BR112015020255B1

BR112015020255B1 - método para o imageamento de partículas com o uso de um sistema de análise de partículas configurado para a hidro-focalização geométrica, e sistema de análise de partículas que realiza a hidro-focalização geométrica para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido corpóreo

Info

Publication number: BR112015020255B1
Application number: BR112015020255-1A
Authority: BR
Inventors: Bart J. Wanders; Eric Chapoulaud; Brett Jordan
Original assignee: Iris International, Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2021-02-23
Also published as: KR20150129707A; US10794900B2; JP6521940B2; WO2014146062A3; US9857361B2; EP2972215A2; WO2014146062A2; CN105122034B; US20180143182A1; CN105122034A; JP2016519760A; BR112015020255A2; KR102083051B1; US20140329265A1

Abstract

"CÉLULA DE FLUXO, FLUIDO ENVOLTÓRIO E SISTEMAS DE FOCO AUTOMÁTICO E MÉTODOS PARA ANÁLISE DE PARTÍCULAS EM AMOSTRAS DE URINA" A presente revelação se refere a aparelho, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra que contém partículas. Um sistema de imageamento ou analisador de partículas pode incluir uma célula de fluxo através da qual uma amostra de urina que contém partículas é induzida a fluir, e um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica que captura imagens para a análise de imagem. Um padrão de contraste para a focalização automática é fornecido na célula de fluxo. O processador de imagem avalia a exatidão de foco a partir do contraste de dados de pixel. Um motor de posicionamento move o microscópio e/ou célula de fluxo ao longo do eixo geométrico óptico para focalização automática no alvo de padrão de contraste. O processador, então, desloca o microscópio e a célula de fluxo por uma distância conhecida entre o padrão de contraste e a corrente de amostra, focalizando, assim, a corrente de amostra. As imagens de célula ou partícula são coletadas a partir daquela posição até que o foco automático seja reiniciado, periodicamente, por sinal de entrada, ou quando se detecta mudanças de temperatura ou inexatidão de foco nos dados de imagem.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido é um não provisório e reivindica o benefício de prioridade do pedido de patente provisório US n° 61/799.014, depositado em 15 de março de 2013, cujo conteúdo é aqui incorporado, por referência. Este pedido também está relacionado ao pedido de patente US n° 14/216.562 e pedido de patente internacional n° (agente de contraste), ambos depositados em 17 de março de 2014. O conteúdo de cada um desses depósitos está aqui incorporado, a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Esta revelação se refere ao campo de sistemas, analisadores,composições e métodos para análise de partículas, incluindo imageamento de partículas em amostras de fluido, tais como amostras de urina, com o uso de dispositivos completa ou parcialmente automatizados para discriminar e quantificar partículas na amostra. A presente revelação também se refere a um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL - particle and/or intracellular organelle alignment liquid) útil para analisar partículas em uma amostra de urina de um indivíduo, métodos para produzir o líquido, e métodos para usar o líquido para detectar e analisar as partículas na urina. As composições e métodos úteis para conduzir a análise de amostra de urina à base de imagem também são revelados. As composições e métodos da presente revelação também são úteis para detectar, contar e caracterizar partículas na urina, tais partículas podem compreender, por exemplo, células, cálculos, cristais ou corpos de gordura para contagem, categorização, subcategorização, caracterização e/ou análise de partículas à base de imagem e em forma morfológica.

[0003] A análise de sedimento urinário é um dos testes de diagnóstico mais comumente realizados para fornecer uma visão geral de um estado de saúde do paciente. Uma amostra de urina pode ser obtida a partir de um corpo do paciente e armazenada em um tubo de teste para o processamento e análise posterior. A aparência de certos sedimentos característicos também chamados de elementos formados em uma amostra de urina pode ser clinicamente significativa e/ou indicativa de condições patológicas em um indivíduo.

[0004] Em geral, a urina anormal pode conter uma variedade de elementos formados, tais como células sanguíneas, células epiteliais, cristais, cálculos ou micro-organismos. Por exemplo, as amostras de urina podem conter células de origem hematológica. Os eritrócitos ou glóbulos vermelhos (RBCs) podem estar presentes na urina como resultado de hemorragia (hematúria) a qualquer ponto no sistema urogenital a partir do glomérulo até a uretra. A presença de leucócitos ou WBCs, neutrófilos, eosinófilos podem ter importância clínica. As células brilhantes são um tipo de neutrófilo visto em urina hipotônica de gravidade específica de 1,010 ou menos. A presença de linfócitos tem sido usada como um indicador precoce de rejeição renal após transplante. Os eosinófilos estão associados à nefrite intersticial induzida por fármaco, filamentos de muco que se originam a partir do rim ou do trato urinário inferior podem estar presentes.

[0005] As amostras de urina podem conter, também, células de origem epitelial. Algumas células epiteliais renais, também chamadas de células tubulares renais, podem ser encontradas na urina de indivíduos saudáveis devido à esfoliação normal. Entretanto, a presença de células tubulares renais excessivas é indicativa de doença renal ativa ou lesão tubular. Dentre os diversos tipos de células epiteliais encontradas na urina (renal, transicional ou urotelial, e escamosa), as células epiteliais renais são as mais significativas clinicamente. As mesmas estão associadas à necrose tubular aguda, infecções virais (tais como citomegalovírus), e rejeição de transplante renal. Sua presença também é aumenta com febre, toxinas químicas, fármacos (especificamente aspirina), metais pesados, inflamação, infecção e neoplasmas. Ademais, a presença de corpos de inclusão pode ser vista em infecções virais, tais como rubéola e herpes, e especificamente com citomegalovírus.

[0006] A urina pode também conter células epiteliais transicionais ou células uroteliais. As células epiteliais transicionais são a multicamada de células epiteliais que revestem o trato urinário a partir da pélvis renal até a parte distal da uretra masculina e até a base da bexiga (trígono) em indivíduos do sexo feminino. As mesmas podem ser difíceis de distinguir de células epiteliais renais, mas são geralmente maiores e mais esféricas. Algumas células transicionais estão presentes na urina de indivíduos saudáveis. Os números aumentados estão associados à infecção. Grandes nódulos ou folhas dessas células podem ser vistas com carcinoma de célula transicional.

[0007] A urina pode também conter células epiteliais escamosas. As células epiteliais escamosas revestem a uretra em indivíduos do sexo feminino e a porção distal da uretra masculina. A presença de grandes números de células escamosas em indivíduos do sexo feminino geralmente indica contaminação vaginal.

[0008] A urina pode também conter células indicadoras. As células indicadoras são outro tipo de célula escamosa de origem vaginal, podem ser vistas contaminando o sedimento urinário. Essa célula epitelial escamosa é coberta ou incrustada com uma bactéria, Gardnerella vaginalis, cuja presença é indicativa de uma vaginite bacteriana.

[0009] A urina pode também conter corpos de gordura ovais,gordura tubular renal ou corpos de gordura tubulares renais. Esses corpos são células epiteliais renais (ou macrófagos) que têm se preenchido com gotículas de gordura ou lipídio. A gordura pode ser gordura neutra (triglicerídeo) ou colesterol; têm a mesma importância clinicamente. A presença de corpos de gordura ovais em urina é indicativa de anormalidade de doença e não deveria ser desconsiderada. As mesmas são muitas vezes vistas com cálculos graxos e gotículas de gordura no sedimento urinário e estão associadas à proteinúria massiva, conforme visto em síndrome nefrótica.

[00010] A urina pode também conter micro-organismos, tais como bactérias e levedura. Normalmente, a urina é estéril ou livre de bactérias. Entretanto, certas bactérias são tipicamente vistas na urina de um pH alcalino. As descobertas de sedimento associado podem incluir a presença de WBCs (neutrófilos) e cálculos (WBC, celular, granular ou bacteriano). Embora as infecções sejam mais frequentemente devido a bastonetes gram-negativos de origem entérica, os organismos infecciosos podem também ser cocos gram-positivos.

[00011] Além disso, a levedura pode ser vista em urina, especificamente como resultado da contaminação vaginal, tal como contaminação a partir de pacientes do sexo feminino com infecções de levedura. Também está associada a diabetes mellitus devido à presença de glicose urinária. A levedura é um contaminante comum, a partir da pele e do ambiente, e as infecções são um problema em pacientes debilitados e imunossuprimidos ou imunodeprimidos.

[00012] Tradicionalmente, a análise de sedimentos em urina tem sido realizada por inspeção visual com o uso de um microscópio em um laboratório geral. Com essas abordagens, uma amostra de urina é primeiramente submetida à separação centrífuga e enriquecida. Os sedimentos assim obtidos são, em alguns casos, corados e, então, carregados em uma lâmina para microscópio, e são submetidos à determinação e contagem manual sob o microscópio.

[00013] As etapas de preparação de amostra podem incluir a concentração dos sedimentos de urina por centrifugação e às vezes a aplicação de uma coloração de microscopia para acentuar o contraste, por exemplo, entre tipos de sedimento, tais como RBCs, WBCs e células epiteliais. Em uma contagem manual, o técnico visualiza a lâmina de exame a fresco, distinguindo entre os tipos de células visíveis ou por sua aparência com o uso do julgamento profissional, e conta manualmente o número de sedimentos de urina observados de diferentes tipos dentro de uma área predeterminada.

[00014] O uso de sistemas para análise de urina é geralmente descrito na patente US n° 4.473.530 por Villa-Real, intitulada "Compact Sanitary Urinalysis Unit"; patente US n° 3.894.845, intitulada "Urine Collection and Analysis Device" e patente US n° 3.988.209, intitulada "Microorganism Analysis Device", ambas por McDonald; patente US n° 4.973.450 por Schluter, intitulada "Device for Urinalysis"; patente US n° 4.622.298 por Mansour, et al., intitulada "Detection and Quantitation of Microorganisms, Leukocytes and Squamous Epithelial Cells in Urine"; e patente US n° 5.132.232 por Parker, intitulada "Method and Apparatus for Preparation of Liquids for Examination". A patente US n° 4.612.614 por Deindoerfer, et al., intitulada "Method of Analyzing Particles in a Fluid Sample", relata um método para analisar sedimentos urinários distribuindo-se uma amostra sobre uma área estendida, tal como uma lâmina para microscópio ou uma célula de fluxo. Deindoerfer, et al. relata o uso de uma pluralidade de imagens fixas ópticas da amostra que são convertidas em imagens eletrônicas que são exibidas em uma matriz ordenada por classes de características visualmente discerníveis. Entretanto, muitos desses sistemas de análise de urina desenvolvidos anteriormente geralmente carecem da taxa de rendimento, da exatidão e/ou da aplicabilidade geral exigida para adaptação através de todos os alvos/indivíduos para todos os propósitos pretendidos.

[00015] Para a automação de determinação de sedimento urinário, um microscópio de fluxo automatizado pode ser usado (por exemplo, microscópio automático tipo fluxo -- iQ®200, Iris Diagnostics). Com esses tipos de dispositivos, uma amostra de urina é introduzida em uma célula de fluxo do tipo plana sem pré-concentração e as imagens são tiradas e armazenadas, enquanto que a amostra está fluindo através da célula de fluxo. Entretanto, os sedimentos urinários são diversificados em sua morfologia e muitos sedimentos estão sendo danificados e, portanto, a determinação de imagens tiradas com boa exatidão é difícil de alcançar. É particularmente difícil determinar sedimentos com tamanho pequeno, tais como eritrócitos (especificamente eritrócitos dismórficos), bactérias e cristais com boa exatidão sem validação externa do usuário.

[00016] Embora os sistemas e métodos de análise de partículas atualmente conhecidos, junto com as técnicas de diagnóstico médico relacionadas, possam fornecer benefícios reais para médicos, clínicos e pacientes, aperfeiçoamentos adicionais ainda são desejáveis. As modalidades da presente invenção fornecem soluções para ao menos algumas dessas necessidades existentes.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00017] A presente revelação se refere a analisador, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra preparada que contém partículas, tal como uma amostra de urina. Em alguns aspectos, o sistema inclui um analisador que pode ser um analisador isual. Em alguns aspectos, o analisador contém um analisador visual (por exemplo, imageamento) e um processador. Em um aspecto, esta revelação se refere a um sistema de imageamento de partículas automatizado no qual uma amostra de urina que contém partículas de interesse é induzida a fluir através de uma célula de fluxo que tem uma porta de visualização através da qual um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura uma imagem. Em alguns aspectos, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica compreende uma câmera, tal como uma câmera digital. Em um aspecto, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica compreende uma lente objetiva.

[00018] A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido de amostra, tal como uma amostra preparada, e a uma fonte de líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL). O sistema permite a captura de imagens focalizadas de partículas em uma amostra em fluxo. Em algumas modalidades, as imagens podem ser usadas em processos automatizados de alta taxa de rendimento para categorizar e subcategorizar partículas.

[00019] Em uma modalidade, o analisador é configurado para detectar partículas na amostra que têm uma ou mais distinções visuais e determinar concentração ou contagem de partículas exata de diferentes categorias ou subcategorias de partículas na amostra.

[00020] As amostras podem ser obtidas por meio de qualquer método convencional, por exemplo, uma coleta de amostra de urina. A amostra pode ser de um indivíduo considerado saudável, por exemplo, uma amostra coletada como parte de um grupo de controle ou exame físico de rotina. A amostra pode também ser de um indivíduo que tem, que está em risco ou que é suspeito de ter um distúrbio. O distúrbio pode ser o resultado de uma doença, uma anormalidade genética, uma infecção, uma lesão ou causas desconhecidas. Alternativa ou adicionalmente, os métodos podem ser úteis para monitorar um indivíduo durante o curso do tratamento para um distúrbio. Onde existem sinais de falta de capacidade de resposta ao tratamento, um médico pode escolher um tratamento alternativo ou adjuntivo. Dependendo da condição do indivíduo e do distúrbio particular, se houver, as amostras podem ser coletadas quando (ou duas vezes, três vezes, etc.) diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente. A amostra pode ser preparada pelo contato com uma composição de agente de contraste de partículas conforme descrito na presente invenção.

[00021] As partículas podem variar dependendo da amostra. As partículas podem ser células biológicas, por exemplo, células epiteliais ou células sanguíneas. Em algumas modalidades, as partículas podem ser um agente infeccioso, por exemplo, uma bactéria, protista, protozoário, fungo ou parasita.

[00022] Em um aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para imageamento de partículas com o uso de um sistema de análise de partículas. Em alguns casos, o sistema é configurado para hidro-focalização geométrica. As partículas podem ser incluídas dentro de uma amostra de fluido corpóreo. Os métodos exemplificadores incluem injetar um fluido envoltório ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo do analisador de partículas, injetar a amostra de fluido corpóreo a partir de um tubo de injeção de fluido de amostra em uma taxa de fluxo no fluido envoltório circulante dentro da célula de fluxo, a fim de fornecer uma corrente de amostra que tem uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção, sendo que a trajetória de fluxo da célula de fluxo tem uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo de tal modo que a espessura do corrente de amostra diminua a partir da espessura inicial a uma segunda espessura adjacente a um sítio de captura de imagem, focalizar um dispositivo de captura de imagem por meio de imageamento de um alvo de imageamento que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o alvo de imageamento e a corrente de amostra definem uma distância de deslocamento predeterminada ao longo do eixo geométrico de imageamento, e adquirir uma imagem focalizada de uma primeira pluralidade das partículas a partir da primeira amostra ao longo do eixo geométrico de imageamento no sítio de captura de imagem da célula de fluxo, adequada para caracterização e contagem de partículas, dentro da corrente com o dispositivo de captura de imagem, em que o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de amostra com o uso da etapa de focalização e da distância de deslocamento predeterminada. A diminuição em tamanho de trajetória de fluxo pode ser definida por uma porção de trajetória de fluxo proximal que tem uma espessura proximal e uma porção de trajetória de fluxo distal que tem uma espessura distal menor que a espessura proximal. Uma extremidade a jusante do tubo de injeção de fluido de amostra pode ser posicionada distal à porção de trajetória de fluxo proximal. Uma diferença de velocidade entre as amostras de fluido sanguíneo e envoltório, em combinação com a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo e na taxa de fluxo da amostra, pode ser eficaz para liberar células na amostra a partir do tubo de injeção de fluido de amostra ao sítio de captura de imagem em quatro segundos ou menos. Em alguns casos, a amostra de fluido corpóreo é uma amostra de fluido de urina. Em alguns casos, o sítio de captura de imagem tem um campo de visão de cerca de 800 μm x 800 μm. Em alguns casos, o fluido de amostra tem um volume de cerca de 900 μl. Em alguns casos, o fluido de amostra se move a partir de uma porta de saída do tubo de injeção de fluido de amostra ao eixo geométrico de imageamento no sítio de captura de imagem em cerca de 1,5 segundo. Em alguns casos, a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo é definida pelas paredes opostas da angulação de trajetória de fluxo radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo geralmente simétrica sobre um plano transversal que bisecciona a primeira e segunda espessura da corrente de fluido de amostra. Em alguns casos, a célula de fluxo é configurada para receber o fluido envoltório a partir de uma fonte de fluido envoltório na trajetória de fluxo em uma primeira direção de fluxo que é perpendicular à segunda direção de fluxo do fluido envoltório ao longo da trajetória de fluxo no sítio de imageamento. Em alguns casos, a célula de fluxo inclui um alvo de foco automático para o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de foco automático pode ser em uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Em alguns casos, a amostra de fluido corpóreo tem uma viscosidade de amostra, e o fluido envoltório tem uma viscosidade de fluido envoltório que é diferente da viscosidade de amostra.

