末端以将样品流体一起带向排放口。

观察区中的带形样品料流的尺寸受PIOAL流路的几何变薄以及样品流体和PIOAL的差异线速度(导致带形样品料流的变薄和拉伸)的影响。样品与PIOAL的初始差异线速度可在0.5:1至5:1的范围内。PIOAL流路横截面可通过降低深度而变薄约10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1、125:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1的因子。在一个实施例中，几何变薄为40:1。在一个实施例中，几何变薄为30:1。所考虑的因素为穿过流通池的通过时间，样品通量的所需速率，实现与粒子尺寸相当的带形样品料流厚度，获得粒子和细胞器的配向，实现粒子的焦距内内容物，在操作限值内平衡压力、流动和粘度，优化带形样品料流厚度，获得所需的线速度，可制造性考量，以及所需的样品和PIOAL体积。

可对插管的长度和容积以及横截面变平进行选择以缩短样品流动不稳定的时期，从而提高通量。在一些实施例中，流动不稳定的时期可小于约3、2.75、2.5、2.25、2、1.75、1.5、1.25或小于约1秒。较小的插管容积也可缩短所述时间并减小在样品运行之间清洗插管所需的稀释剂的体积。在一些实施例中，穿过流通池的通过时间为1、2、3或4秒，或那些时间中任何两个之间的任何范围。在一些实施例中，该通过时间可小于4、3或2秒。

样品流体和PIOAL的粘度和流速以及流通池的轮廓被布置成使得PIOAL流变平并将样品流拉伸成薄带，所述薄带在对应于图像捕获位点的可靠位置一致地穿过观察区。样品流体料流可被压缩成大约2至3μm的流体流厚度。若干血细胞类型都具有大于料流厚度的直径。在平行于流动方向的方向上的剪切力导致在成像条件下在高光学分辨率成像装置的焦平面中粒子的图像投影增加和/或导致粒子内结构(例如，细胞内结构、细胞器或小叶)定位、重定位和/或更好地定位成基本上平行于流动方向。高光学分辨率成像装置视野深度最多为7μm，例如1-4μm。

与带形样品料流一起携带的PIOAL的流动横截面穿过观察孔(物镜镜头被引导穿过其中)前面的观察区时保持一致。物镜镜头可以是高光学分辨率成像装置或数字图像捕获装置的物镜部件。带形样品料流在流通池内的已知且可重复的位置处(例如，在离流通池的两个壁的已知且可重复的距离处)顺着横跨观察区的路径流动，并在下游排放。

当带形样品料流被携带穿过观察孔前面的观察区时，来自样品中的粒子的光学信息通过分析仪中的检测段检测，从而生成来自样品中所含粒子/细胞的数据。使用该分析仪允许对样品中所含的细胞和/或粒子进行捕获、处理、分类及子分类和计数。PIOAL液体可通过添加粘度改性剂、缓冲剂、pH调节剂、抗微生物剂、离子强度改性剂、表面活性剂和/或螯合剂而制备。本公开中的分析仪的示例性功能部件和/或特征可包括例如采集和/或处理来自图像分析、样品染色处理、图像处理和/或粒子图像鉴定、计数和/或分类及子分类的数据的能力。

在一个实施例中，本公开基于以下令人惊讶且出人意料的发现：在PIOAL中添加适量的粘度剂明显改善流通池中的粒子/细胞配向，从而使配向细胞或处于焦距内的细胞组分的百分比更高，以及使流动中的细胞和/或粒子的图像的质量更高。粘度差与变窄过渡区的几何聚焦作用相结合可实现增强的配向和聚焦结果。通过鞘流体与样品流体料流之间的速度差，可以看到改善的结果。在一些情况下，当将样品流体以一定速率递送时，观察到了无细胞和粒子重叠的改善的图像。添加粘度剂增加对细胞(比如RBC)的剪切力，这改善在基本上平行于流动方向的平面中的细胞配向，从而导致图像优化。这还导致粒子内结构(诸如细胞内结构、细胞器或小叶)基本上平行于流动方向而定位、重定位和/或更好地定位，从而导致图像优化。粘度剂还减少细胞的不良配向，所述细胞通常为直径比流动料流小的细胞，但不限于这些细胞。

直径比流动料流小的细胞(例如，红血细胞)的配向可通过例如增大PIOAL的粘度或通过增大流速比而获得。这导致RBC平行于流动方向并平行于焦平面FP配向(例如，如图4K中所描绘)。在一些实施例中，RBC不良配向的减少和/或RBC配向的增加通过增大PIOAL的粘度而实现。

带形样品料流厚度可受样品流体和PIOAL的相对粘度和流速的影响。样品源和/或PIOAL源(例如，包括精密容积泵)可被配置成以受控的流速提供样品和/或PIOAL以优化带形样品料流的尺寸，即作为至少与高光学分辨率成像装置或数字图像捕获装置的视野一样宽的薄带。

与带形样品料流一起携带的PIOAL的流动横截面穿过观察孔(物镜镜头被引导穿过其中)前面的观察区时保持一致。带形样品料流在离流通池前壁和后壁任一者的已知且可重复的距离处顺着横跨观察区的路径流动，并在其下游排放。

本公开提供自动实现高光学分辨率成像装置的正确工作位置以对带形样品料流聚焦的技术。流通池结构被配置成使得带形样品料流在限定样品流体的流路的流通池壁之间具有固定且可重复的位置，以PIOAL层之间的薄带形式穿过流通池中的观察区。在例如图1-4G中所公开的流通池实施例中，PIOAL的流路的横截面可在过渡区对称变窄，并且样品可插入变平的孔口，诸如在孔口具有矩形内腔的管。变窄流路(例如，以20:1至40:1的比率在横截面积上几何变窄)并且还由于与样品流相比任选地更大的PIOAL线速度相互配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率变平。根据一些实施例，该比率可在10:1至100:1的范围内，在50:1至100:1的范围内，在70:1至80:1的范围内。根据一些实施例，该比率为75:1。有效地，由于流速、粘度和几何形状的组合，样品形成薄带。变窄流路(例如，以40:1的比率或以20:1至70:1之间的比率在横截面积上几何变窄)以及与样品流相比的PIOAL的线速度差相互配合使样品横截面以约20:1至70:1的比率压缩。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为40:1。在一些实施例中，该横截面厚度比率可为30:1。

