BR112015019969B1 - método para a obtenção de imagens de partículas usando um sistema de análise de partículas configurado para focalização hidrodinâmica combinada da viscosidade e da geometria, e sistema de análise de partículas que realiza focalização hidrodinâmica combinada da viscosidade e da geometria para partículas de imagem em uma amostra de sangue - Google Patents

método para a obtenção de imagens de partículas usando um sistema de análise de partículas configurado para focalização hidrodinâmica combinada da viscosidade e da geometria, e sistema de análise de partículas que realiza focalização hidrodinâmica combinada da viscosidade e da geometria para partículas de imagem em uma amostra de sangue Download PDF

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Abstract

SISTEMAS DE CÉLULA DE FLUXO E MÉTODOS PARA ANÁLISE DE PARTÍCULAS EM AMOSTRAS DE SANGUE. A presente revelação refere-se a aparelhos, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra contendo partículas. Em alguns aspectos, o sistema compreende um analisador que pode ser um analisador visual. Em um aspecto, a presente revelação refere-se a um sistema de obtenção de imagens de partículas compreendendo uma célula de fluxo, através da qual o fluxo de uma amostra contendo partículas é passado, e um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica, que captura imagens para a análise de imagens das amostras. Outras composições, métodos e recursos da presente revelação são revelados no presente pedido.

Description

REFERÊNCIAS REMISSIVAS AOS PEDIDOS CORRELATOS
[001] Este pedido é reivindica o benefício de prioridade do pedido de patente provisório US n° 61/799.152, depositado em 15 de março de 2013, e também reivindica prioridade do pedido de patente US n° 14/216,533 depositado em 17 de março de 2014; seus conteúdos es- tão incorporados ao presente pedido mediante a referência. O presen- te pedido também está relacionado aos pedidos de patente US n° 14/215.834, 14/216.533, 14/216.339, 14/216.811 e 14/217.034; e aos pedidos de patente internacionais N°s PCT/US2014/030928, PCT/US2014/030850, E PCT/US2014/03851 depositados em 17 de março de 2014 e PCT/US2014/030939 e PCT/US2014/030942 deposi- tados em 18 de março de 2014. O conteúdo de todos esses depósitos está incorporado ao presente pedido mediante a referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A presente revelação refere-se ao campo dos aparelhos, sistemas, composições e métodos para a análise de partículas, inclu- indo a obtenção de imagens de partículas em amostras de fluidos usando dispositivos total ou parcialmente automatizados para discrimi- nar e quantificar as partículas, como as células sanguíneas na amos- tra. A presente revelação também se refere a um líquido de alinha- mento de organelas intracelulares e/ou partículas (PIOAL) útil para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo, a métodos para produzir o líquido e a métodos para usar o líquido na detecção e na análise das partículas. Composições, sistemas, dispositivos e métodos úteis para conduzir a análise de fluido biológico com base em imagens também são revelados. As composições, sistemas, dispositivos e mé- todos da presente revelação também são úteis para detectar, contar e caracterizar partículas em fluidos biológicos, como glóbulos vermelhos, reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas e para a contagem, cate- gorização, subcategorização, caracterização e/ou análise diferenciais de glóbulos brancos com base em imagens e na morfologia.
[003] A análise das células sanguíneas é um dos exames clínicos realizados com mais frequência para obter-se um panorama do estado de saúde de um paciente. Amostras de sangue podem ser colhidas dos pacientes e armazenadas em tubos de ensaio contendo anticoa- gulante para impedir a coagulação. Uma amostra de sangue total nor- malmente compreende três classes principais de células sanguíneas, são elas os glóbulos vermelhos (eritrócitos), os glóbulos brancos (leu- cócitos) e as plaquetas (trombócitos). Cada classe pode ser ainda di- vidida em subclasses de elementos. Por exemplo, cinco tipos ou sub- classes principais de glóbulos brancos (GB) têm formas e funções dis- tintas. Os glóbulos brancos podem ser divididos em neutrófilos, linfóci- tos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Também há subclasses dos tipos de glóbulos vermelhos. Os aspectos das partículas em uma amostra podem diferir de acordo com as condições patológicas, a ma- turidade celular ou com outras causas. As subclasses de glóbulos vermelhos podem incluir reticulócitos e eritrócitos nucleados.
[004] Um hemograma com estimativa da concentração de GV, GB ou plaquetas pode ser feito manualmente ou usando um analisa- dor hemológico automatizado. Quando os hemogramas são feitos ma- nualmente, uma gota de sangue é aplicada em uma lâmina de micros- copia na forma de um esfregaço delgado. O exame manual de um es- fregaço de sangue desidratado e colorido em uma lâmina de micros- copia é, tradicionalmente, usado para determinar o número de teores relativos de cinco tipos de glóbulos brancos. Corantes e colorações histológicos são usados para colorir células ou estruturas celulares. Por exemplo, a coloração de Wright é usada para colorir esfregaços de sangue a serem examinados em um microscópio óptico. Um hemo- grama completo (HC) pode ser obtido mediante o uso de um analisa- dor hemológico automatizado, um tipo de aparelho que conta o núme- ro das diferentes partículas ou células em uma amostra de sangue com base na impedância ou dispersão dinâmica de luz à medida que as partículas ou células atravessam uma área sensível ao longo de um pequeno tubo. O HC automatizado pode empregar instrumentos ou métodos para diferenciar os tipos de células dos glóbulos vermelhos (GB), dos glóbulos brancos (GB) e das plaquetas (PLTs) e contá-los separadamente. Por exemplo, para contar apenas as células grandes, poderia ser empregada uma técnica de contagem que exigisse um ta- manho de partícula ou um volume mínimo. Certas células, como as células anormais no sangue, podem não ser contadas ou identificadas corretamente. Células pequenas que se aderem umas às outras po- dem ser equivocadamente contadas como uma célula grande. Quando há suspeita de contagens equivocadas, a revisão manual dos resulta- dos do instrumento pode ser necessária para verificar e identificar as células.
[005] As técnicas de contagem automatizada das células sanguí- neas podem envolver a citometria de fluxo. A citometria de fluxo envol- ve a preparação de uma trajetória de fluxo estreita e a detecção e con- tagem de células sanguíneas individuais. Os métodos de citometria de fluxo são usados para detectar partículas suspensas em um fluido, como as células de uma amostra de sangue, e para analisar as partí- culas quanto a seus tipos, dimensões e distribuição de volume, de modo a inferir a concentração do respectivo tipo de partícula ou volu- me de partícula na amostra de sangue. Exemplos de métodos ade- quados para a análise de partículas suspensas em um fluido incluem sedimentação, caracterização microscópica, contagem baseada na impedância e dispersão dinâmica de luz. Essas ferramentas estão su- jeitas a erros nos exames. E, ainda assim, a caracterização precisa dos tipos e da concentração das partículas pode ser fundamental em aplicações como diagnósticos médicos.
[006] Nas técnicas de contagem baseadas em imagens, imagens com dados de pixel de uma amostra preparada que esteja atravessan- do uma área de visualização são capturadas com o uso de uma lente objetiva de um microscópio acoplada a uma câmera digital. Os dados de pixel da imagem podem ser analisados usando técnicas de proces- samento de dados e também podem ser mostrados em um monitor.
[007] Os aspectos de sistemas diagnósticos automatizados com células de fluxo são revelados na patente US n° 6.825.926, de Turner et al., e nas patentes US n°s 6.184.978, 6.424.415 e 6.590.646, todos de Kasdan et al., que estão aqui incorporados, por referência, como se estivessem totalmente previstos no presente pedido.
[008] Os sistemas automatizados que usam dispersão dinâmica de luz ou impedância são usados para obtenção de hemogramas completos (HC): leucograma total (LC), distribuição do volume total de glóbulos vermelhos, hemoglobina Hgb (quantidade de hemoglobina no sangue); volume corpuscular médio (VCM) (volume médio dos glóbu- los vermelhos); VPM (volume de PLT médio); hematócrito (Hct); HCM (Hgb/GV) (média de hemoglobina por glóbulo vermelho); e CHCM (Hgb/Hct) (concentração média de hemoglobina nas células). Proces- sos automatizados ou parcialmente automatizados são usados para facilitar a contagem diferencial de glóbulos brancos em cinco elemen- tos e as análises de amostras de sangue.
[009] Embora esses sistemas e métodos de análise de partículas atualmente conhecidos, junto com as técnicas de diagnóstico clínico relacionadas, possam fornecer benefícios reais a médicos, profissio- nais de saúde pacientes, ainda são desejados outros aprimoramentos. As modalidades da presente invenção apresentam soluções para pelo menos algumas dessas necessidades pendentes.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] As modalidades da presente invenção referem-se a apare- lhos, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra preparada contendo partículas. Em alguns aspectos, o sistema com- preende um analisador que pode ser um analisador visual. Em alguns aspectos, o aparelho contém um analisador visual e um processador. Em um aspecto, a presente revelação refere-se a um sistema automa- tizado de obtenção de imagens de partículas em que uma amostra de fluido contendo partículas de interesse é colocada em fluxo através de uma célula de fluxo com uma seção de visualização por meio da qual um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica captu- ra uma imagem. Em alguns aspectos, o dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica compreende uma câmera, como uma câmera digital. Em um aspecto, o dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica compreende uma lente objetiva.
[0011] A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido da amos- tra, como uma amostra preparada, e a uma fonte de líquido de alinha- mento de organelas intracelulares e/ou partículas (PIOAL). O sistema permite a captura de imagens focalizadas das partículas em uma amostra no fluxo. Em algumas modalidades, as imagens podem ser usadas em processos automatizados de alta produtividade para a ca- racterização e subcategorização das partículas. Um analisador visual exemplificador pode incluir um processador para facilitar a análise au- tomatizada das imagens. Em alguns casos, o analisador visual pode ser usado nos métodos desta revelação para realizar a contagem dife- rencial de GB automatizada e baseada em imagens ou outros protoco- los de análise de partículas em amostras de sangue. Em alguns casos, os métodos da presente revelação referem-se à identificação automa- tizada de anormalidades morfológicas para a determinação, o diagnós- tico o prognóstico, a previsão e/ou a fundamentação do diagnóstico de que o paciente está saudável ou tem uma doença, quadro, anormali- dade e/ou infecção, além do monitoramento da resposta ou da ausên- cia de resposta de um paciente ao tratamento.
[0012] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para a obtenção de imagens usando um sistema de análise de partículas configurado para a focalização hidrodinâmica combinada da viscosidade e da geometria. As partículas podem estar incluídas em um primeiro e um segundo fluxo de amostra de uma mesma amostra de sangue. Os métodos exemplificadores podem in- cluir o fluxo de um fluido de revestimento por um caminho de fluxo de uma célula de fluxo do analisador de partículas; o fluido de revestimen- to pode ter viscosidade distinta da viscosidade da amostra de sangue. Em alguns casos, o fluido de revestimento tem uma viscosidade de fluido de revestimento diferente da viscosidade do fluido da amostra com uma determinada diferença de viscosidade, e essa diferença de viscosidade tem um valor incluído em uma faixa de diferença de visco- sidade predeterminada. Os métodos também podem incluir a injeção de um primeiro fluido da amostra contido em um tubo de injeção no fluido de revestimento em fluxo no interior da célula de fluxo, de modo a criar uma corrente de fluido da amostra com uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção. O caminho de fluxo da célula de fluxo pode ter, então, uma redução no tamanho, de modo que uma espes- sura da corrente do fluido da amostra reduz-se de uma espessura ini- cial para uma segunda espessura adjacente a um ponto de captura de imagens. Os métodos podem incluir ainda a obtenção de imagens de uma primeira pluralidade de partículas do primeiro fluido da amostra no ponto de captura de imagens da célula de fluxo, e o início de tran- sientes do fluido da amostra pelo encerramento da injeção do primeiro fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo e pela injeção do segundo fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo. Os mé- todos podem ainda incluir a obtenção de imagens de uma segunda pluralidade de partículas de um segundo fluido da amostra no ponto de captura de imagens da célula de fluxo. A obtenção de imagens da se- gunda pluralidade de partículas pode ser realizada substancialmente depois dos transientes do fluido da amostra e em até 4 segundos após a obtenção de imagens da primeira pluralidade de partículas. Em al- guns casos, a diminuição no tamanho caminho de fluxo é definida por uma porção proximal do caminho de fluxo com uma espessura proxi- mal e por porção distal do caminho de fluxo com uma espessura distal menor que a espessura proximal. Uma extremidade a jusante do tubo de injeção do fluido da amostra pode estar posicionada distalmente em relação à porção proximal do caminho de fluxo. A diferença de viscosi- dade entre o fluido de revestimento e a amostra de sangue, em com- binação com a diminuição no tamanho do caminho de fluxo, pode ser eficaz para a focalização hidrodinâmica do primeiro e do segundo flui- do da amostra no ponto de captura de imagens, enquanto que um agente doador de viscosidade no fluido de revestimento preserva a viabilidade das células no primeiro e no segundo fluidos da amostra, deixando a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as célu- las se estendem da corrente de fluido da amostra para o fluido de re- vestimento em fluxo.
[0013] Em alguns métodos, o tubo de injeção pode incluir um vo- lume interno baseado na razão entre a seção transversal da área de fluxo do tubo de injeção e a seção transversal da área de fluxo da cé- lula de fluxo, na razão entre a seção transversal da área de fluxo do tubo de injeção e o diâmetro externo da célula de fluxo ou na razão entre a seção transversal da área de fluxo do tubo de injeção e a se- ção transversal da área de fluxo da corrente da amostra. Em alguns casos, a diminuição do tamanho do caminho de fluxo pode ser definida pela inclinação radial e interna das paredes opostas do caminho de fluxo ao longo do caminho de fluxo, de modo geral, simétrica em rela- ção a um plano transversal que divide a corrente de fluido da amostra em primeira e segunda espessuras. Em alguns casos, a simetria na diminuição no tamanho do caminho de fluxo é eficaz para limitar o de- salinhamento na orientação de obtenção de imagem dos glóbulos vermelhos na amostra de sangue a menos de cerca de 20%. Em al- guns casos, a amostra de sangue inclui partículas esféricas, e uma diferença de viscosidade entre o fluido da amostra e o fluido de reves- timento é eficaz para alinhar as organelas intracelulares das partículas esféricas em um plano focal no ponto de captura de imagens da célula de fluxo. Em alguns casos, uma porção distal do tubo de injeção de fluido da amostra é posicionada a uma distância de separação axial do ponto de captura de imagens, e a distância de separação axial tem um valor na faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em alguns casos, o tubo de injeção tem um volume interno menor que cerca de 30 μL.
[0014] Em alguns métodos, o tubo de injeção tem uma porção proximal com uma primeira seção transversal de fluxo e uma porção distal com uma segunda seção transversal de fluxo, e a seção trans- versal de fluxo da porção proximal é 1,5 vezes maior que a seção transversal de fluxo da porção distal. Em alguns métodos, o tubo de injeção tem uma porção central disposta entre a porção proximal e a porção distal, a porção central tem uma terceira seção transversal de fluxo, e a terceira seção transversal de fluxo é maior que a primeira e a segunda seções transversais de fluxo.
[0015] Em alguns métodos, uma porção distal do tubo de injeção de fluido da amostra inclui uma porta de saída com uma altura e uma largura, e a altura pode ser menor que a largura. Em alguns casos, a altura é cerca de 150 μm e a largura é cerca de 1.350 μm. Em alguns casos, a altura tem um valor na faixa de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm, e a largura tem um valor na faixa de 500 μm a cerca de 3.000 μm.
[0016] Em alguns métodos, uma razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra é cerca de 70. Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra é cerca de 200. Em alguns casos, o fluido de reves- timento tem uma vazão de cerca de 35 μL/s, e o fluido da amostra tem uma vazão de cerca de 0,5 μL/s. Em alguns casos, o fluido da amostra tem uma velocidade entre cerca de 20 e 200 mm/segundo no ponto de captura de imagens. Em alguns casos, a velocidade do fluido de re- vestimento e a velocidade da amostra de fluido podem ser diferentes em uma posição do caminho de fluxo próxima à porta de saída do tubo de injeção, e a velocidade do fluido de revestimento e a velocidade da amostra de fluido podem ser as mesmas no ponto de captura de ima- gens. Em alguns casos, a primeira espessura da corrente de fluido da amostra é cerca de 150 μm, por exemplo, no ponto em que o fluido da amostra deixa o tubo de injeção. Em alguns casos, a segunda espes- sura da corrente de fluido da amostra está numa faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm, por exemplo, no ponto em que a corrente do fluido da amostra atravessa o ponto de captura de imagens. Em al- guns casos, a segunda espessura da corrente de fluido da amostra está numa faixa de cerca de 2 μm a cerca de 4 μm. Em alguns casos, a razão entre a primeira espessura da corrente de fluido da amostra e a segunda espessura da corrente de fluido da amostra tem um valor na faixa de cerca de 20:1 a cerca de 70:1. Em alguns casos, a razão entre a primeira espessura da corrente de fluido da amostra e a se- gunda espessura da corrente de fluido da amostra tem um valor na faixa de cerca de 5:1 a cerca de 200:1. Em alguns casos, a razão en- tre a espessura proximal da porção proximal do caminho de fluxo e a espessura distal da porção distal de caminho de fluxo tem um valor de redução geométrica selecionado do grupo que consiste em 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 e 200:1. Em alguns casos, a célula de fluxo tem uma razão de compressão mínima de cerca de 50:1 e uma razão de compressão máxima de cerca de 125:1.
[0017] Em alguns métodos, a célula de fluxo está orientada de modo que o fluido da amostra e o fluido de revestimento em fluxo no interior da célula de fluxo movem-se contra a gravidade. Em alguns métodos, a célula de fluxo está orientada de modo que o fluido da amostra e o fluido de revestimento em fluxo no interior da célula de fluxo movem-se a favor da gravidade. Métodos exemplificadores tam- bém podem incluir a retirada de bolhas do fluido da amostra em fluxo. Em alguns casos, o primeiro fluido da amostra chega a um estado es- tabilizado em cerca de 1 a 3 segundos após a injeção do primeiro flui- do da amostra do tubo de injeção de fluido da amostra no fluido de re- vestimento em fluxo. Em alguns casos, o primeiro fluido da amostra chega a um estado estabilizado em menos de 1 segundo após a inje- ção do primeiro fluido da amostra do tubo de injeção de fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo. Em alguns casos, o pri- meiro fluido da amostra chega a um estado estabilizado em cerca de 1,8 segundo após a injeção do primeiro fluido da amostra do tubo de injeção de fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo. Em alguns casos, o fluido da amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo na faixa de cerca de 1 a 4 segundos. Em alguns casos, o fluido da amostra tem um tempo de trânsito através da célula de flu- xo na faixa de cerca de 2 a 4 segundos. Em alguns casos, o ponto de captura de imagens tem um campo de visão entre cerca de 150 μm x 150 μm e 400 μm x 400 μm. Em alguns casos, o primeiro fluido da amostra tem um volume na faixa de cerca de 50 a cerca de 150 μL. Em alguns casos, uma porção proximal do tubo de injeção está aco- plada a uma porta de amostra de um adaptador de entrada de amos- tra.
[0018] Em um outro aspecto, as modalidades da presente inven- ção abrangem sistemas de análise de partículas que realizam a focali- zação hidrodinâmica da viscosidade e da geometria para a obtenção de imagens de partículas em uma amostra de sangue. As partículas podem estar incluídas em um primeiro e um segundo fluxo de amostra. Sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo com um caminho de fluxo configurado para transmitir um fluxo do fluido de re- vestimento. O fluido de revestimento pode ter uma viscosidade diferen- te da viscosidade da amostra de sangue. Em alguns casos, a viscosi- dade do fluido de revestimento é maior que a viscosidade da amostra de sangue. Em alguns casos, o fluido de revestimento tem uma visco- sidade de fluido de revestimento diferente da viscosidade do fluido da amostra com uma determinada diferença de viscosidade, e essa dife- rença de viscosidade tem um valor incluído em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada. Os sistemas também podem incluir um sistema de injeção de fluido da amostra em comunicação fluida com o caminho de fluxo. O sistema de injeção de fluido da amostra pode ser configurado para injetar os fluidos da amostra no fluido de revestimento em fluxo na célula de fluxo, de modo a criar uma corrente de fluido da amostra com uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção. O caminho de fluxo da célula de fluxo pode ter, então, uma redução no tamanho, de modo que uma espessura da corrente do flui- do da amostra reduz-se de uma espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um ponto de captura de imagens. Os sistemas podem incluir também dispositivo de captura de imagem alinhado com o ponto de captura de imagens para obter imagens de uma primeira pluralidade de partículas do primeiro fluido da amostra no ponto de captura de imagens da célula de fluxo. Além disso, os sistemas podem incluir um processador acoplado ao sistema injetor de fluido da amos- tra e o dispositivo de captura de imagem. O processador pode ser con- figurado para encerrar a injeção do primeiro fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo e injetar o segundo fluido da amostra no flui- do de revestimento em fluxo de modo que os transientes do fluido da amostra sejam iniciados e para obter imagens de uma segunda plura- lidade de partículas do segundo fluido da amostra no ponto de captura de imagens da célula de fluxo depois dos transientes do fluido da amostra e em até 4 segundos após a obtenção de imagens da primei- ra pluralidade de partículas. Em sistemas exemplificadores, a diferen- ça de viscosidade entre o fluido de revestimento e as amostras de sangue, em combinação com a diminuição no tamanho do caminho de fluxo, é eficaz para a focalização hidrodinâmica do primeiro e do se- gundo fluidos da amostra no ponto de captura de imagens da célula de fluxo, enquanto que um agente doador de viscosidade no fluido de re- vestimento preserva a viabilidade das células no primeiro e no segun- do fluidos da amostra, deixando a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido da amostra para o fluido de revestimento em fluxo.