[00023] Em um outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem um sistema de análise de partículas que realiza a hidro- focalização geométrica para imageamento de partículas em uma amostra de fluido corpóreo. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo configurada para transmitir um fluxo de fluido envoltório, um sistema de injeção de fluido de amostra em comunicação fluida com a trajetória de fluxo e configurado para injetar a amostra no fluido envoltório circulante dentro da célula de fluxo, a fim de fornecer uma corrente de fluido de amostra que tem uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção, em que a trajetória de fluxo da célula de fluxo tem uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo de modo que a espessura da corrente de fluido de amostra diminua a partir da espessura inicial a uma segunda espessura adjacente a um sítio de captura de imagem. Os sistemas podem também incluir um dispositivo de captura de imagem alinhado com o sítio de captura de imagem, a fim de imagear uma pluralidade das partículas a partir do fluido de amostra no sítio de captura de imagem da célula de fluxo, um mecanismo de focalização configurado para ajustar um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo, em que um alvo de imageamento tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo. O alvo de imageamento e a corrente de amostra podem definir uma distância de deslocamento ao longo do eixo geométrico de imageamento. Os sistemas podem também incluir um processador, um módulo de focalização que tem um meio tangível que incorpora código legível por máquina executado no processador para operar o mecanismo de focalização para ajustar o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partículas, com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, o sistema de injeção de fluido de amostra é configurado para liberar o fluido de amostra de tal modo que o fluido de amostra tenha um tempo de trânsito através da célula de fluxo dentro de uma faixa a partir de cerca de 2 a 4 segundos. Em alguns casos, a amostra de fluido corpóreo é uma amostra de fluido de urina. Em alguns casos, o sítio de captura de imagem tem um campo de visão de cerca de 800 μm x 800 μm. Em alguns casos, o fluido de amostra tem um volume de cerca de 900 μl. Em alguns casos, a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo é definida pelas paredes opostas da trajetória de fluxo posicionadas em ângulo radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo geralmente simétrica sobre um plano transversal que bisecciona a primeira e segunda espessura da corrente de fluido de amostra. Em alguns casos, a célula de fluxo é configurada para receber o fluido envoltório a partir de uma fonte de fluido envoltório na trajetória de fluxo em uma primeira direção de fluxo que é perpendicular à segunda direção de fluxo do fluido envoltório ao longo da trajetória de fluxo no sítio de imageamento. Em alguns casos, a célula de fluxo inclui um alvo de foco automático para o dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o alvo de foco automático tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Em alguns casos, a amostra de fluido corpóreo tem uma viscosidade de amostra, e o fluido envoltório tem uma viscosidade de fluido envoltório que é diferente da viscosidade de amostra.

[00024] Em um outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para imageamento de partículas em uma amostra de fluido corpóreo com o uso de um sistema de análise de partículas configurado para hidro-focalização geométrica. As partículas podem ser incluídas na amostra de fluido, em que a amostra de fluido tem uma viscosidade de fluido de amostra. Os métodos exemplificadores incluem injetar a amostra de fluido em uma célula de fluxo de modo que a amostra de fluido flua em uma corrente de amostra com uma largura de corrente maior que uma espessura de corrente, em que a corrente de amostra flui através de uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo e atravessa um eixo geométrico de imageamento, focalizar um dispositivo de captura de imagem por meio de imageamento de um alvo de imageamento que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, e adquirir uma imagem focalizada das partículas, adequada para a caracterização e contagem de partículas, dentro da corrente com o dispositivo de captura de imagem, em que o dispositivo de captura de imagem é focalizado na corrente de amostra com o uso de uma distância de deslocamento. Em alguns casos, a amostra de fluido corpóreo é uma amostra de urina.

[00025] Em um outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas de análise de partículas que realizam a hidro-focalização geométrica para imageamento de partículas em uma amostra de fluido corpóreo. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo geométrico de imageamento através da mesma, em que a trajetória de fluxo da célula de fluxo tem uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo, uma entrada de fluido em comunicação fluida com o tubo de infecção, a entrada de fluido configurada para injetar a amostra de fluido em uma célula de fluxo, de modo que a amostra de fluido flui em uma corrente de amostra com uma largura de corrente maior que uma espessura de corrente, um dispositivo de captura de imagem, um mecanismo de focalização configurado para ajustar um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo, em que um alvo de imageamento tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o alvo de imageamento e a corrente de amostra definem uma distância de deslocamento ao longo do eixo geométrico de imageamento, um processador, e um módulo de focalização que tem um meio tangível que incorpora código legível por máquina executado no processador para operar o mecanismo de focalização para ajustar o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para caracterização e contagem de partículas, com o uso da distância de deslocamento. Em algumas modalidades, a amostra de fluido corpóreo é uma amostra de urina.

[00026] Em um outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem métodos para imageamento de uma pluralidade de partículas com o uso de um sistema de análise de partículas configurado para hidro-focalização geométrica. As partículas podem ser incluídas em uma amostra de fluido corpóreo que tem uma viscosidade de fluido de amostra. Os métodos exemplificadores incluem fazer fluir um fluido envoltório ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, em que o fluido envoltório tem uma viscosidade de fluido envoltório que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada, e injetar a amostra de fluido corpóreo no fluido envoltório circulante dentro da célula de fluxo, a fim de fornecer uma corrente de fluido de amostra envolvida pelo fluido envoltório. Os métodos podem também incluir fazer fluir a corrente de fluido de amostra e o fluido envoltório através de uma redução em tamanho de trajetória de fluxo em direção a um sítio de imageamento, de tal modo que um efeito de hidro- focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido envoltório e a corrente de fluido de amostra associado à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidro-focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido envoltório e a corrente de fluido de amostra associado à redução em tamanho de trajetória de fluxo, seja eficaz para fornecer um estado de imageamento alvo em pelo menos parte da pluralidade de partículas no sítio de imageamento, enquanto que um agente de viscosidade no fluido envoltório retém a viabilidade de células na estrutura de saída de corrente de fluido de amostra e teor das células intactas quando as células se estendem a partir da corrente de fluido de amostra no fluido envoltório circulante. Adicionalmente, os métodos podem incluir o imageamento da pluralidade de partículas no sítio de imageamento. Em algumas modalidades, a amostra de fluido corpóreo é uma amostra de urina.

[00027] Em ainda um outro aspecto, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas para imageamento de uma pluralidade de partículas em uma amostra de fluido corpóreo que tem uma viscosidade de fluido de amostra. Os sistemas podem ser configurados para o uso com um fluido envoltório que tem uma viscosidade de fluido envoltório que difere da viscosidade de fluido de amostra em uma diferença de viscosidade em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo e um tubo de injeção de fluido de amostra, em que a trajetória de fluxo tem uma redução em tamanho de trajetória de fluxo, uma entrada de fluido envoltório em comunicação fluida com a trajetória de fluxo da célula de fluxo, a fim de transmitir um fluxo do fluido envoltório ao longo da trajetória de fluxo da célula de fluxo, e uma entrada de amostra de fluido corpóreo em comunicação fluida com o tubo de injeção da célula de fluxo, a fim de injetar um fluxo da amostra de fluido corpóreo no fluido envoltório circulante dentro da célula de fluxo, de tal modo que, à medida que o fluido envoltório e o fluido de amostra fluem através da redução em tamanho de trajetória de fluxo e em direção a um sítio de imageamento, um efeito de hidro-focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido envoltório e o fluido de amostra associado à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidro-focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido envoltório e o fluido de amostra associado à redução em tamanho de trajetória de fluxo, forneça um estado de imageamento alvo em pelo menos parte da pluralidade de partículas no sítio de imageamento, enquanto que um agente de viscosidade no fluido envoltório retém a viabilidade de células na estrutura de saída de corrente de fluido de amostra e o teor das células intactas quando as células se estendem a partir da corrente de fluido de amostra no fluido envoltório circulante. Os sistemas podem incluir, também, um dispositivo de imageamento que imageia a pluralidade de partículas no sítio de imageamento. Em algumas modalidades, a amostra de fluido corpóreo é uma amostra de urina.

[00028] Os recursos e vantagens presentes descritas acima e muitas outras das modalidades da presente invenção se tornarão evidentes e adicionalmente compreendidas mediante a referência à seguinte descrição detalhada, quando considerada em conjunto com os desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00029] A Figura 1 é uma ilustração esquemática, parcialmente em seção e não em escala, que mostra aspectos operacionais de uma célula de fluxo exemplificadora, e sistema de foco automático e dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para análise de imagem de amostra com o uso de processamento de imagem digital.

[00030] As Figuras 1A e 1B mostram uma disposição de bancada óptica de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00031] A Figura 1C é um diagrama de blocos de um analisador de urinálise de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00032] A Figura 1D mostra um fluxograma de um processo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00033] A Figura 1E representa aspectos de um sistema de módulo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00034] A Figura 2 é uma ilustração em perspectiva de uma célula de fluxo de acordo com uma modalidade exemplificadora.

[00035] A Figura 3 é uma vista em corte mediana longitudinal ao longo das linhas 3-3 da célula de fluxo mostrada na Figura 2.

[00036] As Figuras 3A e 3B fornecem vistas em corte adicionais de células de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00037] A Figura 4 representa aspectos de um sistema de imageamento de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00038] As Figuras 4A, 4B-1 e 4B-2 representam aspectos de células de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00039] As Figuras 4A-1 e 4A-2 representam vistas em cortetransversal de dimensões de corrente de fluido de amostra e envelope de fluido envoltório (por exemplo, PIOAL) dentro de uma célula de fluxo em uma porta de saída de cânula e um sítio de captura de imagem, respectivamente, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00040] As Figuras 4C-4G, 4C-1 e 4D-1 representam aspectos de configurações de cânula de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00041] A Figura 4H mostra uma porção de uma cânula de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00042] As Figuras 4I e 4J representam células de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00043] As Figuras 4K e 4L mostram uma corrente de amostra que flui através de um sítio de captura de imagem de uma célula de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00044] As Figuras 4K-1 e 4K-2 mostram um sítio de imageamento alvo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00045] A Figura 4K-3 representa aspecto de alinhamento de partícula em uma corrente de amostra, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00046] A Figura 4L-1 representa aspectos de perfis de velocidade de corrente de fluido dentro de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00047] As Figuras 4M e 4N mostram recursos de alinhamento de partícula intracelular exemplificadores, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00048] As Figuras 4O e 4P mostram imagens que demonstram a comparação entre as imagens obtidas com o uso de um PIOAL versus um fluido envoltório convencional, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00049] A Figura 4Q mostra as imagens resultantes obtidas com o uso de sistemas e métodos de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00050] A Figura 5 representa um cronograma que corresponde à injeção de um ou mais fluidos de amostra em uma célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00051] A Figura 6 representa aspectos de um método exemplificador para imageamento de partículas em uma amostra de fluido de urina, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00052] As Figuras 7 e 8 representam aspectos de taxas de esforço de corrente presentes dentro de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00053] A Figura 9A representa um alvo de foco automático exemplificador, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00054] A Figura 9B mostra uma imagem capturada, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00055] As Figuras 10 e 11 representam alvos de foco automático exemplificadores, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00056] A Figura 12A representa um alvo de foco automático exemplificador, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00057] A Figura 12B mostra uma vista de perto da porção central do alvo de foco automático, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00058] As Figuras 13A, 13B e 13C representam vistas de sensores de temperatura de célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00059] A Figura 13D representa aspectos de técnicas de remoção de bolhas de célula de fluxo, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00060] As Figuras 14A e 14B fornecem vistas laterais em corte transversal que ilustram aspectos de sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00061] A Figura 14C representa uma vista lateral em corte transversal de uma célula de fluxo que ilustra aspectos de sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00062] A Figura 14D fornece uma vista lateral em corte transversal que ilustra aspectos de sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00063] A Figura 15 representa aspectos de técnicas de focalização e padrão de foco automático, de acordo com as modalidades da presente invenção.

[00064] As Figuras 16A e 16B mostram aspectos de sistemas e métodos de focalização, de acordo com as modalidades da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00065] A presente revelação se refere a analisador, sistemas, composições e métodos para analisar uma amostra de urina que contém partículas. Em uma modalidade, a invenção se refere a um sistema de imageamento de partícula automatizado que pode compreender um analisador visual. Em algumas modalidades, o analisador visual pode compreender adicionalmente um processador para facilitar a análise automatizada das imagens. As partículas de urina exemplificadoras podem incluir partículas de sedimento urinário. As partículas de sedimento urinário exemplificadores podem incluir eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e fragmentos de célula. As células exemplificadoras podem incluir glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e células epiteliais. Os cálculos exemplificadores podem incluir cálculos de pigmento acelulares, cálculo não classificado (por exemplo, cálculos granulares). Os cálculos acelulares exemplificadores podem incluir, por exemplo, cálculos cerosos, cálculos amplos, cálculos graxos e cálculos cristais. Os cálculos celulares exemplificadores podem incluir, por exemplo, cálculos de RBC, cálculos de WBC e cálculos celulares. Os cristais exemplificadores podem incluir, por exemplo, oxalato de cálcio, fosfato triplo, fosfato de cálcio, ácido úrico, carbonato de cálcio, leucina, cistina, tirosina e cristais amorfos. As células epiteliais não escamosas exemplificadoras podem incluir, por exemplo, células epiteliais renais e células epiteliais transicionais. A levedura exemplificadora pode incluir, por exemplo, levedura de germinação e levedura com pseudo-hifas. A partícula de sedimento urinário exemplificadora pode também incluir nódulos de RBC, gordura, corpos de gordura ovais e tricomonas.

[00066] De acordo com esta revelação, é fornecido um sistema que compreende um analisador para obtenção de imagens de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido. O sistema pode ser útil, por exemplo, na caracterização de partículas em fluídos biológicos, tais como na detecção e quantificação de eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e fragmentos de célula, categorização e subcategorização, contagem e análise. Outros usos similares, tais como caracterização de células e partículas a partir de outro fluidos, também são contemplados.

[00067] A discriminação de partículas de sedimento urinário em uma amostra de urina é uma aplicação exemplificadora para qual o assunto é particularmente bem adequado. A amostra é preparada por técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica como uma corrente de amostra em formato de fita delgada a ser imageada periodicamente, enquanto que a corrente de amostra em formato de fita flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (tais como em urina) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas e contadas, com o uso de técnicas de processamento programado de dados de imagens de pixel, de maneira exclusivamente automática ou com assistência humana limitada, para identificar e contar células e/ou partículas. Em adição às imagens de célula, as quais podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de traços críticos ou incomuns de partículas, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria particular de célula ou partícula distinguida nas imagens de amostra registradas.

[00068] As contagens das diferentes partículas encontradas em cada imagem podem ser processadas adicionalmente, por exemplo, usadas para acumular razões exatas e estatisticamente significativas de contagens de célula de cada categoria e/ou subcategoria distinguida na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação com base em imagem (por exemplo, visual) pode ser diluída, mas as razões de contagens de célula em cada categoria e/ou subcategoria são proporcionalmente representadas na amostra diluída, particularmente após uma série de imagens ter sido processada.

Urinálise - Sistema de análise de partículas

[00069] Novamente com referência aos desenhos, a Figura 1 mostra esquematicamente uma célula de fluxo exemplificadora 22 para transportar um fluido de amostra através de uma zona de visualização 23 de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 em uma configuração para imageamento de partículas microscópicas em uma corrente de amostra 32 com o uso de processamento de imagem digital. A célula de fluxo 22 é acoplada a uma fonte 25 de fluido de amostra que pode ter sido submetida ao processamento, tal como contato com uma composição de agente de contraste de partículas e aquecimento. A célula de fluxo 22 também é acoplada a uma ou mais fontes 27 de fluido envoltório ou um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL), tal como uma solução de glicerol límpida que tem uma viscosidade que é maior que a viscosidade do fluido de amostra.

[00070] O fluido de amostra é injetado através de uma abertura aplanada em uma extremidade distal 28 de um tubo de alimentação de amostra 29, e no interior da célula de fluxo 22 em um ponto em que o fluxo de PIOAL tem sido substancialmente estabelecido resultando em um fluxo laminar simétrico e estável do PIOAL acima e abaixo (ou um lados opostos) da corrente de amostra em formato de fita. As correntes de amostra e PIOAL podem ser supridas por bombas de medição de precisão que movem o PIOAL com o fluido de amostra injetado ao longo de uma trajetória de fluxo que se estreita substancialmente. O PIOAL envolve e comprime o fluido de amostra na zona 21 em que a trajetória de fluxo se estreita. Por conseguinte, a diminuição em espessura de trajetória de fluxo na zona 21 pode contribuir para uma focalização geométrica da corrente de amostra 32. A fita de fluido de amostra 32 é envolvida e carregada junto com o PIOAL a jusante da zona de estreitamento 21, passando na frente ou de outro modo através da zona de visualização 23 do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24, em que as imagens são coletadas, por exemplo, com o uso de um CCD 48. O processador 18 pode receber, como entrada, dados de pixel a partir do CCD 48. A fita de fluido de amostra flui em conjunto com o PIOAL para uma descarga 33.

[00071] Conforme mostrado aqui, a zona de estreitamento 21 pode ter uma porção de trajetória de fluxo proximal 21a que tem uma espessura proximal PT e uma porção de trajetória de fluxo distal 21b que tem uma espessura distal DT, de tal modo que a espessura distal DT seja menor que a espessura proximal PT. O fluido de amostra pode ser, portanto, injetado através da extremidade distal 28 do tubo de amostra 29 em um local que é distal à porção proximal 21a e proximal à porção distal 21b. Por conseguinte, o fluido de amostra pode entrar no envelope de PIOAL à medida que a corrente de PIOAL é comprimida pela zona 21.

[00072] O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital 24 com lente objetiva 46 é direcionado ao longo de um eixo geométrico óptico que cruza a corrente de amostra em formato de fita 32. A distância relativa entre a lente objetiva 46 e a célula de fluxo 33 é variável pela operação de um acionamento de motor 54, para separar e coletar uma imagem digitalizada focalizada em uma matriz de fotossensor.