因此，方法变量(诸如样品和PIOAL的特定线速度)不会倾向于使带形样品料流从其流动位置发生位移。相对于流通池的结构，带形样品料流位置是稳定且可重复的。

在另一方面，本发明涉及包括本发明的粒子对比剂组合物的试剂盒。该试剂盒还可以包括根据本文所述的任何方法的粒子对比剂组合物的使用说明。该试剂盒还可以包括粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)。该试剂盒还可以包括可编程的存储介质和用于诸如以下粒子的基于图像的鉴定的相关软件：中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、网织红细胞、有核RBC、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、细菌、真菌、原生生物、原生动物或寄生生物。该试剂盒还可以包括一种或多种缓冲剂，其可以包括等渗缓冲剂和/或稀释剂。该试剂盒或缓冲剂还可以包括表面活性剂、pH调节剂和/或抗微生物剂。在其他实施例中，该试剂盒还可以包括清洗溶液或冲洗溶液。该试剂盒还可以包括阳性和阴性对照的标准品。在一些实施例中，该标准品可以包括标准染色细胞试剂。该试剂盒还可以包括一次性用品，诸如用于转移试剂盒组分的一次性微量移液器、移液头或试管。该试剂盒可以包括这些试剂盒组分中的任一种，或两种或更多种的任何组合。

辨别血液样品中的血细胞是本发明实施例尤其适合的示例性应用。样品通过自动化技术制备并作为薄带形样品料流呈递给高光学分辨率成像装置，以在带形样品料流流经视野的同时周期性地成像。粒子(诸如血细胞)的图像可使用像素图像数据编程的处理技术完全自动地或以有限的人工辅助而彼此区分、分类、子分类和计数，以鉴定和计数细胞或粒子。除了可以存储并使得就粒子的不寻常或关键特征而言可用的细胞图像之外，输出数据还包括在所记录的样品图像中区分的各特定分类和/或子分类的细胞或粒子的出现次数。

存在于各图像中的不同粒子的计数可进一步处理，例如用于作为一个整体而累积样品中各区分分类和/或子分类的细胞的准确且统计上显著的比率。用于视觉辨别的样品可进行稀释，但在稀释的样品中描绘各分类和/或子分类中的细胞的比例，特别是在处理多个图像之后。

本文所公开的设备、组合物和方法可用于基于视觉差别而辨别和定量样品中的细胞。样品可以为生物样品，例如包含白血细胞的体液样品，包括但不限于血液、血清、骨髓、灌洗液、积液、渗出液、脑脊髓液、胸膜液、腹膜液和羊水。在一些实施例中，样品可以为实体组织样品，例如，已进行了处理而产生细胞悬液的生物活检样品。样品也可以为通过处理粪便样品而得到的悬液。样品也可以为包含粒子的实验室或生产线样品，诸如细胞培养样品。术语样品可用于指代得自患者或实验室的样品或其任何级分、部分或等分试样。样品可在一些过程中进行稀释、分成多个部分或进行染色。

在一个方面，本公开的系统、组合物和方法提供流动中的细胞的令人惊讶的高质量的图像。在一个方面，视觉分析仪可用于本公开的方法以提供自动化的基于图像的WBC分类计数。在某些实施例中，本公开的方法涉及视觉差别(包括形态特征和/或异常)的自动化鉴定，以用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常和/或感染和/或对治疗响应还是无响应进行确定、诊断、预后、预测和/或支持诊断。该系统在一些实施例中还可以包括粒子计数器。应用包括对流体样品(诸如血液样品)中的细胞进行分类和/或子分类以及计数。也设想了用于对另外类型的粒子和/或其他流体样品中的粒子进行计数的其他类似的用途。本发明的系统、组合物和方法可用于采用任何合适的自动化粒子识别算法进行实时分类及子分类以及图像观察。可存储各样品的捕获图像以日后观察。

在另一方面，本发明的设备、组合物和方法提供令人惊讶更准确的基于图像的细胞分类及子分类和标记，与使用目前的自动化分析仪时的人工复查率相比，所述标记降低人工复查率。所述系统、组合物和方法降低人工复查率并允许在仪器上进行人工复查。此外，本公开的系统、组合物和方法还降低在自动化分析期间标记为需要人工复查的样品的百分比。

本公开还涉及用于将全血计数(CBC)计数器与分析仪(诸如视觉分析仪)相结合的系统、方法和组合物，以便得到CBC以及基于图像的扩展白血细胞分类计数和基于图像的扩展血小板计数，从而延伸血小板计数的有效检测范围。

因此，在一些实施例中，本公开提供用于分析包含粒子(例如，血细胞)的样品的设备和方法。根据本公开，提供视觉分析仪以获得包含悬浮在液体中的粒子的样品的图像。在一些实施例中，视觉分析仪包括流通池和自聚焦部件，其中使包含所关注粒子的液体样品流过具有观察孔的流通池，而耦合到物镜镜头的相机通过所述观察孔捕获粒子的数字图像。可使用本发明的实施例实施的示例性自聚焦技术在2014年3月17日提交的共同未决的美国专利申请No.14/216,811中有所公开，该专利申请的内容以引用方式并入本文。流通池耦合到样品流体源，诸如经稀释和/或处理的血液样品或如本文所述的其他体液样品，并耦合到透明鞘流体或粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)源。

在一个实施例中，所述设备还包括具有至少一个检测范围的粒子计数器，以及分析仪和处理器。所述分析仪和处理器被配置成提供另外的信息以校正与粒子计数器相关的计数、分类和子分类误差，并且还确定样品中不同分类和/或子分类的粒子的准确粒子计数或浓度。