[0019] Em alguns sistemas, o tubo de injeção inclui um volume interno baseado na razão entre a seção transversal da área de fluxo do tubo de injeção e a seção transversal da área de fluxo da célula de fluxo, na razão entre a seção transversal da área de fluxo do tubo de injeção e o diâmetro externo da célula de fluxo ou na razão entre a se- ção transversal da área de fluxo do tubo de injeção e a seção trans- versal da área de fluxo da corrente da amostra. Em alguns casos, a diminuição do tamanho do caminho de fluxo é definida pela inclinação radial e interna das paredes opostas do caminho de fluxo ao longo do caminho de fluxo, de modo geral, simétrica em relação a um plano transversal que divide a corrente de fluido da amostra em primeira e segunda espessuras. Em alguns casos, a simetria na diminuição no tamanho do caminho de fluxo é eficaz para limitar o desalinhamento na orientação de obtenção de imagem dos glóbulos vermelhos na amostra de sangue a menos de cerca de 20%. Em alguns casos, uma porção distal do tubo de injeção de fluido da amostra é posicionada a uma distância de separação axial do ponto de captura de imagens, e a distância de separação axial tem um valor na faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em alguns casos, o tubo de injeção inclui uma por- ção proximal com uma primeira seção transversal de fluxo e uma por- ção distal com uma segunda seção transversal de fluxo, e a seção transversal de fluxo da porção proximal é 1,5 vezes maior que a seção transversal de fluxo da porção distal. Em alguns casos, o fluido da amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo na faixa de cerca de 1 a 4 segundos. Em alguns casos, o fluido da amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo na faixa de cerca de 2 a 4 segundos. Em alguns casos, a célula de fluxo está configurada pa- ra receber o fluido de revestimento de uma fonte de fluido de revesti- mento no interior do caminho de fluxo, em uma primeira direção de fluxo que é perpendicular à segunda direção de fluxo do fluido de re- vestimento ao longo do caminho de fluxo no ponto de obtenção de imagens. Em alguns casos, a célula de fluxo inclui um alvo de focali- zação automática para o dispositivo de captura de imagem.
[0020] Os recursos e consequentes vantagens das modalidades da presente invenção descritos acima, e muitos outros, ficarão paten- tes e serão mais bem compreendidos mediante a referência à seguinte descrição detalhada, quando tomada em conjunto com os desenhos que aqui seguem.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0021] A Figura 1 é uma ilustração esquemática, parcialmente em seção e fora de escala, mostrando os aspectos operacionais de uma célula de fluxo exemplificadora, de um sistema de focalização automá- tica e um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica para a análise de imagens de uma amostra empregando o processo de imagens digitais.
[0022] A Figura 2 é uma ilustração em perspectiva de uma célula de fluxo de acordo com uma modalidade exemplificadora.
[0023] A Figura 3 é uma vista em corte longitudinal mediano ao longo das linhas 3-3 da célula de fluxo mostrada na Figura 2.
[0024] As Figuras 3A e 3B apresentam vistas em corte adicionais das células de fluxo de acordo com modalidades da presente inven- ção.
[0025] A Figura 4 representa aspectos do sistema analisador de acordo com modalidades da presente invenção.
[0026] As Figuras 4A, 4B-1 e 4B-2 representam aspectos das célu- las de fluxo de acordo com modalidades da presente invenção.
[0027] As Figuras 4A-1 e 4A-2 representam vistas da seção trans- versal do envelope do fluido de revestimento (por exemplo PIOAL) e das dimensões da corrente da amostra no interior de uma célula de fluxo em uma porta de saída de uma cânula e um ponto de captura de imagens, respectivamente, de acordo com modalidades da presente invenção.
[0028] As Figuras 4C-4G, 4C-1 e 4D-1 representam aspectos das configurações da cânula de acordo com modalidades da presente in- venção.
[0029] A Figura 4H representa aspectos de uma célula de fluxo de acordo com modalidades da presente invenção.
[0030] As Figuras 4I e 4J representam aspectos de um fluxo de fluido em uma célula de fluxo em relação à gravidade de acordo com modalidades da presente invenção.
[0031] As Figuras 4K e 4L representam aspectos do fluido de re- vestimento e do fluxo da amostra no interior de uma célula de fluxo em um ponto de captura de imagens, de acordo com modalidades da pre- sente invenção.
[0032] A Figura 4L-1 representa aspectos da velocidade de fluxo do fluido no interior de uma célula de fluxo de acordo com modalida- des da presente invenção.
[0033] As Figuras 4M e 4N representam aspectos de obtenção de imagens e alinhamento intracelular de acordo com modalidades da presente invenção.
[0034] A Figura 4O representa aspectos do efeito do PIOAL no alinhamento de partículas e/ou de partículas intracelular e na obtenção de imagens de acordo com modalidades da presente invenção. Nessa comparação das imagens obtidas usando o PIOAL com as imagens obtidas usando um fluido de revestimento diferente do PIOAL, é possí- vel ver que o PIOAL proporcionou conteúdos celulares, como lobos, citoplasma e/ou grânulos, mais bem focalizados.
[0035] A Figura 4R ilustra certos resultados de alinhamento de partículas obtidos com o uso de configurações de célula de fluxo e composições de fluido de revestimento de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0036] As Figuras 4P e 4Q mostram a comparação das imagens obtidas usando o PIOAL com as imagens obtidas usando um fluido de revestimento convencional. Pode-se notar que o usar de PIOAL resul- tou em um alinhamento aprimorado dos GV.
[0037] A Figura 5 representa aspectos de métodos de obtenção de imagens de partículas de acordo com modalidades da presente inven- ção.
[0038] A Figura 6 representa aspectos de métodos de obtenção de imagens de partículas de acordo com modalidades da presente inven- ção.
[0039] As Figuras 7 e 8 representam aspectos da taxa de defor- mação da corrente de acordo com modalidades da presente invenção.
[0040] As Figuras 9A e 9B representam aspectos dos alvos da fo- calização automática de acordo com modalidades da presente inven- ção.
[0041] As Figuras 10 e 11 representam aspectos dos alvos da fo- calização automática de acordo com modalidades da presente inven- ção.
[0042] As Figuras 12A e 12B representam aspectos dos alvos da focalização automática de acordo com modalidades da presente in- venção.
[0043] As Figuras 13A, 13B e 13C representam aspectos dos sen- sores de temperatura da célula de fluxo de acordo com modalidades da presente invenção.
[0044] A Figura 13D representa aspectos das técnicas para remo- ção de bolhas da célula de fluxo de acordo com modalidades da pre- sente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0045] A presente revelação refere-se a aparelhos, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra contendo partícu- las. Em uma modalidade, a invenção refere-se um sistema automati- zado de obtenção de imagens de partículas compreendendo um anali- sador, que pode ser, por exemplo, um analisador visual. Em algumas modalidades, o analisador visual pode compreender adicionalmente um processador para facilitar a análise automatizada das imagens.
[0046] De acordo com a presente revelação, um sistema compre- endendo um analisador visual é fornecido para obter imagens de uma amostra compreendendo partículas suspensas em um líquido. O sis- tema pode ser útil, por exemplo, na caracterização de partículas em fluidos biológicos, como na detecção e na quantificação de eritrócitos, reticulócitos, eritrócitos nucleados, plaquetas e glóbulos brancos, inclu- indo, a contagem diferencial de glóbulos brancos e sua categorização, subcategorização e análise. Outros usos semelhantes, como a carac- terização de células sanguíneas de outros fluidos também estão con- templados.
[0047] A discriminação de células sanguíneas em uma amostra de sangue é uma aplicação exemplificadora para a qual o objeto é parti- cularmente conveniente. A amostra é preparada por técnicas automa- tizadas e apresentada a um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica na forma de uma corrente de amostra em formato de fita delgada; as imagens são obtidas periodicamente à medida que a corrente de amostra em formato de fita flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (como das células sanguíneas) po- dem ser distinguidas umas das outras, caracterizadas, subcategoriza- das e contadas usando técnicas de processamento de dados de pixel da imagem programadas, por meio exclusivamente automatizado ou com assistência humana limitada, para identificar e contar as células ou partículas. Além das imagens das células, que podem ser armaze- nadas e disponibilizadas caso as partículas tenham características atí- picas ou críticas, os dados fornecidos incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria específica de célula ou partícula distinguida nas imagens de amostra gravadas.
[0048] As contagens de diferentes partículas obtidas para cada imagem podem ser ulteriormente processadas, por exemplo, usadas para acumular razões precisas e estatisticamente significativas das células de cada categoria e/ou subcatogoria distinguida pela amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual pode ser diluída, mas as proporções de células em cada categoria e/ou subca- tegoria são representadas na amostra diluída, particularmente depois que inúmeras imagens tiverem sido processadas.
[0049] O aparelho e os métodos revelados no presente pedido são úteis para discriminar e quantificar as células nas amostras com base nas distinções visuais. A amostra pode ser uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de fluido corporal compreendendo glóbulos brancos, incluindo, mas sem limitação, sangue, soro, medula óssea, fluido de lavagem, efusões, exsudatos, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal e líquido amniótico. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biópsia tratada para produzir uma suspensão celular. A amostra também pode ser uma suspensão obtida do tratamento de uma amostra de fezes. Uma amostra também pode ser uma amostra de laboratório ou linha de produção que compreende partículas, como uma amostra de cultura celular. O termo amostra pode ser usado em referência a uma amostra obtida de um paciente ou laboratório ou qualquer fração, porção ou alíquota dela. A amostra pode ser diluída, dividida em porções ou colorida em alguns processos.
[0050] Em um aspecto, os sistemas, as composições e os méto- dos desta revelação produzem imagens de qualidade surpreendente- mente alta das células em um fluxo. Em um aspecto, o analisador vi- sual pode ser usado nos métodos desta revelação para produzir con- tagens diferenciais de GB automatizadas e baseadas em imagens. Em certas modalidades, os métodos da presente revelação referem-se à identificação automatizada de distinções visuais, incluindo característi- cas e/ou anormalidades morfológicas para a determinação, o diagnós- tico, o prognóstico, a previsão e/ou a fundamentação do diagnóstico de que o paciente está saudável ou tem uma doença, quadro, anorma- lidade e/ou infecção, além do monitoramento da resposta ou da au- sência de resposta de um paciente ao tratamento. O sistema pode compreender adicionalmente um contador de partículas em algumas modalidades. As aplicações incluem a categorização e/ou a subcate- gorização e a contagem de células em uma amostra de fluido, como uma amostra de sangue. Outros usos semelhantes para a contagem de outros tipos de partículas e/ou de partículas em outras amostras de fluido também estão contemplados. O sistema, as composições e os métodos desta invenção podem ser usados para a categorização e a subcategorização em tempo real e para a visualização de imagens usando qualquer algoritmo de reconhecimento automatizado de partí- culas adequado. As imagens capturadas para cada amostra podem ser armazenadas para que sejam visualizadas posteriormente.
[0051] Em um outro aspecto, os aparelhos, as composições e os métodos desta invenção proporcionam categorização, subcategoriza- ção e identificação de células baseadas em imagens surpreendente- mente mais precisas, o que reduz a taxa de revisão manual em com- paração com a do uso de analisadores automáticos. Os sistemas, as composições e os métodos reduzem a taxa de revisão manual e per- mitem que a revisão manual seja realizada no próprio instrumento. Além disso, os sistemas, as composições e os métodos da presente revelação reduzem ainda o percentual das amostras com identificação de necessidade de revisão manual durante a análise automatizada.
[0052] A presente revelação refere-se ademais a sistemas, méto- dos e composições para combinar um contador de células sanguíneas com um analisador, como um analisador visual, de modo a obter um HC e uma contagem diferencial de glóbulos brancos expandida base- ada em imagens e uma contagem de plaquetas expandida baseada em imagens, estendendo, assim, a faixa de detecção efetiva para a contagem de plaquetas.
[0053] Dessa forma, em algumas modalidades, a presente revela- ção fornece um aparelho e um método para analisar uma amostra con- tendo partículas, por exemplo, células sanguíneas. De acordo com a presente revelação, um analisador visual é fornecido para obter ima- gens de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido. Em algumas modalidades, o analisador visual compreende uma célula de fluxo e um componente de focalização automática, em que é provocado o fluxo de uma amostra de líquido contendo partícu- las de interesse através de uma célula de fluxo com uma porta de vi- sualização, por meio da qual uma câmera acoplada a uma lente objeti- va captura imagens das partículas. A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido da amostra, como uma amostra de sangue diluída e/ou tratada, ou outra amostra de fluido corporal, conforme descrito aqui, e a uma fonte de um fluido de revestimento transparente ou líquido de alinhamento de organelas intracelulares e/ou partículas (PIOAL).
[0054] Em uma modalidade, o aparelho compreende também um contador de partículas com ao menos uma faixa de detecção, assim como um analisador e um processador. O analisador e o processador são configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de contagem, categorização e subcategorização associados ao contador de partículas, e ainda para determinar a contagem exata de partículas ou a concentração de diferentes categorias e/ou subcatego- rias de partículas na amostra.
[0055] A presente revelação fornece métodos e composições úteis para o alinhamento de organelas intracelulares e/ou partículas na con- dução de análise de amostras baseadas em imagens. Em algumas modalidades, a revelação refere-se a métodos e composições para um sistema combinado de obtenção de imagens e contagem com a capa- cidade de realizar um hemograma completo (HC) e uma contagem di- ferencial de glóbulos brancos (GB) baseada em imagens que seja ca- paz de identificar e contar tipos de células, como GB, GV e/ou plaque- tas, incluindo, por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófi- los, basófilos, reticulócitos, GV nucleados, blastos, promielócitos, mie- lócitos ou metamielócitos, além de fornecer informações baseadas em imagens para contagens e morfologias de GB, para contagens e mor- fologias de glóbulos vermelhos (GV) e para contagens e morfologias de plaquetas (PLT).
[0056] Em outras modalidades, a presente revelação refere-se a um PIOAL que pode ser usado na análise baseada em imagens de partículas, como descrito no presente pedido. A contagem de catego- rias e/ou subcategorias de células em amostras de sangue é usada na presente revelação como exemplo não limitador dos tipos de amostras que podem ser analisados. Em algumas modalidades, as células pre- sentes nas amostras também podem incluir células de bactérias ou de fungos, e também glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e/ou plaque- tas. Em algumas modalidades, suspensões de partículas obtidas de tecidos ou aspirados podem ser analisadas.
[0057] A discriminação de células sanguíneas em uma amostra de sangue é uma aplicação exemplificadora para a qual o objeto é parti- cularmente conveniente. A amostra é preparada por técnicas automa- tizadas e apresentada a um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica na forma de uma corrente de amostra em formato de fita; as imagens são obtidas periodicamente à medida que a amos- tra flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (co- mo das células sanguíneas) podem ser distinguidas umas das outras, caracterizadas, subcategorizadas e/ou contadas usando técnicas de processamento de dados de pixel da imagem programadas, por meio exclusivamente automatizado ou com assistência humana limitada, para identificar e contar as células ou partículas. Além das imagens das células, que podem ser armazenadas e disponibilizadas caso as partículas tenham características atípicas ou críticas, os dados forne- cidos incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria específica de célula ou partícula distinguida nas imagens de amostra gravadas. As contagens das diferentes partículas obtidas para cada imagem podem ser ulteriormente processadas, por exem- plo, usadas para acumular razões proporcionais, ou funções, precisas e estatisticamente significativas das células de cada categoria e/ou subcatogoria distinguida pela amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual também pode ser altamente diluída, mas as proporções de células em cada categoria e/ou subcategoria são representadas na distribuição da amostra diluída, particularmente de- pois que inúmeras imagens tiverem sido processadas.
[0058] Em alguns aspectos, a apresentação, a obtenção de ima- gens e a análise das amostras são todas automatizadas. No caso de amostras de sangue, a amostra pode ser diluída substancialmente com um diluente adequado ou uma solução salina, o que reduz a di- mensão em que algumas células poderiam ser ocultadas pelas outras células em uma amostra não diluída ou menos diluída. As células po- dem ser tratadas com agentes que reforçam o contraste de alguns as- pectos celulares, usando, por exemplo, agentes permeabilizantes, pa- ra tornar as membranas celulares permeáveis, e colorações histológi- cas, para aderirem às células e revelar seus aspectos, como grânulos, e o núcleo. Em algumas modalidades, pode ser desejável colorir uma alíquota da amostra para contar e caracterizar partículas, incluindo re- ticulócitos, eritrócitos nucleados e plaquetas, e para a análise, a carac- terização e o diferencial de glóbulos brancos. Em outras modalidades, as amostras contendo glóbulos vermelhos podem ser diluídas antes da introdução na célula de fluxo e a obtenção de imagens.
[0059] Os pormenores do aparelho de preparação da amostra e os métodos para a diluição, a permeabilização e a coloração histológica da amostra são, de modo geral, realizados com o uso de bombas e válvulas de precisão operadas por um ou mais controladores progra- máveis, não sendo fundamentais para a presente revelação. Os exemplos podem ser encontrados em patentes concedidas à Internati- onal Remote Imaging Systems, Inc., como a US 7.319.907, que diz respeito a controles programáveis. Da mesma forma, as técnicas para distinguir determinadas categorias e subcategoria celulares com base em seus atributos, como tamanho relativo e cor, podem ser encontra- das no documento US 5.436.978 em conjunto com os glóbulos bran- cos. As revelações dessas patentes estão aqui incorporadas mediante a referência.
[0060] Para facilitar a capacidade, a velocidade e a eficácia com as quais as partículas, como as células, são categorizadas e/ou subca- tegorizadas, é vantajoso produzir imagens de alta qualidade nítidas das células sanguíneas para a análise automatizada por meio do sis- tema de processamento de dados. De acordo com a presente revela- ção, uma corrente de amostra é disposta no formato de uma fita del- gada com uma posição estável entre as paredes opostas de uma célu- la de fluxo. O posicionamento da corrente da amostra e seu adelga- çamento até o formato de uma fita delgada pode ser realizado pela introdução, na célula de fluxo, de um fluxo entre camadas de um PIO- AL que tenha viscosidade diferente da do fluido da amostra e que seja levado através de um canal de fluxo simétrico.
[0061] O PIOAL tem viscosidade e densidade adequadas, e as vazões no ponto da introdução na célula de fluxo da amostra são tais que o fluido da amostra adelgaça-se até formar uma fita delgada. A corrente de amostras em formato de fita é transportada em conjunto com o PIOAL até que passe em frente a uma porta de visualização, onde estão dispostas uma lente objetiva e uma fonte de luz para per- mitir a visualização da corrente da amostra em formato de fita. O fluido da amostra é introduzido, por exemplo, por injeção, em um ponto em que o caminho de fluxo do PIOAL estreita-se simetricamente. Como resultado, a corrente do fluido da amostra é adelgaçada e estirada até que forme uma fita delgada. Um PIOAL da presente revelação pode ser usado como fluido de revestimento em qualquer analisador visual da presente revelação. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser intro- duzido em uma extremidade da célula de fluxo para transportar o fluido da amostra no sentido da descarga.
[0062] A dimensão da corrente de amostra em formato de fita na zona de visualização é afetada pelo adelgaçamento geométrico do caminho de fluxo do PIOAL e pela velocidade linear diferencial do flui- do da amostra e do PIOAL, resultando em adelgaçamento e estira- mento da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear diferencial inicial entre a amostra e o PIOAL pode variar de 0,5:1 a 5:1. A seção transversal do caminho de fluxo do PIOAL pode ser adelga- çada mediante a redução da sua altura por um fator de cerca de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 ou 200:1. Em uma modalida- de, o adelgaçamento geométrico é 40:1. Em uma modalidade, o adel- gaçamento geométrico é 30:1. Os fatores levados em conta são o tempo de trânsito através da célula de fluxo, a taxa desejada de produ- tividade das amostras, a obtenção de uma espessura da corrente da amostra em formato de fita comparável ao tamanho da partícula, a ob- tenção do alinhamento das partículas e organelas, a obtenção de con- teúdo focalizado das partículas, o equilíbrio da pressão, do fluxo e da viscosidade nos limites operacionais, a otimização da espessura da corrente da amostra em formato de fita, a obtenção da velocidade li- near desejada, considerações sobre as possibilidades de fabricação e os volumes da amostra e do PIOAL necessários.