[00073] A presente revelação apresenta uma técnica para alcançar automaticamente uma posição de trabalho correta do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 para focalizar na corrente de amostra em formato de fita 32. A estrutura de célula de fluxo 22 pode ser configurada de tal modo que a corrente de amostra em formato de fita 32 tenha um local fixo e confiável dentro da célula de fluxo que define a trajetória de fluxo de fluido de amostra, em uma fita delgada entre camadas de PIOAL, passando através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo 22. Em determinadas modalidades de célula de fluxo, a seção transversal da trajetória de fluxo para o PIOAL se estreita simetricamente no ponto em que a amostra é inserida através de um orifício aplanado, tal como um tubo 29 com um lúmen retangular no orifício, ou cânula. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área em seção transversal por uma razão de 20:1, ou por uma razão entre 20:1 a 70:1) junto com uma viscosidade diferencial entre o PIOAL e os fluidos de amostra e, opcionalmente, uma diferença em velocidade linear do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para comprimir a seção transversal da amostra por uma razão entre cerca de 20:1 a 70:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura em seção transversal pode ser de 40:1.

[00074] Em um aspecto, a natureza simétrica da célula de fluxo 22 e a maneira de injeção do fluido de amostra e PIOAL fornecem uma posição repetível dentro da célula de fluxo 22 para a corrente de amostra em formato de fita 32 entre as duas camadas do PIOAL. Como resultado, as variações do processo, tais como as velocidades lineares específicas da amostra e do PIOAL; não tendem a deslocar a corrente de amostra em formato de fita a partir de seu local no fluxo. Em relação à estrutura da célula de fluxo 22, o local da corrente de amostra em formato de fita 32 é estável e repetível.

[00075] Entretanto, as posições relativas da célula de fluxo 22 e do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 do sistema óptico podem ser submetidas à mudança e podem se beneficiar de ajustes de posição ocasionais para manter uma distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a corrente de amostra em formato de fita 32, fornecendo, assim, uma imagem de foco de qualidade das partículas envelopadas na corrente de amostra em formato de fita 32. De acordo com algumas modalidades, pode existir uma distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a corrente de amostra em formato de fita 32 para obter imagens focalizadas das partículas envelopadas. A óptica pode ser primeiramente posicionada com exatidão em relação à célula de fluxo 22 por foco automático ou outras técnicas para localizar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 na distância ideal ou desejada de um alvo de foco automático 44 com uma posição fixa em relação à célula de fluxo 22. A distância de deslocamento entre o alvo de foco automático 44 e a corrente de amostra em formato de fita 32 é conhecida de maneira precisa, por exemplo, como resultado de etapas de calibração inicial. Após a focalização automática sobre o alvo de foco automático 44, a célula de fluxo 22 e/ou dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 é, então, deslocado sobre a distância de deslocamento conhecida entre o alvo de foco automático 44 e a corrente de amostra em formato de fita 32. Como resultado, a lente objetiva do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 44 é focalizada de maneira precisa sobre a corrente de amostra em formato de fita 32 que contém as partículas envelopadas.

[00076] As modalidades exemplificadoras da presente invenção envolvem a focalização automática sobre o alvo de imageamento ou foco 44, que é uma figura de alto contraste que define um local conhecido ao longo do eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital 24. O alvo 44 pode ter uma distância de deslocamento conhecida em relação ao local da corrente de amostra em formato de fita 32. Um algoritmo de medição de contraste pode ser empregado especificamente nos traços alvo. Em um exemplo, a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 pode ser variada ao longo de um linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital, para encontrar a profundidade ou distância na qual uma ou mais amplitudes diferenciais máximas são encontradas entre os valores de luminância de pixel que ocorrem ao longo de uma linha de pixels na imagem que é conhecida por cruzar uma borda da figura de contraste. Em alguns casos, o padrão de foco automático não tem variação ao longo da linha paralela ao eixo geométrico óptico, a qual também é a linha ao longo da qual um controle motorizado opera para ajustar a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 para fornecer a distância de deslocamento registrada.

[00077] Dessa forma, pode não ser necessário focalizar automaticamente ou depender de um aspecto de conteúdo de imagem que é variável entre diferentes imagens, isto é, menos altamente definido como contraste, ou que poderia estar localizado em algum lugar em uma faixa de posições, como a base para determinar um local de distância para referência. Tendo encontrado o local de foco ideal ou desejado sobre o alvo de foco automático 44, as posições relativas da objetiva do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e da célula de fluxo 22 podem ser deslocadas pela distância de deslocamento registrada para fornecer a posição de foco ideal ou desejada para as partículas na corrente de amostra em formato de fita 32.

[00078] De acordo com algumas modalidades, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 pode resolver uma imagem da corrente de amostra em formato de fita 32 como iluminado por trás por uma fonte de luz 42 aplicada através de uma abertura de iluminação (janela) 43. Nas modalidades mostradas na Figura 1, o perímetro da abertura de iluminação 43 forma um alvo de focalização automática 44. Entretanto, o objetivo é coletar uma imagem precisamente focalizada da corrente de amostra em formato de fita 32 através da óptica do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 46 em uma matriz de elementos fotossensíveis, tal como um dispositivo acoplado de carga integrada.

[00079] O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e sua óptica 46 são configurados para separar uma imagem das partículas na corrente de amostra em formato de fita 32 que está em foco em distância 50, tal distância pode ser um resultado das dimensões do sistema óptico, do formato das lentes e dos índices de refração de seus materiais. Em alguns casos, a uma distância ideal ou desejada entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e a corrente de amostra em formato de fita 32 não mudam, mas a distância entre a célula de fluxo 22 e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e sua óptica 46 pode ser alterada. O movimento do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e/ou célula de fluxo 22 para mais próximo ou mais afastado, um em relação ao outro (por exemplo, ajustando-se a distância 51 entre o dispositivo de imageamento 24 e a célula de fluxo 22), move o local do ponto de focalização na extremidade da distância 50 em relação à célula de fluxo.

[00080] De acordo com as modalidades da presente invenção, um alvo de foco 44 pode estar localizado a uma distância da corrente de amostra em formato de fita 32, nesse caso, fixo diretamente à célula de fluxo 22 nas bordas da abertura 43 para luz a partir da fonte de iluminação 42. O alvo de foco 44 está em uma distância de deslocamento constante 52 a partir da corrente de amostra em formato de fita 32. Muitas vezes, a distância de deslocamento 52 é constante devido ao fato de que o local da corrente de amostra em formato de fita 32 na célula de fluxo pode permanecer constante.

[00081] Um procedimento de foco automático exemplificador envolveajustar as posições relativas do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e célula de fluxo 22 com o uso de um motor 54 para fazer com que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 focalize sobre o alvo de foco automático 44. Nesse exemplo, o alvo de foco automático 44 está atrás da corrente de amostra em formato de fita 32 na célula de fluxo. Então, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e/ou célula de fluxo 22 são movidos um em direção ao outro até que os procedimentos de foco automático estabeleçam que a imagem separada no fotossensor seja uma imagem focalizada com exatidão do alvo de foco automático 44. Então, o motor 54 é operado para deslocar as posições relativas do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e célula de fluxo 22 para fazer com que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica focalize na corrente de amostra em formato de fita 32, ou seja, movendo-se o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e/ou célula de fluxo 22 para longe um do outro, precisamente pela amplitude da distância de deslocamento 52.

[00082] Essas direções de movimento seriam, certamente, invertidas se o alvo de foco 44 estivesse localizado na janela de visualização frontal em oposição à janela de iluminação traseira 43. Nesse caso, a distância de deslocamento seria a amplitude entre a corrente de amostra em formato de fita 32 e um alvo 44 na porta de visualização frontal (não mostrada).

[00083] A distância de deslocamento 52, a qual é igual à distância entre a corrente de amostra em formato de fita 32 e o alvo de foco automático 44 ao longo do eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24, pode ser estabelecida em uma etapa de calibração de fábrica. Tipicamente, quando estabelecida, a distância de deslocamento 52 não se altera. As vibrações e variações de expansão térmica podem fazer com que a posição precisa do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e célula de fluxo 22 varie um em relação ao outro, necessitando, assim, da reiniciação do processo de foco automático. Porém, a focalização automática no alvo 44 fornece uma referência de posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22 e, desse modo, fixa em relação à corrente de amostra em formato de fita 32. De modo semelhante, a distância de deslocamento é constante. Portanto, focalizando-se automaticamente o alvo 44 e deslocando-se o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e célula de fluxo 22 através da amplitude da distância de deslocamento, o resultado é que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica focaliza sobre a corrente de amostra em formato de fita 32.

[00084] De acordo com algumas modalidades, o alvo de focalização é fornecido como um círculo de alto contraste impresso ou aplicado em torno da abertura de iluminação 43. As configurações de alvo de focalização alternativas são discutidas em outro local no presente documento. Quando uma imagem quadrada ou retangular é coletada em foco sobre o alvo 44, uma margem de alto contraste aparece em torno do centro de iluminação. A procura da posição na qual o contraste maior é obtido na imagem nas bordas internas da abertura focaliza automaticamente o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica no local de trabalho do alvo 44. De acordo com algumas modalidades, o termo "distância de trabalho" pode se referir à distância entre a objetiva e seu plano focal e o termo "local de trabalho" pode se referir ao plano focal do dispositivo de imageamento. A medição de contraste maior de uma imagem é onde os pixels medidos em preto mais escuro e branco mais brilhante estão adjacentes um ao outro ao longo de uma linha através de uma borda interna. A medição de contraste maior pode ser usada para avaliar se o plano focal do dispositivo de imageamento está na posição desejada em relação ao alvo 44. Outras técnicas de foco automático também podem ser usadas, tais como a integração das diferenças em amplitude entre pixels adjacentes e procura da soma maior de diferenças. Em uma técnica, a soma de diferenças é calculada em três distâncias que abrangem posições de trabalho em qualquer lado do alvo 44 e correspondendo os valores resultantes com uma curva característica, em que a distância ideal é no valor de pico na curva. De modo correspondente, as técnicas de foco automático exemplificadoras podem envolver coletar imagens do alvo de célula de fluxo em diferentes posições e analisar as imagens para encontrar a melhor posição de foco com o uso de uma medida que é maior quando a imagem do alvo é mais nítida. Durante uma primeira etapa (grossa), a técnica de foco automático pode operar para encontrar uma melhor posição preliminar a partir de um conjunto de imagens coletadas em intervalos de 2,5 μm. A partir dessa posição, a técnica de foco automático pode, então, envolver a coleta de um segundo conjunto de imagens (finas) em intervalos de 0,5 μm e o cálculo da melhor posição de foco final sobre o alvo.

[00085] Em alguns casos, o alvo de foco (padrão de foco automático) pode se encontrar na periferia da área de visão na qual a amostra deve aparecer. Também é possível que o alvo de foco possa ser definido contrastando os formatos que se encontram no campo de visão, tais como aqueles representados na Figura 15. Tipicamente, o alvo de foco automático é montado sobre a célula de fluxo ou fixado rigidamente em posição fixa em relação à célula de fluxo. Sob a potência de um motor de posicionamento controlado por um detector responsivo à maximização do contraste da imagem do alvo de focalização automática, o aparelho focaliza automaticamente no alvo em oposição à corrente de amostra em formato de fita. Então, deslocando-se a célula de fluxo e/ou o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica um em relação ao outro, pela distância de deslocamento conhecida como a distância entre o alvo de foco automático e a corrente de amostra em formato de fita, a posição de trabalho do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é deslocada a partir do alvo de foco automático para a corrente de amostra em formato de fita. Como resultado, a corrente de amostra em formato de fita aparece em foco na imagem digital coletada.

[00086] Com a finalidade de distinguir tipos de partícula por meio de técnicas de processamento de dados, tais como categorias e/ou subcategorias de glóbulos vermelhos e glóbulos brancos, é vantajoso registrar as imagens de pixel microscópico que têm resolução e claridade suficiente para revelar os aspectos que distinguem uma categoria ou subcategoria das outras. É um objetivo da invenção facilitar as técnicas de foco automático conforme descrito.

[00087] Em uma modalidade prática, o aparelho pode ser com base em uma disposição de bancada óptica, tal como mostrado na Figura 1A e conforme ampliado na Figura 1B, que tem uma fonte de iluminação 42 direcionada para uma célula de fluxo 22 montada em um suporte a cardan 55, que ilumina por trás os conteúdos da célula de fluxo 22 em uma imagem obtida por um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24. O suporte de célula de fluxo 55 é montado em um acionamento de motor para que seja móvel de maneira precisa em direção a e para longe do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24. O suporte a cardan 55 também permite um alinhamento preciso da célula de fluxo em relação ao eixo geométrico de visualização óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital, de modo que a corrente de amostra em formato de fita flua em um plano ortogonal ao eixo geométrico de visualização na zona em que a corrente de amostra em formato de fita é imageada, ou seja, entre a abertura de iluminação 43 e a porta de visualização 57, conforme representado na Figura 1. O alvo de foco 44 pode ajudar no ajuste do suporte a cardan 55, por exemplo, para estabelecer o plano da corrente de amostra em formato de fita ortogonal ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital.

[00088] Por conseguinte, o sustentáculo ou suporte de célula de fluxo 55 fornece o ajuste linear e angular muito preciso da posição e orientação de célula de fluxo 22, por exemplo, em relação ao dispositivo de captura de imagem 24 ou à objetiva do dispositivo de captura de imagem. Conforme mostrado aqui, o suporte 55 inclui dois pontos de pivô 55a, 55b para facilitar o ajuste angular do suporte e célula de fluxo em relação ao dispositivo de captura de imagem. Os pontos de pivô de ajuste angular 55a, 55b estão localizados no mesmo plano e centralizados para o canal de célula de fluxo (por exemplo, no sítio de captura de imagem). Isso permite o ajuste dos ângulos sem causar qualquer translação linear da posição de célula de fluxo. O suporte 55 pode ser girado em torno de um eixo geométrico do ponto de pivô 55a ou em torno de um eixo geométrico do ponto de pivô 55b ou em torno de ambos os eixos geométricos. Tal rotação pode ser controlada por um processador e um mecanismo de controle de movimento de célula de fluxo, tal como processador 440 e mecanismo de controle de célula de fluxo 442 representados na Figura 4.

[00089] Novamente com referência à Figura 1B, pode ser visto que qualquer um dentre ou tanto o dispositivo de captura de imagem 24 como o suporte 55 (junto com a célula de fluxo 22) podem ser girados ou transladados ao longo de diversos eixos geométricos (por exemplo, X, Y, Z) em três dimensões. Por conseguinte, uma técnica exemplificadora para ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem pode incluir implantar a rotação axial do dispositivo de captura de imagem 24 em torno do eixo geométrico de imageamento, por exemplo, girando-se o dispositivo 24 em torno do eixo geométrico X. O ajuste de foco pode também ser alcançado pela rotação axial da célula de fluxo 22 e/ou suporte 55 em torno de um eixo geométrico que se estende ao longo do eixo geométrico de imageamento, por exemplo, em torno do eixo geométrico X, e dentro do campo de visão do dispositivo de imageamento. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação de ponta (por exemplo, rotação em torno do eixo geométrico Y) do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação de ponta (por exemplo, rotação em torno do eixo geométrico Y, ou em torno do ponto de pivô 55a) da célula de fluxo. Conforme representado aqui, o ponto de pivô 55a corresponde a um eixo geométrico Y que se estende ao longo de e dentro da trajetória de fluxo da célula de fluxo. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação de inclinação (por exemplo, rotação em torno do eixo geométrico Z) do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o ajuste de foco pode incluir a rotação de inclinação (por exemplo, rotação em torno do eixo geométrico Z, ou em torno do ponto de pivô 55b) da célula de fluxo. Conforme representado aqui, o ponto de pivô 55b corresponde a um eixo geométrico Z que atravessa a trajetória de fluxo e o eixo geométrico de imageamento. Em alguns casos, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado na corrente de amostra implantando-se uma rotação da célula de fluxo (por exemplo, em torno do eixo geométrico X), de tal modo que a rotação seja centralizada no campo de visão do dispositivo de captura de imagem. Os ajustes rotacionais tridimensionais descritos no presente documento podem ser implantados a fim de responder pelo desvio posicional em um ou mais componentes do sistema analisador. Em alguns casos, os ajustes rotacionais tridimensionais podem ser implantados a fim de responder pelas flutuações de temperatura em um ou mais componentes do sistema analisador. Em alguns casos, o ajuste de um sistema analisador pode incluir transladar o dispositivo de imageamento 24 ao longo do eixo geométrico X. Em alguns casos, o ajuste do sistema analisador pode incluir transladar o suporte 55 ou célula de fluxo 22 ao longo do eixo geométrico X.

[00090] De acordo com algumas modalidades, um analisador visual para obter imagens de uma amostra que contém partículas suspensas em um líquido inclui a célula de fluxo 22, acoplada a uma fonte 25 da amostra e a uma fonte 27 de fluido envoltório ou material de PIOAL, conforme representado na Figura 1. Conforme visto na vista em corte da Figura 3, a célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo interna que se estreita simetricamente na direção de fluxo (direita para esquerda na Figura 3 ou fundo para o topo na Figura 1). A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo, ou seja, atrás da porta de visualização 57.

[00091] Com referência novamente à Figura 1, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital 24 com lente objetiva 46 é direcionado ao longo de um eixo geométrico óptico que cruza a corrente de amostra em formato de fita 32. A distância relativa entre a objetiva 46 e a célula de fluxo 33 é variável pela operação de um acionamento de motor 54, para separar e coletar uma imagem digitalizada focalizada em uma matriz de fotossensor.