本公开在进行基于图像的样品分析中提供可用于粒子和/或细胞内细胞器配向的方法和组合物。在一些实施例中，本公开涉及用于组合式计数和成像系统的方法和组合物，该系统能够执行全血计数(WBC)和基于图像的扩展白血细胞(WBC)分类，而能够鉴定并计数细胞类型，诸如WBC、RBC和/或血小板，包括例如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、网织红细胞、有核RBC、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞，并提供WBC计数和形态、红血细胞(RBC)计数和形态以及血小板(PLT)计数和形态的基于图像的信息。

在其他实施例中，本公开涉及可用于如本文所述的基于图像的粒子分析的PIOAL。血液样品中的细胞分类和/或子分类计数在本公开中用作可以分析的样品的分类的非限制性例子。在一些实施例中，存在于样品中的细胞还可以包括细菌或真菌细胞以及白血细胞、红血细胞和/或血小板。在一些实施例中，可以分析得自组织或抽吸物的粒子悬液。

在一些方面，样品以自动化方式呈递、成像和分析。就血液样品而言，样品可用合适的稀释剂或盐水溶液进行充分稀释，这降低一些细胞的视野在未稀释或稀释不够的样品中可能被其他细胞隐藏的程度。细胞可用增强一些细胞方面的对比度的试剂加以处理，例如使用透化剂使细胞膜为可渗透的，以及使用组织学染剂粘附并揭示特征，诸如颗粒和细胞核。在一些实施例中，可能有利的是，对样品的等分试样进行染色以用于对包括网织红细胞、有核红血细胞和血小板的粒子进行计数和表征，以及用于白血细胞分类、表征和分析。在其他实施例中，包含红血细胞的样品可在引入流通池并成像之前进行稀释。

根据一些实施例，样品制备设备以及用于样品稀释、透化和组织学染色的方法的细节通常使用由一个或多个可编程控制器操作的精密泵和阀实现，并且不是本公开的核心。例子可见于转让给国际遥感成像系统公司(International Remote Imaging Systems,Inc.)的专利，诸如关于可编程控件的US 7,319,907。同样，用于借助其属性(诸如相对尺寸和颜色)而区分某些细胞分类和/或子分类的技术可见于与白血细胞相关的US 5,436,978。这些专利的公开内容据此以引用方式并入。根据一些实施例，样品制备技术可包括染色、裂解、透化和其他处理模式，诸如在2014年3月17日提交的共同未决的美国专利申请No.14/216,339中所述的那些，这些专利的内容以引用方式并入本文。

术语高光学分辨率成像装置可包括能够获得粒子图像的装置，所述图像具有充分的视觉差别以区分形态特征和/或变化。示例性高光学分辨率成像装置可包括光学分辨率为1μm或更低(包括例如0.4至0.5μm，诸如0.46μm)的装置。

在一些实施例中，在本发明的任何组合物和/或方法中得到的图像可以为数字化图像。在一些实施例中，所得的图像为显微镜图像。在某些实施例中，所述图像可以人工方式获得。在其他实施例中，获得图像的程序的至少一部分为自动化的。在一些实施例中，使用包括流通池、高光学分辨率成像装置或数字图像捕获装置(任选地具有自聚焦特征)的视觉分析仪获得图像。

在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或细胞核组分相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的颗粒组分和/或其他形态特征相关的信息。在一个实施例中，图像提供与细胞的细胞质、细胞核和/或颗粒组分相关的信息。颗粒和/或细胞核图像和/或特征独立地或彼此相结合地为细胞分类及子分类决定性的。

在又一个方面，本发明的方法涉及用于执行基于图像的红血细胞分类及子分类的方法，其包括：a)对红血细胞的一部分成像；以及b)确定所成像的红血细胞的形态。如本文所用，红血细胞(RBC)可包括例如正常或异常的红血细胞、网织红细胞、有核红血细胞和/或疟疾感染的细胞。在一些实施例中，使用本公开的设备(诸如包括粒子计数器、视觉分析仪和处理器的设备)进行成像。

如本文所用，示例性全血计数(CBC)可包括医生或其他医疗专业人员通常需要的测试板，其提供关于患者血液样品中的粒子和/或细胞的信息。在血流中循环的示例性细胞可通常分成三种类型：包括但不限于例如白血细胞(例如，白血球)、红血细胞(例如，红血球)和血小板(例如，凝血细胞)。

如本文所用，异常高或低的计数可指示存在疾病、障碍和/或病症。因此，CBC是在医学中常常进行的血液检验中的一种，因为其可提供患者一般健康状态的概况。因此，CBC通常在年度体检期间进行。

如本文所用，通常采血师从受试者采集血液样品，而血液一般被抽入通常容纳有抗凝剂(例如EDTA，有时为柠檬酸盐)以防止其凝结的试管。然后将样品转运到实验室。有时，用巴斯德吸管穿刺手指而抽吸血液以通过自动化计数器立即处理。在一个实施例中，在粒子被包封在鞘流体或PIOAL中的同时获取粒子图像。在某些实施例中，可在显微镜下在用患者血液的样品制作的载玻片上观察血液样品(血膜或外周涂片)。在某些实施例中，通过自动化分析仪进行全血计数。