[0063] O comprimento e o volume da cânula e o adelgaçamento da seção transversal podem ser selecionados para reduzir o período de instabilidade do fluxo da amostra, aumentando, assim, a produtivi- dade. Em algumas modalidades o período da instabilidade do fluxo pode ser inferior a cerca de 3, 2,75, 2,5, 2,25, 2, 1,75, 1,5 1,25 ou me- nor que cerca de 1 segundo. Uma cânula de volume menor também pode reduzir o tempo e o volume de diluente necessário para limpar a cânula entre corridas de amostras. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito através da célula de fluxo é 1, 2, 3 ou 4 segundos, ou qual- quer faixa entre qualquer desses tempos. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito pode ser inferior a 4, 3 ou 2 segundos.
[0064] As viscosidades e as vazões do fluido da amostra e do PI- OAL e o contorno da célula de fluxo são providenciados de modo que o PIOAL adelgace e estire o fluxo da amostra até que forme uma fita delgada consistente ao longo da zona de visualização em um local se- guro. A corrente do fluido da amostra pode ser comprimida até apro- ximadamente 2 a 3 μm em espessura de fluxo de fluido. Vários tipos de células sanguíneas têm diâmetros maiores que o da espessura da corrente. As forças de cisalhamento na direção paralela à direção do fluxo causam um aumento da projeção da imagem das partículas nas condições de obtenção de imagens no plano focal do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica e/ou fazem com que as estruturas intrapartícula, por exemplo, estruturas intracelulares, orga- nelas ou lobos sejam posicionadas, reposicionadas e/ou mais bem po- sicionadas de modo a ficarem substancialmente paralelas à direção do fluxo. A profundidade do campo do dispositivo de obtenção de ima- gens de alta resolução óptica é de até 7 μm, por exemplo, 1 a 4 μm.
[0065] A seção transversal do fluxo do PIOAL, ao carregar a cor- rente da amostra em formato de fita, é constante ao longo da zona de visualização em frente a uma porta de visualização à qual a lente obje- tiva é direcionada. A lente objetiva pode ser o componente objetivo de um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital. A corrente da amostra em formato de fita segue um caminho através da zona de visualização em uma posição conhecida e reproduzível no interior da célula de fluxo, por exemplo, a uma distância conhecida e repetível de duas paredes da célula de fluxo, e é descarregada a jusante.
[0066] As informações ópticas das partículas na amostra são de- tectadas por uma seção de detecção no analisador, quando a corrente da amostra em formato de fita é transportada através da zona de visu- alização em frente à porta de visualização, gerando, assim, dados das partículas/células contidas na amostra. O uso desse analisador permi- te a captura, o processamento, a categorização e a subcategorização e a contagem de células e/ou partículas contidas nas amostras. O lí- quido PIOAL pode ser preparado pela adição de um agente modifica- dor de viscosidade, um agente de tamponamento, um agente de ajuste do pH, um agente antimicrobiano, um modificador de força iônica, um tensoativo e/ou um agente quelante. Componentes funcionais e/ou re- cursos exemplificadores do analisador na presente revelação podem incluir, por exemplo, a capacidade de adquirir e/ou processar dados de análises de imagem, de processar coloração de amostras, de proces- sar imagens e/ou de identificar, contar e/ou categorizar e subcategori- zar partículas com base em imagens.
[0067] Em uma modalidade, a presente revelação baseia-se na descoberta surpreendente e inesperada de que a adição de uma quan- tidade adequada de um agente doador de viscosidade ao PIOAL me- lhora significativamente o alinhamento de partículas/células em uma célula de fluxo, levando a uma porcentagem mais alta de células ou componentes celulares focalizados e a imagens de qualidade mais alta das células e/ou partículas em fluxo. A adição do agente doador de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento em células como GV, o que melhora o alinhamento das células em um plano substancial- mente paralelo à direção do fluxo, resultando na otimização da ima- gem. Isso também resulta no posicionamento, no reposicionamento e/ou no melhor posicionamento das estruturas intrapartículas, das or- ganelas ou dos lobos em sentido substancialmente paralelo à direção do fluxo, resultando na otimização da imagem. O agente doador de viscosidade também reduz o desalinhamento das células, incluindo, de modo geral, mas sem limitação, as células que têm diâmetro menor que o da corrente de fluxo.
[0068] O alinhamento das células que têm diâmetro menor que o da corrente do fluxo, por exemplo, glóbulos vermelhos, pode ser obti- do, por exemplo, pelo aumento da viscosidade do PIOAL ou pelo au- mento da razão de velocidade do fluxo. Isso resulta no alinhamento dos GV paralelamente à direção do fluxo e ao plano focal FP (por exemplo como representado na Figura 4K). Em algumas modalidades, uma redução no desalinhamento dos GV e/ou uma melhora no ali- nhamento dos GV são obtidas pelo aumento da viscosidade do PIOAL.
[0069] A espessura da corrente da amostra em formato de fita po- de ser afetada pelas viscosidades relativas e pelas vazões do fluido da amostra e do PIOAL. A fonte da amostra e/ou a fonte do PIOAL, com- preendendo, por exemplo, bombas de deslocamento de precisão, po- dem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em va- zões controláveis para otimizar as dimensões da corrente da amostra em formato de fita, principalmente na forma de uma fita delgada com largura pelo menos igual à do campo de visão do dispositivo de obten- ção de imagens de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura imagem digital.
[0070] A seção transversal do fluxo do PIOAL, durante o transpor- te da corrente da amostra em formato de fita, é constante ao longo da zona de visualização em frente a uma porta de visualização à qual o dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica é direcio- nado. A corrente da amostra em formato de fita segue um caminho através da zona de visualização a uma distância conhecida e reprodu- zível das paredes anterior e posterior da célula de fluxo e é descarre- gada a jusante.
[0071] O termo dispositivo de obtenção de imagens de alta resolu- ção óptica pode incluir dispositivos capazes de obter imagens de partí- culas com distinções visuais suficientes para diferenciar as alterações e/ou aspectos morfológicos. Os dispositivos de obtenção de imagens de alta resolução óptica exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução óptica igual a 1 ou menos, incluindo, por exemplo, 0,4 a 0,5 um, como, por exemplo, 0,46 um.
[0072] Em algumas modalidades, as imagens obtidas em qualquer das composições e/ou métodos da presente invenção podem ser ima- gens digitalizadas. Em algumas modalidades, as imagens obtidas são imagens de microscopia. Em certas modalidades, as imagens podem ser obtidas manualmente. Em outras modalidades, ao menos parte do procedimento para obter imagens é automatizado. Em algumas moda- lidades, as imagens podem ser obtidas usando um analisador visual compreendendo uma célula de fluxo, um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura imagem digital, opcionalmente com um recurso de focalização automática.
[0073] Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relativas aos componentes do citosol, do núcleo celular e/ou dos com- ponentes nucleares da célula. Em uma modalidade, as imagens forne- cem informações referentes aos componentes granulares e/ou a ou- tros aspectos morfológicos da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relativas aos componentes do citosol, do núcleo e/ou dos componentes granulares da célula. As imagens e/ou os as- pectos dos grânulos e/ou do núcleo são decisivos para a categoriza- ção e a subcategorização da célula, independente ou combinadamen- te.
[0074] Em um aspecto dos métodos desta invenção, as células que entram em contato com a composição do agente de contraste das partículas e/ou de que são obtidas imagens são eritrócitos nucleados. Em ainda um outro aspecto, os métodos da presente invenção refe- rem-se a um método para realizar uma categorização ou subcategori- zação de glóbulos vermelhos baseada em imagem, que compreende: a) a obtenção de imagens de uma porção dos glóbulos vermelhos; e b) a determinação da morfologia dos glóbulos vermelhos das imagens obtidas. Como aqui usado, o termo glóbulos vermelhos (GV) pode in- cluir, por exemplo, eritrócitos normais ou anormais, reticulócitos, eritró- citos nucleados e /ou células infectadas por malária. Em algumas mo- dalidades, a obtenção de imagens é realizada usando o aparelho da presente revelação, como um aparelho que compreende um contador de partículas, um analisador visual e um processador.
[0075] Como aqui usado, um hemograma completo (HC) exempli- ficador pode incluir um painel de teste tipicamente solicitado por um médico ou por outro profissional médico que forneça informações so- bre as partículas e/ou células em uma amostra de sangue de um paci- ente. As células exemplificadoras que circulam na corrente sanguínea podem ser, de modo geral, divididas em três tipos: incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, glóbulos brancos (por exemplo, leucóci- tos), glóbulos vermelhos (por exemplo, eritrócitos) e plaquetas (por exemplo, trombócitos).
[0076] Como aqui usadas, contagens altas ou baixas anormais podem indicar a presença de uma doença, distúrbio e/ou condição. Dessa forma, um HC é um dos exames realizados com frequência na medicina, pois pode apresentar um panorama do quadro clínico geral do paciente. Consequentemente, um HC é usualmente realizado em exames físicos anuais.
[0077] Como usado aqui, tipicamente um flebotomista coleta a amostra de sangue do indivíduo, o sangue é, de modo geral, sugado para um tubo de ensaio que normalmente contém anticoagulante (por exemplo, EDTA, às vezes citrato) para impedi-lo de coagular. A amos- tra é então transportada para um laboratório. Às vezes, a amostra é coletada com uma punção no dedo, usando uma pipeta de Pasteur para o processamento imediato por um contador automatizado. Em uma modalidade, a imagem das partículas é adquirida enquanto a par- tícula está envelopada por um fluido de revestimento ou PIOAL. Em certas modalidades, a amostra de sangue pode ser visualizada em uma lâmina preparada com uma amostra do sangue do paciente em um microscópio (uma camada fina de sangue, ou um esfregaço perifé- rico). Em certas modalidades, o hemograma completo é realizado por um analisador automatizado.
[0078] Os analisadores sanguíneos usados no presente pedido podem, de modo geral, aspirar uma quantidade muito pequena de amostra por meio de uma tubulação estreita. Os sensores podem de- tectar a contagem e/ou o número de células que atravessam a tubula- ção e podem identificar o tipo de célula. Sensores exemplificadores podem incluir detectores de luz (por exemplo, visível, UV ou IV) e/ou impedância elétrica. Parâmetros de detecção exemplificadores podem incluir o tamanho, o volume e/ou aspectos celulares. Em certas moda- lidades, os sensores podem detectar luz visível e não visível em um espectro do comprimento de onda na faixa de cerca de 200 nm a cer- ca de 10.000 nm. Em certas modalidades, os sensores podem detec- tar um comprimento de onda entre cerca de 380 nm e cerca de 760 nm.
[0079] Quando usados no presente pedido, os dados/parâmetros de um hemograma podem incluir, por exemplo, eritrócitos totais; he- moglobina - a quantidade de hemoglobina no sangue; hematócrito ou volume do concentrado de hemácias (PCV); volume corpuscular médio (VCM) - o volume médio das células vermelhas (a anemia é classifica- da como microcítica ou macrocítica conforme este valor esteja acima ou abaixo da faixa normal. Outras condições que podem afetar o VCM incluem talassemia, reticulose e alcoolismo); hemoglobina corpuscular média (HCM) - a quantidade média de hemoglobina por glóbulo ver- melho em picogramas; concentração corpuscular média de hemoglo- bina (CHCM) - a concentração média de hemoglobina nas células; amplitude de distribuição dos glóbulos vermelhos (RDW) - a variação no volume celular da população de GV; glóbulos brancos totais; granu- lócitos neutrófilos (podem indicar infecção bacteriana, tipicamente au- mentados em infecções virais agudas). Devido ao aspecto segmenta- do de seu núcleo, os neutrófilos são, às vezes, chamados de "segs". O núcleo de neutrófilos menos maduros não é segmentado, mas tem um formato de bastão, ou alongado. Neutrófilos menos maduros — os que acabaram de passar da medula óssea à corrente sanguínea — são conhecidos como "bastonetes". Outros dados/parâmetros para um hemograma podem incluir ainda, por exemplo, linfócitos (por exemplo, aumentados com algumas infecções virais, como febre glandular, e na leucemia linfocítica crônica (LLC), ou diminuídos na infecção pelo HIV); monócitos (podem ser aumentados em infecções bacterianas, tuberculose, malária, febre maculosa das Montanhas Rochosas, leu- cemia monocítica, colite ulcerativa crônica e enterite regional; granuló- citos eosinófilos (por exemplo, aumentados em infecções parasíticas, asma ou reação alérgica); granulócitos basófilos (por exemplo, aumen- tados em quadros relacionados à medula, como leucemia ou linfoma.
[0080] Como aqui usado, o termo data/parâmetros de um hemo- grama também pode incluir, por exemplo, dados associados a plaque- tas, incluindo números de plaquetas, informações sobre o tamanho delas e sua variação de tamanho no sangue; o volume de plaquetas médio (VPM) - uma medição do tamanho médio das plaquetas.
[0081] Em um outro aspecto dos métodos desta invenção, as célu- las que são colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou de que são obtidas imagens são células anormais, como células infectadas pela malária, linfócitos atípicos. Em alguns aspectos desta invenção, as células são células anormais que podem ser usadas para identificar, prever, diagnosticar, prognosticar ou fundamentar um diagnóstico de um quadro, uma doença, uma in- fecção e/ou uma síndrome.
[0082] Em um outro aspecto dos métodos desta invenção, as célu- las são plaquetas.
[0083] Salvo indicação expressa em contrário, as referências a "partícula" ou "partículas" nesta revelação serão compreendidas como abrangendo qualquer objeto distinto ou formado disperso em um flui- do. Como aqui usado, o termo "partícula" pode incluir todos os compo- nentes mensuráveis e detectáveis (por exemplo, por imagem e/ou ou- tros parâmetros de medição) em fluidos biológicos. As partículas po- dem ser de qualquer material, formato e tamanho. Em certas modali- dades, as partículas podem compreender células. Exemplos de partí- culas incluem, mas não se limitam a, células, incluindo as células san- guíneas, células fetais, epiteliais, células-tronco, células tumorais ou bactérias, parasitas, ou fragmentos de qualquer dos exemplos anterio- res, ou outros fragmentos em um fluido biológico. As células sanguí- neas podem ser qualquer célula sanguínea, incluindo qualquer célula normal ou anormal, madura ou imatura, que possam estar presentes em um fluido biológico, por exemplo, glóbulos vermelhos (GV), glóbu- los brancos (GB), plaquetas (PLT) e outras células. Também estão in- cluídas células imaturas ou anormais. Os GB imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos, pró-mielócitos e blastos. Além dos GVs maduros, os GVs também podem incluir GV nucleados (NRBC) e reti- culócitos. As PLTs podem incluir PLTs gigantes e grumos de PLT. As células sanguíneas e os elementos formados são adicionalmente des- critos em outras seções da presente revelação.
[0084] As partículas exemplificadoras podem incluir elementos formados nas amostras de fluido biológico, incluindo, por exemplo, partículas esféricas e não esféricas. Em certas modalidades, as partí- culas podem compreender componentes não esféricos. A projeção da imagem de componentes não esféricos pode ser maximizada no plano focal do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica. Em certas modalidades, as partículas não esféricas estão alinhadas no plano focal do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica (alinhado em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo). Em algumas modalidades, as plaquetas, os reticulócitos, os GV nucleados e os GB, incluindo neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinó- filos, basófilos e os GB imaturos, incluindo blastos, promielócitos, mie- lócitos ou metamielócitos são contados e analisados como partículas.
[0085] Como aqui usado, o termo parâmetros de partículas detec- táveis e mensuráveis de partículas pode incluir, por exemplo, índices visuais e/ou não baseados em imagens de tamanho, formato, simetria, contorno e/ou outras características.
[0086] A amostra pode ser uma amostra biológica isolada e/ou preparada, incluindo, por exemplo, uma amostra de fluido corporal, uma amostra de sangue, soro, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal, saliva, líquido seminal, lágrimas, suor, leite, líquido amniótico, fluido de lavagem, aspirado de medula óssea, efusões, ex- sudados ou outra amostra obtida de um indivíduo (por exemplo, amos- tra de biópsia tratada para produzir uma suspensão celular ou uma amostra de laboratório ou linha de produção que compreenda partícu- las). Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biópsia tratada para pro- duzir uma suspensão celular. A amostra também pode ser uma sus- pensão obtida do tratamento de uma amostra de fezes. Uma amostra também pode ser uma amostra de laboratório, produto químico, de in- dústria ou linha de produção compreendendo partículas, como uma amostra de cultura celular. O termo amostra pode ser usado em refe- rência a uma amostra obtida de um paciente ou laboratório ou qual- quer fração, porção ou alíquota dela. A amostra pode ser diluída, divi- dida em porções ou tratada com um agente de contraste em alguns processos.
[0087] Os métodos revelados na presente invenção são aplicáveis para amostras de uma ampla variedade de organismos, incluindo ma- míferos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), cavalos, vacas ou outro tipo de rebanho, cães, gatos ou outros mamíferos mantidos como animais de estimação, ra- tos, camundongos ou outros animais de laboratório; aves, por exem- plo, galinhas; répteis, por exemplo, jacarés; peixes, por exemplo, sal- mão e outras espécies criadas em cativeiro; e anfíbios.
[0088] As amostras podem ser obtidas por qualquer método con- vencional, por exemplo, excreção, coleta, cultura, aspirado ou biópsia. A amostra pode ser de um indivíduo considerado saudável, por exem- plo, uma amostra coletada como parte de um exame físico de rotina. A amostra também pode ser de um indivíduo que tenha determinado dis- túrbio, que indique suspeita de tê-lo contraído ou que esteja em risco de contraí-lo. O distúrbio pode ser o resultado de uma doença, de uma anormalidade genética, de uma infecção, de uma lesão ou de causas não conhecidas. Alternativa ou adicionalmente, os métodos podem ser úteis para o monitoramento de um indivíduo durante o curso do trata- mento de um distúrbio. Quando houver sinais de ausência de resposta a um tratamento e/ou terapia, um médico pode escolher um agente alternativo ou adjuntivo. Dependendo do quadro do indivíduo e do dis- túrbio em particular, se houver algum, as amostras podem ser coleta- das uma vez (ou duas vezes, ou três vezes, etc.) por dia, por semana, por mês ou por ano.
[0089] As partículas podem variar dependendo da amostra. As partículas podem ser células biológicas, por exemplo, células sanguí- neas, células fetais, células-tronco, células tumorais ou fragmentos delas. Em algumas modalidades, as partículas podem ser um agente infeccioso, por exemplo, um vírus ou bactéria.
[0090] A referência a "células sanguíneas" na presente revelação será entendida como abrangendo qualquer célula normal ou anormal, madura ou imatura que possa estar presente em um fluido biológico, por exemplo, glóbulos vermelhos (GV), glóbulos brancos (GB), plaque- tas (PLTs) e outras células. No geral, GV, PLT e GB normais têm par- tículas com diâmetro na faixa de 6 a 8 μm, 2 a 3 μm e 8 a 15 μm, res- pectivamente. GV, PLT e GB normais estão presentes nas amostras de sangue total de pacientes normais em uma faixa de concentração de aproximadamente 3,9 a 5,7 x 1012 células/L, 1,4 a 4,5 x 1011 célu- las/L, 3,5 a 11 x 109 células/L, respectivamente. Consulte, Barbara J. Bain, Blood Cells, A Practical Guide, 4th ed., Blackwell Publishing, 2007, 34-36.
[0091] A referência a um "elemento formado" será entendida como abrangendo elementos não fluidos presentes nas amostras de fluido biológico. Os elementos formados incluem, por exemplo, as classes de células sanguíneas baseadas em classificação científica ou função fi- siológica, incluindo eritrócitos (GV), leucócitos (GB) e plaquetas (PLTs), grumos de GB, subclasses de leucócitos, que incluem linfóci- tos maduros e leucócitos imaturos, como monócitos, neutrófilos, eosi- nófilos, basófilos. O termo "elementos formados", quando usado na presente invenção, incluirá também partículas como micro- organismos, bactérias, fungos, parasitas ou seus fragmentos ou frag- mentos de outras células. Os principais elementos dos GBs incluem, mas não se limitam a, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Também estão incluídas células imaturas ou anormais. Por exemplo, GBs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos, pró- mielócitos. Além dos GVs maduros, os GVs também podem incluir GV nucleados (NRBC) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs nor- mais e PLTs "gigantes", cujo tamanho é parecido com o tamanho dos GBs normais. A referência a um "elemento" ou a "elementos" de uma categoria e/ou subcategoria de partículas na presente revelação será entendida como abrangendo partículas individuais em uma mesma categoria ou subcategoria de partículas.
[0092] Salvo indicação expressa em contrário, a referência a uma "categoria" de partículas na presente revelação será entendida como abrangendo um grupo de partículas detectado mediante o uso de ao menos um critério de detecção medido, detectado ou derivado, como o tamanho, o formato, a textura ou a cor. Em algumas modalidades, os elementos de ao menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas contadas pelo aparelho da presente revelação será o mesmo tipo de elemento formado.
[0093] Essas partículas podem ser detectadas em um "canal. " A referência ao "canal" nesta revelação será entendida como abrangen- do uma porção do contador de partículas que compreende um detector acoplado a uma fonte de sinal e produz uma saída que varia com a maior ou menor detecção de partículas de acordo com pelo menos um critério de detecção de canal. Por exemplo, um critério de detecção de canal pode ser baseado no tamanho ou no volume das partículas. Em algumas modalidades, o número de canais em um contador de partí- culas é igual a um. Em algumas outras modalidades, o número de ca- nais em um contador de partículas é igual a dois ou mais.