[00092] O padrão de foco automático 44, que tem uma posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22, está situado em uma distância de deslocamento 52 a partir do plano da corrente de amostra em formato de fita 32. Na modalidade mostrada, o padrão de foco automático (alvo 44) é aplicado diretamente à célula de fluxo 22 em um local que é visível na imagem coletada pelo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24. Em uma outra modalidade, o alvo pode ser carregado em uma parte que é rigidamente fixa em posição em relação à célula de fluxo 22 e à corrente de amostra em formato de fita 32 na mesma, se não aplicado diretamente ao corpo da célula de fluxo de uma maneira integral.

[00093] A fonte de luz 42, a qual pode ser uma fonte estacionária ou pode ser um estroboscópio que é brilhado no devido tempo com a operação do fotossensor de dispositivo de imageamento de alta resolução óptica, é configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita 32 e também para contribuir com o contraste do alvo 44. Na modalidade representada, a iluminação é a partir da iluminação traseira.

[00094] A Figura 1C fornece um diagrama de blocos que mostra aspectos adicionais de um analisador de urinálise exemplificador. Conforme mostrado aqui, o analisador 100c inclui ao menos um processador digital 18 acoplado para operar o acionamento de motor 54 e para analisar a imagem digitalizada a partir da matriz de fotossensor, conforme coletada em diferentes posições de foco em relação ao padrão de foco automático alvo 44. O processador 18 é configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático 44, isto é, para focalizar automaticamente o padrão de foco automático alvo 44 e, desse modo, estabelecer uma distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e o padrão de foco automático 44. Isso pode ser realizado por etapas de processamento de imagem, tais como aplicar um algoritmo para avaliar o nível de contraste na imagem em uma primeira distância, o qual pode se aplicar à imagem inteira ou ao menos em uma borda do padrão de foco automático 44. O processador move o motor 54 para outra posição e avalia o contraste nessa posição ou borda, e depois de duas ou mais iterações determina uma distância ideal que maximiza a exatidão do foco sobre o padrão de foco automático 44 (ou que otimizaria a exatidão do foco se movido para essa posição). O processador depende do espaçamento fixo entre o padrão de foco automático 44 do alvo de foco automático e a corrente de amostra em formato de fita, o processador 18, então, controla o motor 54 para mover o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 para a distância correta para focalizar sobre a corrente de amostra em formato de fita 32. Mais particularmente, o processador opera o motor para deslocar a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita 32 pela distância de deslocamento 52 (por exemplo, conforme representado na Figura 1) por meio da qual a corrente de amostra em formato de fita é deslocada do padrão de foco automático alvo 44. Dessa forma, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é focalizado sobre a corrente de amostra em formato de fita.

[00095] O motor 54 pode compreender um motor de passo com engrenagens com precisão um pouco menor que os traços distintivos imageados pelo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou pelo dispositivo de captura de imagem digital, especificamente os aspectos de células sanguíneas. Desde que o local do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 seja ajustado para localizar a posição da objetiva óptica dentro da largura da corrente de amostra em formato de fita, a vista da célula/partícula na corrente de amostra em formato de fita está em foco. Um padrão de foco automático 44 pode estar situado em uma borda de um campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital, e não interferir com a visualização por essa razão.

[00096] Adicionalmente, quando o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é movido sobre a distância de deslocamento e o padrão de foco automático não sai do foco, os traços que aparecem em foco são as células sanguíneas em oposição ao padrão de foco automático. Na modalidade da Figura 15, por exemplo, o padrão de foco automático é definido por formatos no campo de visão. Os formatos são formas discretas relativamente finas de um tamanho limitado e, portanto, após o movimento pela distância de deslocamento, as formas se tornam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizada sobre a corrente de amostra em formato de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, de 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para aplicações de imageamento de urinálise Em algumas modalidades, o recurso de foco automático mantém o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica dentro de 1 μm da distância de foco ideal.

[00097] O contorno interno da célula de fluxo e as taxas de fluxo de PIOAL e amostra podem ser ajustados de tal modo que a amostra seja formada em uma corrente em formato de fita. A corrente pode ser aproximadamente tão fina quanto ou até mais fina que as partículas que são envelopadas na corrente de amostra em formato de fita. Os glóbulos brancos podem ter um diâmetro em torno de 10 μm, por exemplo. Mediante o fornecimento de uma corrente de amostra em formato de fita com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em formato de fita é estendida pelo fluido envoltório, ou PIOAL. Surpreendentemente, o estiramento da corrente de amostra em formato de fita ao longo de uma trajetória de fluxo de estreitamento dentro de camadas de PIOAL de viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, tal como viscosidade maior, tende vantajosamente a alinhar partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, e aplicar forças sobre as células, aperfeiçoando os conteúdos em foco de estruturas intracelulares de células. O eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 é substancialmente ortogonal (perpendicular) ao plano da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita no ponto de imageamento pode ser, por exemplo, de 20 a 200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, de 50 a 150 mm/segundo. Outra modalidade do fluido envoltório pode ser a solução LAMINA™ (IRIS International, Inc.). LAMINA™ pode ter um pH em torno de 7,0 e uma gravidade específica de 1,007 a 20 °C. Em uma modalidade relacionada, um fluido envoltório pode ser fornecido como uma solução salina. Em algumas modalidades, o fluido envoltório é uma composição de sal aquosa. Em algumas modalidades, a viscosidade do fluido envoltório é igual ou similar à viscosidade do fluido de amostra.

[00098] A corrente de amostra em formato de fita espessura pode ser afetada pelas viscosidades relativas e taxas de fluxo do fluido de amostra e do PIOAL. Novamente com referência a Figura 1, a fonte 25 da amostra e/ou a fonte 27 do fluido envoltório ou PIOAL, por exemplo, que compreende bombas de deslocamento de precisão, pode ser configurada para fornecer a amostra e/ou o PIOAL em taxas de fluxo controláveis para otimizar as dimensões da corrente de amostra em formato de fita 32, ou seja, como uma fita delgada ao menos tão ampla quanto o campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24.

[00099] Em uma modalidade, a fonte 27 do fluido envoltório ou PIOAL é configurada para fornecer o PIOAL em uma viscosidade predeterminada. Essa viscosidade pode ser diferente da viscosidade da amostra e pode ser maior que a viscosidade da amostra. A viscosidade e a densidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a taxa de fluxo do PIOAL e a taxa de fluxo da amostra material são coordenadas para manter a corrente de amostra em formato de fita na distância de deslocamento a partir do padrão de foco automático, e com características dimensionais predeterminadas, tais como uma espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa.

[000100] Em uma modalidade prática, o PIOAL tem uma velocidade linear maior que a amostra e uma viscosidade maior que a amostra, estirando, assim, a amostra na fita plana. Em alguns casos, a viscosidade de PIOAL pode ser de até 10 centipoise.

[000101] Na modalidade mostrada na Figura 1C, o mesmo processador digital 18 que é usado para analisar a imagem digital de pixel obtida a partir da matriz de fotossensor também é usado para controlar o motor de focalização automática 54. Entretanto, tipicamente o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 não é focalizado automaticamente para cada imagem capturada. O processo de foco automático pode ser realizado periodicamente (no início do dia ou no início de um deslocamento) ou, por exemplo, quando a temperatura ou outras mudanças do processo são detectadas por sensores adequados, ou quando a análise de imagem detecta uma necessidade potencial de refocalização. Em alguns casos, um processo de focalização automática automatizado pode ser realizado dentro de uma duração de tempo de cerca de 10 segundos. Em alguns casos, um procedimento de foco automático pode ser realizado antes do processamento de uma prateleira de amostras (por exemplo, 10 amostras por prateleira). Também é possível, em outras modalidades, ter a análise de imagem de amostra de urina realizada por um processador e ter um processador separado, opcionalmente associado a sua própria matriz de fotossensor, disposto para manusear as etapas de focalização automática a um alvo fixo 44.

[000102] O processador digital 18 pode ser configurado para foco automático em tempo programados ou em condições programadas ou sob demanda do usuário, e também é configurado para realizar a categorização e subcategorização com base em imagem das partículas. As partículas exemplificadoras incluem células, glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e similares.

[000103] Em uma modalidade, o processador digital 18 da Figura 1 ou Figura 1C é configurado para detectar um sinal de reiniciação de foco automático. O sinal de reiniciação de foco automático pode ser disparado por uma mudança detectada em temperatura, uma diminuição em qualidade de foco, conforme discernido por parâmetros da data de imagem de pixel, passagem do tempo, ou entrada de usuário. Vantajosamente, não é necessário recalibrar no sentido de medir a distância de deslocamento 52 representada na Figura 1 a recalibrar. Opcionalmente, o foco automático pode ser programado para recalibrar em determinadas frequências/intervalos entre execuções para o controle de qualidade e/ou para manter o foco.

[000104] A distância de deslocamento 52 varia ligeiramente de uma célula de fluxo a uma outra, mas permanece constante para uma determinada célula de fluxo. Conforme um processo de configuração, quando se equipa um analisador de imagem com uma célula de fluxo, a distância de deslocamento é primeiramente estimada e, então, durante as etapas de calibração em que os aspecto de imageamento e foco automático são exercitados, a distância de deslocamento exata para a célula de fluxo é determinada e inserida como uma constante na programação do processador 18.

[000105] Consequentemente, conforme mostrado na forma de fluxograma na Figura 1D, e com referência ao analisador de urinálise da Figura 1 e/ou Figura 1C, o processo realizado de acordo com os métodos e aparelho revelados podem envolver a calibração uma vez ou raramente. A calibração pode incluir focalizar sobre o alvo de contraste 44, focalizar sobre a corrente de amostra em formato de fita 32 e observar o deslocamento ao longo do eixo geométrico óptico entre esses dois locais, conforme indicado na etapa 110d. Esse deslocamento pode ser observado como uma constante. Posteriormente, mediante o controle do motor 54 e a análise de dados da imagem a partir da matriz de fotossensor, o processador 18 focaliza automaticamente no alvo 44 e desloca o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e/ou célula de fluxo 22 um em relação ao outro pela distância de deslocamento observada, conforme indicado na etapa 120d. A corrente de amostra em formato de fita 32 está, então, em foco e sua imagem pode ser coletada (conforme indicado na etapa 130d) e processada (conforme indicado na etapa 140d) em intervalos regulares, especificamente em intervalos suficientes para coletar vistas adjacentes substancialmente não sobrepostas de porções da corrente de amostra em formato de fita que passam através da zona de visualização na porta de visualização 57. Quando o automonitoramento (conforme indicado na etapa 150d) revela uma anormalidade de dados ou uma mudança de temperatura que poderia ter alterado as posições relativas do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 e célula de fluxo 22 devido às diferenças em expansão térmica, então, o foco automático (conforme indicado na etapa 160d) é iniciado, depois do qual a operação regular se reinicia. Por conseguinte, um processo de focalização automática pode incluir detectar um sinal de reiniciação de foco automático e repetir as etapas de focalização automática e aquisição de imagem em resposta ao sinal de reiniciação de foco automático. Em algumas modalidades, o sinal de reiniciação de foco automático pode incluir ou ter como base a mudança em temperatura, uma diminuição em qualidade de foco, um intervalo de tempo transcorrido ou uma entrada de usuário.

[000106] A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser limitada de maneira suficiente para evitar obscuridade de movimento da imagem digitalizada no tempo de exposição de imagem da matriz de fotossensor. A fonte de luz pode, opcionalmente, ser uma luz estroboscópica que brilha para aplicar alta amplitude incidente por um tempo breve. Na medida em que o padrão de foco automático 44 e a imagem estão no mesmo campo de visão, a fonte de luz é configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático simultaneamente. Entretanto, em outras modalidades, o campo de visão para o imageamento e para o foco automático pode ser diferente, por exemplo, iluminado e/ou imageado separadamente.

[000107] Os presentes desenvolvimentos têm aspectos do método, assim como do aparelho. Um método para focalizar um analisador visual compreende focalizar um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24, o qual pode ser um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital ou o dispositivo de captura de imagem digital, em um padrão de foco automático 44 fixo em relação a uma célula de fluxo 22, em que o padrão de foco automático 44 está situado em uma distância de deslocamento 52 a partir de uma corrente de amostra em formato de fita 32. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital 24 tem uma objetiva com um eixo geométrico óptico que cruza a corrente de amostra em formato de fita 32. Uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo 22 é variada pela operação de um acionamento de motor 54, enquanto que a distância ao longo do eixo geométrico óptico entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e o ponto de foco ideal é conhecido. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital é configurado para separar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. O acionamento de motor é operado para focalizar sobre o padrão de foco automático em um processo de foco automático. O acionamento de motor, então, é operado sobre a distância de deslocamento, focalizando, assim, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica sobre a corrente de amostra em formato de fita.

[000108] É possível usar a focalização automática sobre o alvo e deslocamento pela distância de deslocamento para obter uma distância adequada para focalizar sobre a corrente de amostra em formato de fita. Vantajosamente, entretanto, a focalização automática não é necessária ou repetida para cada captura de imagem. Entretanto, a focalização automática é começada em determinadas condições. Um sinal de reiniciação de foco automático pode ser detectado ou gerado, levando às etapas de refocalizar sobre o padrão de foco automático, operar o acionamento de motor sobre a distância de deslocamento e refocalizar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica sobre a corrente de amostra em formato de fita. O sinal de reiniciação de foco automático pode ser causado pela detecção de uma mudança, por exemplo, em temperatura, uma diminuição em qualidade de foco, a passagem do tempo, outros parâmetros de processo ou entrada de usuário.

[000109] A Figura 1E é um diagrama de blocos simplificado de um sistema de módulo exemplificador que ilustra amplamente como os elementos individuais do sistema para um sistema de módulo 100e podem ser implantados de uma maneira separada ou mais integrada. O sistema de módulo 100e pode ser parte de ou estar em conectividade com um sistema de análise de partículas para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido corpóreo, tal como uma amostra de urina, de acordo com as modalidades da presente invenção. O sistema de módulo 100e é bem adequado para produzir dados ou instruções relacionadas às técnicas de focalização e imageamento, receber entrada relacionada às técnicas de focalização e imageamento e/ou processar informações ou dados relacionados às técnicas de focalização e imageamento, conforme descrito em outro lugar no presente documento. Em alguns casos, o sistema de módulo 100e inclui elementos de hardware que são acoplados eletricamente através de um subsistema de barramento 102e, incluindo um ou mais processadores 104e, um ou mais dispositivos de entrada 106e, tais como dispositivos de entrada de interface de usuário e/ou um ou mais dispositivos de saída 108e, tais como dispositivos de saída de interface de usuário. Em alguns casos, o sistema 100e inclui uma interface de rede 110e e/ou uma interface de sistema de imageamento 140e que pode receber sinais a partir de e/ou transmitir sinais para um sistema de imageamento 142e. Em alguns casos, o sistema 100e inclui elementos de software, por exemplo, mostrados aqui como sendo atualmente localizados dentro de uma memória de trabalho 112e de uma memória 114e, um sistema de operação 116e e/ou outro código 118e, tal como um programa configurado para implantar um ou mais aspectos das técnicas reveladas no presente documento.

[000110] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 100e pode incluir um subsistema de armazenamento 120e que pode armazenar as construções de dados e programação básica que fornecem a funcionalidade das várias técnicas reveladas no presente documento. Por exemplo, os módulos de software que implantam a funcionalidade de aspectos do método, conforme descrito aqui, podem ser armazenados em subsistema de armazenamento 120e. Esses módulos de software podem ser executados pelos um ou mais processadores 104e. Em um ambiente distribuído, os módulos de software podem ser armazenados em uma pluralidade de sistemas de computador e executados por processadores da pluralidade de sistemas de computador. O subsistema de armazenamento 120e pode incluir subsistema de memória 122e e subsistema de armazenamento de arquivo 128e. O subsistema de memória 122e pode incluir várias memórias que incluem uma memória de acesso aleatório principal (RAM) 126e para o armazenamento de instruções e dados durante a execução do programa e uma memória somente para leitura (ROM) 124e na qual as instruções fixas são armazenadas. O subsistema de armazenamento de arquivo 128e pode fornecer armazenamento persistente (não volátil) para arquivos de dados e programa e pode incluir meios de armazenamento tangíveis que podem, opcionalmente, incorporar amostra, paciente, tratamento, avaliação ou outros dados. O subsistema de armazenamento de arquivo 128e pode incluir uma unidade de disco rígido, uma unidade de disquete junto com meios removíveis associados, uma unidade de memória somente para leitura digital compacta (CD-ROM), um disco óptico, DVD, CD-R, CD RW, memória removível de estado sólido, outros discos ou cartuchos de meios removíveis e similares. Uma ou mais das unidades podem estar localizadas em locais remotos em outros computadores conectados em outros sítios acoplados ao sistema de módulo 100e. Em alguns casos, os sistemas podem incluir um meio de armazenamento legível por computador ou outro meio de armazenamento tangível que armazena uma ou mais sequências de instruções que, quando executadas por um ou mais processadores, podem fazer com que os um ou mais processadores realizem qualquer aspecto das técnicas ou métodos revelados no presente documento. Um ou mais módulos que implantam a funcionalidade das técnicas reveladas no presente documento podem ser armazenados pelo subsistema de armazenamento de arquivo 128e. Em algumas modalidades, o software ou código irá fornecer protocolo para permitir que o sistema de módulo 100e se comunique com a rede de comunicação 130e. Opcionalmente, essas comunicações podem incluir comunicações por conexão por discagem ou conexão de Internet.