如本文所用，血液计数的数据/参数包括例如总红血细胞；血红蛋白-血液中血红蛋白的量；血细胞比容或红细胞压积(PCV)；平均红细胞体积(MCV)-红细胞的平均体积(基于该值是高于还是低于预期正常范围而将贫血分类成小红细胞性或大红细胞性贫血。可影响MCV的其他病症包括地中海贫血、网状细胞过多症和酒精中毒)；平均红细胞血红蛋白(MCH)-每个红血细胞的血红蛋白的平均量，单位为微微克；平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)-细胞中的血红蛋白的平均浓度；红血细胞分布宽度(RDW)-RBC群体的细胞体积的变化；总白血细胞；中性粒细胞(可指示细菌感染，通常在急性病毒感染中增加)。由于细胞核的分段式外观，中性粒细胞有时称为“segs”(分段中性粒细胞)。不太成熟的中性粒细胞的细胞核不分段，但具有带式或细长形状。不太成熟的中性粒细胞—最近从骨髓释放到血流中的那些中性粒细胞—也称为“bands”(带状中性粒细胞)。血液计数的其他数据/参数还可以包括例如淋巴细胞(例如，因一些病毒感染诸如腺热以及在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中增加，或因HIV感染而降低)；单核细胞(可在细菌感染、肺结核、疟疾、落基山斑疹热、单核细胞性白血病、慢性溃疡性结肠炎和局限性肠炎中增加)；嗜酸性粒细胞(例如，在寄生虫感染、哮喘或变态反应中增加)；嗜碱性粒细胞(例如，在骨髓相关病症诸如白血病或淋巴瘤中增加)。

如本文所用，血液计数的数据/参数还可以包括例如与血小板相关的数据，包括血小板数、其在血液中的尺寸和尺寸范围的相关信息；平均血小板体积(MPV)-血小板平均大小的度量。

在本发明的方法的另一个方面，与粒子对比剂组合物接触和/或成像的细胞为异常细胞，诸如疟疾感染的细胞、非典型淋巴细胞。在本发明的一些方面，细胞是可用于对病症、疾病、感染和/或综合征鉴定、预测、诊断、预后或支持诊断的异常细胞。

在本发明的方法的另一方面，细胞为血小板。

除非明确地另外指明，否则在本公开中提及“粒子”将被理解为涵盖分散在流体中的任何离散的或有形的物体。如本文所用，“粒子”可包括生物流体中的所有可测量和可检测(例如，通过图像和/或其他可测量参数)的组分。粒子具有任何材料、任何形状和任何尺寸。在某些实施例中，粒子可包括细胞。粒子的例子包括但不限于细胞，包括血细胞、胎儿细胞、上皮细胞、干细胞、肿瘤细胞，或细菌、寄生生物或任何前述例子的碎片或生物流体中的其他碎片。血细胞可以为任何血细胞，包括可能存在于生物流体中的任何正常或异常、成熟或未成熟的细胞，例如红血细胞(RBC)、白血细胞(WBC)、血小板(PLT)和其他细胞。成员也包括未成熟的或异常的细胞。未成熟的WBC可包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞。除了成熟的RBC之外，RBC的成员还可以包括有核RBC(NRBC)和网织红细胞。PLT可包括“巨大”PLT和PLT团块。血细胞和有形成分在本公开的其他地方进一步描述。

示例性粒子可包括生物流体样品中的有形成分，包括例如球形和非球形粒子。在某些实施例中，粒子可包括非球形组分。非球形组分的图像投影可在高光学分辨率成像装置的焦平面中最大化。在某些实施例中，非球形粒子在高光学分辨率成像装置的焦平面中配向(在基本上平行于流动方向的平面中配向)。在一些实施例中，作为粒子对血小板、网织红细胞、有核RBC以及WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)计数和分析。

如本文所用，可检测和可测量的粒子参数可包括例如尺寸、形状、对称性、轮廓和/或其他特性的基于视觉和/或非图像的指标。

在另一个实施例中，本公开涉及在包括例如以下步骤的方法中使用例如本发明的试剂盒对粒子进行成像的方法：1)在视觉分析仪中用光照明粒子；2)获得包封在PIOAL中的样品粒子的数字化图像；以及3)基于图像信息分析包含粒子的样品。在其他实施例中，该方法还可以包括在照明经处理的样品之前将包含粒子的样品与粒子对比剂组合物接触。

在一个实施例中，所分析的粒子包括球形粒子、非球形粒子中的至少一种，或这两种。在另一个实施例中，粒子包括至少一个球形粒子。在又一个实施例中，粒子包括至少一个非球形粒子。在另一个实施例中，非球形粒子或具有非球形组分的粒子的图像投影在基本上平行于流动方向的平面中最大化。粒子可以为例如WBC、RBC和/或血小板。在一个实施例中，至少50％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。在另一方面，在流通池中使用本发明的PIOAL允许至少90％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。

小于包封在PIOAL中的带形样品料流的厚度的细胞的流动导致那些细胞平行于流动方向配向。在本公开的一个实施例中，至少92％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。在又一个实施例中，至少90％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。在另一个实施例中，至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或至少95％的粒子基本上配向，即在基本上平行于流动方向的平面的20度内。在另一个实施例中，在基本上平行于流动方向的平面中配向的非球形和/或球形粒子的百分比可为所列百分比中的任何两个之间的任何范围，例如至少75-85％、75-80％，和其他范围，诸如75-92％。

因包封在PIOAL中的样品中的较大细胞(诸如WBC)的流动而在平行于流动方向的方向中产生的剪切力导致细胞核结构、细胞质结构或颗粒或其他细胞内组分或结构更靠近平行于流动方向的平面而定位、重定位和/或更好地定位

在一个实施例中，非球形粒子包括红血细胞。在本发明的另一方面，球形粒子包括白血细胞或有核红血细胞。

在本发明的方法的一个实施例中，粒子为非球形粒子。在一个实施例中，所分析的粒子包括球形粒子、非球形粒子中的至少一种，或这两种。在另一个实施例中，粒子包括至少一个球形粒子。在又一个实施例中，粒子包括至少一个非球形粒子。在另一个实施例中，非球形粒子或具有非球形组分的粒子的图像投影在基本上平行于流动方向的平面中最大化。粒子可以为例如RBC(包括网织红细胞和有核RBC)、血小板和/或WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)或未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)。在一个实施例中，至少50％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。在另一方面，在流通池中使用本发明的PIOAL允许至少90％的非球形粒子在基本上平行于流动方向的平面中配向。