[0094] Uma categoria e/ou subcategoria de partículas detectada em um canal de um contador de partículas pode compreender diferen- tes classes e subclasses de partículas e elementos de partículas agru- pados em duas ou mais subclasses. A referência a uma "categoria" de partículas nessa revelação será entendida como abrangendo um gru- po de partículas correspondente aos critérios medidos, detectados ou derivados, como o tamanho, o formato, a textura ou a cor. Em algumas modalidades, os elementos de ao menos uma categoria e/ou subcate- goria de partículas contadas pelo aparelho da presente revelação será o mesmo tipo de elemento formado.
[0095] Como aqui usado, o termo dispositivo de obtenção de ima- gens de alta resolução óptica pode incluir dispositivos capazes de ob- ter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para dife- renciar as alterações e/ou aspectos morfológicos. Os dispositivos de obtenção de imagens de alta resolução óptica exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução óptica igual a 1 ou menos, in- cluindo, por exemplo, 0,4 a 0,5 um, como, por exemplo, 0,46 um.
[0096] Como usadas no presente pedido, as composições de agente de contraste podem ser adaptadas para o uso em combinação com um líquido de alinhamento de organelas intracelulares e/ou partí- culas (PIOAL) em um analisador visual para a análise de partículas em uma amostra de um indivíduo. O PIOAL exemplificador é útil, como exemplo, nos métodos para o reconhecimento automatizado de dife- rentes tipos de partículas em uma amostra de um indivíduo.
[0097] Em um outro aspecto, as células podem estar envelopadas em PIOAL na obtenção das imagens. São aqui descritos líquidos de alinhamento de organelas intracelulares adequados exemplificadores.
[0098] Como aqui usado, o termo "alinhamento" pode ser caracte- rizado em parte pelo alinhamento de partículas esféricas e não esféri- cas. Por exemplo, partículas como partículas não esféricas podem ser alinhadas em um plano substancialmente paralelo com a direção do fluxo. Em certas modalidades, o alinhamento das partículas não esfé- ricas é caracterizado pela orientação do aumento das partículas em uma projeção da imagem das partículas não esféricas em condições de obtenção de imagens no plano focal do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica. As partículas, como as partículas esféricas, podem ter um aumento na quantidade de conteúdo intrapar- tícula das partículas e células que é focalizado, o que pode ser eficaz para gerar distinções visuais para a categorização e a subcategoriza- ção das partículas. As estruturas intrapartículas, como as partículas esféricas, podem ser posicionadas, reposicionadas e/ou mais bem po- sicionadas para que fiquem substancialmente paralelas à direção do fluxo. Por exemplo, as estruturas, organelas ou lobos intracelulares também podem ser posicionados, reposicionados e/ou mais bem posi- cionados para que fiquem substancialmente paralelos à direção do flu- xo.
[0099] A referência a uma "classe" de partículas na presente reve- lação será entendida como abrangendo um grupo de partículas base- ado na classificação científica. Há, por exemplo, três classes principais de células sanguíneas em uma amostra de amostra de sangue total, incluindo GV, GB e PLT.
[00100] A referência um "elemento" ou a "elementos" de partículas na presente revelação será entendida como abrangendo partículas em uma categoria ou subcategoria de partículas. Por exemplo, cada cate- goria de células sanguíneas pode ser dividida ainda em subcategorias ou elementos. Os principais elementos dos GBs incluem, mas não se limitam a, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Também estão incluídas células imaturas ou anormais. Por exemplo, os GBs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos e pró- mielócitos. Além dos GVs maduros, os GVs também podem incluir GV nucleados (NRBC) e reticulócitos. As PLTs podem incluir PLTs nor- mais e PLTs "gigantes", cujo tamanho é parecido com o tamanho dos GBs normais.
[00101] A referência A "células imaturas" será entendida como abrangendo as células em um certo estágio de desenvolvimento, por exemplo, no interior da medula óssea ou pouco depois de serem libe- radas pela medula óssea, mas antes de completarem seu desenvolvi- mento até uma célula madura.
[00102] A referência a "células anormais" será entendida como abrangendo células com características morfológicas irregulares ou células associadas a determinada doença ou quadro, ou irregularida- des associadas que possam, em alguns casos, estar associadas a de- terminadas doenças ou quadros. Os exemplos dessas doenças inclu- em, mas não se limitam a, eritrocitose, policitemia, anemia, eritroblas- topenia, leucocitose, leucopenia, linfocitose, linfocitopenia, granulocito- se, granulocitopenia ou agranulocitose, neutrofilia, neutropenia, eosi- nofilia, eosinopenia, basofilia, basopenia, trombocitose, trombocitope- nia e pancitopenia. Uma dada classe de células pode aumentar ou di- minuir na corrente sanguínea. Em algumas condições, há células anormais, muito maiores que os glóbulos brancos normais, em uma pequena concentração em uma amostra de sangue. Variações no ta- manho, formato, cor e/ou estruturas intracelulares podem estar asso- ciadas a certas doenças ou condições.
[00103] A referência a "contagem" de partículas nesta revelação será entendida como abrangendo os números de partículas obtidos de um canal de um contador de partículas. A referência à "concentração" de uma classe ou um elemento das partículas nesta revelação será entendida como os números das partículas por unidade de volume (por exemplo, por litro) ou por amostra de um volume conhecido. Por exemplo, um contador de partículas pode produzir contagens, ou con- centrações, ou outras contagens de categorias de partículas baseadas na função, enquanto que um analisador visual pode produzir conta- gens, concentrações, razões ou outros parâmetros baseados na con- centração para cada categoria ou subcategoria de partículas.
[00104] A referência a "razão" nesta revelação será entendida como abrangendo qualquer razão quantitativa e/ou proporcional de duas ca- tegorias/subcategorias, classes ou elementos de partículas. Exemplos dessa razão incluem, mas não se limitam a, uma razão em termos de concentração, peso e/ou número das partículas. Tipicamente, a razão refere-se a uma fração numérica entre a contagem de uma categoria, classe ou elemento e a contagem de outra dessas categorias, classe ou elemento. Em algumas modalidades, também podem ser obtidas determinações que usam contagens proporcionais ou razões pondera- das e/ou proporcionais.
Hematologia - Sistema de análise de partículas
[00105] Voltando agora aos desenhos, a Figura 1 mostra esquema- ticamente uma célula de fluxo exemplificadora 22 para o transporte de um fluido da amostra através da zona de visualização 23 de um dispo- sitivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica 24 em uma configuração para a obtenção de imagens de partículas microscópicas em uma corrente de fluxo da amostra 32 usando processamento de imagem digital. A célula de fluxo 22 é acoplada a uma fonte 25 de flui- do da amostra, que pode ter sido submetida a processamento, como o contato com uma composição de agente de contraste de partículas e aquecimento. A célula de fluxo 22 também é acoplada a uma ou mais fontes 27 de um líquido de alinhamento de organelas intracelulares e/ou partículas (PIOAL), como uma solução de glicerol transparente com uma viscosidade maior que a do fluido da amostra.
[00106] O fluido da amostra é injetado através de uma abertura achatada na extremidade distal 28 de um tubo de alimentação de amostra 29 e chega ao interior da célula de fluxo 22 em um ponto em que o fluxo do PIOAL já foi estabelecido substancialmente, resultando em um fluxo laminar estável e simétrico do PIOAL acima e abaixo da corrente da amostra em formato de fita (ou em seus lados opostos). As correntes da amostra e do PIOAL podem ser fornecidas por bombas medidoras de precisão que movem o PIOAL com o fluido da amostra injetado ao longo do caminho de fluxo, que se estreita substancialmen- te. O PIOAL envolve e comprime o fluido da amostra na zona 21 onde o caminho de fluxo se estreita. Por isso, a diminuição na espessura do caminho de fluxo na zona 21 pode contribuir para uma focalização ge- ométrica da corrente da amostra 32. A fita do fluido da amostra 32 é envolvida e transportada com o PIOAL a jusante da zona do estreita- mento 21, passando em frente, ou através dela de algum outro modo, da zona visualização 23 do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica 24, onde as imagens são obtidas, por exemplo, usan- do um CCD 48. O processador 18 pode receber, como entrada, dados de pixel do CCD 48. A fita de fluido da amostra flui junto ao PIOAL até a descarga 33.
[00107] Conforme mostrado aqui, a zona de estreitamento 21 pode ter uma porção proximal do caminho de fluxo 21a com uma espessura proximal PT e uma porção distal do caminho de fluxo 21b com uma espessura distal DT de modo que a espessura distal DT seja inferior à espessura proximal PT. O fluido da amostra pode, portanto, ser injeta- do através da extremidade distal 28 do tubo de amostra 29 em um lo- cal que é distal à porção proximal 21a e proximal à porção distal 21b. Dessa forma, o fluido da amostra pode entrar no envelope do PIOAL à medida que a corrente de PIOAL é comprimida pela zona 21. Onde o tubo de injeção de fluido da amostra tem uma porta de saída distal através da qual o fluido da amostra é injetado no fluido de revestimen- to em fluxo, sendo a porta de saída distal limitada pela diminuição no tamanho do caminho de fluxo da célula de fluxo.
[00108] O dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica digital 24 com lente objetiva 46 é dirigido no sentido de um eixo óptico que cruza a corrente da amostra em formato de fita 32. A dis- tância relativa entre a objetiva 46 e a célula de fluxo 33 pode ser varia- da pela operação de um motor 54 para revelar e coletar imagens digi- talizadas focalizadas em um arranjo de fotossensores.
[00109] De acordo com algumas modalidades, o sistema pode ope- rar para a focalização hidrodinâmica da fita de fluido da amostra 32. O termo focalização hidrodinâmica pode referir-se a um efeito de focali- zação que é influenciado por uma diferença de viscosidade entre os fluidos de revestimento e da amostra, uma zona de transição da célula de fluxo em que há estreitamento geométrico e uma diferença de velo- cidade entre os fluidos de revestimento e da amostra. O fluxo hidrodi- nâmico resulta da diferença de velocidade entre as correntes do fluido da amostra e do fluido de revestimento, que afeta a espessura e o formato da fita do fluxo.
Célula de fluxo
[00110] Uma modalidade prática da célula de fluxo 22 é descrita em mais detalhe nas Figuras 2 e 3. Conforme mostrado aqui, a célula de fluxo 22 pode ser acoplada a uma fonte de amostra 25 e também a uma fonte 27 de um material PIOAL. O fluido da amostra é injetado na célula de fluxo 22 através da cânula 29, por exemplo, através de uma porta de saída distal 31 da cânula 29. Tipicamente, o fluido de reves- timento PIOAL não está em estado de fluxo laminar à medida que per- corre uma seção de canal curva 41 na célula de fluxo, da fonte 27 à zona de visualização 23. Entretanto, a célula de fluxo 22 pode ser con- figurada de modo que o fluido de revestimento PIOAL seja ou fique laminar, ou apresente um perfil de velocidade constante, à medida que atravessa a porta de saída distal 31 onde o fluido da amostra é intro- duzido no fluido de revestimento em fluxo. O fluido da amostra e o PI- OAL podem fluir ao longo da célula de fluxo 22 em uma direção indi- cada, de modo geral, pela seta A, e, então, sair da célula de fluxo 22 pela descarga 33. Uma célula de fluxo 22 define um caminho de fluxo interno 20 que se estreita simetricamente (por exemplo na zona de transição 21) na direção do fluxo A. A simetria do caminho de fluxo contribui para um fluxo robusto e centralizado da corrente da amostra. A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envolvido pelo PIOAL através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo, precisamente atrás da porta de visualização 57. Associado à porta de visualização 57 há um padrão de focalização au- tomática 44. A célula de fluxo 22 tem, também, uma sede arredondada ou rebaixada 58, que é configurada para aceitar ou receber a objetiva de um microscópio (não mostrada).
[00111] De acordo com algumas modalidades, o padrão de focali- zação automática 44 pode ter uma posição fixa com relação à célula de fluxo 22, localizada a uma distância de deslocamento do plano da corrente da amostra em formato de fita 32. Na modalidade mostrada aqui, o padrão de focalização automática (alvo 44) é aplicado direta- mente na célula de fluxo 22, em um local visível em uma imagem cole- tada pela porta de visualização 57, por um dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica (não mostrado). A célula de fluxo 22 pode ser construída em uma peça única de material. Alternativamente, a célula de fluxo 22 pode ser composta por uma primeira seção ou camada, ou seção ou camada superior, 22a e uma segunda seção ou camada, ou seção ou camada inferior, 22b. Conforme mostrado aqui, um caixilho de janela de vidro ou transparente 60 é fixado na primeira seção 22a, ou é parte integrante dela. O caixilho 60 pode definir ao menos uma porção do caminho de fluxo da amostra no interior da cé- lula de fluxo. A luz provinda da fonte de luz 42 pode viajar através de uma abertura ou passagem do padrão de focalização automática 44, de modo a iluminar as partículas da amostra em fluxo no interior da corrente de fluxo 32.
[00112] Em alguns casos, a espessura do caixilho 60 pode ter um valor na faixa de cerca de 150 μm a cerca de 170 μm. Como observa- do acima, o caixilho 60 pode definir o canal do caminho de fluxo ou do revestimento (por exemplo, PIOAL) ou fazer parte dele. Mediante o uso de um caixilho delgado 60, é possível colocar a objetiva do mi- croscópio muito próximo da fita do fluido da amostra e, assim, obter imagens amplificadas das partículas em fluxo ao longo do caminho de fluxo.
[00113] A Figura 3A representa aspectos de uma modalidade de célula de fluxo em que uma distância entre o eixo de obtenção das imagens 355 e a porção distal da zona de transição 316 tem cerca de 8,24 mm. Uma distância entre a porção distal da zona de transição 316 e a porta de saída da cânula 331 tem cerca de 12,54 mm. Uma distância entre a porta de saída da cânula 331 e a entrada do fluido de revestimento 301 tem cerca de 12,7 mm. Uma distância entre a porta de saída da cânula 331 e uma porção proximal da zona de transição 318 tem cerca de 0,73 mm. A Figura 3B representa aspectos de uma modalidade de célula de fluxo em que a porta de saída da cânula foi movida para um local mais distal em relação à zona de transição em comparação com a modalidade da Figura 3A. Conforme mostrado aqui, a extremidade distal da cânula é avançada no interior da zona de transição da célula de fluxo em que há estreitamento, e uma distância entre o eixo de obtenção de imagens 355 e a porção distal da zona de transição 316 está numa faixa de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em alguns casos, a distância entre o eixo de obtenção de imagens 355 e a porção distal da zona de transição 316 tem cerca de 21 mm.
[00114] Novamente com referência à Figura 1, o contorno interno da célula de fluxo (por exemplo na zona de transição 21) e as vazões do PIOAL e da amostra podem ser ajustados de modo que a corrente da amostra adquira o formato de fita 32. A corrente pode ser aproxi- madamente tão delgada quanto as partículas envolvidas pela corrente da amostra em formato de fita, ou mesmo mais delgada que elas. Os glóbulos brancos podem ter diâmetro em torno de 10 μm, por exemplo. Ao dotar a corrente da amostra em formato de fita de uma espessura inferior a 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente em formato de fita for estirada pelo fluido de revestimento ou PIOAL. Surpreendentemente, o estiramento da corrente da amostra em forma- to de fita ao longo de um caminho de fluxo em que há estreitamento no interior das camadas do PIOAL com viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, como uma viscosidade mais alta, ten- de, vantajosamente, a alinhar partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção do fluxo e a aplicar forças nas cé- lulas, melhorando o conteúdo focalizado das estruturas intracelulares das células. O eixo óptico do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica 24 é substancialmente normal (perpendicular) ao plano da corrente da amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente da amostra em formato de fita no ponto da obtenção de imagens pode ser, por exemplo, 20 a 200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente da amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, 50 a 150 mm/segundo.
[00115] A espessura da corrente da amostra em formato de fita po- de ser afetada pelas viscosidades relativas e pelas vazões do fluido da amostra e do PIOAL. A fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do PIOAL, compreendendo, por exemplo, bombas de deslocamento de precisão, podem ser configuradas para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em va- zões controláveis para otimizar as dimensões da corrente da amostra em formato de fita 32, principalmente na forma de uma fita delgada com largura pelo menos igual à do campo de visão do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica 24.
[00116] Em uma modalidade, a fonte 27 do PIOAL é configurada para fornecer o PIOAL com uma viscosidade predeterminada. Essa viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra e pode ser mais alta que a viscosidade da amostra. A viscosidade e a densidade do PIOAL, a viscosidade do material da amostra, a vazão do PIOAL e a vazão do material da amostra são coordenadas para manter a cor- rente da amostra em formato de fita na distância de deslocamento no padrão de focalização automática e com características dimensionais predeterminadas, como uma espessura de corrente de amostra em formato de fita.
[00117] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear mais alta que a da amostra e uma viscosidade mais alta que a da amostra, estirando, assim, a amostra até que forme a fita achatada. A viscosidade do PIOAL pode ser de até 10 centipoise.
[00118] Também com referência às Figuras 2 e 3, o caminho de fluxo interno da célula de fluxo estreita-se a jusante do ponto de inje- ção da corrente da amostra em formato de fita no interior do PIOAL para produzir uma espessura da corrente da amostra em formato de fita, por exemplo, com até 7 μm, e/ou o caminho de fluxo interno pro- duz uma largura de corrente da amostra em formato de fita de 500 a 3.000 μm. Em modalidades exemplificadoras, como representadas na Figura 1, o caminho de fluxo interno da célula de fluxo começa inicia uma zona de transição com estreitamento a montante do ponto de in- jeção da corrente da amostra no PIOAL.
[00119] Em uma outra modalidade o caminho de fluxo interno es- treita-se para produzir uma espessura da corrente da amostra em for- mato de fita de 2 a 4 μm, e/ou o caminho de fluxo interno resulta na corrente da amostra em formato de fita com 2.000 μm de largura. Es- sas dimensões são particularmente úteis para a hematologia. A es- pessura da corrente nesse caso é inferior ao diâmetro de algumas par- tículas, como os glóbulos vermelhos, em seu estado relaxado. Conse- quentemente, essas partículas podem ser reorientadas de modo que sua dimensão mais larga fique voltada para o eixo de obtenção de imagens, o que é útil para revelar as características distintivas.
[00120] A velocidade linear da corrente da amostra em formato de fita pode ser suficientemente limitada para impedir borrões de movi- mento na imagem digitalizada no tempo de exposição da imagem do arranjo de fotossensores. A fonte de luz pode, opcionalmente, ser uma luz estroboscópica, disparada para aplicar uma alta amplitude inciden- te por um curto período de tempo. Na medida em que o padrão de fo- calização automática 44 e a imagem estão no mesmo campo de visão, a fonte de luz é configurada para iluminar a corrente da amostra em formato de fita e o padrão de focalização automática simultaneamente. Entretanto, em outras modalidades, o campo de visão para a obtenção de imagens e para a focalização automática podem ser diferentes, por exemplo, com iluminação e/ou obtenção de imagens separadas.
[00121] As evoluções no campo têm aspectos relacionados ao mé- todo e aspectos relacionados ao aparelho. Um método de focalizar um analisador visual compreende a focalização de um dispositivo de ob- tenção de imagens de alta resolução óptica 24, que pode ser um dis- positivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica digital ou o dispositivo de captura imagem digital, em um padrão de focalização automática 44, fixo relativamente a uma célula de fluxo 22, estando, o padrão de focalização automática 44, localizado a uma distância de deslocamento 52 da corrente da amostra em formato de fita 32. O dis- positivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica digital 24 tem uma lente objetiva com um eixo óptico que cruza a corrente da amostra em formato de fita 32. Uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo 22 é alterada pela operação de um motor 54, ao passo que a distância ao longo do eixo óptico entre o dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica e o ponto do foco ideal é conhecida. O dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica digital é configurado para revelar e coletar uma imagem digitali- zada em um arranjo de fotossensores. O motor é operado para focali- zar o padrão de focalização automática em um processo de focaliza- ção automática. O motor é, então, operado ao longo da distância de deslocamento, focalizando, assim, o dispositivo de obtenção de ima- gens de alta resolução óptica na corrente da amostra em formato de fita.
[00122] O método pode incluir ainda a conformação da corrente da amostra em formato de fita até que adquira um formato de fita. O for- mato de fita é apresentado de modo que o eixo óptico do dispositivo de obtenção de imagens de alta resolução óptica esteja substancial- mente perpendicular à corrente da amostra em formato de fita, mais especificamente normal ao plano da corrente em formato de fita.