[000111] É entendido que o sistema 100e pode ser configurado para realizar diversos aspectos dos métodos da presente invenção. Por exemplo, o componente ou módulo de processador 104e pode ser um módulo de controle de microprocessador configurado para receber sinais de parâmetro de temperatura e/ou parâmetros operacionais de célula de fluxo a partir de um módulo ou dispositivo de entrada de sensor 132e, a partir de um módulo ou dispositivo de entrada de interface de usuário 106e e/ou a partir de um sistema de imageamento 142e, opcionalmente através de uma interface de sistema de imagem 140e e/ou uma interface de rede 110e e uma rede de comunicação 130e. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada de sensor pode(m) incluir ou ser parte de um sistema de análise de partículas que é equipado para obter imagens de amostras de fluido corpóreo, tais como amostras de urina. Em alguns casos, o(s) dispositivo(s) de entrada de interface de usuário 106e e/ou interface de rede 110e podem ser configurados para receber sinais de parâmetro de imagem gerados por um sistema de análise de partículas que é equipado para obter parâmetros de imagem. Em alguns casos, o sistema de imageamento 142e pode incluir ou ser parte de um sistema de análise de partículas que é equipado para obter parâmetros de imagem relacionados a amostras de fluido corpóreo, tais como amostras de urina.

[000112] O componente ou módulo de processador 104e pode também ser configurado para transmitir sinais de parâmetro de análise de partículas ou sinais de parâmetro de imagem, opcionalmente processados de acordo com qualquer uma das técnicas reveladas no presente documento, para o módulo ou dispositivo de saída de sensor 136e, para o módulo ou dispositivo de saída de interface de usuário 108e, para o módulo ou dispositivo de interface de rede 110e, para a interface de sistema de imageamento 140e, ou qualquer combinação dos mesmos.Cada dos dispositivos ou módulos de acordo com as modalidades da presente invenção pode incluir um ou mais módulos de software em um meio legível por computador que é processado por um processador, ou módulos de hardware, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer dentre uma variedade de plataformas comumente usadas, como Windows, MacIntosh e Unix, juntamente com qualquer dentre uma variedade de linguagens de programação comumente usadas, pode ser usada para implementar modalidades da presente invenção.

[000113] Os dispositivos de entrada de interface de usuário 106e podem incluir, por exemplo, um touchpad, um teclado, dispositivos de apontamento, tais como um mouse, um trackball, um computador do tipo tablet gráfico, um dispositivo de varredura, um controle do tipo joystick, uma tela sensível ao toque incorporada em um visor, dispositivos de entrada de áudio, tais como sistemas de reconhecimento de voz, microfones, e outros tipos de dispositivos de entrada. Os dispositivos de entrada de usuário 106e podem também transferir por download um código executável por computador a partir de um meio de armazenamento tangível ou a partir da rede de comunicação 130e, em que o código incorpora qualquer um dos métodos ou aspectos dos mesmos revelados no presente documento. Será entendido que o software do terminal pode ser atualizado de tempos em tempos e baixado para o terminal, conforme for adequado. Em geral, o uso do termo "dispositivo de entrada" destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e exclusivos e formas para inserir informações no sistema de módulo 100e.

[000114] Os dispositivos de saída de interface de usuário 106e podem incluir, por exemplo, um subsistema de exibição, uma impressora, uma máquina de fax ou visores não visuais, tais como dispositivos de saída de áudio. O subsistema de exibição pode ser um tubo de raios catódicos (TRC), um dispositivo de painel plano, como uma tela de cristal líquido (LCD), um dispositivo de projeção, ou similares. O subsistema de exibição pode também fornecer uma exibição não visual, como através de dispositivos de saída de áudio. Em geral, o uso do termo "dispositivo de saída" destina-se a incluir uma variedade de dispositivos convencionais e exclusivos e formas para emitir informações a partir de sistema de módulo 100e para um usuário.

[000115] O subsistema de barramento 102e fornece um mecanismo para permitir que os diversos componentes e subsistemas do sistema de módulo 100e se comuniquem uns com os outros conforme pretendido ou desejado. Os diversos subsistemas e componentes do sistema de módulo 100e não precisam estar no mesmo local físico, mas podem ser distribuídos em diversos locais dentro de uma rede distribuída. Embora o subsistema de barramento 102e seja mostrado esquematicamente como um único barramento, as modalidades alternativas do subsistema de barramento podem utilizar múltiplos barramentos.

[000116] A interface de rede 110e pode fornecer uma interface para uma rede externa 130e ou outros dispositivos. A rede de comunicação externa 130e pode ser configurada para efetuar comunicações, conforme necessário ou desejado, com outras partes. A mesma pode, desse modo, receber um pacote eletrônico a partir do sistema de módulo 100e e transmitir quaisquer informações, conforme necessário ou desejado, de volta para o sistema de módulo 100e. Conforme representado aqui, a rede de comunicação 130e e/ou interface de sistema de imageamento 142e pode transmitir informações para ou receber informações a partir de um sistema de imageamento 142e que é equipado para obter imagens ou parâmetros de imagem que correspondem às amostras de fluido corpóreo, tais como amostras de urina.

[000117] Adicionalmente ao fornecimento de tais enlaces de comunicações de infra-estrutura internos ao sistema, o sistema de rede de comunicações 130e pode também fornecer uma conexão a outras redes, tais como a internet, e pode compreender um modem sem fio, com fio e/ou outro tipo de conexão de interface.

[000118] Ficará aparente ao versado na técnica que variações consideráveis podem ser usadas de acordo com requisitos específicos. Por exemplo, hardware personalizado também poderá ser usado e/ou elementos específicos poderão ser implementados no hardware, software (incluindo software portátil, como applets), ou ambos. Adicionalmente, a conexão com outros dispositivos de computação, como dispositivos de entrada/saída de rede, pode ser usada. O próprio sistema terminal de módulo 100e pode ser de tipos variados que incluem um terminal de computador, um computador pessoal, um computador portátil, uma estação de trabalho, um computador de rede, ou qualquer outro sistema de processamento de dados. Devido à natureza em evolução constante dos computadores e redes, a descrição do sistema de módulo 100e representado na Figura 1E é destinada somente como um exemplo específico para os propósitos de ilustrar uma ou mais modalidades da presente invenção. Muitas outras configurações do sistema de módulo 100e são possíveis com mais ou menos componentes que o sistema de módulo representado na Figura 1E. Qualquer um dos módulos ou componentes do sistema de módulo 100e, ou quaisquer combinações de tais módulos ou componentes, pode ser acoplado a, integrado em ou de outro modo configurado para ficar em conectividade com qualquer uma das modalidades de sistema de análise de partículas e/ou sistema de imageamento reveladas na presente invenção. De modo correspondente, qualquer dos componentes de hardware e software discutidos acima podem ser integrados com ou configurados para interfacear com outro sistema de avaliação médica ou de tratamento usado em outros locais.

[000119] Em algumas modalidades, o sistema de módulo 100e pode ser configurado para receber um ou mais parâmetros de imagem de uma amostra de fluido corpóreo, tal como uma amostra de urina, em um módulo de entrada. Os dados de parâmetro de imagem podem ser transmitidos para um módulo de avaliação, em que o diagnóstico ou outros resultados podem ser previstos ou determinados com base na análise dos dados da imagem. Os dados de imagem ou diagnóstico podem ser emitidos para um usuário do sistema através de um módulo de saída. Em alguns casos, o sistema de módulo 100e pode determinar resultados de diagnóstico para uma amostra de fluido corpóreo, tal como uma amostra de urina, por exemplo, com o uso de um módulo de diagnóstico As informações de diagnóstico podem ser emitidas para um usuário do sistema através de um módulo de saída. Opcionalmente, determinados aspectos do diagnóstico podem ser determinados por um dispositivo de saída, e transmitidos para um sistema de diagnóstico ou um subdispositivo de um sistema de diagnóstico. Qualquer um dentre uma variedade de dados relacionados às amostras de fluido corpóreo, tais como amostras de urina, ou pacientes a partir dos quais as amostras são obtidas, pode ser inserido no sistema de módulo, incluindo idade, peso, sexo, histórico de tratamento, histórico médico e similares. Os parâmetros dos regimes de tratamento ou avaliações diagnósticas podem ser determinados com base nesses dados.

[000120] De modo correspondente, em alguns casos, um sistema inclui um processador configurado para receber os dados da imagem como entrada. Opcionalmente, um processador, meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado dentro de uma máquina de urinálise ou análise de partículas. Em alguns casos, a máquina de urinálise pode gerar dados da imagem ou outras informações para entrada no processador. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado dentro de um computador, e o computador pode ser em comunicação com uma máquina de urinálise. Em alguns casos, um processador, um meio de armazenamento, ou ambos, pode ser incorporado dentro de um computador, e o computador pode ser em comunicação remota com uma máquina de urinálise através de uma rede.

Célula de fluxo

[000121] Uma modalidade prática da célula de fluxo 22 é adicionalmente representada nas Figuras 2 e 3. Conforme mostrado aqui, a célula de fluxo 22 pode ser acoplada a uma fonte de amostra 25 e a uma fonte 27 de fluido envoltório ou material de PIOAL. O fluido de amostra é injetado na célula de fluxo 22 através da cânula 29, por exemplo, através de uma porta de saída distal 31 da cânula 29. Tipicamente, o fluido envoltório de PIOAL não está em um estado de fluxo laminar à medida que percorre através de uma seção de canal curvada 41 na célula de fluxo a partir da fonte 27 em direção à zona de visualização 23. Entretanto, a célula de fluxo 22 pode ser configurada de modo que o fluido envoltório de PIOAL esteja ou se torne laminar, ou apresente um perfil de velocidade plano, à medida que o mesmo flui além da porta de saída distal 31, em que o fluido de amostra é introduzido no fluido envoltório circulante. O fluido de amostra e o PIOAL podem fluir ao longo da célula de fluxo 22 em uma direção geralmente indicada pela seta A, e, então, para fora da célula de fluxo 22 através da descarga 33. A célula de fluxo 22 define uma trajetória de fluxo interna 20 que se estreita simetricamente (por exemplo, na zona de transição 21) na direção de fluxo A. A simetria da trajetória de fluxo contribui para um fluxo robusto e centralizado da corrente de amostra. A célula de fluxo 22 é configurada para direcionar um fluxo 32 da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização 23 na célula de fluxo, ou seja, atrás da porta de visualização 57. Associado à porta de visualização 57 está um padrão de foco automático 44. A célula de fluxo 22 tem, também, um assento arredondado ou rebaixado 58 que é configurado para aceitar ou receber uma objetiva de microscópio (não mostrada).

[000122] De acordo com algumas modalidades, o padrão de foco automático 44 pode ter uma posição que é fixa em relação à célula de fluxo 22, e que está localizada em uma distância de deslocamento do plano da corrente de amostra em formato de fita 32. Na modalidade mostrada aqui, o padrão de foco automático (alvo 44) é aplicado diretamente à célula de fluxo 22 em um local que é visível em uma imagem coletada através da porta de visualização 57 por um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica (não mostrado). A célula de fluxo 22 pode ser construída de uma primeira camada ou seção ou camada ou seção superior 22a e uma segunda camada ou seção ou camada ou seção inferior 22b. Conforme mostrado aqui, um painel de janela de vidro ou transparente 60 é fixado a ou integral com a primeira seção 22a. O painel 60 pode definir ao menos uma porção da trajetória de fluxo de amostra dentro da célula de fluxo. A luz a partir da fonte de luz 42 pode percorrer através de uma abertura ou passagem do padrão de foco automático 44 a fim de iluminar partículas de amostra que fluem dentro da corrente 32.

[000123] Em alguns casos, a espessura do painel 60 pode ter um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 150 μm a cerca de 170 μm. Conforme observado acima, o painel 60 pode definir ou formar parte da trajetória de fluxo ou canal de envoltório (por exemplo, PIOAL). Com o uso de um painel fino 60, é possível colocar a objetiva de microscópio muito próxima à fita de fluido de amostra e, por conseguinte, obter imagens altamente ampliadas de partículas que fluem ao longo da trajetória de fluxo.

[000124] A Figura 3A representa aspectos de uma modalidade de célula de fluxo, em que uma distância entre o eixo geométrico de imageamento 355 e a porção de zona de transição distal 316 é de cerca de 8,24 mm. Uma distância entre a porção de zona de transição distal 316 e a porta de saída de cânula 331 é de cerca de 12,54 mm. Uma distância entre a porta de saída de cânula 331 e a entrada de fluido envoltório 301 é de cerca de 12,7 mm. Uma distância entre a porta de saída de cânula 331 e uma porção de zona de transição proximal 318 é de cerca de 0,73 mm. A Figura 3B representa aspectos de uma modalidade de célula de fluxo em que a porta de saída de cânula tem sido movida para um local mais distal em relação à zona de transição, conforme comparado com a modalidade da Figura 3A. Conforme mostrado aqui, a extremidade distal da cânula é avançada para a zona de transição de estreitamento da célula de fluxo, e uma distância entre o eixo geométrico de imageamento 355 e a porção de zona de transição distal 316 se situa em uma faixa a partir de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm. Em algum caso, a distância entre o eixo geométrico de imageamento 355 e a porção de zona de transição distal 316 é de cerca de 21 mm.

[000125] Novamente com referência à Figura 1, o contorno interno da célula de fluxo (por exemplo, na zona de transição 21) e as taxas de fluxo de PIOAL e amostra podem ser ajustados de tal modo que a amostra seja formada em uma corrente em formato de fita 32. A corrente pode ser aproximadamente tão fina quanto ou até mais fina que as partículas que são envelopadas na corrente de amostra em formato de fita. Os glóbulos brancos podem ter um diâmetro em torno de 10 μm, por exemplo. Mediante o fornecimento de uma corrente de amostra em formato de fita com uma espessura menor que 10 μm, as células podem ser orientadas quando a corrente de amostra em formato de fita é estendida pelo fluido envoltório, ou PIOAL. Surpreendentemente, o estiramento da corrente de amostra em formato de fita ao longo de uma trajetória de fluxo de estreitamento dentro de camadas de PIOAL de viscosidade diferente da corrente de amostra em formato de fita, tal como viscosidade maior, tende vantajosamente a alinhar partículas não esféricas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, e aplicar forças sobre as células, aperfeiçoando os conteúdos em foco de estruturas intracelulares das células. O eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica 24 é substancialmente ortogonal (perpendicular) ao plano da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita no ponto de imageamento pode ser, por exemplo, de 20 a 200 mm/segundo. Em algumas modalidades, a velocidade linear da corrente de amostra em formato de fita pode ser, por exemplo, de 50 a 150 mm/segundo.

[000126] Com referência também às Figuras 2 e 3, a trajetória de fluxo interna da célula de fluxo se estreita a jusante do ponto de injeção da corrente de amostra em formato de fita no PIOAL, para produzir uma espessura de corrente de amostra em formato de fita, por exemplo, até 7 μm, e/ou a trajetória de fluxo interna produz uma largura de corrente de amostra em formato de fita de 500 a 3.000 μm. Em modalidades exemplificadoras, conforme representado na Figura 1, a trajetória de fluxo interna da célula de fluxo começa em uma zona de transição de estreitamento a montante do ponto de injeção da corrente de amostra no PIOAL.

[000127] Em outra modalidade, a trajetória de fluxo interna se estreita para produzir uma espessura de corrente de amostra em formato de fita de 2 a 4 μm e/ou a trajetória de fluxo interna resulta na corrente de amostra em formato de fita de 2.000 μm em largura. Em alguns casos, a corrente de amostra tem uma largura de cerca de 2.190 μm. A espessura da corrente nesse caso é menor que o diâmetro de algumas partículas, tais como glóbulos vermelhos em seu estado relaxado. Consequentemente, aquelas partículas podem se tornar reorientadas em sua dimensão mais ampla em direção ao eixo geométrico de imageamento, o qual é útil na revelação de características distintivas.

[000128] O método pode incluir, adicionalmente, formar a corrente de amostra em formato de fita em um formato de fita. O formato de fita é apresentado de tal modo que o eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica seja substancialmente perpendicular à corrente de amostra em formato de fita, ou seja, ortogonal ao plano da corrente em formato de fita.

[000129] A Figura 4 representa aspectos de uma sistema 400 para imageamento de partículas em uma amostra de urina. Conforme mostrado aqui, o sistema 400 inclui um sistema de injeção de fluido de amostra 410, uma célula de fluxo 420, e dispositivo de captura de imagem 430, e um processador 440. A célula de fluxo 420 fornece uma trajetória de fluxo 422 que transmite um fluxo do fluido envoltório, opcionalmente em combinação com o fluido de amostra. De acordo com algumas modalidades, o sistema de injeção de fluido de amostra 410 pode incluir ou ser acoplado a um tubo ou cânula 412. O sistema de injeção de fluido de amostra 410 pode estar em comunicação fluida com a trajetória de fluxo 422, e pode operar para injetar fluido de amostra 424 através de uma porta de saída distal 413 da cânula 412 e em um fluido envoltório circulante 426 dentro da célula de fluxo 420, a fim de fornecer uma corrente de fluido de amostra 428. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou ficar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 410 injete fluido de amostra 424 no fluido envoltório circulante 426. Conforme mostrado aqui, o fluido envoltório 426 pode ser introduzido na célula de fluxo 420 por um sistema de injeção de fluido envoltório 450. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou ficar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 450 injete fluido envoltório 426 na célula de fluxo 420.

[000130] A corrente de fluido de amostra 428 tem uma primeira espessura T1 (consulte, por exemplo, a Figura 4A) adjacente ao tubo de injeção 412. A trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo que tem uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo de tal modo que a espessura da corrente de fluido de amostra 428 diminua a partir da espessura inicial T1 a uma segunda espessura T2 adjacente a um sítio de captura de imagem 432. O dispositivo de captura de imagem 430 é alinhado ao sítio de captura de imagem 432 a fim de imagear uma primeira pluralidade das partículas a partir do primeiro fluido de amostra no sítio de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420.