在本公开的一个实施例中，图像横截面包括在WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)或未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)中差异染色的细胞核结构、差异染色的细胞质结构或差异染色的颗粒中的至少一种。在另一个实施例中，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或至少95％的球形和/或非球形粒子在高光学分辨率成像装置的焦平面或视野深度中具有细胞核结构、细胞质结构或颗粒。

在本发明的方法的一些实施例中，图像信息是粒子的图像横截面。在一些方面，图像横截面包括在WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)或未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)中差异染色的细胞核结构、差异染色的细胞质结构或差异染色的颗粒中的至少一种。

在一个实施例中，本发明的方法提供令人惊讶的高质量的细胞图像，其中流动中的高百分比的粒子和粒子内容物处于焦距内，这可用于获得自动化的、基于图像的WBC分类，以及自动化鉴定形态异常，其可用于对受试者是健康还是具有疾病、病症、异常或感染和/或对治疗有响应还是无响应确定、诊断、预后、预测或支持诊断。

在另一方面，本发明的组合物和方法提供更准确的基于图像的细胞分类及子分类和标记，与目前的分析仪相比，所述标记大大降低人工复查率。

如本文所用，示例性白血细胞(WBC)可包括例如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、未成熟的粒细胞(包括晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞和母细胞)以及异常的白血细胞。如本文所用，红血细胞(RBC)可包括例如正常或异常的红血细胞、网织红细胞和有核红血细胞。

如本文所用，粘度剂可包括粘度剂或粘度改性剂。示例性粘度剂/改性剂具有与样品的粘度不同的特性粘度，使得当混合PIOAL和粘度剂时，PIOAL的粘度发生改变和/或增加以便最大程度提高粒子的配向。在某些实施例中，带形样品料流与PIOAL之间的粘度差和/或速度差可引入剪切力而作用在处于流动中的粒子上，从而减少不良配向和/或使粒子配向。

如本文所用，粒子对比剂组合物可适于与粒子和/或细胞内细胞器配向液体(PIOAL)组合用于视觉分析仪以分析得自受试者的样品中的粒子。示例性PIOAL可用于例如得自受试者的样品中的不同类型的粒子的自动化识别方法。

在另一方面，在获得图像时细胞可被包封在PIOAL中。在本文描述了合适的示例性细胞内细胞器配向液体。

在一个实施例中，本公开涉及用于视觉分析仪的PIOAL。在某些实施例中，PIOAL可包含以下至少一者：缓冲剂；pH调节剂；缓冲剂；粘度剂/改性剂；离子强度改性剂、表面活性剂、螯合剂和/或抗微生物剂。

在一个方面，PIOAL可包含两种或更多种粘度剂/改性剂。

在一个方面，本发明的PIOAL可具有约1至约10厘泊之间的粘度。在一个实施例中，本发明的PIOAL可包含粘度剂/改性剂。在一个实施例中，PIOAL包含最多100％的粘度剂。

如本文所用，粘度剂和/或粘度改性剂可包括适于实现约1至约10厘泊的粘度而光学特性(包括光学清晰度)适用于成像系统的任何物质。一般来讲，粘度剂或改性剂是无毒的、生物相容的并使细胞结构和内容物基本上完整。粘度剂和/或粘度改性剂可包含以下至少一者：甘油；甘油衍生物；乙二醇；丙二醇(二羟基丙烷)；聚乙二醇；水溶性聚合物和/或葡聚糖。在一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为甘油。例如，在一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为甘油衍生物。例如，在一个方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为乙二醇。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为丙二醇(二羟基丙烷)。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为聚乙二醇。又如，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为水溶性聚合物或葡聚糖。在其他方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可包含以下两者或更多者：甘油、甘油衍生物；乙二醇；丙二醇(二羟基丙烷)；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚乙二醇；水溶性聚合物或葡聚糖。粘度剂/改性剂可包括适于提供约1至约10厘泊的粘度而光学特性(包括光学清晰度)适用于成像系统的任何试剂。

如本文所用，其他示例性粘度剂/改性剂可包括例如天然水解胶体(及衍生物)，诸如阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻酸、角叉菜胶、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶、阿拉伯树胶、瓜耳胶、明胶、纤维素、海藻酸盐、淀粉、糖类、葡聚糖；明胶；糖类(及衍生物)，诸如右旋糖、果糖；聚右旋糖；葡聚糖；多聚葡聚糖；糖类；和多糖；半合成水解胶体(及衍生物)，诸如甘油、甲基纤维素、羟乙基淀粉(hetastarch)、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；合成水解胶体(及衍生物)，诸如聚乙烯醇(PVA)和/或也考虑了其他细胞相容性粘度剂/改性剂可用于该目的。

在另一方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为以PIOAL的约1至约50％(v/v)的浓度存在的甘油。例如，在一个实施例中，粘度剂/改性剂可以约5.0％至约8.0％(v/v)的浓度存在于PIOAL中。在另一方面，粘度剂/改性剂可以约6.5％(v/v)的浓度存在。在一个实施例中，粘度剂/改性剂是以约6.5％(v/v)的浓度存在的甘油。

在又一个实施例中，PIOAL可包含以约30％(v/v)的浓度存在的甘油粘度剂/改性剂。

在另一方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为以约0.5至约2.5％(w/v)的浓度存在的PVP。例如，在一个实施例中，粘度剂/改性剂PVP可以约1.0至约1.6％(w/v)的浓度存在于PIOAL中。在一个实施例中，PVP以约1.0％(w/v)的浓度存在。

在另一方面，PIOAL中的粘度剂/改性剂可以为PVP和甘油。例如，在一个实施例中，甘油可以约5％(v/v)的浓度与约1％(w/v)的PVP相结合存在于PIOAL中。