[00123] A Figura 4 representa aspectos de um sistema 400 para a obtenção de imagens de partículas em uma amostra de sangue. Con- forme mostrado no presente pedido, o sistema 400 inclui um sistema de injeção de fluido da amostra 410, uma célula de fluxo 420 e um dis- positivo de captura de imagem 430 e um processador 440. A célula de fluxo 420 proporciona um caminho de fluxo 422 que transmite um fluxo do fluido de revestimento, opcionalmente, em combinação com o fluido da amostra. De acordo com algumas modalidades, o sistema de inje- ção do fluido da amostra 410 pode incluir uma cânula ou um tubo 412, ou estar acoplado a uma cânula ou um tubo. O sistema de injeção do fluido da amostra 410 pode estar em comunicação fluida com o cami- nho de fluxo 422 (por exemplo, por meio de uma entrada de fluido da amostra 402) e pode operar para injetar o fluido da amostra 424 atra- vés de uma porta de saída distal 413 da cânula 412 e para o interior de um fluido de revestimento em fluxo 426 no interior da célula de flu- xo 420 de modo a propiciar uma corrente de fluido da amostra 428. Por exemplo, o processador 440 pode incluir um meio de armazena- mento, ou estar em associação operacional com um meio de armaze- namento que tenha um aplicativo de computador configurado para, ao ser executado pelo processador, fazer com que o sistema de injeção do fluido da amostra 410 injete o fluido da amostra 424 no fluido de revestimento em fluxo 426. Como mostrado no presente pedido, o flui- do de revestimento 426 pode ser introduzido na célula de fluxo 420 por um sistema de injeção de fluido de revestimento 450 (por exemplo, por meio da entrada do fluido de revestimento 401). Por exemplo, o pro- cessador 440 pode incluir um meio de armazenamento, ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tenha um aplicativo de computador configurado para, ao ser executado pelo processador, fazer com que o sistema de injeção do fluido de revesti- mento 450 injete o fluido de revestimento 426 na célula de fluxo 420.
[00124] A corrente do fluido da amostra 428 tem uma primeira es- pessura T1 adjacente ao tubo de injeção 412. O caminho de fluxo 422 da célula de fluxo tem uma diminuição no tamanho do caminho de flu- xo tal que a espessura da corrente do fluido da amostra 428 diminui da espessura inicial T1 para uma segunda espessura T2 adjacente a um ponto de captura de imagens 432. O dispositivo de captura de imagem 430 é alinhado com o ponto de captura de imagens 432 para obter imagens de uma primeira pluralidade de partículas do primeiro fluido da amostra no ponto de captura de imagens 432 da célula de fluxo 420.
[00125] O processador 440 é acoplado ao sistema de injeção do fluido da amostra 410, ao dispositivo de captura de imagem 430 e, op- cionalmente, ao sistema de injeção de fluido de revestimento 450. O processador 440 é configurado para terminar a injeção da primeira amostra de fluido no fluido de revestimento em fluxo 426 e começar a injeção do segundo fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo 426, de modo que os transientes do fluido da amostra sejam ini- ciados. Por exemplo, o processador 440 pode incluir, ou estar em as- sociação operacional, um meio de armazenamento com um aplicativo de computador que esteja configurado para, ao ser executado pelo processador, fazer com que o sistema de injeção do fluido da amostra 410 injete o segundo fluido da amostra no fluido de revestimento 426, de modo que os transientes do fluido da amostra sejam iniciados.
[00126] Adicionalmente, o processador 440 é configurado para ini- ciar a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade de partícu- las do segundo fluido da amostra no ponto de captura de imagens 432 da célula de fluxo 420 depois dos transientes do fluido da amostra e em até 4 segundos após a obtenção de imagens da primeira pluralida- de de partículas. Por exemplo, o processador 440 pode incluir, ou es- tar em associação operacional, um meio de armazenamento com um aplicativo de computador que esteja configurado para, ao ser executa- do pelo processador fazer com que o dispositivo de captura de ima- gem 430 inicie a captura de imagens de uma segunda pluralidade de partículas do segundo fluido da amostra no ponto de captura de ima- gens 432 da célula de fluxo 420 depois dos transientes do fluido da amostra e em até quatro segundos após a obtenção de imagens da primeira pluralidade de partículas.
[00127] Conforme mostrado na modalidade da célula de fluxo re- presentada na Figura 4A, uma diminuição no tamanho da célula de fluxo (por exemplo na zona de transição 419a) pode ser definida por paredes opostas 421a, 423a do caminho de fluxo 422a. As paredes opostas 421a, 423a podem inclinar-se radial e internamente ao longo do caminho de fluxo 422a, de modo geral simetricamente em relação a um plano transversal 451a que divide a corrente do fluido da amostra 428a em duas partes. O plano 451a pode dividir a corrente da amostra em duas partes 428a, tendo, a corrente da amostra, uma primeira es- pessura T1 no local em que a corrente da amostra 428a sai por uma porção distal 427a da cânula ou do tubo de injeção da amostra 412a. De modo similar, o plano 451a pode dividir a corrente da amostra 428a em duas partes, tendo, a corrente da amostra, uma segunda espessu- ra T2 no local em que a corrente da amostra 428a atravessa o ponto de captura de imagens 432a. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor de cerca de 150 μm, e a segunda espessura T2 tem um valor de cerca de 2 μm. Em tais casos, a razão de compressão da corrente em fita da amostra é 75:1. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor na faixa de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm, e uma segunda espessura T2 tem um valor na faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Conforme o fluido da corrente da amostra flui através da célula de fluxo, a fita adelgaça-se à medida que acelera e é estirada. Duas características da célula de fluxo podem contribuir para o adelgaçamento da fita do fluido da amostra. Em primeiro lugar, uma diferença de velocidade en- tre o envelope do fluido de revestimento e a fita do fluido da amostra pode operar para reduzir a espessura da fita. Em segundo lugar, a ge- ometria afunilada da zona de transição pode operar para reduzir a es- pessura da fita.
[00128] Como representado na Figura 4A (assim como nas Figu- ras 4 e 4B-1), a zona de transição 419a pode ser definida por transi- ções inclinadas nas porções proximal (415a) e distal (416a). Também é compreendido que a zona de transição 419a pode, em vez disso, apresentar transições suaves ou curvas nas porções proximal (415a) e distal (416a), semelhantes às transições suaves ou curvas representa- das nas Figuras 1, 3, 3A, 3B e 4B-2).
[00129] Tipicamente, a primeira espessura T1 é muito maior que o tamanho das partículas, e, assim, as partículas estão inteiramente contidas nos limites da corrente em fita da amostra. Entretanto, a se- gunda espessura T2 pode ser menor que o tamanho de determinas partículas da amostra e, desse modo, as partículas podem estender-se ao exterior do fluido da amostra e até o fluido de revestimento que as circunda. Como mostrado na Figura 4A, a corrente em fita da amostra pode fluir, de modo geral, ao longo de um mesmo plano conforme dei- xa a cânula e se dirige ao ponto de captura de imagens.
[00130] A célula de fluxo também pode proporcionar uma distância de separação 430a entre a porção distal da cânula 427a e o ponto de captura de imagens 432a. De acordo com algumas modalidades, a porção distal 427a do tubo de injeção de fluido da amostra 412a pode ser posicionada a uma distância de separação axial 430a do ponto de captura de imagens 432a, com a distância de separação axial 432a tendo um valor de cerca de 21 mm. Em alguns casos, a distância de separação axial 430a tem um valor na faixa de cerca de 16 mm a cer- ca de 26 mm.
[00131] A distância de separação axial 430a entre a porta de saída da cânula e o ponto de captura de imagens pode impactar o tempo de transição para o fluido da amostra à medida que o fluido vai da porta de saída ao ponto de captura de imagens. Por exemplo, uma distância de separação axial relativamente menor 430a pode contribuir para um tempo de transição menos, e uma distância de separação axial relati- vamente mais longa 430a pode contribuir para um tempo de transição mais longo.
[00132] A posição da porta de saída na porção distal da cânula 427a relativamente à zona de transição do caminho de fluxo 419a ou relativamente à porção proximal 415a da zona de transição do cami- nho de fluxo 419a também pode interferir no tempo de transição para o fluido de amostra à medida que o fluido vai da porta de saída ao ponto de captura de imagens. Por exemplo, o fluido de revestimento pode ter uma velocidade relativamente mais lenta na porção proximal 415a e uma velocidade relativamente mais rápida em um local entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a. Assim, se, por um lado, a porta de saída da cânula na porção distal 427a estiver posicionada na por- ção proximal 415a, levará um período maior de tempo para que o flui- do da amostra alcance o ponto de captura de imagens, não apenas porque a distância do percurso é maior, mas também pelo fato de que a velocidade inicial do fluido da amostra depois de deixar a porta distal da cânula é menor (em razão da menor velocidade do fluido de reves- timento). Dito de outro modo, quanto mais tempo o fluido da amostra permanece na porção mais espessa (por exemplo perto da porção proximal 415a) da célula de fluxo, mais tempo leva para que a amostra alcance o ponto de captura de imagens. Se, por outro lado, a porta de saída da cânula na porção distal 427a estiver posicionada distalmente em relação à porção proximal 415a (por exemplo, em um local central entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a, como represen- tado na Figura 4A), levará menos tempo para que o fluido da amostra alcance o ponto de captura de imagens, não apenas porque a distân- cia do percurso é menor, mas também porque a velocidade inicial do fluido da amostra depois que ele deixa a porta distal da cânula é maior (em decorrência da maior velocidade do fluido de revestimento). Como discutido em outras seções do presente pedido, o fluido de revesti- mento é acelerado à medida que flui através da zona de transição 419a em decorrência do estreitamento da área da seção transversal da zona 419a.
[00133] De acordo com algumas modalidades, com um tempo de transição menor, há mais tempo disponível para a coleta de imagens no ponto de captura de imagens. Por exemplo, à medida que a dura- ção do tempo de transição da ponta distal da cânula até a área de ob- tenção de imagens diminui, é possível processar mais amostras em um espaço de tempo específico e, desse modo, é possível obter mais imagens em um espaço de tempo específico (por exemplo, imagens por minuto).
[00134] Embora haja vantagens associadas ao posicionamento da porta de saída da porção distal da cânula 427a mais perto do ponto de captura de imagens 432a, é desejável, também, manter uma certa dis- tância entre a porta e o ponto de captura. Por exemplo, como repre- sentado na Figura 3, uma lente óptica objetiva ou frontal de um dispo- sitivo de obtenção de imagens pode ser posicionada na sede 58 da célula de fluxo 22. Se a porta de saída 31 da cânula estiver muito pró- xima da sede 58, o fluido da amostra pode, então, depois da injeção no fluido de revestimento, não ser estabilizado o suficiente para pro- porcionar as propriedades desejadas às imagens obtidas no ponto de captura de imagens. De modo similar, pode ser desejável manter a região de transição afunilada 21 a uma distância da zona de visualiza- ção 23, de modo que a região afunilada não interfira no posicionamen- to da sede 58, que recebe a objetiva do dispositivo de captura de ima- gem.
[00135] Ainda com referência à Figura 4A, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção de fluido da amostra 412a pode ser posicio- nada distalmente em relação a uma porção proximal 415a da zona de transição do caminho de fluxo 419a. Consequentemente, a extremida- de a jusante 427a do tubo de injeção de fluido da amostra 412a pode ser posicionada proximalmente em relação a uma porção distal 416a da zona de transição do caminho de fluxo 419a. Desse modo, de acordo com algumas modalidades, o fluido da amostra pode ser inje- tado da cânula de injeção 412a na célula de fluxo em um local nos li- mites da zona de transição 419a.
[00136] Conforme algumas modalidades, a simetria na diminuição do tamanho do caminho de fluxo (por exemplo na zona de transição do caminho de fluxo 419a) opera de modo a limitar o desalinhamento das partículas na amostra de sangue. Por exemplo, tal simetria pode ser eficaz para limitar o desalinhamento na orientação de obtenção de imagens dos glóbulos vermelhos na amostra de sangue a menos de cerca de 20%.
[00137] De acordo com algumas modalidades, os métodos revela- dos na presente invenção podem ser operados para que a taxa de identificação durante a análise do hemograma seja inferior a 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% das amostras.
[00138] Conforme algumas modalidades, o ponto de captura de imagens 432a tem um campo de visão 433a entre cerca de 150 μm x 150 μm e 400 μm x 400 μm. Em alguns casos, o ponto de captura de imagens 432a tem um campo de visão 433a de cerca de 275 μm x 275 μm. Em alguns casos, o campo de visão pode ser defi- nido em termos do produto do comprimento pela largura. Se for ex- presso em termos de área superficial, um campo de visão de 275 μm x 275 μm tem uma área de 75.625 μm2. De acordo com algumas moda- lidades, o campo de visão pode ser determinado pela objetiva do dis- positivo de obtenção de imagens e por sua ampliação. Em alguns ca- sos, o campo de visão pode corresponder à extensão do campo (área) que é capturada pelos elementos ópticos de coleta (por exemplo, obje- tiva, tubo extensor e câmera). Em alguns casos, o campo de visão é muito menor que a porta de visualização da área transparente no pon- to de captura de imagens.
[00139] As Figuras 4A-1 e 4A-2 ilustram os efeitos da focalização hidrodinâmica na corrente da amostra à medida que passa da porta de saída de cânula para o ponto de captura de imagens. Como mostrado na Figura 4A-1, a corrente da amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 150 μm e uma largura W(S) de cerca de 1.350 μm. Adicio- nalmente, a corrente de revestimento do PIOAL pode ter uma altura de H(P) de cerca de 6.000 μm e uma largura W(P) de cerca de 4.000 μm. Após a focalização hidrodinâmica, como mostrado na Figura 4A-2, a corrente da amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 2 μm e uma largura W(S) de cerca de 1.350 μm. Adicionalmente, a corrente de re- vestimento do PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca de 150 μm e uma largura W(P) de cerca de 4.000 μm. Em uma modalidade, a área da seção transversal da corrente de revestimento do PIOAL na saída da cânula é 40 vezes maior que a área da seção transversal próxima ao ponto de captura de imagens.
[00140] De acordo com algumas modalidades, pode ser útil deter- minar a seção transversal do canal da célula de fluxo no ponto de cap- tura de imagens. Ela pode corresponder à altura da corrente de reves- timento do PIOAL H(P) de cerca de 150 μm e à largura W(P) de cerca de 4.000 μm, como representado na Figura 4A-2. Também pode ser útil determinar a vazão volumétrica combinada da corrente do fluido da amostra e da corrente do fluido de revestimento através da célula de fluxo no ponto de captura de imagens. Quando a área da seção trans- versal e a vazão são conhecidas, é possível determinar a velocidade combinada do fluido da amostra e do fluido de revestimento no ponto de captura de imagens.
[00141] De acordo com algumas modalidades, o fluxo do fluido da amostra e do fluido de revestimento através da célula de fluxo pode ser parecido com o modelo de perfil de placas paralelas. Consequen- temente, a vazão no centro da corrente do fluido da amostra (por exemplo, como representada na Figura 4A-2) pode ser cerca de 1,5 vezes a vazão média da corrente do fluido da amostra e da corrente do fluido de revestimento combinadas.
[00142] De acordo com algumas modalidades, a área da seção transversal na saída da cânula (por exemplo W(S) x H(S) na Figura 4A-1) é 40 vezes maior que a área da seção transversal do fluxo da amostra no ponto de obtenção de imagens (por exemplo W(S) x H(S) na Figura 4A-2). A vazão volumétrica do fluido de revestimento na área de obtenção de imagens pode ser cerca de 45 μL/segundo. A va- zão volumétrica do fluido da amostra na área de obtenção de imagens pode ser cerca de 0,232 μL/segundo. Em alguns casos, a área da se- ção transversal da corrente de revestimento e da corrente da amostra combinadas no ponto de obtenção de imagens é 600.000 μm2. Em al- guns casos, a velocidade média da corrente de fluxo no ponto de ob- tenção de imagens é 75 mm/segundo.
[00143] A vazão ou a velocidade do fluxo podem ser determinadas como as que resultarem em imagens celulares nítidas e focalizadas. As vazões e velocidades de fluxo exemplificadoras foram descobertas com base nas vazões das duas amostras que se observou tomarem determinados certos formatos ou características de fita na corrente de fluxo da amostra ao passar pelo ponto de obtenção de imagens. Por exemplo, com uma vazão de cerca de 75 mm/s (ou numa faixa de 20 a 200 mm/s), as células não fluem muito tão lentamente a ponto de ha- ver sobreposição de células em imagens consecutivas, e as células não fluem tão rapidamente a ponto de serem criados efeitos-fantasma (imagem borrada). Consequentemente, ao evitar vazões excessiva- mente altas, é possível preservar mais o reagente e a amostra. De acordo com algumas modalidades, uma velocidade linear ideal ou de- sejada pode ser obtida alterando-se o fluxo volumétrico (velocidade da bomba) ou o formato da cânula.
[00144] A velocidade de fluxo da corrente da amostra através da zona de captura de imagens também pode estar relacionada ao de- sempenho do dispositivo de captura de imagem relativamente ao fun- cionamento da célula de fluxo. Por exemplo, se a corrente da amostra estiver fluindo muito rapidamente, pode ser difícil obter imagens nítidas das partículas contidas na amostra (por exemplo, a velocidade do ob- turador do dispositivo de captura de imagem pode ser muito lenta, produzindo, assim, uma imagem borrada). De modo similar, se a cor- rente da amostra estiver fluindo muito lentamente, o dispositivo de captura de imagem pode obter imagens consecutivas da mesma partí- cula (por exemplo, a mesma partícula permanece no quadro de captu- ra durante duas capturas de imagem). Em algumas modalidades, a velocidade da fita da amostra pode ser modulada (por exemplo, ajus- tando-se qualquer um de uma variedade de parâmetros operacionais da célula de fluxo) relativamente à velocidade de captura de imagens, de modo que haja um fluxo mínimo entre as capturas de quadros e, assim, sejam obtidas imagens de um alto percentual da amostra.
[00145] De acordo com algumas modalidades, o sistema de análise de partículas e os componentes associados podem ser configurados de modo que, à medida que o fluido de revestimento e o fluido da amostra fluem através da célula de fluxo, o fluido de revestimento po- de fluir com uma vazão volumétrica de fluido de revestimento igual a 45 μL/s, e o fluido da amostra pode fluir com uma vazão volumétrica de fluido da amostra de 0,232 μL/s (ou na faixa de 0,2 a 0,35 μL/s). Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra é cerca de 200. Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra tem um valor na faixa de cerca de 70 a 200. Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra é cerca de 193. Em alguns casos, a razão entre a vazão do fluido de revestimento e a vazão do fluido da amostra é cerca de 70. Em alguns casos, uma razão entre o volume do fluido de revestimento e o volume do fluido de amostra em fluxo no interior da célula de fluxo pode estar na faixa de 25:1 a 250:1.
[00146] De acordo com algumas modalidades, o sistema e os com- ponentes associados podem ser configurados de modo que, à medida que o fluido de revestimento e a amostra de fluido fluam através da célula de fluxo 420, o fluido de revestimento possa fluir com uma velo- cidade de fluido de revestimento de 75 mm/s antes da área de obten- ção de imagens e a amostra de fluido possa fluir com uma velocidade de amostra de fluido de 130 mm/s antes da área de obtenção de ima- gens. Em alguns casos, uma razão entre o volume do fluido de reves- timento e o volume do fluido de amostra em fluxo no interior da célula de fluxo pode estar na faixa de 100:1 a 200:1.
[00147] Em alguns casos, uma célula de fluxo pode ter uma razão de compressão mínima de cerca de 50:1 e uma razão de compressão máxima de cerca de 125:1. Em alguns casos, a razão de compressão mínima pode ser cerca de 30:1 ou 20:1. Essa razão de compressão refere-se à razão da espessura da corrente de fluxo H(S):H(S) ao se comparar a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2. Essa razão de compres- são pode ser influenciada por uma combinação de compactação geo- métrica (por exemplo, a razão da espessura do fluido de revestimento H(P):H(P) ao se comparar a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2, que também pode corresponder, de modo geral, às dimensões da zona de transição afunilada e com estreitamento da célula de fluxo 419a mos- trada na Figura 4A) e compressão hidrodinâmica (por exemplo, tam- bém correspondente a uma diferença na velocidade). De acordo com algumas modalidades, a razão de compressão geométrica é cerca de 40:1.
[00148] A diminuição no tamanho do caminho de fluxo, que corres- ponde à zona de transição, pode ser definida por uma porção proximal de caminho de fluxo com uma espessura ou altura proximal e uma porção distal do caminho de fluxo com uma espessura ou altura, infe- rior à espessura ou altura proximal. Por exemplo, conforme mostrado nas vistas parciais das Figuras 4B-1 e 4B-2, a zona de transição 419b do caminho de fluxo pode ter um comprimento L entre uma porção proximal 415b e uma porção distal 416b, tendo, a porção proximal 415b, uma altura proximal 417b, e tendo, a porção distal 416b, uma altura distal 418b. Como representado na Figura 4B-2 e conforme ob- servado em outras seções do presente pedido, o formato ou o contor- no da zona de transição podem ser curvos ou atenuados e pode, por exemplo, ter o formato de uma curva em S, uma curva sigmoidal ou uma curva tangente. De acordo com algumas modalidades, a altura proximal 417b tem um valor de cerca de 6.000 μm. Em alguns casos, a altura proximal 417b tem um valor na faixa de cerca de 3.000 μm a cerca de 8.000 μm. De acordo com algumas modalidades, a altura dis- tal 418b tem um valor de cerca de 150 μm. Em alguns casos, a altura distal 418b tem um valor na faixa de cerca de 50 μm a cerca de 400 μm.