[000131] O processador 440 é acoplado ao sistema injetor de fluido de amostra 410, ao dispositivo de captura de imagem 430 e, opcionalmente, ao sistema de injeção de fluido envoltório 450. O processador 440 é configurado para interromper a injeção do primeiro fluido de amostra no fluido envoltório circulante 426 e começar a injeção do segundo fluido de amostra no fluido envoltório circulante 426 de tal modo que transientes de fluido de amostra sejam iniciados. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou ficar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema de injeção de fluido de amostra 410 injete o segundo fluido de amostra no fluido envoltório circulante 426 de tal modo que transientes de fluido de amostra sejam iniciados.

[000132] Adicionalmente, o processador 440 é configurado para iniciar a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade das partículas a partir do segundo fluido de amostra no sítio de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 após os transientes de fluido de amostra e dentro de 4 segundos do imageamento da primeira pluralidade das partículas. Por exemplo, o processador 440 pode incluir ou ficar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o dispositivo de captura de imagem 430 inicie a captura de uma imagem de uma segunda pluralidade das partículas a partir do segundo fluido de amostra no sítio de captura de imagem 432 da célula de fluxo 420 após os transientes de fluido de amostra e dentro de quatro segundos do imageamento da primeira pluralidade das partículas.

[000133] Em algumas modalidades, o processador 440 pode incluir ou ficar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que um mecanismo de controle de movimento de célula de fluxo 442 ajuste a posição da célula de fluxo 420, por exemplo, em relação ao dispositivo de captura de imagem 430. Em algumas modalidades, o processador 440 pode incluir ou ficar em associação operacional com um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador é configurado para fazer com que um mecanismo de controle de movimento de dispositivo de captura de imagem 444 ajuste a posição do dispositivo de captura de imagem 430, por exemplo, em relação à célula de fluxo 420. Os mecanismos de controle de movimento 442, 444 podem incluir motores, suspensões cardan e outros recursos mecânicos que facilitam e produzem o movimento na célula de fluxo e dispositivo de captura de imagem, respectivamente. Em alguns casos, o mecanismo de controle de célula de fluxo 442 e/ou o mecanismo de controle de dispositivo de captura de imagem 444 podem incluir um controle de motor de passo de alta precisão que fornece a focalização motorizada e automatizada do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Conforme representado na Figura 1, um processador pode controlar o movimento do dispositivo de captura de imagem 24. De modo similar, conforme representado na Figura 1B, um processador pode controlar o movimento de um suporte de célula de fluxo 55.

[000134] Por conseguinte, as modalidades da presente invenção abrangem sistemas de análise de partículas que realizam a hidro- focalização geométrica e viscosidade combinada para o imageamento de partículas em uma amostra de urina. Os sistemas exemplificadores podem incluir uma célula de fluxo que tem uma trajetória de fluxo com um tubo de injeção e uma janela de imageamento com um eixo geométrico de imageamento através da mesma. A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo. Adicionalmente, os sistemas analisadores podem incluir uma entrada de fluido envoltório em comunicação fluida com a trajetória de fluxo, e uma entrada de urina em comunicação fluida com o tubo de injeção. A entrada de urina pode ser configurada para injetar a amostra de urina no fluido envoltório circulante dentro da célula de fluxo, de modo que a amostra de urina flua em uma corrente de amostra com uma largura de corrente maior que uma espessura de corrente. O fluido envoltório pode ter uma viscosidade que é maior que uma viscosidade da amostra de urina. Além disso, o sistema analisador pode incluir um dispositivo de captura de imagem, e um mecanismo de focalização que define um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Adicionalmente, o sistema pode incluir um alvo de imageamento que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o alvo de imageamento e a corrente de amostra definem uma distância de deslocamento ao longo do eixo geométrico de imageamento. O sistema pode também incluir um processador e um módulo de focalização que tem um meio tangível que incorpora código legível por máquina executado no processador para operar o mecanismo de focalização para ajustar o estado focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partículas, com o uso da distância de deslocamento. A diferença de viscosidade entre o fluido envoltório e a amostra de urina, em combinação com a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo, pode ser eficaz para a hidro-focalização do primeiro e segundo fluido de amostra no eixo geométrico de imageamento, enquanto que retém a viabilidade de células na amostra de urina. Em alguns casos, o mecanismo de focalização pode incluir um motor de acionamento configurado para ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo.

[000135] Em alguns casos, um sistema analisador 400 pode incluir um sensor térmico ou de temperatura 448 que é termicamente acoplado à célula de fluxo 420, conforme representado na Figura 4. Um módulo de focalização, o qual pode estar associado de maneira operacional ao processador, pode incluir um meio tangível que incorpora código legível por máquina que é executado no processador para operar uma mecanismo de focalização (por exemplo, mecanismo de controle de célula de fluxo 442 ou mecanismo de controle de dispositivo de captura de imagem 444) a fim de ajustar o estado focal ou plano focal do dispositivo de captura de imagem, adequado para a caracterização e contagem de partículas, em resposta a uma mudança em temperatura detectada pelo sensor de temperatura e uma relação conhecida entre temperatura e um foco desejado.

[000136] Consequentemente, as modalidades da presente invenção abrangem um sistema 400 para imageamento de uma pluralidade de partículas em uma amostra de urina 424 que tem uma viscosidade de fluido de amostra. O sistema 400 pode ser usado com um fluido envoltório 426 que tem uma viscosidade de fluido envoltório que difere da viscosidade de fluido de amostra por uma diferença de viscosidade em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada. O sistema 400 pode incluir uma célula de fluxo 420 que tem uma trajetória de fluxo 422 e um tubo de injeção de fluido de amostra 412. A trajetória de fluxo 422 pode ter uma redução em tamanho de trajetória de fluxo ou zona de transição de estreitamento. Adicionalmente, o sistema 400 pode incluir uma entrada de fluido envoltório 401 em comunicação fluida com a trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo 420 a fim de transmitir um fluxo do fluido envoltório ao longo da trajetória de fluxo 422 da célula de fluxo 420. O sistema 400 pode também incluir uma entrada de amostra de urina 402 em comunicação fluida com o tubo de injeção 412 da célula de fluxo 420 a fim de injetar um fluxo ou corrente 428 da amostra de urina no fluido envoltório circulante 428 dentro da célula de fluxo 420. Por exemplo, o fluido de amostra 424 pode sair da porta de saída distal 423 da cânula 412 e para dentro de um envelope do fluido envoltório circulante 426 para formar uma fita de amostra 428 no mesmo.

[000137] À medida que o fluido envoltório 426, junto com a fita de fluido de amostra 428 formada a partir do fluido de amostra 424, flui através de uma redução 419 em tamanho de trajetória de fluxo e em direção a um sítio de imageamento 432, um efeito de hidro-focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido envoltório 426 e o fluido de amostra 424 associado à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidro-focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido envoltório 426 e o fluido de amostra 424 associado à redução em tamanho de trajetória de fluxo, fornece um estado de imageamento alvo em pelo menos parte da pluralidade de partículas no sítio de imageamento 432. Conforme mostrado aqui, o sistema 400 inclui também um dispositivo de imageamento 430 que imageia a pluralidade de partículas no sítio de imageamento 432.

[000138] Conforme mostrado na modalidade de célula de fluxo representada na Figura 4A, uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição 419a) pode ser definida por paredes opostas 421a, 423a da trajetória de fluxo 422a. As paredes opostas 421a, 423a podem se posicionar em ângulo radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo 422a, geralmente simétrica sobre um plano transversal 451a que bisecciona a corrente de fluido de amostra 428a. O plano 451a pode biseccionar a corrente de amostra 428a, em que a corrente de amostra tem uma primeira espessura T1, em um local em que a corrente de amostra 428a sai de uma porção distal 427a da cânula ou tubo de injeção de amostra 412a. De modo similar, o plano 451a pode biseccionar a corrente de amostra 428a, em que a corrente de amostra tem uma segunda espessura T2, em um local em que a corrente de amostra 428a passa do sítio de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor de cerca de 150 μm e a segunda espessura T2 tem um valor de cerca de 2 μm. Em tais casos, a razão de compressão da corrente de fita de amostra é de 75:1. De acordo com algumas modalidades, a primeira espessura T1 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm e a segunda espessura T2 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. À medida que o fluido da corrente de amostra flui através da célula de fluxo, a fita fica mais fina à medida que a mesma acelera e é estirada. Dois traços da célula de fluxo podem contribuir para o adelgaçamento da fita de fluido de amostra. Primeiramente, uma diferença de velocidade entre o envelope de fluido envoltório e a fita de fluido de amostra pode operar para reduzir a espessura da fita. Em segundo lugar, a geometria afunilada da zona de transição pode operar para reduzir a espessura da fita. Conforme representado na Figura 4A, a porta de saída distal 413a da cânula 412a pode ser posicionada em um local central ao longo do comprimento da zona de transição de estreitamento 419a. Em alguns casos, a porta de saída distal pode ser posicionada de maneira mais próxima ao início (porção proximal 415a) da zona de transição 419a. Em alguns casos, a porta de saída distal pode ser posicionada de maneira mais próxima à extremidade (porção distal 416a) da zona de transição 419a. Em alguns casos, a porta de saída distal 413a pode ser posicionada totalmente fora da zona de transição 419a, por exemplo, conforme representado na Figura 3A (em que a porta de saída distal 331 está disposta proximal à zona de transição de estreitamento).

[000139] Conforme representado na Figura 4A (assim como nas Figuras 4 e 4B-1), a zona de transição 419a pode ser definida por transições angulares nas porções proximal (415a) e distal (416a). Deve- se compreender também que a zona de transição 419a pode, em vez disso, apresentar transições curvadas ou lisas nas porções proximal (415a) e distal (416a), similares às transições curvadas ou lisas conforme representado nas Figuras 1, 3, 3A, 3B e 4B-2).

[000140] Tipicamente, a primeira espessura T1 é muito maior que o tamanho das partículas de amostra e, por conseguinte, as partículas são contidas totalmente dentro da corrente de fita de amostra. Entretanto, a segunda espessura T2 pode ser menor que o tamanho de determinadas partículas de amostra e, por conseguinte, aquelas partículas podem se estender para fora do fluido de amostra e no fluido envoltório circundante. Conforme mostrado na Figura 4A, a corrente de fita de amostra pode fluir geralmente ao longo do mesmo plano que a mesma sai da cânula e percorre em direção ao sítio de captura de imagem.

[000141] A célula de fluxo pode também fornecer uma distância de separação 430a entre a porção de cânula distal 427a e o sítio de captura de imagem 432a. De acordo com algumas modalidades, a porção distal 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode ser posicionada em uma distância de separação axial 430a do sítio de captura de imagem 432a, em que a distância de separação axial 432a tem um valor de cerca de 21 mm. De acordo com algumas modalidades, a distância de separação axial 430a tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 16 mm a cerca de 26 mm.

[000142] A distância de separação axial 430a entre a porta de saída de cânula e o sítio de captura de imagem pode impactar o tempo de transição para o fluido de amostra, à medida que o fluido se move a partir da porta de saída ao sítio de captura de imagem. Por exemplo, uma distância de separação axial 430a relativamente mais curta pode contribuir para um tempo de transição mais curto, e uma distância de separação axial 430a relativamente mais longa pode contribuir para um tempo de transição mais longo.

[000143] A posição da porta de saída na porção distal de cânula 427a em relação à zona de transição de trajetória de fluxo 419a, ou em relação à porção proximal 415a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a, pode também interferir com o tempo de transição para o fluido de amostra, à medida que o fluido se move a partir da porta de saída ao sítio de captura de imagem. Por exemplo, o fluido envoltório pode ter uma velocidade relativamente menor na porção proximal 415a, e uma velocidade relativamente maior em um local entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a. Por conseguinte, se a porta de saída de cânula na porção distal 427a for posicionada na porção proximal 415a, levará uma quantidade de tempo maior para o fluido de amostra alcançar o sítio de captura de imagem, não apenas devido ao fato de que a distância de percurso é mais longa, mas também devido ao fato de que a velocidade inicial do fluido de amostra, depois que o mesmo sai da porção distal da cânula, é menor (devido à velocidade de fluido envoltório menor). De outro modo, quanto mais tempo o fluido de amostra estiver presente na parte mais espessa (por exemplo, próximo à porção proximal 415a) da célula de fluxo, mais tempo a amostra levará para alcançar o sítio de captura de imagem. Inversamente, se a porta de saída de cânula na porção distal 427a for posicionada distal à porção proximal 415a (por exemplo, em um local central entre a porção proximal 415a e a porção distal 416a, conforme representado na Figura 4A), levará uma quantidade de tempo menor para o fluido de amostra alcançar o sítio de captura de imagem, não somente devido ao fato de que a distância de percurso é mais curta, mas também devido ao fato de que a velocidade inicial do fluido de amostra, depois que o mesmo sai da porção distal da cânula, é maior (devido à velocidade de fluido envoltório maior). Conforme discutido em outro lugar no presente documento, o fluido envoltório é acelerado à medida que flui através da zona de transição 419a, devido à área da seção transversal da zona 419a.

[000144] De acordo com algumas modalidades, com um tempo de transição mais curto, mais tempo está disponível para a coleta de imagem no sítio de captura de imagem. Por exemplo, à medida que a duração do tempo de transição a partir da ponta distal da cânula até a área de imageamento diminui, é possível processar mais amostras em uma quantidade específica de tempo e, de modo correspondente, é possível obter mais imagens em uma quantidade específica de tempo (por exemplo, imagens por minuto).

[000145] Embora existam vantagens associadas ao posicionamento da porta de saída da porção distal de cânula 427a de maneira mais próxima ao sítio de captura de imagem 432a, é desejável, também, manter uma determinada distância entre a porta e o sítio de captura. Por exemplo, conforme representado na Figura 3, uma lente frontal ou objetiva óptica de um dispositivo de imageamento pode ser posicionada no assento 58 da célula de fluxo 22. Se a porta de saída 31 da cânula estiver próxima demais ao assento 58, então, o fluido de amostra pode não ser suficientemente estabilizado depois que o mesmo seja injetado no fluido envoltório, a fim de fornecer propriedades de imageamento desejadas no sítio de captura de imagem. De modo similar, pode ser desejável manter a região de transição afunilada 21 a uma distância da zona de visualização 23, de modo que a região afunilada não interfira com o posicionamento do assento 58, o qual recebe a objetiva do dispositivo de captura de imagem.

[000146] Novamente com referência à Figura 4A, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode ser posicionada distal a uma porção proximal 415a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a. De modo correspondente, a extremidade a jusante 427a do tubo de injeção de fluido de amostra 412a pode ser posicionada proximal a uma porção distal 416a da zona de transição de trajetória de fluxo 419a. Por conseguinte, de acordo com algumas modalidades, o fluido de amostra pode ser injetado a partir da cânula de injeção 412a e na célula de fluxo em um local dentro da zona de transição 419a.

[000147] De acordo com algumas modalidades, a simetria na diminuição em tamanho de trajetória de fluxo (por exemplo, na zona de transição de trajetória de fluxo 419a) opera para limitar o desalinhamento de partícula na amostra de urina. Por exemplo, tal simetria pode ser eficaz para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de glóbulos vermelhos na amostra de urina para menos que cerca de 20%.

[000148] De acordo com algumas modalidades, os métodos revelados no presente documento são operáveis para a taxa de sinalização durante a análise de exame de sangue a abaixo de 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% de amostras.

[000149] De acordo com algumas modalidades, o sítio de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a entre cerca de 800 μm x 800 μm. Em alguns casos, o sítio de captura de imagem 432a tem um campo de visão 433a de cerca de 275 μm x 275 μm. Em alguns casos, o campo de visão pode ser definido em termos de comprimento por largura. Se expressado como área superficial, um campo de visão de 275 μm x 275 μm tem uma área de 75.625 μm2. De acordo com algumas modalidades, o campo de visão pode ser determinado pela objetiva do dispositivo de imageamento e sua ampliação. Em alguns casos, o campo de visão pode corresponder à extensão do campo (área) que é imageado pela óptica de coleta (por exemplo. objetiva, lente de tubo e câmera). Em alguns casos, o campo de visão é muito menor que a porta de visualização da área transparente no sítio de captura de imagem.

[000150] As Figuras 4A-1 e 4A-2 ilustram os efeitos da hidro- focalização sobre a corrente de amostra à medida que a mesma se move da porta de saída de cânula ao sítio de captura de imagem. Conforme mostrado na Figura 4A-1, a corrente de amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 150 μm e uma largura W(S) de cerca de 1.350 μm. Em alguns casos, a largura W(S) é de cerca de 1.600 μm. Em alguns casos, a largura W(S) e cerca de 2.000 μm. Em alguns casos, a corrente de amostra tem uma largura de cerca de 2.190 μm. Em alguns casos, a largura W(S) tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 1.350 μm a cerca de 2.200 μm. As dimensões de corrente de amostra representadas aqui podem corresponder às dimensões da porta de saída de cânula, por exemplo, conforme representado na Figura 4E. Adicionalmente, a corrente de envoltório de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca de 6.000 μm e uma largura W(P) de cerca de 4.000 μm. Subsequente à hidro-focalização, conforme mostrado na Figura 4A-2, a corrente de amostra pode ter uma altura H(S) de cerca de 2 μm e uma largura W(S) de cerca de 1.350 μm. Em alguns casos, a largura W(S) é de cerca de 1.600 μm. Em alguns casos, a largura W(S) e cerca de 2.000 μm. Em alguns casos, a corrente de amostra tem uma largura de cerca de 2.190 μm. Em alguns casos, a largura W(S) tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 1.350 μm a cerca de 2.200 μm. Adicionalmente, a corrente de envoltório de PIOAL pode ter uma altura H(P) de cerca de 150 μm e uma largura W(P) de cerca de 4.000 μm. Em uma modalidade, a área de seção transversal da corrente de envoltório de PIOAL na saída da cânula é 40 vezes maior que a área de seção transversal próxima ao sítio de captura de imagem.