在一个实施例中，本发明的PIOAL可用于视觉分析仪以对粒子进行成像。在一个方面，视觉分析仪包括具有对称流路的流通池，和自聚焦部件。

粘度剂和/或粘度改性/调节剂(诸如甘油)可包含在PIOAL中。粘度剂或粘度改性剂在引入时可适当地将PIOAL的粘度调节到所需的范围。可以使用足以增加PIOAL的粘度的任何合适的粘度剂，其具有允许对流动中的细胞进行高质量成像的合适的光学特性。PIOAL将具有合适的粘度以将细胞和/或细胞结构配向到基本上与流动方向平行的单个平面中，从而部分地增加粒子的焦距内内容物。

PIOAL可与本公开的任何分析仪一起使用。

如本文所用，术语“甘油”涵盖甘油和甘油的衍生物(下文称为甘油衍生物)。甘油衍生物的例子包括硫甘油、聚甘油等。聚甘油的可用例子可包括双甘油、POLYGLYCERIN#310(坂本药品工业株式会社(Sakamoto Yakuhin Kogyo Co.,Ltd.))、POLYGLYCERIN#750(坂本药品工业株式会社)、POLYGLYCERIN#500(坂本药品工业株式会社)等。

在另一个实施例中，本公开的PIOAL还包含pH调节剂。在一个方面，PIOAL和/或样品的最终pH在约6.0至约8.0之间。在另一方面，PIOAL和/或样品的最终pH在约6.6至约7.4之间。在一个方面，PIOAL的最终pH可与制备的样品12B的pH相同(参见图8)。

示例性pH调节剂可包括例如酸(示例包括有机酸和矿物酸)、碱(示例包括有机碱以及碱金属和碱土金属氢氧化物)。示例性有机酸可包括乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、草酸和尿酸。示例性矿物酸可包括例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、硼酸、氢氟酸、氢溴酸和过氯酸。示例性有机碱可包括例如吡啶、甲胺、咪唑、苯并咪唑、组氨酸、磷腈和阳离子氢氧化物。示例性碱金属和碱土金属氢氧化物可包括例如氢氧化钾(KOH)、氢氧化钡(Ba(OH)₂)、氢氧化铯(CsOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锶(Sr(OH)₂)、氢氧化钙(Ca(OH)₂)、氢氧化锂(LiOH)和氢氧化铷(RbOH)。

在一些实施例中，使用缓冲剂，优选地将PIOAL的pH维持在约6.0至约8.5，更优选地约7.0至约8.0。在一些实施例中，优选的是向PIOAL添加缓冲剂以便调节PIOAL的pH。可以使用一种或多种任何合适的缓冲剂，只要所述缓冲剂能够将PIOAL调节到适当的范围即可。这样的缓冲剂的例子包括可以单独使用或组合使用的PBS、Good's缓冲液(具体地讲，tris缓冲液、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS等)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、巴比土钠盐酸盐(veronal sodium-HCl)、可力丁盐酸盐(collidine-HCl)、三(羟甲基)氨基甲烷-马来酸、三(羟甲基)氨基甲烷-HCl。

在另一个实施例中，本发明的PIOAL包含离子强度改性剂以调节所得配方的离子强度。示例性离子强度改性剂可包括Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Cl^-、Br^-、HCO^- ₃、硫酸盐、焦硫酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐(例如焦磷酸钾)、柠檬酸盐、卡可基酸盐或其他合适的盐。在一个实施例中，PIOAL可以为等渗的。

可将表面活性剂加入PIOAL中。表面活性剂的种类无特别限制，只要它们与PIOAL的其他组分相容且与带形样品料流和样品中的粒子相容即可。表面活性剂可包括例如阳离子、阴离子、非离子和两性表面活性剂。示例性表面活性剂可包括聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂、聚氧乙烯烷基苯基醚型表面活性剂(例如，NISSAN NONION NS-240(日本油脂株式会社(NOF CORPORATION)，注册商标))、聚氧乙烯山梨糖醇烷基酯型表面活性剂(例如，RHEODOL TW-0120(花王株式会社(Kao Corporation)，注册商标))、多元醇共聚物(例如，PLURONIC F-127、F-123、F-109、F-87、F-86、F-68、T-1107、T-1102(巴斯夫公司(BASFCorporation)，注册商标))、MEGA-8、蔗糖单癸酸酯、脱氧-BIGCHAP、正辛基-β-D-硫代葡糖苷、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷、正庚基-β-D-硫代葡糖苷、正辛基-β-D-硫代葡糖苷、CHAPS、CHAPSO等。其他表面活性剂可包括处于样品和带形样品料流相容性浓度的Triton-X-100和Tween 20。

表面活性剂在PIOAL中的浓度优选地为样品中的粒子(诸如细胞)不受影响和/或保持基本上完整的浓度水平。具体地讲，该浓度优选地为5至5000mg/L，更优选地为100至3000mg/L。

当用分析仪分析样品中所含的粒子时，诸如磷酸铵、磷酸镁、碳酸钙的无定形盐可在样品中沉淀。可将螯合剂加入PIOAL中以便溶解这些无定形盐。添加螯合剂使得不仅能够溶解无定形盐，还能够抑制PIOAL的氧化。螯合剂的可用例子包括EDTA盐、CyDTA、DHEG、DPTA-OH、EDDA、EDDP、GEDTA、HDTA、HIDA、甲基-EDTA、NTA、NTP、NTPO、EDDPO等。螯合剂在PIOAL中的浓度优选地在0.05至5g/L的范围内。