[00149] A geometria da zona de transição 419a pode formar um primeiro ângulo α1 entre o primeiro contorno do caminho de fluxo 403b e o plano transversal que o divide ao meio 451b e um segundo ângulo α2 entre o segundo contorno do caminho de fluxo 404b e o plano transversal que o divide ao meio 451b. Em alguns casos, o ângulo α1 tem cerca de 45 graus, e o ângulo α2 tem cerca de 45 graus. Em al- guns casos, o ângulo α1 tem um valor na faixa de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. Em alguns casos, o ângulo α2 tem um valor na fai- xa de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. De acordo com algumas modalidades, os ângulos α1 e α2 têm o mesmo valor. Os ângulos α1 e α2 podem ser selecionados de modo a manter o fluxo laminar ou mi- nimizar a turbulência do fluido da amostra em seu trajeto da porção proximal 415b à porção distal 416b, que, por sua vez, pode aprimorar o alinhamento das partículas na amostra ao longo do plano transversal 451b. Conforme observado acima com referência à Figura 4A, os con- tornos ou porções distal e proximal da zona de transição podem ser curvos ou atenuados em vez de inclinados.
[00150] A Figura 4C representa recursos de uma cânula ou tubo de alimentação de amostra exemplificador 400c de acordo com as moda- lidades da presente invenção, tendo, a cânula, um comprimento L. A Figura 4D representa uma seção transversal longitudinal da cânula 400d. Conforme mostrado no presente pedido, a cânula 400d inclui uma seção distal adelgaçada 410d, uma seção central afunilada 420d e uma porção proximal tubular 430d. Como representado na Figura 4C-1, uma cânula ou tubo de alimentação de amostra exemplificador 400c-1 pode ter uma porção distal 410c-1 e uma porção proximal 430c-1. Em alguns casos, a porção distal 410c-1 tem um comprimento de cerca de 1.359 mm e uma largura de cerca de 1,43 mm. Em alguns casos, a porta de saída da extremidade distal tem uma largura de saí- da W(E) de cerca de 1.359 mm. De acordo com algumas modalidades, uma cânula pode ter uma geometria interna de caminho de fluxo dife- rente da representada nas Figuras 4C e 4D. Por exemplo, como ilus- trado na Figura 4D-1, a cânula 400d-1 não inclui uma seção central afunilada com uma seção transversal da área de fluxo expandida. Co- mo representado na Figura 4D-1, a cânula 400d-1 tem uma seção dis- tal 410d-1, uma seção central afunilada 420d-1 com um diâmetro in- terno afunilado e uma seção proximal 430d-1. Em consequência do diâmetro interno afunilado da seção central 420d-1, a área interna da seção transversal 410d-1 é menor que a área interna da seção trans- versal 430d-1.
[00151] A Figura 4E ilustra uma seção transversal de uma seção distal adelgaçada 410e. Conforme mostrado no presente pedido, a se- ção distal 410e tem largura interna W(I) e altura interna H(I), através das quais flui uma corrente de amostra. Adicionalmente, a seção distal 410e tem uma largura externa W(O) e uma altura externa H(O). Como mostrado nas Figuras 4D e 4E tomadas em combinação, a porção distal 410e do tubo de injeção de fluido da amostra tem uma porta da saída P com uma altura H(I) e uma largura W(I), sendo a altura H(I) menor que a largura W(I). De acordo com algumas modalidades, a al- tura H(I) da porta de saída P da porção distal 410e (ou a altura interna da porção distal 410d) pode ter um valor de cerca de 150 μm. Em al- guns casos, a altura H(I) pode estar na faixa de cerca de 50 μm a cer- ca de 250 μm. De acordo com algumas modalidades, a largura W(I) da porta de saída P da porção distal 410e (ou a largura interna da porção distal 410d) pode ter um valor de cerca de 1.350 μm. Em alguns ca- sos, a largura tem cerca de 1.194 μm. Em alguns casos, a largura W(I) pode ter um valor na faixa de cerca de 500 μm a cerca de 3.000 μm. Em alguns casos, a seção distal adelgaçada 410d pode ser produzida pela aplicação de uma força de preensão em um tubo ou conduto.
[00152] A Figura 4F ilustra uma seção transversal de uma seção central afunilada 420f. Conforme mostrado no presente pedido, a se- ção central afunilada 420f tem um diâmetro interno D(I) através do qual flui uma corrente de amostra. Adicionalmente, a seção central afunilada 420f tem um diâmetro externo D(O). A Figura 4G ilustra uma seção transversal de uma seção proximal 430g. Conforme mostrado no presente pedido, a seção proximal 430g tem um diâmetro interno D(I) através do qual flui uma corrente de amostra. Adicionalmente, a seção distal 430g tem um diâmetro externo D(O).
[00153] Como representado na Figura 4D, o tubo de injeção ou câ- nula 400d pode ter uma porção proximal 430d com uma primeira se- ção transversal de fluxo (por exemplo π*(D/2)2 mostrada na Figura 4G), uma porção distal 410d com uma segunda seção transversal de fluxo (por exemplo W(I)*H(I) mostrada na Figura 4E), inferior à primei- ra seção transversal de fluxo, e uma terceira porção 420d disposta en- tre a porção proximal 430d e a porção distal 410d. A terceira porção 420d pode ter uma terceira seção transversal de fluxo (por exemplo π*(D/2)2 mostrada na Figura 4F) maior que a primeira e a segunda seções transversais de fluxo. Em alguns casos, o diâmetro externo D(O) da porção proximal 430g é cerca de 1.067 μm, e o diâmetro in- terno D(I) da porção proximal 430g é cerca de 813 μm.
[00154] De acordo com algumas modalidades, uma porção proximal de um tubo de injeção pode ser acoplada a uma porta de amostra de um adaptador de entrada de amostra. Por exemplo, como mostrado na Figura 4H, uma porção proximal 405 h de uma cânula 400 h pode ser acoplada diretamente a uma porta de amostra 410 h em uma saída de um adaptador de entrada de amostra 420 h.
[00155] Uma célula de fluxo de um sistema para a obtenção de imagens de partículas em uma amostra de sangue pode ser orientada em qualquer ângulo ou direção desejados em relação à direção da for- ça da gravidade. Por exemplo, uma célula de fluxo pode ser orientada em uma direção ascendente, de modo que o fluido em fluxo na célula de fluxo (por exemplo, o fluido de revestimento, opcionalmente em combinação com o fluido da amostra) possa deslocar-se em uma dire- ção ascendente, contra a força da gravidade. Do mesmo modo, uma célula de fluxo pode ser orientada em uma direção descendente, de modo que o fluido em fluxo na célula de fluxo (por exemplo, o fluido de revestimento, opcionalmente em combinação com o fluido da amostra) possa deslocar-se em uma direção descendente, a favor da força da gravidade. A Figura 4I representa uma célula de fluxo 420i orientada em uma direção ascendente, de modo que o fluido da amostra 424i e o fluido de revestimento 426i em fluxo no interior da célula de fluxo 420i fluam contra a gravidade G. A Figura 4J representa uma célula de fluxo 420j orientada em uma direção descendente, de modo que o fluido da amostra 424j e o fluido de revestimento 426j em fluxo no inte- rior da célula de fluxo 420j não fluam contra a gravidade G, mas, em vez disso, a favor da gravidade G.
[00156] Como mostrado na Figura 4K, uma fita da corrente de amostra R em fluxo através de um ponto de captura de imagens 432 k de uma célula de fluxo 420 k pode ter uma espessura T de cerca de 2 μm. Em alguns casos, a espessura T da fita da corrente de amostra pode ter até cerca de 3 μm. Tipicamente, as células ou partículas que são menores que a espessura da corrente da amostra ficarão contidas na fita. Um glóbulo vermelho (GV) exemplificador pode estar presente na forma de um disco bicôncavo e pode ter um diâmetro D entre cerca de 6,2 μm e cerca de 8,2 μm. Adicionalmente, um glóbulo vermelho exemplificador pode ter uma espessura máxima T1 entre cerca de 2 μm e cerca de 2,5 μm e uma espessura mínima T2 entre cerca de 0,8 μm e cerca de 1 μm. Em alguns casos, os glóbulos vermelhos podem ter uma espessura de até cerca de 3 μm. As plaquetas humanas exemplificadoras podem ter tamanhos variados e também podem ter uma espessura ou diâmetro de cerca de 2 μm. Embora não esteja re- presentada em escala neste pedido, a célula de fluxo pode definir uma espessura de caminho de fluxo F com valor de cerca de 150 μm no ponto de captura de imagens. Em alguns casos, a espessura do cami- nho de fluxo F tem um valor entre 50 μm e 400 μm. Essa espessura do caminho de fluxo F também pode corresponder à altura distal 418b da porção distal 461b representada nas Figuras 4B-1 e 4B-2.
[00157] Como mostrado na Figura 4K, a razão entre a espessura T da corrente do fluido da amostra e a espessura da partícula (glóbulo vermelho) é cerca de 1:1. De acordo com algumas modalidades, uma razão entre a espessura T da corrente do fluido da amostra no ponto de captura de imagens e o tamanho de uma das partículas está numa faixa de 0,25 a 25. Em alguns casos, a espessura T pode ter um valor na faixa de 0,5 μm a 5 μm.
[00158] Como discutido em outras seções do presente pedido, as- sim como nos pedidos de patente US n° copendentes, as dife- renças de viscosidade entre o fluido da fita da amostra R e o fluido de revestimento podem operar para alinhar ou orientar as partículas em uma corrente de amostra, por exemplo, glóbulos vermelhos, ao longo da direção do fluxo. Quando alinhadas dessa maneira, como mostrado na Figura 4K, o dispositivo de obtenção de imagens ou câmera pode obter imagens dos glóbulos vermelhos de modo que apareçam redon- dos porque a maior superfície do glóbulo vermelho está voltada para a câmera. Desse modo, o glóbulo vermelho assume um alinhamento que apresenta uma resistência baixa em relação ao fluxo. Assim, as características de viscosidade relativa do fluido de revestimento e do fluido da amostra podem contribuir para que um alto percentual ou número de glóbulos vermelhos fiquem voltados para a câmera, apri- morando, assim, a capacidade de avaliação do sistema de análise de partículas.
[00159] De acordo com algumas modalidades, as características de viscosidade do fluido de revestimento operam de modo a limitar o de- salinhamento das partículas na amostra de sangue. Por exemplo, dife- renciais de viscosidade podem ser eficazes para limitar o desalinha- mento na orientação de obtenção de imagens dos glóbulos vermelhos na amostra de sangue a menos de cerca de 10%. Ou seja, 90 ou mais glóbulos vermelhos de cada 100 glóbulos vermelhos em uma amostra podem ser alinhados de modo que suas superfícies maiores estejam voltadas para o dispositivo de obtenção de imagens. Uma zona de transição com estreitamento simétrico pode proporcionar um valor de 20%. Como discutido nas outras seções do presente pedido, por exemplo com referência à Figura 4R, é possível comparar os resulta- dos de alinhamento obtidos com uma configuração de analisador que envolva uma zona de transição de célula de fluxo com estreitamento simétrico e um fluido de revestimento viscoso com os resultados de alinhamento obtidos com uma configuração de analisador que envolva uma zona de transição de célula de fluxo com estreitamento simétrico sem o uso de um fluido de revestimento viscoso. O uso de um fluido de revestimento viscoso pode reduzir o percentual de células desali- nhadas. De acordo com algumas modalidades, o fluido de revestimen- to tem um índice de refração similar ao da água (isto é, n = 1,3330). Em alguns casos, o fluido de revestimento tem teor de água da ordem de cerca de 89%. Em adição aos afeitos de alinhamento observados como resultado do diferencial de viscosidade, os efeitos de alinhamen- to também são observados como resultado de uma zona de transição com afunilamento bilateral. Em alguns casos, é observado que uma zona de transição com afunilamento bilateral (isto é, simétrica) é duas vezes mais eficaz no alinhamento das partículas se comparada a uma zona de transição com desenho de afunilamento assimétrico.
[00160] O alinhamento eficiente dos glóbulos vermelhos pode con- tribuir para melhorar o diagnóstico. Em alguns casos, o formato dos glóbulos vermelhos de que são obtidas imagens pode ser usado para determinar se o paciente de que foi obtida a amostra tem um quando ou uma doença em especial. Por exemplo, os pacientes com anemia falciforme têm células sanguíneas com formato anormal (isto é, em formato de foice). Assim, mediante a obtenção de imagens de alta qualidade dos glóbulos vermelhos alinhados, é possível garantir um diagnóstico preciso. Outras variações no formato dos glóbulos verme- lhos, por exemplo, de glóbulos vermelhos com área periférica delgada e área central grande e achatada, quando os glóbulos vermelhos pa- recem ter o perfil de um pneu de bicicleta, é possível obter, com eficá- cia, as imagens com o uso das técnicas de alinhamento instantâneo. De modo similar, de glóbulos vermelhos com porção central pequena e área periférica espessa, quando o glóbulo vermelho parece ter o perfil de um pneu de caminha, é possível obter imagens com propósitos di- agnósticos. As técnicas de obtenção de imagens aprimoradas revela- das no presente pedido também são úteis para avaliar outras caracte- rísticas dos glóbulos vermelhos, como o teor de hemoglobina, o teor de ferro e similares.
[00161] Sem limitar-se a qualquer teoria específica, acredita-se que um alto diferencial de viscosidade entre a viscosidade do fluido de re- vestimento e a viscosidade do fluido da amostra produz um perfil pa- rabólico modificado, com o perfil sendo, de modo geral, parabólico, e tendo uma saliência correspondente a uma área central do fluxo em que a aceleração é aumentada; a saliência central contribui para o ali- nhamento das partículas da amostra ou das organelas intrapartícula. De acordo com algumas modalidades, a diferença de velocidade entre o revestimento e a fita da amostra gera forças de cisalhamento para aumentar o alinhamento das organelas e das partículas intracelulares. Os aspectos exemplificadores do perfil parabólico do fluido de revesti- mento são discutidos no pedido de patente US n° copen- dente, cujo conteúdo é incorporado ao presente pedido mediante a referência.
[00162] Os glóbulos brancos são tipicamente maiores que os glóbu- los vermelhos e as plaquetas. Por exemplo, neutrófilos e eosinófilos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 10 μm e cerca de 12 μm. Basófilos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Linfócitos exemplificadores (peque- nos) podem ter um diâmetro entre cerca de 7 μm e cerca de 8 μm, e os linfócitos exemplificadores (grandes) podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Monócitos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 20 μm. A configura- ção do sistema de análise de partículas, incluindo a interação entre o fluido de revestimento e a fita da amostra de fluido à medida que atra- vessam a célula de fluxo, pode operar para comprimir os glóbulos brancos à medida que atravessam o ponto de captura de imagens 432l, como indicado na Figura 4L. Assim, por exemplo, uma porção central do glóbulo branco (GB) pode estar posicionada na fita do fluido da amostra R, e porções periféricas do glóbulo branco podem estar posicionadas no fluido de revestimento. Assim, à medida que o glóbulo branco é transportado através da célula de fluxo pela fita, os lados do glóbulo branco podem estender-se para o interior do fluido de revesti- mento. Os valores ou faixas numéricos para a espessura T da fita da corrente da amostra R e a espessura F do caminho de fluxo, como discutidos acima com respeito à Figura 4K, são aplicáveis de modo semelhante à Figura 4L.
[00163] De acordo com algumas modalidades, as diferenças de vis- cosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra podem operar para alinhar as organelas ou os outros aspectos intracelulares que estão presentes nas células, como nos glóbulos brancos. Sem li- mitar a nenhuma teoria em particular, acredita-se que as forças de ci- salhamento associadas ao diferencial de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra podem agir nos glóbulos brancos de modo a alinhar os aspectos intracelulares. Em alguns casos, as for- ças de cisalhamento associadas aos diferenciais de velocidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra podem contribuir para tal alinhamento. Esses efeitos do alinhamento também podem ser impac- tados pelo diferencial de tamanho entre as partículas e a fita do fluido da amostra. Por exemplo, quando porções das partículas estendem-se ao exterior da fita do fluido da amostra e ao interior do fluido de reves- timento circundante, as forças de cisalhamento associadas à diferença na viscosidade podem ter um efeito pronunciado no alinhamento dos aspectos intracelulares.
[00164] Com referência às Figuras 4K e 4L, em alguns casos, as porções da célula ou da partícula podem estender-se ao exterior da fita do fluido da amostra delgada R e ao interior do fluido de revesti- mento circundante. Conforme discutido no pedido de patente US n° copendente, o fluido de revestimento pode conter protetores ce- lulares que inibam ou que impeçam o rompimento ou a lise das células ou partículas pelo fluido de revestimento. Por exemplo, o fluido de re- vestimento pode conter protetores celulares que preservem a integri- dade estrutural das paredes celulares enquanto as células estiverem expostas ao meio químico do fluido de revestimento. De modo similar, os protetores celulares também podem operar para preservar a inte- gridade estrutural das paredes celulares enquanto às células estive- rem submetidas a forças de cisalhamento induzidas pela geometria da célula de fluxo e por uma diferença na velocidade e/ou na viscosidade do fluido da amostra e do fluido de revestimento. Consequentemente, os protetores podem proteger as células ou partículas das forças resul- tantes da diferença na velocidade do fluido da amostra e do fluido de revestimento. Desse modo, as células preservam sua viabilidade ao atingirem o ponto de captura de imagens.
[00165] As forças de cisalhamento podem ser significativas na inter- face entre a fita do fluido da amostra e o envelope do fluido de reves- timento. De acordo com algumas modalidades, o fluxo no interior do caminho de fluxo da célula de fluxo pode ser caracterizado por um per- fil de fluxo parabólico. A Figura 4L-1 representa aspectos exemplifica- dores dos perfis de fluxo parabólicos 400l-1a e 400l-1b. O perfil para- bólico 400l-1a no painel superior é um perfil de velocidade típico ob- servado nos fluxos no interior de determinadas modalidades de célula de fluxo da presente invenção (por exemplo, quando há pouco ou ne- nhum diferencial de viscosidade entre uma corrente de fluxo de um fluido de amostra envolvido no interior de uma corrente de fluxo do flu- ido de revestimento). Como pode ser visto, uma velocidade linear mais alta é observada no centro da corrente de fluido, velocidades lineares mais baixas são observadas próximo à parede da célula de fluxo. O perfil 400l-1a também pode ser observado na corrente de fluido com uma discreta diferença de viscosidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra. No caso de haver um diferencial de viscosidade alto entre as correntes de fluido de revestimento e de fluido da amos- tra, uma saliência central é observada, como mostrado no perfil 400l- 1b, quando há uma área central localizada com velocidades lineares amplificadas. De acordo com algumas modalidades, as partículas que são suficientemente grandes em termos de tamanho, serão submeti- das a alguma medida de forças de cisalhamento, mesmo quando tais partículas estiverem totalmente contidas em uma única fase do fluido (isto é, seja no interior do envelope do fluido de revestimento, seja, al- ternativamente, no interior da fita do fluido da amostra).
[00166] Em alguns casos, a velocidade do fluido de revestimento pode ser diferente da velocidade do fluido da amostra. Por exemplo, o fluido de revestimento pode estar se movendo a 80 mm/s, e o fluido da amostra pode estar se movendo a 60 mm/s. Dessa forma, em alguns casos, o fluido da amostra deixa a porta distal da cânula com uma ve- locidade de fluido da amostra menor que a velocidade do fluido de re- vestimento do envelope circundante. Assim, o fluido de revestimento pode operar de modo a conduzir o fluido da amostra ao longo do ca- minho de fluxo da cânula, acelerando, assim, o fluido da amostra e re- duzindo a espessura da fita do fluido da amostra. A fita do fluido da amostra mantém seu volume e massa totais, de modo que move-se mais rápido à medida que fica mais delgada. De acordo com algumas modalidades, tanto o fluido de revestimento como o fluido da amostra têm uma velocidade entre cerca de 20 e 200 mm/s no ponto de captu- ra de imagens.
[00167] Tipicamente, a velocidade do fluido da amostra aumenta à medida que o fluido da amostra se move da porta de saída da cânula ao ponto de captura de imagens. Em alguns casos, a velocidade do fluido da amostra no ponto de captura de imagens é 40 vezes a velo- cidade do fluido da amostra à medida que deixa a porta da cânula na porção distal da cânula. De acordo com algumas modalidades, a dimi- nuição na área da seção transversal da fita da amostra é linear ao au- mento na velocidade. De acordo com algumas modalidades, se a ve- locidade do revestimento na saída da cânula for mais alta que a velo- cidade da fita da amostra, ela também aumentara a velocidade final da fita da amostra na área de obtenção de imagens.