[000151] De acordo com algumas modalidades, pode ser útil determinar a seção transversal do canal de célula de fluxo no sítio de captura de imagem. Isso pode corresponder à altura H(P) de corrente de envoltório de PIOAL de cerca de 150 μm e uma largura W(P) de cerca de 4.000 μm, conforme representado na Figura 4A-2. Também pode ser útil determinar a taxa de fluxo volumétrica da corrente de amostra e fluido envoltório combinado através da célula de fluxo no sítio de captura de imagem. Quando a área de seção transversal e a taxa de fluxo são conhecidas, é possível determinar a velocidade da amostra e fluido envoltório combinados no sítio de captura de imagem.

[000152] De acordo com algumas modalidades, o fluxo da amostra e fluidos envoltórios através da célula de fluxo pode ser aproximado a um modelo de perfil de placa paralela. De modo correspondente, a taxa de fluxo no centro da corrente de fluido de amostra (por exemplo, conforme representado na Figura 4A-2), pode ser cerca de 1,5 vezes a taxa de fluxo média da corrente de amostra e fluido envoltório combinada.

[000153] De acordo com algumas modalidades, a área da seção transversal do fluxo de amostra na saída de cânula (por exemplo, W(S) x H(S) na Figura 4A-1) é 40 vezes maior que a área da seção transversal do fluxo de amostra no sítio de imageamento (por exemplo, W(S) x H(S) na Figura 4A-2). A taxa de fluxo volumétrica do fluido envoltório na área de imageamento pode ser de cerca de 45 μl/segundo. A taxa de fluxo volumétrica do fluido de amostra na área de imageamento pode ser de cerca de 0,232 μl/segundo. Em alguns casos, a área da seção transversal das correntes de amostra e envoltório combinadas no sítio de imageamento é de 600.000 μm2. Em alguns casos, a velocidade de corrente média no sítio de imageamento é de 75 mm/segundo.

[000154] A taxa de fluxo ou velocidade pode ser determinada como a taxa que resulta em imagens celulares límpidas e focalizadas. As taxas de fluxo e velocidades exemplificadoras foram reveladas com base nas taxas de fluxo das duas amostras que foram observadas por alcançar determinadas características ou formatos de fita de corrente de amostra no sítio de imageamento. Por exemplo, em taxa de fluxo de cerca de 75 mm/segundo (ou dentro de uma faixa a partir de 20 a 200 mm/segundo), as células não fluem lento demais de tal modo que existem sobreposições de células em imagens consecutivas, e as células não fluem rápido demais de tal modo que os efeitos de formação de imagens-fantasma são criados (imagem embaçada). De modo correspondente, evitando-se taxas de fluxo excessivamente altas, é possível conservar mais reagente e amostra. De acordo com algumas modalidades, uma velocidade linear ideal ou desejada pode ser alcançada alterando-se o fluxo volumétrico (taxa de bomba) ou o formato da cânula.

[000155] A velocidade de fluxo da corrente de amostra através da zona de captura de imagem pode também estar relacionada ao desempenho do dispositivo de captura de imagem em relação à função da célula de fluxo. Por exemplo, se a corrente de amostra estiver fluindo rápido demais, pode ser difícil obter imagens límpidas de partículas contidas na amostra (por exemplo, a velocidade do obturador do dispositivo de captura de imagem pode ser pequena demais, produzindo, assim, uma imagem embaçada). De modo similar, se a corrente de amostra estiver fluindo lenta demais, o dispositivo de captura de imagem pode obter imagens consecutivas da mesma partícula (por exemplo, a mesma partícula permanece no quadro de captura durante duas capturas de imagem). Em algumas modalidades, a velocidade da fita de amostra pode ser modulada (por exemplo, ajustando-se qualquer um dentre uma variedade de parâmetros operacionais de célula de fluxo) em relação à taxa de captura de imagem, de modo que exista fluxo mínimo entre capturas de quadro e, por conseguinte, uma alta porcentagem da amostra é imageada.

[000156] De acordo com algumas modalidades, o sistema de análise de partículas e componentes associados podem ser configurados de modo que, à medida que o fluido envoltório e a amostra de fluido fluem através da célula de fluxo, o fluido envoltório possa fluir em uma taxa volumétrica de fluido envoltório de 45 μl/s e a amostra de fluido possa fluir em uma taxa de fluxo volumétrica de amostra de fluido de 0,232 μl/s (ou dentro de uma faixa a partir de 0,2 a 0,35 μl/s). Em alguns casos, uma taxa de fluxo do fluido de amostra pode ter um valor dentro de uma faixa a partir de 0,2 μl/s a 1 μl/s. Em alguns casos, o fluido envoltório pode ter uma taxa de fluxo de cerca de 40 μl/s. Em alguns casos, o fluido de amostra pode ter uma taxa de fluxo de cerca de 0,56 μl/s. Em algum caso, para uma duração de imageamento de cerca de 19 segundos, um volume de fluido de amostra que flui através da célula de fluxo pode ter um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 8 μl a cerca de 12 μl. Em alguns casos, a razão entre a taxa de fluxo de fluido envoltório e a taxa de fluxo de fluido de amostra é de cerca de 200. Em alguns casos, a razão entre a taxa de fluxo de fluido envoltório e a taxa de fluxo de fluido de amostra tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 70 a 200. Em alguns casos, a razão entre a taxa de fluxo de fluido envoltório e a taxa de fluxo de fluido de amostra é de cerca de 193. Em alguns casos, a razão entre a taxa de fluxo de fluido envoltório e a taxa de fluxo de fluido de amostra é de cerca de 70. Em alguns casos, uma razão entre o volume de fluido envoltório e o volume de amostra de fluido fluindo dentro da célula de fluxo pode se situar em uma faixa a partir de 25:1 a 250:1.

[000157] De acordo com algumas modalidades, o sistema e componentes associados podem ser configurados de modo que, à medida que o fluido envoltório e a amostra de fluido fluem através da célula de fluxo 420, o fluido envoltório possa fluir em uma velocidade de fluido envoltório de 75 mm/segundo antes da área imageamento e a amostra de fluido possa fluir em uma velocidade de amostra de fluido de 130 mm/segundo antes da área de imageamento. Em alguns casos, uma razão entre o volume de fluido envoltório e o volume de amostra de fluido fluindo dentro da célula de fluxo pode se situar em uma faixa a partir de 100:1 a 200:1.

[000158] Em alguns casos, uma célula de fluxo pode ter uma razão de compressão mínima de cerca de 50:1 e uma razão de compressão máxima de cerca de 125:1. Em alguns casos, a razão de compressão mínima pode ser de cerca de 30:1 ou 20:1. Essa razão de compressão se refere à razão de espessuras de corrente de fluxo H(S):H(S) quando se compara a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2. Essa razão de compressão pode ser influenciada por uma combinação de compressão geométrica (por exemplo, a razão entre as espessuras de fluido envoltório H(P):H(P) quando se compara a Figura 4A-1 com a Figura 4A-2, o qual pode também corresponder geralmente às dimensões da zona de transição afunilada de estreitamento de célula de fluxo 419a mostrada na Figura 4A) e uma compressão hidrodinâmica (por exemplo, que também corresponde a uma diferença em velocidade). De acordo com algumas modalidades, a razão de compressão geométrica é de cerca de 40:1.

[000159] A diminuição em tamanho de trajetória de fluxo, que corresponde à zona de transição, pode ser definida por uma porção de trajetória de fluxo proximal que tem uma altura ou espessura proximal e uma porção de trajetória de fluxo distal que tem uma altura ou espessura distal que é menor que a altura ou espessura proximal. Por exemplo, conforme mostrado nas vistas parciais das Figuras 4B-1 e 4B-2, a zona de transição 419b da trajetória de fluxo pode ter um comprimento L entre uma porção proximal 415b e uma porção distal 416b, em que a porção proximal 415b tem uma altura proximal 417b, e a porção distal 416b tem uma altura distal 418b. Conforme representado na Figura 4B-2, e conforme observado em outro lugar no presente documento, o formato ou contorno da zona de transição pode ser curvado ou liso e, por exemplo, pode ser fornecido no formato de uma curva em S, uma curva sigmoide, ou uma curva tangente. De acordo com algumas modalidades, a altura proximal 417b tem um valor de cerca de 6.000 μm. Em alguns casos, a altura proximal 417b tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 3.000 μm a cerca de 8.000 μm. De acordo com algumas modalidades, a altura distal 418b tem um valor de cerca de 150 μm. Em alguns casos, a altura distal 418b tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 50 μm a cerca de 400 μm.

[000160] A geometria da zona de transição 419a pode fornecer um primeiro ângulo α1 entre o primeiro limite de trajetória de fluxo 403b e o plano transversal bissetor 451b, e um segundo ângulo α2 entre o segundo limite de trajetória de fluxo 404b e o plano transversal bissetor 451b. Em alguns casos, o ângulo α1 tem cerca de 45 graus e o ângulo α2 tem cerca de 45 graus. Em alguns casos, o ângulo α1 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. Em alguns casos, o ângulo α2 tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 10 graus a cerca de 60 graus. De acordo com algumas modalidades, os ângulos α1 e α2 têm o mesmo valor. Os ângulos α1 e α2 podem ser selecionados para manter o fluxo laminar ou minimizar a turbulência do fluido de amostra à medida que o mesmo se move a partir da porção proximal 415b à porção distal 416b, que, por sua vez, pode acentuar o alinhamento de partículas dentro da amostra ao longo do plano transversal 451b. Conforme observado acima com referência à Figura 4A, as porções ou limites distal e proximal da zona de transição podem ser curvadas ou lisas, em vez de angulares.

[000161] A Figura 4C representa traços de uma cânula ou tubo de alimentação de amostra 400c exemplificador de acordo com as modalidades da presente invenção, em que a cânula tem um comprimento L. A Figura 4D representa uma seção transversal longitudinal da cânula 400d. Conforme mostrado aqui, a cânula 400d inclui uma seção aplanada distal 410d, uma seção afunilada central 420d e uma porção tubular proximal 430d. Conforme representado na Figura 4C-1, uma cânula ou tubo de alimentação de amostra exemplificador 400c-1 pode ter uma porção distal 410c-1 e uma porção proximal 430c- 1. Em alguns casos, a porção distal 410c-1 tem um comprimento de cerca de 1,359 mm e uma largura de cerca de 1,43 mm. Em alguns casos, a porta de saída da extremidade distal tem uma largura de saída W(E) de cerca de 1,359 mm. De acordo com algumas modalidades, uma cânula pode ter uma geometria de trajetória de fluxo interna que é diferente daquela representada nas Figuras 4C e 4D. Por exemplo, conforme ilustrado na Figura 4D-1, a cânula 400d-1 não inclui uma seção central afunilada que tem uma seção transversal de área de fluxo expandida. Conforme representado na Figura 4D-1, a cânula 400d-1 tem uma seção distal 410d-1, uma seção afunilada central 420d-1 que tem um diâmetro interno afunilada, e uma seção proximal 430d-1. Correspondendo ao diâmetro interno afunilado da seção central 420d-1, a área interna em seção transversal de 410d-1 é menor que a área interna em seção transversal de 430d-1.

[000162] Um sistema de urinálise de acordo com as modalidades da presente invenção pode processar uma amostra de urina que tem um volume de cerca de 900 μl. A cânula ou tubo de injeção 400d mostrado na Figura 4D tem um volume interno de cerca de 13 ul. De acordo com algumas modalidades, a cânula ou tubo de injeção tem um volume interno menor que cerca de 30 ul.

[000163] A Figura 4E ilustra uma seção transversal de uma seção aplanada distal 410e. Conforme mostrado aqui, a seção distal 410e tem uma largura interna W(I) e uma altura interna H(I), através das quais flui uma corrente de amostra. Adicionalmente, a seção distal 410e tem uma largura externa W(O) e uma altura externa H(O). Conforme representado nas Figuras 4D e 4E tomadas em combinação, a porção distal 410e do tubo de injeção de fluido de amostra tem uma porta de saída P que tem uma altura H(I) e uma largura W(I), em que a altura H(I) é menor que a largura W(I). De acordo com algumas modalidades, a altura H(I) da porta de saída P da porção distal 410e (ou a altura interna da porção distal 410d) pode ter um valor de cerca de 150 μm. Em alguns casos, a altura H(I) pode se situar em uma faixa a partir de cerca de 50 μm a cerca de 250 μm. De acordo com algumas modalidades, a largura W(I) da porta de saída P da porção distal 410e (ou a largura interna da porção distal 410d) pode ter um valor de cerca de 1.350 μm. Em alguns casos, a largura é de cerca de 1.194 μm. Em alguns casos, a largura W(I) pode ter um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 500 μm a cerca de 3.000 μm. Em alguns casos, a altura H(I) pode ser cerca de 150 μm e a largura W(I) pode ser cerca de 1.350 μm. Em alguns casos, a largura W(I) é de cerca de 1.600 um. Em alguns casos, a largura W(I) é de cerca de 2.000 μm. Em alguns casos, a largura W(I) é de cerca de 2.190 μm. Em alguns casos, a largura W(I) tem um valor dentro de uma faixa a partir de cerca de 1.350 μm a cerca de 2.200 μm. Conforme discutido em outro lugar no presente documento, o valor para largura W(I) pode determinar a largura da corrente de amostra no sítio de imageamento. Em alguns casos, a seção aplanada distal 410d pode ser produzida pela aplicação de uma força de fixação a uma tubo ou conduto. Em alguns casos, a cânula pode ter um comprimento de cerca de 3,12 cm (cerca de 1,23 pol) e um diâmetro interno de cerca de 0,140 cm (cerca de 0,055 pol). Em alguns casos, a cânula pode ter um volume interno de cerca de 48 μl.

[000164] A Figura 4F ilustra uma seção transversal de uma seção afunilada central 420f. Conforme mostrado aqui, a seção afunilada central 420f tem um diâmetro interno D(I) através do qual flui uma corrente de amostra. Adicionalmente, a seção afunilada central 420f tem um diâmetro externo D(O). A Figura 4G ilustra uma seção transversal de uma seção proximal 430g. Conforme mostrado aqui, a seção proximal 430g tem um diâmetro interno D(I) através do qual flui uma corrente de amostra. Adicionalmente, a seção distal 430g tem um diâmetro externo D(O).

[000165] Conforme representado na Figura 4D, o tubo de injeção ou cânula 400d pode ter uma porção proximal 430d que tem uma primeira área de seção transversal de fluxo (por exemplo, π*(D/2)2 mostrada na Figura 4G), uma porção distal 410d que tem uma segunda área de seção transversal de fluxo (por exemplo, W(I)*H(I) mostrada na Figura 4E) que é menor que a primeira área de seção transversal de fluxo e uma terceira porção 420d disposta entre a porção proximal 430d e a porção distal 410d. A terceira porção 420d pode ter uma terceira seção transversal de fluxo (por exemplo, π*(D/2)2 mostrada na Figura 4F) que é maior que a primeira e a segunda seções transversais de fluxo. Em alguns casos, o diâmetro externo D(O) da porção proximal 430g tem cerca de 1.067 μm e o diâmetro interno D(I) da porção proximal 430g tem cerca de 813 μm.

[000166] De acordo com algumas modalidades, uma porção proximal de um tubo de injeção pode ser acoplado a uma porta de amostra de um encaixe de entrada de amostra. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 4H, uma porção proximal 405h de uma cânula 400h pode ser acoplada diretamente a uma porta de amostra 410h em uma saída de um encaixe de entrada de amostra 420h.

[000167] Uma célula de fluxo de um sistema para imageamento de partículas em uma amostra de urina pode ser orientada em qualquer direção ou ângulo desejado em relação à direção da força da gravidade. Por exemplo, uma célula de fluxo pode ser orientada em uma direção para cima, de modo que o fluido que flui dentro da célula de fluxo (por exemplo, fluido envoltório, opcionalmente em combinação com o fluido de amostra) possa se mover em uma direção para cima, contra a força da gravidade. De modo semelhante, uma célula de fluxo pode ser orientada em uma direção para baixo, de modo que o fluido que flui dentro da célula de fluxo (por exemplo, fluido envoltório, opcionalmente, em combinação com o fluido de amostra) possa se mover em uma direção para baixo, contra a força da gravidade. A Figura 4I representa uma célula de fluxo 420i orientada em uma direção para cima, de modo que o fluido de amostra 424i e o fluido envoltório 426i que fluem dentro da célula de fluxo 420i fluam contra a gravidade G. A Figura 4J representa uma célula de fluxo 420j orientada em uma direção para baixo, de modo que o fluido de amostra 424j e o fluido envoltório 426j que fluem dentro da célula de fluxo 420j não fluam contra a gravidade G, mas, de preferência, fluam com a gravidade G.