在另一个实施例中，PIOAL还可以包含一种或多种抗微生物剂。在一些方面，抗微生物剂可以为例如具有杀真菌活性的物质(杀真菌剂)和/或具有杀菌活性的物质(杀菌剂)。在某些实施例中，合适的抗微生物剂可包括例如对羟基苯甲酸酯、异噻唑啉酮、酚类物质、酸性防腐剂、卤化化合物、quarternia和醇。示例性对羟基苯甲酸酯可包括对羟基苯甲酸酯和对羟基苯甲酸酯盐。示例性异噻唑啉酮可包括甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、苯异噻唑啉酮、ProClin 150、ProClin 200、ProClin 300和ProClin950。示例性酚类可包括苯氧基乙醇、苄醇和苯乙醇。示例性酸性防腐剂可包括脱氢乙酸、苯甲酸、山梨酸、水杨酸、甲酸、丙酸。示例性卤化化合物可包括2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、氯乙酰胺、氯代丁醇、氯二甲苯酚、氯苯甘油醚、二氯苄醇、丁基氨基甲酸碘代丙炔酯、甲基二溴戊二腈。示例性quaternia可包括苯扎氯铵、苄索氯铵、氯己定、二羟乙基磺酸己氧苯醚和聚氨丙基双胍。示例性醇可包括乙醇和异丙醇。其例子包括三嗪抗微生物剂、噻唑杀菌剂(例如，苯并异噻唑啉酮)、吡啶硫酮、吡啶杀菌剂(例如，1-羟基吡啶-2-硫钠等)、2-苯氧基乙醇等。具体地讲，可以使用Proxel GXL(奥维斯公司(Avecia))、TOMICIDE S(API公司(API Corporation))等。杀菌剂和/或杀真菌剂有助于改善PIOAL的稳定性。

在一个实施例中，抗微生物剂的浓度可以为0.01％至0.5％(w/v)。该浓度可以为0.03至0.05％(w/v)。

在实施例中经受使用具有PIOAL的分析仪的分析的样品无特别限制。通常使用得自活体的样品(生物样品)。或者，可对那些样品进行稀释、纯化、与对比剂接触等以供使用。具体地讲，这样的样品的例子可包括血液、精液、脑脊髓液等。样品还可以包括源自组织样品的粒子悬液。在分析粒子(红血细胞、白血细胞、细菌等)时，该实施例中的PIOAL是适用的。

本发明的PIOAL可用于对粒子进行成像的视觉分析仪。在一个方面，视觉分析仪包括能够以预定的尺寸特性(诸如有利的带形样品料流厚度)维持带形样品料流的流动的流通池。在一些实施例中，流通池可具有对称流路，并与自聚焦部件结合使用。

本公开涉及对粒子进行成像的方法，其包括：1)将样品与粒子对比剂组合物接触；2)照明制备的粒子；3)获得包封在PIOAL中的带形样品料流中的粒子的数字化图像；以及4)分析图像信息以对粒子分类或子分类。在一些实施例中，粒子可以为WBC、RBC和/或血小板(包括例如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、网织红细胞、有核RBC、母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)、细胞、细菌、寄生生物、颗粒物、细胞团、细胞组分和未成熟粒细胞中的至少一种。在一些实施例中，基于粒子图像信息对血小板、网织红细胞、有核RBC以及WBC(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和未成熟的WBC(包括母细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞或晚幼粒细胞)计数和分析。

在一些实施例中，视觉分析仪包括具有对称或不对称流路的流通池，和自聚焦部件。

在一般的方面，当与存在于研究和/或医学实验室中的自动化分析仪结合使用时，所述示例性PIOAL及其使用方法是有用的。示例性自动化分析仪为被设计成以最少的人工辅助快速地测量多种生物样品(包括例如人类体液样品)中的不同有形成分和/或其他特性的仪器。示例性自动化分析仪可包括例如血液学分析仪和/或细胞计数器，其可执行例如全血计数(CBC)测定。示例性分析仪可逐一地、分批地或连续地处理样品。

在一个方面，示例性分析仪/系统包括被配置成检测符合一项或多项选择标准的多个粒子并提供其粒子计数的自动化粒子计数器，其中所述选择标准涵盖所述粒子中至少两个分类的成员。对可包括处理器(可包括计数器的部件)的分析仪进行编程以区分所述至少两个分类的粒子。各粒子的分布使用该分析仪进行测定。该处理器使用所述分布来校正所述至少两个分类和/或子分类中至少一个的成员的粒子计数。在一些实施例中，粒子计数器包括至少一个通道，所述通道被配置成基于体积、尺寸、形状和/或其他标准的预定范围提供所述至少一个分类和/或子分类的粒子的粒子计数。例如，所述至少一个分类和/或子分类的成员包括选自以下子分类的至少一种类型的粒子：白血细胞(WBC)、红血细胞(RBC)、巨大血小板(PLT)和有核红血细胞(NRBC)。在粒子计数器上，由于相似的尺寸或其他测得的特性，诸如巨大PLT和NRBC的细胞可作为WBC计数。通过操作如本文所述的设备，可准确地测量巨大PLT和NRBC的粒子计数或浓度。

可使用计算机或具有硬件、软件和/或固件的其他处理器来执行本文描述的计算或操作中的每一个。各个方法步骤可通过模块执行，并且所述模块可包括被布置用于执行本文所述的方法步骤的多种多样的数字和/或模拟数据处理硬件和/或软件中的任何一种。所述模块任选地包括数据处理硬件，该数据处理硬件由于具有与其相关联的适当机器编程代码而适于执行这些步骤中的一个或多个，用于两个或更多个步骤(或两个或更多个步骤的部分)的模块被集成到单个处理器板中或采用多种多样的集成式和/或分布式处理架构中的任何一种被分成不同的处理器板。这些方法和系统通常将采用有形介质，该有形介质体现具有用于执行上述方法步骤的指令的机器可读代码。合适的有形介质可包括存储器(包括易失性存储器和/或非易失性存储器)、存储介质(诸如软盘、硬盘、磁带等上的磁记录；光学存储器诸如CD、CD-R/W、CD-ROM、DVD等上的磁记录；或任何其他数字或模拟存储介质)，等等。