[00168] O fluido de revestimento pode operar de modo a aplicar for- ças de cisalhamento significativas na fita do fluido da amostra e nas partículas na fita do fluido da amostra. Algumas forças são paralelas à direção do fluxo, e as partículas também podem encontrar forças per- pendiculares à direção do fluxo. Frequentemente, à medida que o flui- do de revestimento e o fluido da amostra aproximam-se da zona ou ponto de captura de imagens, o fluido de revestimento e o fluido da amostra estão movendo-se com a mesma velocidade, ou com veloci- dades próximas. Desse modo, o limite ou interface entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra à medida que passam pelo ponto de captura de imagens pode apresentar forças de cisalhamento mais baixas se comparadas as do limite ou interface na porta de saída distal da cânula ou na zona de transição afunilada. Por exemplo, na zona de transição afunilada, o limite ou interface entre o envelope do fluido de revestimento e a fita do fluido da amostra pode estar em transição, de modo que a fita da amostra, que inicialmente é mais lenta e mais es- pessa, fica mais rápida e mais delgada, e as partículas no fluido da amostra ficam mais alinhadas. Dito de outro modo, as forças de cisa- lhamento podem ser proeminentes na zona de transição afunilada e podem dissipar-se na direção ao ponto de captura de imagens. As for- ças de cisalhamento no ponto de captura de imagens podem ser re- presentadas por um perfil parabólico e podem ser muito menores que as forças de cisalhamento na zona de transição afunilada. Com isso, as células ou partículas podem apresentar forças de cisalhamento maiores à medida que atravessam zona de transição e forças de cisa- lhamento menores à medida que atravessam o ponto de captura de imagens. De acordo com algumas modalidades, a diferença de visco- sidade entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra pode colo- car os glóbulos vermelhos em alinhamento e, consequentemente, no foco. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosida- de entre o fluido de revestimento e o fluido da amostra pode colocar as organelas dos glóbulos brancos em alinhamento e, consequentemen- te, no foco. Desse modo, é possível obter resultados aprimorados na obtenção de imagens dos componentes das células e das organelas alinhados e focalizados como resultado do estreitamento geométrico da corrente e da diferença de velocidade entre o fluido de revestimento e da amostra.
[00169] A Figura 4M representa um neutrófilo exemplificador 400m (um tipo de glóbulo branco) com organelas internas, como lobos 410m. Como resultado do diferencial de viscosidade entre o fluido da amostra e o fluido de revestimento, as organelas internas podem alinhar-se no interior da célula, como indicado na Figura 4N. Assim, é possível obter imagens das organelas intracelulares com eficácia usando um disposi- tivo de captura de imagem 430m sem que as organelas se sobrepo- nham umas às outras. Ou seja, em vez de os lobos estarem empilha- dos um sobre o outro, como representado na Figura 4M, quando vis- tos do eixo de obtenção de imagens, ou eixo óptico, do dispositivo de captura de imagem, os lobos estão alinhados e dispostos lado a lado, como representado na Figura 4N. Desse modo, os lobos podem ser visualizados na imagem capturada com mais eficácia. O alinhamento das organelas internas é um resultado surpreendente e inesperado do diferencial de viscosidade entre o fluido da amostra e o fluido de reves- timento.
[00170] Qualquer técnica de análise de partículas sanguíneas ou de hematologia dentre a variedade disponível pode ser executada usando imagens de um fluido da amostra em fluxo através de uma célula de fluxo. Frequentemente, a análise de imagens pode envolver a determi- nação de certos parâmetros de células ou partículas, ou a medição, a detecção ou a avaliação de certos aspectos de células e partículas. Por exemplo, a análise de imagens pode envolver a avaliação do ta- manho das células ou partículas, dos aspectos do núcleo da célula, dos aspectos do citoplasma da célula, dos aspectos das organelas in- tracelulares e semelhantes. Consequentemente, as técnicas de análi- se podem envolver certos métodos de contagem ou classificação ou testes diagnósticos, incluindo os diferenciais de glóbulos brancos (GB). Em alguns casos, as imagens obtidas usando a célula de fluxo podem permitir um leucograma diferencial de 5 partes. Em alguns casos, as imagens obtidas usando a célula de fluxo podem permitir um leuco- grama diferencial de 9 partes. Consequentemente, com referência à Figura 4, o processador 440 pode incluir um meio de armazenamento, ou estar em associação operacional com um meio de armazenamento que tenha um aplicativo de computador configurado para, ao ser exe- cutado pelo processador, fazer com que o sistema 400 diferencie dife- rentes tipos de células com base em imagens obtidas do dispositivo de captura de imagem. Por exemplo, técnicas de diagnóstico ou de exa- me podem ser usadas para diferenciar várias células (por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, metamielócitos, mielócitos, promielócitos e blastos).
[00171] A Figura 4O mostra uma comparação de imagens obtidas usando PIOAL com imagens obtidas usando um fluido de revestimento diferente de PIOAL. O uso do PIOAL resultou na focalização de mais conteúdo celular, como lobos, citoplasma e/ou grânulos. Neste exem- plo, um PIOAL compreendendo um agente doador de viscosidade (gli- cerol a cerca de 30%) foi usado para processar a amostra. O pH foi ajustado até um pH de cerca de 6,8 a 7,2, e a mistura da amostra foi tornada isotônica com (cloreto de sódio a 0,9 %). Os resultados mos- trados aqui demonstram a eficácia de um PILOL exemplificador usado em um analisador de imagens para alinhar células e organelas intrace- lulares.
[00172] As Figuras 4P e 4Q mostram uma comparação de imagens obtidas usando um fluido de revestimento convencional (Figura P pai- néis superior e inferior) com imagens obtidas usando um fluido PIOAL exemplificador (Figura 4Q painéis superior e inferior). Conforme mos- trado no presente pedido, o uso de PIOAL resultou em alinhamento melhorado dos GV. A amostra foi analisada usando um protocolo de focalização do instrumento (em um alvo exemplificador 44, como re- presentado na Figura 1), e o alvo foi levado ao foco por um analisador visual. O sistema de focalização foi, então, deslocado por uma distân- cia de deslocamento 52, resultando na focalização das partículas na corrente da amostra em formato de fita. A amostra de sangue foi diluí- da previamente usando um diluente da amostra. A amostra fluiu atra- vés de uma cânula e ao longo de um caminho de fluxo de uma célula de fluxo, gerando, assim, uma corrente da amostra em formato de fita (por exemplo, 2 mícrons de espessura) que estava entre as duas ca- madas de PIOAL ou revestimento convencional (nos controles). O analisador visual gera, então, as imagens focalizadas das partículas na corrente da amostra em formato de fita (por exemplo, a cerca de 60 quadros por segundo) que serão usadas para a análise. A amostra de sangue é obtida de um indivíduo e processada para a análise pelo analisador hematológico. As imagens dos GV em uma célula de fluxo são capturadas durante o processamento da amostra mediante o uso de um fluido de revestimento convencional ou um PIOAL. Os percen- tuais relativos demonstram melhora significativa no número de GV ali- nhados com base nos dados das imagens (por exemplo, 4P e 4Q). O resultado demonstrou que o PIOAL foi eficaz no aumento do percentu- al de alinhamento de GV durante o fluxo na corrente da amostra em formato de fita com o uso dos protocolos/instrumentos de focalização descritos no presente pedido.
[00173] Também foi observado que a implementação do PIOAL re- sultou em um alinhamento aprimorado com base no uso de níveis crescentes de glicerol (gli) em células de fluxo simétricas e assimétri- cas.
[00174] O gráfico na Figura 4R mostra o percentual de células não alinhadas obtido usando glicerol entre 0% e 30% no PIOAL, células de fluxo simétricas comparadas às assimétricas. O uso de glicerol a 30% no PIOAL e uma célula de fluxo simétrica resulta na redução do per- centual de células desalinhadas para apenas 8%. Vale observar que, sem glicerol no PIOAL e com a célula assimétrica, o percentual de cé- lulas desalinhadas aumentou para 87%. Assim, este gráfico demonstra o efeito do percentual de glicerol e da geometria da célula de fluxo no alinhamento das partículas (por exemplo, GV). A adição do glicerol di- minui o percentual de GVs desalinhados, seja no uso de geometria de célula de fluxo simétrica, seja no de assimétrica. O % de GV não ali- nhados foi reduzido de 87 % para 15 % nas células assimétrica e de 46% para 8% nas simétricas. Dessa forma, o gráfico apresenta uma comparação entre os resultados de desalinhamento (8%) obtidos de uma configuração de analisador que envolve uma zona de transição de célula de fluxo com estreitamento simétrico e um fluido de revesti- mento viscoso e os resultados de desalinhamento (46%) obtidos de uma configuração de analisador que envolve uma zona de transição de célula de fluxo com estreitamento simétrico sem o uso de um fluido de revestimento viscoso.
[00175] Esses resultados proporcionam evidências para a surpre- endente e inesperada descoberta de que certas composições de PIO- AL têm propriedades inesperadas no alinhamento de células e no re- posicionamento de estruturas intracelulares quando usadas para reali- zar a análise de partículas/células com base em imagens.
[00176] A título de exemplo, diversas formulações de PIOAL e mé- todos de uso exemplificadores foram desenvolvidos. Seguem alguns exemplos de formulações de PIOAL com as propriedades desejadas. O PIOAL compreende um diluente e ao menos um agente modificador da viscosidade.
[00177] A formulação de PIOAL exemplificadora A inclui uma solu- ção de glicerol a 30% (v/v) com 300 mL de glicerol e q.s. (quantidade suficiente ou para levar o volume final a) para 1 L, com o diluente con- tendo 9,84 g de sulfato de sódio, 4,07 g de cloreto de sódio, 0,11 g de cloridrato de procaína, 0,68 g de fosfato de potássio monobásico, 0,71 g de fosfato de sódio dibásico e 1,86 g de EDTA dissódico. A mistura inicial foi seguida por q.s. para 1 L com água deionizada e ajuste do pH em 7,2 com hidróxido de sódio.
[00178] A formulação de PIOAL exemplificadora B inclui uma solu- ção de glicerol a 6,5% (v/v) com 65 mL de glicerol e q.s. para 1 L, com o diluente exemplificador adequado contendo 9,84 g de sulfato de só- dio, 4,07 g de cloreto de sódio, 0,11 g de cloridrato de procaína, 0,68 g de fosfato de potássio monobásico, 0,71 g de fosfato de sódio dibásico e 1,86 g de EDTA dissódico. A mistura inicial foi seguida por q.s. para 1 L com água deionizada e ajuste do pH em 7,2 com hidróxido de só- dio.
[00179] A formulação de PIOAL exemplificadora C inclui uma solu- ção de glicerol a 5% (v/v) com 1% PVP (p/v) em tampão com 50 mL de glicerol, 10 g PVP (PM: 360.000), 1 pacote STF Sigma em pó em pH 7,4 (0,01 M de solução salina tamponada com fosfato; 0,138M cloreto de sódio; 0,0027M cloreto de potássio) e q.s. para 1 L com água deio- nizada.
[00180] A formulação de PIOAL exemplificadora D inclui uma solu- ção de PVP a 1,6% (p/v) com 16 g de PVP (PM: 360.000) e 1 pacote STF Sigma em pó em pH 7,4 (0,01 M de solução salina tamponada com fosfato; 0,138 M cloreto de sódio; 0,0027 M cloreto de potássio) e q.s. para 1 L com água deionizada.
Produtividade
[00181] A Figura 5 representa a linha de tempo 500 que corres- ponde à injeção de um ou mais fluidos da amostra em uma célula de fluxo. Conforme mostrado no presente pedido, a injeção de um primei- ro fluido da amostra pode ser iniciada em uma célula de fluxo, como indicado pela etapa 510. Depois disso, é possível obter imagens das partículas do primeiro fluido da amostra na célula de fluxo, como indi- cado pela etapa 515. De acordo com algumas modalidades, o primeiro fluido da amostra pode ter um volume na faixa de cerca de 5 μL a cer- ca de 150 μL. Em alguns casos, o fluxo é 0,232 μL/s (ou na faixa de 0,2 μL/s a 0,35 μL/s) na área de obtenção de imagens. A injeção do primeiro fluido da amostra pode ser encerrada, como indicado na eta- pa 520, e a injeção de um segundo fluido da amostra pode ser iniciada na célula de fluxo, como indicado pela etapa 530. Os transientes do fluido da amostra podem ser iniciados, como indicado pela etapa 535, como um resultado do encerramento da injeção do primeiro fluido da amostra e o início da injeção do segundo fluido da amostra. Subse- quentemente, os transientes do fluido da amostra na célula de fluxo podem dissipar-se, como indicado pela etapa 445. É possível obter imagens das partículas do segundo fluido da amostra na célula de flu- xo, como indicado pela etapa 550. A injeção do segundo fluido da amostra pode ser encerrada, como indicado pela etapa 560. Em al- guns casos, os procedimentos de injeção e fluxo são realizados em temperaturas na faixa de cerca de 18 °C a cerca de 40 °C.
[00182] Tipicamente, a corrente do fluido de revestimento continua a fluir no interior da célula de fluxo enquanto a amostra é injetada e quando a injeção é encerrada. Desse modo, de acordo com algumas modalidades, é mantido um fluxo contínuo de fluido de revestimento enquanto as injeções do fluido da amostra são injetadas intermitente- mente no revestimento em fluxo. O fluxo contínuo do fluido de revesti- mento pode contribuir para a preservação de um formato de fita no flu- ido da amostra à medida que o fluido da amostra flui ao longo da célu- la de fluxo.
[00183] De acordo com algumas modalidades, a captura de ima- gens associada à etapa 550 pode ser realizada em até quatro segun- dos da captura de imagem associada à etapa 515. De acordo com al- gumas modalidades, o tempo entre a primeira e a segunda injeção de fluidos da amostra (por exemplo, entre as etapas 510 e 530) é cerca de 30 segundos. Consequentemente, de acordo com algumas modali- dades, o tempo entre o início da obtenção de imagens do primeiro e do segundo fluidos da amostra (por exemplo, entre o início da etapa 515 e o início da etapa 550) é cerca de 30 segundos. Desse modo, é possível processar 120 fluidos de amostra por hora. Em alguns casos, um dispositivo de captura de imagem opera com uma velocidade de 180 quadros por segundo (qps), produzindo, assim, múltiplas imagens ou quadros consecutivos únicos com uma frequência ou velocidade alta. Conforme mostrado no presente pedido, a duração da etapa de obtenção de imagens (por exemplo, 515 ou 550) pode ser 15 segun- dos, produzindo, assim, 2.700 imagens por fluido da amostra.
[00184] Em alguns exemplos, o primeiro fluido da amostra chega a um estado estabilizado em cerca de 1 a 3 segundos após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido da amostra do tubo de in- jeção de fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo. Em al- guns exemplos, o primeiro fluido da amostra chega a um estado esta- bilizado em menos de 1 segundos após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido da amostra do tubo de injeção de fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo. A injeção da amostra na célula de fluxo pode ser um processo de duas etapas. De acordo com essa modalidade, a primeira etapa é uma purga de alta velocidade que expulsa todo o diluente da cânula e, depois da purga inicial, a vazão da amostra é reduzida significativamente. O tempo de transição pode ser definido como o tempo necessário para que a amostra (por exem- plo, uma célula) se mova da saída da cânula até a área de obtenção de imagens em condições de fluxo de obtenção de imagens (vazão da amostra mais lenta). Em alguns casos, pode levar cerca de 4 segun- dos para que o fluido da amostra se mova da saída da cânula a área de obtenção de imagens. Em alguns exemplos, o primeiro fluido da amostra chega a um estado estabilizado em cerca de 1,8 segundos após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido da amostra do tubo de injeção de fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo. Em alguns casos, o fluido da amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo (por exemplo, de uma porta de saída da câ- nula a um ponto de captura de imagens) na faixa de cerca de 2 a 4 segundos. Em alguns casos, o fluido da amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo na faixa de cerca de 1 a 4 segundos.
[00185] De acordo com algumas modalidades, leva entre cerca de 2 e cerca de 5 segundos para que um fluxo se estabilize ou se mova de uma porta de saída distal da cânula à área de obtenção de imagens. Em alguns casos, o período de duração da captura da imagem pode ter cerca de 20 segundos.
[00186] Um sistema de hematologia de acordo com as modalidades da presente invenção pode processar uma amostra de sangue com volume de cerca de 150 μL. O volume de sangue aspirado pode ser cerca de 120 a 150 μL. Em alguns casos, o volume mínimo de sangue disponível no tubo de ensaio é cerca de 500 μL para um modo de cole- ta automatizado e cerca de 250 μL para o modo de coleta manual. A cânula ou tubo de injeção 400d mostrada na Figura 4D tem um volu- me interno de cerca de 13 uL. De acordo com algumas modalidades, a cânula ou tubo de injeção tem um volume interno menor inferior a cer- ca de 30 uL. O volume da amostra de sangue é eficaz para purgar a cânula antes de iniciar a coleta de imagens e, assim, pode evitar lon- gos períodos de tempo com instabilidade do fluxo da amostra. Por exemplo, o uso de uma cânula com volume interno de cerca de 13 uL pode corresponder a um período de instabilidade no fluxo da amostra de cerca de 2 a 3 segundos. De acordo com algumas modalidades, o volume interno da cânula pode não impactar a estabilidade do fluxo da amostra. De acordo com algumas modalidades, o volume interno da cânula pode impactar a estabilidade da concentração celular na pró- pria fita da amostra se a purga inicial de amostra em alta velocidade for insuficiente para substituir todo o diluente no interior da cânula. Consequentemente, a cânula pode ser limpa entre uma amostra e ou- tra em um curto período de tempo, com o uso de uma pequena quan- tidade de diluente. Dessa maneira, é possível alcançar um fluxo de amostra estável, que facilita a captura de uma imagem de alta qualida- de, e, ao mesmo tempo, alcançar uma alta produtividade, com uma bai- xa persistência de resíduos. De acordo com algumas modalidades, uma cânula com um volume interno alto pode demandar um alto volume de purga inicial de amostra em alta velocidade para expulsar todo o diluen- te nas linhas e na cânula. As modalidades da presente invenção abran- gem a implementação de cânulas com volumes interno menores, os quais são adequados para as aplicações hematológicas em que os vo- lumes de amostra disponíveis são baixos e permitem a realização de uma purga de volume menos em um período de tempo menor.
[00187] De acordo com algumas modalidades, os sistemas de he- matologia podem ser configurados para limitar os transientes e a con- taminação cruzada de amostras sequenciais, tendo em vista aumentar a velocidade de captura de imagens das amostras de sangue.
Métodos
[00188] A Figura 6 representa aspectos de um método exemplifica- dor 600 para a obtenção de imagens de partículas em uma amostra de sangue, de acordo com modalidades da presente invenção Conforme mostrado aqui, a amostra de sangue 610 inclui partículas e pode ser dividida em um ou mais fluidos de amostra, como um primeiro fluido da amostra 612 contendo partículas e um segundo fluido da amostra 614 contendo partículas. O método pode incluir a promoção do fluxo de um fluido de revestimento ao longo de um caminho de fluxo de uma célula de fluxo, como indicado pela etapa 620. Adicionalmente, o método po- de incluir a injeção do primeiro fluido da amostra 612 de um tubo de injeção de fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo na cé- lula de fluxo, como indicado pela etapa 630, de modo a criar uma cor- rente de fluido da amostra com uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção. O caminho de fluxo da célula de fluxo pode ter uma redução no tamanho, de modo que uma espessura da corrente do flui- do da amostra reduz-se de uma espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um ponto de captura de imagens. O método 600 pode incluir, também, a obtenção de imagens de uma primeira pluralidade das partículas do primeiro fluido da amostra no ponto de captura de imagens da célula de fluxo, como indicado pela etapa 640.
[00189] O método 600 também pode incluir iniciar os transientes do fluido da amostra. Por exemplo, os transientes do fluido da amostra podem ser iniciados pelo encerramento da injeção do primeiro fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo e pela injeção do se- gundo fluido da amostra no fluido de revestimento em fluxo, como indi- cado pela etapa 650. Além disso, o método 600 pode incluir a obten- ção de imagens de uma segunda pluralidade das partículas do segun- do fluido da amostra no ponto de captura de imagens da célula de flu- xo, como indicado pela etapa 660. De acordo com algumas modalida- des, a obtenção de imagens da segunda pluralidade de partículas po- de ser realizada substancialmente depois dos transientes do fluido da amostra e em até 4 segundos após a obtenção de imagens da primei- ra pluralidade de partículas.
Taxa de deformação
[00190] As Figuras 7 e 8 representam aspectos dos valores da taxa de deformação para determinadas condições de fluxo em uma célula de fluxo de acordo com modalidades da presente invenção. Em cada um desses desenhos, é usado um fluido de revestimento de glicerol a 30%. Em alguns casos, a viscosidade pode ter um valor de 2,45 x 10-3. O valor da tensão de cisalhamento pode ser igual ao produto obtido pela multiplicação do valor da viscosidade pelo valor da taxa de de- formação. Com respeito à Figura 7, a amostra pode ter uma vazão de 0,3 μL/s e o fluido de revestimento pode ter uma vazão de 21 μL/s. Com respeito à Figura 8, a amostra pode ter uma vazão de 1 μL/s e o fluido de revestimento pode ter uma vazão de 70 μL/s. Em cada uma dessas figuras, é possível ver que o fluxo apresenta um menor valor de deformação em direção ao centro (C) e um maior valor de deforma- ção no sentido da periferia (P). Tais valores de deformação podem corresponder a uma configuração assimétrica da célula de fluxo em algumas modalidades.
[00191] Como representado na Figura 7, de acordo com algumas modalidades, a taxa de deformação menor no sentido da porção cen- tral (C) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 500 (1/s) ou menos, e a taxa de deformação maior no sentido da periferia (P) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 3.000 (1/s) ou mais. Como representado na Figura 8, de acordo com algumas modalida- des, a taxa de deformação menor no sentido da porção central (C) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 1.000 (1/s) ou menos, e a taxa de deformação maior no sentido da periferia (P) da corrente de fluxo pode ter um valor de cerca de 9.000 (1/s) ou mais.
[00192] Desse modo, é possível ver que velocidades do fluido da amostra e do fluido de revestimento menores (por exemplo, Figura 7) correspondem a taxas de deformação menores, e velocidades do flui- do da amostra e do fluido de revestimento maiores (por exemplo, Fi- gura 8) correspondem a taxas de deformação maiores. Fica compre- endido que as modalidades da presente invenção envolvem o uso de fluido da amostra e/ou de fluido de revestimento correspondentes a vários valores de viscosidade, vários valores de taxa de deformação e/ou vários valores de tensão de cisalhamento.
Alvo da focalização automática
[00193] Voltando a fazer referência à Figura 1, os sistemas de ob- tenção de imagens de partículas podem incluir um alvo ou padrão de focalização automática 44 que é fixo em relação à célula de fluxo 22. O alvo da focalização automática 44 pode ser usado para obter-se imagens focalizadas das partículas do fluido sanguíneo que fluem através da célula de fluxo.
[00194] A Figura 9A representa um alvo de focalização automática exemplificador 900 de acordo com modalidades da presente invenção. Como mostrado aqui, o alvo 900 inclui uma banda anular opaca 910 e um centro ou abertura transparente 920. Em funcionamento, o disposi- tivo de obtenção de imagens focaliza a banda 910 e captura a imagem através da abertura. Como discutido em outras seções do presente pedido e no pedido de patente US n° copendente, um processo de captura de imagens pode envolver primeiro a focalização (ou a fo- calização automática) na banda 910 e, então, o ajuste da distância en- tre o dispositivo de captura de imagem e a corrente do fluido da amos- tra antes da obtenção da imagem através da abertura 920. Desse mo- do, a banda 910 pode apresentar um alvo mediante o qual um sistema de focalização automática do dispositivo de captura de imagem pode detectar e focalizar, e determinadas porções do alvo (por exemplo, as bordas ou segmentos) podem ser incluídas na imagem. Em alguns ca- sos, o alvo pode ter a forma de um disco de cromo com uma abertura central. Um alvo exemplificador pode ter um orifício central com diâme- tro de cerca de 0,5 mm e estar colado ou fixado na célula de fluxo. O tamanho do orifício ou abertura central 920 pode ser selecionado de modo que apenas quatro porções da borda 930 da banda anular opa- ca 910 sejam visíveis na imagem capturada 940, como ilustrado na Figura 9B. Dessa forma, a banda anular 910 não interfere na captura de imagens da célula (por exemplo, a luz pode atravessar a abertura 920 de modo a iluminar as partículas da amostra, sem que o campo de visão seja significativamente bloqueado pela banda anular). Desse modo, a banda 910 é exibida apenas nos cantos da imagem.
[00195] A Figura 10 representa um alvo de focalização automática exemplificador 1000 de acordo com modalidades da presente inven- ção. O alvo 1000 inclui uma banda ou borda 1010 e uma abertura cen- tral 1020. A Figura 11 mostra um outro alvo de focalização automática exemplificador 1100 de acordo com modalidades da presente inven- ção. O alvo 1100 inclui uma banda ou borda 1110 e uma abertura cen- tral 1120. De acordo com algumas modalidades, o alvo de focalização automática 1100 produz uma imagem com 50 pixels de preto acima e abaixo. Em alguns casos, o alvo de focalização automática 1100 pro- porciona um deslocamento na focalização da célula de fluxo (FCFO) de cerca de 65,3 μm. Os aspectos exemplificadores do FCFO são dis- cutidos com mais detalhes no pedido de patente US n° copen- dente, cujo conteúdo é incorporado ao presente pedido mediante a referência.
[00196] A Figura 12A representa um alvo de focalização automáti- ca exemplificador 1200 de acordo com modalidades da presente in- venção. O alvo 1200 é apresentado no desenho letterbox e inclui uma primeira borda, ou borda superior, 1210 e uma segunda borda, ou bor- da inferior, 1220. O alvo 1200 inclui também uma abertura ou passa- gem transparente 1230 entre a primeira e a segunda bordas. De acor- do com algumas modalidades, o alvo tem um diâmetro de cerca de 4 mm, e a altura da letterbox é 265 μm. Em alguns casos, as bordas su- perior e inferior podem ter a forma de semicírculos e podem ser produ- zidas pode deposição de um metal, como óxido de cromo, ou algum outro material opaco.
[00197] A Figura 12B mostra uma vista de perto da porção central do alvo de focalização automática 1200. Conforme mostrado aqui, a primeira borda 1210 inclui uma escala numérica negativa/positiva, com um valor zero centralizado. A segunda borda 1220 inclui uma escala semelhante. Em alguns casos, os incrementos da escala são de 100 μm. De acordo com algumas modalidades, as escalas podem ser usa- das para facilitar o posicionamento da célula de fluxo para que o cam- po de visão do dispositivo de obtenção de imagens ou câmera possa ser centralizado na corrente da amostra. Conforme mostrado aqui, a corrente da amostra 1240 flui em uma direção perpendicular às esca- las da primeira e da segunda borda. Como parte de um protocolo de focalização, o dispositivo de captura de imagem pode operar de modo a focalizar os números, ou outros caracteres, ou objetos passíveis de obtenção de imagem presentes nas bordas 1210, 1220.
[00198] As modalidades da presente invenção envolvem técnicas para lidar com as oscilações térmicas associadas ao uso do sistema de análise de partículas, caso contrário, esses efeitos térmicos podem comprometer a qualidade das imagens obtidas com o dispositivo de obtenção de imagens. A Figura 13A representa uma vista lateral par- cial de uma célula de fluxo 1320 com um sensor térmico 1370, um re- fletor 1380 e um alvo de focalização automática 1344. Durante o funci- onamento de um sistema de análise de partículas, os efeitos térmicos podem fazer com que a corrente da amostra saia lentamente do foco do dispositivo de obtenção de imagens. Por exemplo, os efeitos térmi- cos podem ser causados pela expansão térmica da célula de fluxo re- sultante da radiação térmica originada na lâmpada. Os efeitos térmicos podem ser também causados pela expansão térmica da célula de fluxo e do conjunto óptico de bancada (OBA) como resultado do aquecimen- to condutivo e radiativo. Em algumas modalidades, certos componen- tes do OBA podem expandir-se, o que pode contribuir para erros de focalização. Por exemplo, tais componentes podem incluir as placas metálicas que sustentam a câmera 24, uma placa metálica que susten- te a célula de fluxo ou esteja conectada a ela, ou uma placa metálica que sustente a célula de fluxo e a câmera 24. A Figura 13B represen- ta uma vista em perspectiva parcial de uma célula de fluxo 1320 com um sensor térmico 1370 e um alvo de focalização automática 1344. Adicionalmente, a Figura 13C representa uma outra vista em perspec- tiva de uma célula de fluxo 1320 com um sensor térmico 1370, um re- fletor 1380 e um alvo de focalização automática 1344.
[00199] O refletor 1380 pode operar para reduzir ou limitar a quanti- dade de calor que é absorvida pela célula de fluxo 1320. Por exemplo, o refletor 1380 pode bloquear o calor irradiado pela lâmpada de um flash 1342, como indicado na Figura 13A. Desse modo, o refletor 1380 pode minimizar o impacto térmico da lâmpada. O refletor 1342 também pode reduzir o ofuscamento e a dispersão da luz gerados pela lâmpada, resultando, assim, em melhor qualidade de imagem. O sen- sor térmico 1370 está posicionado próximo ao canaleta de fluxo de flu- idos e em posição adjacente ao ponto de captura de imagens, para que leituras corretas de temperatura possam ser obtidas. As informa- ções do sensor de temperatura podem ser usadas para focalizar o dis- positivo de captura de imagem na corrente da fita do fluido da amostra.
[00200] Como representado na Figura 13D, uma célula de fluxo 1300d pode incluir um caminho de fluxo 1322d com uma porta ou res- piro 1301d através do qual as bolhas 1302d sejam liberadas ou retira- das. Como representado no presente pedido, um tubo 1303d, através do qual é possível aplicar vácuo, pode estar em contato com a porta 1301d para retirar bolhas 1302d da corrente de fluxo. Esse mecanismo de retirada de bolhas é adequado para a retirada de bolhas do fluido em fluxo no interior da célula de fluxo e pode operar para impedir que bolhas ou microbolhas fiquem alojadas ou presas no interior da célula de fluxo.
[00201] Cada um dos cálculos ou operações descritos no presente pedido pode ser realizado com o uso de um computador ou outro pro- cessador dotado de hardware, software e/ou firmware. As várias eta- pas do método podem ser realizadas por módulos, e os módulos po- dem compreender qualquer dos hardware e/ou software para proces- samento de dados analógicos e/ou digitais da ampla variedade dispo- nível disposto para executar as etapas do método descritas no presen- te pedido. Módulos esses que compreendem opcionalmente hardware para processamento de dados adaptados para realizar uma ou mais dessas etapas com os códigos de programação de máquina apropria- dos associados a eles; os módulos para duas ou mais etapas (ou por- ções de duas ou mais etapas) estão integrados em uma única placa processadora ou separados em diferentes placas processadoras em qualquer arquitetura de processamento distribuída e/ou integrada den- tre a ampla variedade disponível. Esses métodos e sistemas emprega- rão frequentemente um meio tangível incorporando um código legível por máquina com instruções para realizar as etapas do método descri- tas acima. Os meios tangíveis adequados podem compreender uma memória (incluindo uma memória volátil e/ou uma memória não volá- til), uma mídia de armazenamento (como o registro magnético em um disquete, um disco rígido, uma fita ou similares; ou em uma memória óptica, como CD, CD-R/W, CD-ROM, DVD ou similares; ou qualquer outra mídia de armazenamento digital ou analógica) ou similares.
[00202] Todas as patentes, publicações de patentes, pedidos de patente, artigos de periódicos, livros, referências técnicas e similares discutidos na presente revelação estão, para todos os fins, incorpora- dos em sua totalidade ao presente pedido mediante a referência.
[00203] Disposições distintas dos componentes representados nos desenhos ou descritos acima, assim como de componentes e etapas não mostrados ou descritos são possíveis. De modo similar, alguns recursos e subcombinações são úteis e podem ser empregados sem referência a outros recursos e subcombinações. As modalidades da invenção foram descritas para fins de ilustração, não de limitação, e modalidades alternativas ficarão patentes aos leitores desta patente. Em certos casos, as etapas do método ou operações podem ser reali- zadas ou executadas em outra ordem, ou operações podem ser adici- onadas, excluídas ou modificadas. É possível verificar que, em certos aspectos da invenção, um único componente pode ser substituído por múltiplos componentes, e múltiplos componentes podem ser substituí- do por um único componente para propiciar ou elemento ou estrutura ou para realizar ou mais funções. Salvo nos casos em que a substitui- ção não for viável para a execução de certas modalidades, as substi- tuições são consideradas abarcadas pelo escopo da invenção. Conse- quentemente, a presente invenção não se limita às modalidades des- critas acima ou representadas nos desenhos, podendo ser feitas modi- ficações sem que haja desvio do escopo das reivindicações abaixo.

Claims (15)

1. Método para a obtenção de imagens de partículas usan- do um sistema de análise de partículas configurado para focalização hidrodinâmica combinada da viscosidade e da geometria, as partículas incluídas dentro de uma amostra de sangue (25), o método caracteri- zado pelo fato de que compreende: injetar um fluido de revestimento (426) ao longo de um ca- minho de fluxo (422) de uma célula de fluxo (22, 33, 420) do analisa- dor de partículas, o fluido de revestimento (426) tendo uma viscosida- de que é maior que uma viscosidade da amostra de sangue (25); injetar a amostra de sangue (25) de um tubo de injeção do fluido da amostra (29, 412, 400d) a uma vasão de fluxo no fluido de revestimento em fluxo (426) no interior da célula de fluxo (22, 33, 420), de modo a fornecer uma corrente de fluido da amostra (32, 428) tendo uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção (21, 412, 400d), o caminho de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 33, 420) tendo uma diminuição no tamanho do caminho de fluxo (21, 419) de modo que a espessura da corrente de fluido da amostra (32, 428) diminui da es- pessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um ponto de captura de imagens (432); obter imagens de uma primeira pluralidade de partículas da amostra (25) no ponto de captura de imagens (432) da célula de fluxo (22, 33, 420); em que a diminuição no tamanho do caminho de fluxo (422) é definida por uma porção proximal do caminho de fluxo (21a) com uma espessura proximal e a porção distal do caminho de fluxo (21b) com uma espessura distal inferior à espessura proximal, a razão entre a espessura proximal para a espessura distal estando na faixa de 10 e 200, em que uma extremidade a jusante (427a) do tubo de inje- ção do fluido da amostra (29, 412, 400d) está posicionada distalmente em relação à porção proximal do caminho de fluxo (21a), em que uma diferença de viscosidade entre o fluido de re- vestimento (426) e a amostra de sangue (25), em combinação com a diminuição no tamanho do caminho de fluxo e a vasão de fluxo da amostra, é eficaz para levar as células na amostra de sangue (25) do tubo de injeção do fluido da amostra (29, 412, 400d) para o ponto de captura de imagens (432) em um tempo de trânsito diferente de zero que é de quatro segundos ou menos, enquanto um agente de viscosi- dade no fluido de revestimento (426) preserva a viabilidade das célu- las, mantendo a estrutura e o conteúdo das células intactos quando as células se estendem da corrente de fluido da amostra para o fluido de revestimento em fluxo à medida que as células se movem do tubo de injeção de fluido da amostra (29, 412, 400d) para o ponto de captura de imagens (432).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fluido de revestimento (426) é injetado ao longo do caminho de fluxo (422) com uma vasão de fluido de revestimento, em que a vasão de fluido de revestimento (426) e a seção transversal da área de fluxo da célula de fluxo correspondem a uma velocidade do fluido de revestimento, em que a vasão de fluxo da amostra de sangue (25) e a seção transversal da área de fluxo de uma porta de saída do tubo de injeção (P, 331, 431) correspondem a uma velocidade da amostra e em que existe uma diferença de velocidade entre a veloci- dade do fluido de revestimento e a velocidade da amostra.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as diferenças de viscosidade e velocidade e a dimi- nuição no tamanho do caminho de fluxo são eficazes para focalizar hidrodinamicamente as células na amostra de fluido sanguíneo (25) no ponto de captura de imagens (432).
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a diminuição no tamanho do caminho de fluxo é definida por paredes opostas (421a, 423a) do caminho de fluxo (422) inclina- das radialmente para dentro ao longo do caminho de fluxo (422) ge- ralmente simétrica em relação a um plano transversal (451a) que divi- de a primeira e a segunda espessuras da corrente de fluido da amos- tra; ou: a simetria na diminuição do tamanho do caminho de fluxo é eficaz para limitar o desalinhamento da orientação de obtenção de imagem dos glóbulos vermelhos na amostra de sangue (25) para me- nos de cerca de 20%.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a amostra de sangue (25) compreende partículas esféricas, e um diferencial de viscosidade entre o fluido da amostra (25) e o flui- do de revestimento (426) é eficaz para alinhar organelas intracelulares das partículas esféricas dentro de um plano focal no ponto de captura de imagens (432) da célula de fluxo (22,33, 420); ou: o tubo de injeção (29, 412, 400d) compreende uma porção proximal (21a) com uma primeira área de seção transversal de fluxo e uma porção distal (21b) com uma segunda área de seção transversal de fluxo, sendo que a seção transversal de fluxo da área da porção proximal (21a) é 1,5 vezes maior que a área da seção transversal do fluxo da porção distal (21b).
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: uma razão da vasão de fluido de revestimento para a vasão de fluxo da amostra é de cerca de 200; ou: a segunda espessura da corrente de fluido da amostra (32, 428) está dentro de uma faixa de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm; ou: uma razão da primeira espessura da corrente de fluido da amostra (32, 428) para a segunda espessura da corrente de fluido da amostra (32, 428) tem um valor dentro de uma faixa de cerca de 20:1 a cerca de 70:1.
7. Sistema de análise de partículas que realiza focalização hidrodinâmica combinada da viscosidade e da geometria para partícu- las de imagem em uma amostra de sangue (25), o sistema caracteri- zado pelo fato de que compreende: uma célula de fluxo (22, 33, 420) tendo um caminho de flu- xo (422) configurado para transmitir um fluxo de fluido de revestimento (426), sendo que o fluido de revestimento (426) tem uma viscosidade maior que uma viscosidade da amostra de sangue (25); um sistema de injeção de fluido da amostra em comunica- ção fluida com o caminho de fluxo (420) e configurado para injetar a amostra (25) no fluido de revestimento em fluxo (426) no interior da célula de fluxo (22, 33, 420), de modo a proporcionar uma corrente de fluido da amostra (32, 428) tendo uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção (29, 412, 400d), o caminho de fluxo da célula de fluxo tendo uma diminuição no tamanho do caminho de fluxo (21, 419) de modo que a espessura da corrente de fluido da amostra diminua da espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um ponto de captura de imagens (432); em que a diminuição no tamanho do caminho de fluxo (422) é definida por uma porção proximal do caminho de fluxo (21a) com uma espessura proximal, e uma porção distal do caminho de fluxo (21b) com uma espessura distal inferior à espessura proximal, a razão entre a espessura proximal para a espessura distal está na faixa de 10 a 200 e uma extremidade a jusante (427a) do tubo de injeção do fluido da amostra (29, 412, 400d) está posicionada distalmente em relação à porção proximal do caminho de fluxo (21a); um dispositivo de captura de imagem (430) alinhado com o ponto de captura de imagens, de modo a obter uma imagem de uma pluralidade de partículas do fluido da amostra (25) no ponto de captura de imagens (432) da célula de fluxo (22, 33, 420); e um processador (440) e um meio legível por computador não transitório tangível, o processador acoplado ao sistema injetor de fluido da amostra e ao dispositivo de captura de imagem (430), o meio legível por computador programado com um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador (440), faz com que o pro- cessador (440) inicie a injeção do fluido da amostra (25) no fluido de revestimento em fluxo (426) com uma vasão de amostra, de modo que a diferença de viscosidade entre as amostras de revestimento e de sangue, em combinação com a diminuição no tamanho do caminho de fluxo e a vasão da corrente de fluido da amostra (32, 428) é eficaz pa- ra levar as células na amostra de sangue (25) do tubo de injeção de fluido da amostra (29, 412, 400d) para o ponto de captura de imagens (432) em um tempo de trânsito diferente de zero que é de quatro se- gundos ou menos, enquanto um agente de viscosidade no fluido de revestimento (426) preserva a viabilidade das células, mantendo a es- trutura e o conteúdo das células intactos quando as células se esten- dem da corrente de fluido da amostra (32, 428) para o fluido de reves- timento em fluxo (426) à medida que as células se movem do tubo de injeção do fluido da amostra (29, 412, 400d) para o ponto de captura de imagens (432).
8. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a diminuição do tamanho do caminho de fluxo é defi- nida pelas paredes opostas (421a, 423a) do caminho de fluxo que se inclinam radialmente para dentro ao longo do caminho de fluxo geral- mente simétricas em relação a um plano transversal (451a) que divide a corrente de fluido da amostra em primeira e segunda espessuras.
9. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: a simetria na diminuição do tamanho do caminho de fluxo é eficaz para limitar o desalinhamento da orientação de obtenção de imagem dos glóbulos vermelhos na amostra de sangue (25) para me- nos de cerca de 20%; ou: o tubo de injeção (29, 412, 400d) compreende uma porção proximal (21a) com uma primeira área de seção transversal de fluxo e uma porção distal (21b) com uma segunda área de seção transversal de fluxo, e em que a seção transversal de fluxo da porção proximal (21a) é 1,5 vezes maior que a área da seção transversal do fluxo da porção distal (21b).
10. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que: o fluido da amostra (32, 428) tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo (22, 33, 420) na faixa de cerca de 1 a 4 se- gundos; ou: a célula de fluxo (22, 33, 420) está configurada para rece- ber o fluido de revestimento (426) de uma fonte de fluido de revesti- mento para o caminho de fluxo (422) em uma primeira direção de fluxo que é perpendicular à segunda direção de fluxo do fluido de revesti- mento (426) ao longo do caminho de fluxo (422) no ponto de obtenção de imagens (432).
11. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que a célula de fluxo (22, 33, 420) compreende um al- vo de focalização automática para o dispositivo de captura de imagem.
12. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda um alvo de focalização automá- tica (44, 900, 1000, 1200, 1344) tendo uma posição fixa em relação à célula de fluxo (22, 33, 420).
13. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que a diferença de viscosidade entre o fluido de reves- timento (426) e a amostra de sangue (428), em combinação com a di- minuição no tamanho do caminho de fluxo (21, 419) e a vasão da cor- rente de fluido da amostra (32, 428), é eficaz para levar as células na amostra de sangue (25) do tubo de injeção do fluido da amostra (29, 412, 400d) para o ponto de captura de imagens (432) em 1 segundo a 4 segundos.
14. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que o dispositivo de captura de imagem (432) compre- ende um dispositivo de imagem de alta resolução óptica ou um dispo- sitivo de captura de imagem digital.
15. Sistema, de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que o dispositivo de captura de imagem (432) tem uma resolução óptica de 1 μm ou menos.
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