本公开中所论述的所有专利、专利公布、专利申请、期刊论文、书籍、技术参考手册等全文以引用方式并入本文中以用于所有目的。

在附图中描绘或上文所述的部件的不同布置，以及未示出或描述的部件和步骤也是可行的。相似地，一些特征结构和子组合是可用的，且它们可以在与其他特征结构和子组合无关的情况下被采用。出于例示性和非限制性的目的描述了本发明的实施例，但可供选择的实施例对于本专利的读者而言将是显而易见的。在某些情况下，方法步骤或操作可按不同的顺序执行或实施，或者可对操作进行添加、删除或修改。应当理解，在本发明的某些方面，可用多个部件来替换单个部件，并且可用单个部件来替换多个部件，以提供元件或结构或者执行给定的一种或多种功能。除了这种替换将不能有效实践本发明的某些实施例的情况之外，这种替换被视为在本发明的范围之内。因此，本发明不限于上文所述或在附图中描绘的实施例，并且可以在不脱离下方权利要求的范围的前提下，创造各种实施例和进行各种修改。

Claims (29)

1.一种用于组合式粘度和几何流体聚焦分析仪的粒子和细胞内细胞器官配向液体(PIOAL)，其特征在于，所述PIOAL引导被注入所述分析仪的变窄流通池过渡区的给定粘度的血液样品流体的流动，以便产生被所述PIOAL包封的样品流体料流，所述PIOAL包含：

粘度比所述血液样品流体的粘度更高的流体，以及

粘度剂，

其中，

与粘度差相关的所述PIOAL流体和所述样品流体之间的相互相用所引起的粘度流体聚焦作用，与和所述变窄流通池过渡区相关的所述PIOAL流体和所述样品流体之间的相互相用所引起的几何流体聚焦作用相结合，有效地在所述分析仪的成像位点在多个粒子中的至少一些中提供靶成像状态，而所述粘度剂保持所述样品流体料流中的细胞的活力，从而当所述细胞从所述样品流体料流延伸到流动鞘流体中时，使所述细胞的结构和内容物完整，

所述PIOAL减小所述PIOAL流体和所述样品流体之间的所述粘度差和剪切力，以保持细胞膜和细胞形态，并且

所述粘度剂包括从5％到8％(v/v)浓度的甘油。

2.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，所述甘油是5％(v/v)的浓度。

3.如权利要求1或2所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括从0.5％到2.5％(w/v)浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

4.如权利要求1或2所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括1％(w/v)浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

5.如权利要求4所述的PIOAL，其特征在于，所述PVP具有360，000的分子量。

6.如权利要求4所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括磷酸盐缓冲盐水、氯化钠、氯化钾和去离子水。

7.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括pH调节剂。

8.如权利要求7所述的PIOAL，其特征在于，所述pH调节剂是缓冲剂。

9.如权利要求7所述的PIOAL，其特征在于，所述pH调节剂是氢氧化钠。

10.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL具有大约1-10厘泊(cP)之间的粘度。

11.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL的pH是大约7.2。

12.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL是等渗的。

13.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括表面活性剂。

14.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括抗微生物剂。

15.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL具有与所述血液样品流体的pH相等的pH。

16.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括稀释剂和去离子水。

17.如权利要求1所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括离子强度改性剂、表面活性剂、螯合剂和抗微生物剂。

18.一种用于组合式粘度和几何流体聚焦分析仪的粒子和细胞内细胞器官配向液体(PIOAL)，其特征在于，所述PIOAL引导被注入所述视觉分析仪的变窄流通池过渡区的给定粘度的血液样品流体的流动，以便产生被所述PIOAL包封的样品流体料流，所述PIOAL包含：

粘度比所述血液样品流体的粘度更高的流体，

PH调节剂、稀释液和去离子水，

其中所述pH调节剂是缓冲剂，

其中与所述粘度差相关的所述PIOAL流体和所述样品流体之间的相互相用所引起的粘度流体聚焦作用，与和所述变窄流通池过渡区相关的所述PIOAL流体和所述样品流体之间的相互相用所引起的几何流体聚焦作用相结合，有效地在所述视觉分析仪的成像位点在多个粒子中的至少一些中提供靶成像状态，而所述PIOAL中的粘度剂保持所述样品流体料流中的细胞的活力，从而当所述细胞从所述样品流体料流延伸到所述流动鞘流体中时，使所述细胞的结构和内容物完整，

其中所述鞘流体的所述粘度剂包括甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

甘油是大约5％(v/v)的浓度。

19.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是大约1％(w/v)的浓度。

20.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，所述甘油是5％(v/v)的浓度并且聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是1％(w/v)的浓度。

21.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL具有大约1-10厘泊(cP)之间的粘度。

22.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL的pH是大约7.2。

23.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL是等渗的。

24.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括表面活性剂。

25.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，进一步包括抗微生物剂。

26.如权利要求18所述的PIOAL，其特征在于，所述PIOAL具有与所述血液样品流体的pH相等的pH。

27.一种用于组合式粘度和几何流体聚焦分析仪的粒子和细胞内细胞器官配向液体(PIOAL)，其特征在于，所述PIOAL引导被注入所述视觉分析仪的变窄流通池过渡区的给定粘度的血液样品流体的流动，以便产生被所述PIOAL包封的样品流体料流，所述PIOAL包含：

粘度比所述血液样品流体的粘度更高的流体，

PH调节剂，

甘油，

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

缓冲剂，以及

去离子水，

与所述粘度差相关的所述PIOAL流体和所述样品流体之间的相互相用所引起的粘度流体聚焦作用，与和所述变窄流通池过渡区相关的所述PIOAL流体和所述样品流体之间的相互相用所引起的几何流体聚焦作用相结合，有效地在所述视觉分析仪的成像位点在多个粒子中的至少一些中提供靶成像状态，而所述PIOAL中的粘度剂在所述样品流体料流中保持细胞的活力，从而当所述细胞从所述样品流体料流延伸到所述流动鞘流体中时，使所述细胞的结构和内容物完整，

其中所述鞘流体的所述粘度剂包括甘油和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，

甘油是大约5％(v/v)的浓度。

28.如权利要求27所述的PIOAL，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是大约1％(w/v)的浓度。

29.如权利要求27所述的PIOAL，其特征在于，所述甘油是5％(v/v)的浓度并且聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是1％(w/v)的浓度。