[000168] Conforme mostrado na Figura 4K, uma fita de corrente de amostra R que flui através de um sítio de captura de imagem 432k de uma célula de fluxo 420k pode ter uma espessura T de cerca de 2 μm. Em alguns casos, a espessura T da fita de corrente de amostra pode ser de até cerca de 3 μm. Tipicamente, as células ou partículas que são menores que a espessura da corrente de amostra ficarão contidas dentro da fita. Um glóbulo vermelho exemplificador (RBC) pode estar presente como um disco bicôncavo e pode ter um diâmetro D entre cerca de 6,2 μm e cerca de 8,2 μm. Adicionalmente, um glóbulo vermelho exemplificador pode ter uma espessura máxima T1 entre cerca de 2 μm e cerca de 2,5 μm e uma espessura mínima T2 entre cerca de 0,8 μm e cerca de 1 μm. Em alguns casos, os glóbulos vermelhos podem ter uma espessura de até cerca de 3 μm. As plaquetas humanas exemplificadoras podem variar de tamanho e também podem ter uma espessura ou diâmetro de cerca de 2 μm. Embora não mostrado em escala aqui, a célula de fluxo pode definir uma espessura de trajetória de fluxo H que tem um valor de cerca de 150 μm, no sítio de captura de imagem. Em alguns casos, a espessura de trajetória de fluxo F tem um valor entre 50 μm e 400 μm. Essa espessura de trajetória de fluxo F pode também corresponder à altura distal 418b da porção distal 461b representada nas Figuras 4B-1 e 4B-2.

[000169] Conforme mostrado na Figura 4K, a razão entre a espessura T da corrente de fluido de amostra e a espessura da partícula (glóbulo vermelho) é de cerca de 1:1. De acordo com algumas modalidades, uma razão entre a espessura T da corrente de fluido de amostra no sítio de captura de imagem e um tamanho de uma das partículas se situa em uma faixa a partir de 0,25 a 25. Em alguns casos, a espessura T pode ter um valor dentro de uma faixa a partir de 0,5 μm a 5 μm.

[000170] Conforme discutido em outro lugar no presente documento, assim como no pedido de patente copendente US n° , as diferenças de viscosidade entre o fluido da fita de amostra R e o fluido envoltório podem operar para alinhar ou orientar as partículas na corrente de amostra, por exemplo, glóbulos vermelhos, ao longo da direção de fluxo. Quando assim alinhado, conforme mostrado na Figura 4K, o dispositivo de imageamento ou câmera pode obter imagens dos glóbulos vermelhos, os mesmos parecem redondos, devido ao fato de que a superfície maior da célula sanguínea está voltada para a câmera. Dessa forma, o glóbulo vermelho assume um alinhamento que apresenta uma baixa resistência em relação ao fluxo. Por conseguinte, as características de viscosidade relativas do fluido envoltório e do fluido de amostra podem contribuir para uma alta porcentagem ou número de glóbulos vermelhos voltados para a câmera, acentuando, assim, a capacidade de avaliação do sistema de análise de partículas.

[000171] De acordo com algumas modalidades, as características de viscosidade do fluido envoltório operam para limitar o desalinhamento de partícula na amostra de urina. Por exemplo, os diferenciais de viscosidade podem ser eficazes para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de glóbulos vermelhos na amostra de fluido de urina para menos que cerca de 10%. Isto é, 90 ou mais glóbulos vermelhos de 100 glóbulos vermelhos em uma amostra podem ser alinhados de modo que suas superfícies maiores fiquem voltadas para o dispositivo de imageamento. Uma zona de transição de estreitamento simétrica pode fornecer um valor de 20%. Uma imagem de uma amostra de urina processada com o uso de uma célula de fluxo sem um fluido envoltório viscoso é representada na Figura 4O, e em comparação, uma imagem de uma amostra de urina processada com o uso de uma célula de fluxo com um fluido envoltório viscoso é representada na Figura 4P. Conforme mostrado aqui, o uso de um fluido envoltório viscoso pode limitar o desalinhamento em partículas dentro da corrente de fluido de amostra. De acordo com algumas modalidades, o fluido envoltório tem um índice de refração similar àquele da água (isto é, n=1,3330). Em alguns casos, o fluido envoltório tem um teor de água de cerca de 89%. Adicionalmente aos efeitos de alinhamento observados como resultado do diferencial de viscosidade, os efeitos de alinhamento também são observados como resultado de uma zona de transição afunilada bilateral. Em alguns casos, é observado que uma zona de transição afunilada bilateral (isto é, simétrica) é duas vezes eficaz no alinhamento de partículas em comparação com um projeto de zona de transição afunilada assimétrica.

[000172] O alinhamento eficiente dos glóbulos vermelhos pode contribuir para o diagnóstico aperfeiçoado. Em alguns casos, o formato dos glóbulos vermelhos imageados pode ser usado para determinar se um paciente do qual a amostra é obtida tem uma condição ou doença fisiológica particular. Por exemplo, os pacientes com anemia falciforme apresentam células sanguíneas que têm um formato anormal (isto é, no formato de uma foice). Por conseguinte, obtendo-se imagens de alta qualidade de glóbulos vermelhos alinhados, é possível assegurar um diagnóstico preciso. Outras variações de formato em glóbulos vermelhos, por exemplo, glóbulos vermelhos que têm área periférica delgada e uma grande área central plana, de modo que o glóbulo vermelho pareça ter o perfil de um pneu de bicicleta, podem ser imageadas de modo eficaz com o uso das presentes técnicas de alinhamento. De modo similar, os glóbulos vermelhos com uma porção central pequena e uma área periférica espessa, de modo que o glóbulo vermelho pareça ter o perfil de um pneu de caminhão, podem ser imageados para propósitos de diagnósticos. As técnicas de imageamento aperfeiçoadas reveladas no presente documento também são úteis para avaliar outras características de glóbulos vermelhos, tais como teor de hemoglobina, teor de ferro e similares.

[000173] Sem se ater a qualquer teoria particular, acredita-se que um diferencial de viscosidade entre a viscosidade do fluido envoltório e a viscosidade do fluido de amostra produz um perfil parabólico modificado, em que o perfil é geralmente parabólico e tem um ressalto central que corresponde a uma área central do fluxo em que a aceleração é aumentada, e o ressalto central contribui para o alinhamento de partículas de amostra ou organelas intrapartícula. De acordo com algumas modalidades, a diferença de velocidade entre a fita de amostra e envoltório e a diferença de viscosidade geram forças de cisalhamento para aumentar o alinhamento das organelas ou partículas intracelulares. Os aspectos exemplificadores do perfil parabólico de fluido envoltório são discutidos no pedido de patente copendente US n° , cujo conteúdo é aqui incorporado, a título de referência.

[000174] Os glóbulos brancos são tipicamente maiores que os glóbulos vermelhos e plaquetas. Por exemplo, os neutrófilos e eosinófilos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 10 μm e cerca de 12 μm. Os basófilos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Os linfócitos exemplificadores (pequenos) podem ter um diâmetro entre cerca de 7 μm e cerca de 8 μm, e os linfócitos exemplificadores (grandes) podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 15 μm. Os monócitos exemplificadores podem ter um diâmetro entre cerca de 12 μm e cerca de 20 μm. A configuração do sistema de análise de partículas, incluindo a interação entre o fluido envoltório e a fita de amostra de fluido, à medida que os mesmos passam através da célula de fluxo, pode operar para comprimir os glóbulos brancos à medida que se movem através do sítio de captura de imagem 432l, conforme indicado na Figura 4L. Por conseguinte, por exemplo, uma porção central do glóbulo branco (WBC) pode ser posicionada dentro da fita de fluido de amostra R, e as porções periféricas do glóbulo branco podem ser posicionadas dentro do fluido envoltório. Por conseguinte, à medida que o glóbulo branco é transportado através da célula de fluxo pela fita, os lados do glóbulo branco podem estender-se para dentro do fluido envoltório.

[000175] De acordo com algumas modalidades, as diferenças de viscosidade entre o fluido envoltório e o fluido de amostra podem operar para alinhar as organelas ou outros traços intracelulares que estão presentes dentro das células, tais como glóbulos brancos. Sem se ater a qualquer teoria particular, acredita-se que as forças de cisalhamento associadas ao diferencial de viscosidade entre o fluido envoltório e o fluido de amostra podem agir sobre os glóbulos brancos para que alinhem os traços intracelulares. Em alguns casos, as forças de cisalhamento associadas a diferenciais de velocidade entre o fluido envoltório e o fluido de amostra podem contribuir para tal alinhamento. Esses efeitos de alinhamento podem ser impactados por um diferencial de tamanho entre as partículas e a fita de fluido de amostra também. Por exemplo, em que as porções das partículas se estendem para fora da fita de fluido de amostra e para dentro do fluido envoltório circundante, as forças de cisalhamento associadas à diferença em viscosidade podem ter um efeito considerável sobre no alinhamento de traço intracelular.

[000176] Conforme representado na Figura 4L, as porções de uma célula, tal como um glóbulo branco, podem estender-se para dentro do fluido envoltório. As modalidades da presente invenção abrangem as composições de fluido envoltório que não causam a lise ou fragmentam a célula, ou de outro modo comprometam a integridade da membrana celular externa, quando a célula é exposta ao fluido envoltório. Um agente de viscosidade no fluido envoltório pode operar para reter a viabilidade de células na corrente de fluido de amostra, a fim de deixar a estrutura (por exemplo, formato) e o conteúdo (por exemplo, núcleo) das células intactos quando a parede ou membrana celular atravessa uma interface entre a fita de fluido de amostra e o envelope de fluido envoltório, ou de outro modo se estende a partir da corrente de fluido de amostra no fluido envoltório circulante.

[000177] Muitas vezes, existem forças compressivas que agem sob as células ou partículas à medida que as mesmas fluem dentro da fita de fluido de amostra ao longo da célula de fluxo. Por conseguinte, as células podem entrar em contato com o fluido envoltório, enquanto que as células estão em um estado comprimido ou estão de outro modo sujeitas a forças compressivas como resultado de uma zona de transição de estreitamento. O agente de viscosidade do fluido envoltório pode operar para proteger as células comprimidas de serem fragmentadas ou destruídas quando as mesmas emergem a partir da fita de fluido de amostra delgada e ficam expostas ao fluido envoltório viscoso, ao menos até as células alcançarem o sítio de captura de imagem. Por conseguinte, a composição do agente de viscosidade do fluido envoltório pode operar como um protetor celular, enquanto que também acentua o alinhamento das partículas ou conteúdo intrapartícula.

[000178] Com referência às Figuras 4K e 4L, em alguns casos, as porções da célula ou partícula podem se estender para fora da fita de fluido de amostra delgada R e para dentro do fluido envoltório circundante. Conforme discutido no pedido de patente copendente US n° , o fluido envoltório pode conter protetores celulares que inibem ou impedem que o fluido envoltório rompa ou cause a lise das células ou partículas. Por exemplo, o fluido envoltório pode conter protetores celulares que conservam a integridade estrutural das paredes celulares à medida que as células são expostas ao ambiente químico do fluido envoltório. De modo similar, os protetores celulares podem também operar para conservar a integridade estrutural das paredes celulares à medida que as células experimentam quaisquer forças de cisalhamento induzidas pela geometria da célula de fluxo e uma diferença em velocidade e/ou viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido envoltório. De modo correspondente, os protetores podem proteger as células ou partículas contra forças que resultam da diferença em velocidade entre o fluido de amostra e o fluido envoltório. Dessa forma, as células retêm sua viabilidade à medida que alcançam o sítio de captura de imagem.

[000179] As forças de cisalhamento podem ser significantes na interface entre a fita de fluido de amostra e o envelope de fluido envoltório. De acordo com algumas modalidades, o fluxo dentro da trajetória de fluxo de célula de fluxo pode ser caracterizado por um perfil de fluxo parabólico. A Figura 4L-1 representa aspectos exemplificadores de perfis de fluxo parabólicos 400l-1a e 400l-1b. O perfil parabólico 400l-1a no painel superior é um perfil de velocidade típico encontrado em fluxos dentro de determinadas modalidades de célula de fluxo da presente invenção (por exemplo, em que há pouco ou nenhum diferencial de viscosidade entre um fluido de corrente de amostra que é envelopado dentro de uma corrente de fluido envoltório). Conforme pode ser visto, uma velocidade linear maior é observada no meio da corrente de fluido e velocidades lineares mais lentas são observadas próximo à parede da célula de fluxo. O perfil 400l-1a pode também ser observado em corrente de fluido com uma ligeira diferença de viscosidade entre os fluidos envoltórios e de amostra. Em um caso em que há um alto diferencial de viscosidade entre as correntes de fluido e envoltório, um ressalto central é observado conforme mostrado no perfil 400l-1b, em que há uma área localizada com velocidades lineares amplificadas. De acordo com algumas modalidades, as partículas que são suficientemente grandes em tamanho serão submetidas a alguma quantidade de força de cisalhamento, até onde tais partículas estão completamente contidas dentro de uma única fase de fluido (isto é, dentro do envelope de fluido envoltório envelope ou, alternativamente, dentro da fita de fluido de amostra).

[000180] Em alguns casos, a velocidade do fluido envoltório pode ser diferente da velocidade do fluido de amostra. Por exemplo, o fluido envoltório pode estar se movendo a 80 mm/segundo e o fluido de amostra pode estar se movendo a 60 mm/segundo. Por conseguinte, em alguns casos, o fluido de amostra sai da porta de cânula distal em uma velocidade de fluido de amostra que é menor que a velocidade de fluido envoltório do envelope circundante. Por conseguinte, o fluido envoltório pode operar para arrastar o fluido de amostra ao longo da trajetória de fluxo da cânula, acelerando, assim, o fluido de amostra e reduzindo a espessura da fita de fluido de amostra. A fita de fluido de amostra mantém a massa e volume total, à medida que se move mais rápido se torna mais delgada. De acordo com algumas modalidades, tanto o fluido envoltório como o fluido de amostra têm uma velocidade entre cerca de 20 e 200 mm/segundo no sítio de captura de imagem.

[000181] Tipicamente, a velocidade do fluido de amostra aumenta à medida que o fluido de amostra se move a partir da porta de saída de cânula ao sítio de captura de imagem. Em alguns casos, a velocidade do fluido de amostra no sítio de captura de imagem é 40 vezes a velocidade do fluido de amostra à medida que o mesmo sai da porta de cânula na porção distal da cânula. De acordo com algumas modalidades, a diminuição em área de seção transversal da fita de amostra é linear ao aumento em velocidade. De acordo com algumas modalidades, se a velocidade de envoltório na saída da cânula for maior que a velocidade de fita de amostra, isso também aumentará a velocidade de fita de amostra final na área de imageamento.

[000182] O fluido envoltório pode operar para aplicar forças de cisalhamento significantes sobre a fita de fluido de amostra e em partículas dentro da fita de fluido de amostra. Algumas forças são paralelas à direção de fluxo, e as partículas podem também encontrar forças que são perpendiculares à direção de fluxo. Muitas vezes, à medida que o fluido envoltório e o fluido de amostra se aproximam da zona ou sítio de captura de imagem, os fluidos envoltórios e de amostra estão se movendo quase ou na mesma velocidade. Por conseguinte, o limite ou interface entre os fluidos envoltórios e de amostra, à medida que os mesmos passam do sítio de captura de imagem, pode apresentar forças de cisalhamento menores, em comparação com o limite ou interface na porta de saída de cânula distal ou na zona de transição afunilada. Por exemplo, na zona de transição afunilada, o limite ou interface entre o envelope de fluido envoltório e a fita de fluido de amostra pode estar em transição, de tal modo que a fita de amostra que é inicialmente mais lenta e mais espessa se torne mais rápida e mais delgada, e as partículas no fluido de amostra se tornem mais alinhada. De outro modo, as forças de cisalhamento podem ser proeminentes na zona de transição afunilada, e podem se dissipar em direção ao sítio de captura de imagem. As forças de cisalhamento no sítio de captura de imagem podem ser representadas por um perfil parabólico e podem ser muito menores que as forças de cisalhamento na zona de transição afunilada. Por conseguinte, as células ou partículas podem experimentar forças de cisalhamento maiores à medida que passam através da zona de transição, e forças de cisalhamento menores à medida que passam através do sítio de captura de imagem. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de envoltório e amostra pode colocar os glóbulos vermelhos em alinhamento e, assim, em foco. De acordo com algumas modalidades, a diferença de viscosidade entre os fluidos de envoltório e amostra pode colocar os glóbulos brancos em alinhamento e, assim, em foco. De modo correspondente, resultados de imageamento acentuados podem ser obtidos para os componentes celulares e organelas que são alinhados e colocados em foco, que resulta a partir do estreitamento geométrico da corrente e da diferença de velocidade entre os fluidos de envoltório e amostra.

[000183] Conforme observado em outro lugar no presente documento, e com referência às Figuras 4K e 4L, à medida que o fluido envoltório e o fluido de amostra R fluem através de uma redução em tamanho de trajetória de fluxo ou zona de transição de uma célula de fluxo, e em direção a um sítio de imageamento 432k ou 432l, um efeito de hidro- focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido envoltório e o fluido de amostra R associada a uma diferença de viscosidade entre a viscosidade de fluido envoltório e a viscosidade de fluido de amostra, em combinação com um efeito de hidro-focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido envoltório e o fluido de amostra R associada à redução em tamanho de trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de imageamento alvo em pelo menos parte da pluralidade de partículas no sítio de imageamento 432k ou 432l.

[000184] Em alguns casos, o estado de imageamento alvo é uma orientação alvo em relação a um plano focal F no sítio de imageamento. Por exemplo, conforme representado na Figura 4K-1, a partícula (RBC) pode ser deslocada a uma distância do plano focal F. Em alguns casos, uma orientação alvo envolve uma orientação de partícula alvo em relação ao plano focal F no sítio de imageamento 432k-1. A partícula pode ser uma célula sanguínea, tal como um glóbulo vermelho, um glóbulo branco ou uma plaqueta. Conforme mostrado aqui, a trajetória de fluxo no sítio de imageamento 432k-1 pode definir um plano P que é substancialmente paralelo a ou coplanar com o plano focal F. Em alguns casos, uma porção da partícula pode ser posicionada ao longo do plano focal F, ainda, a porção central da partícula pode ser de outro modo deslocada do plano focal F. Em alguns casos, a orientação alvo envolve uma posição alvo em relação ao plano focal F no sítio de imageamento 432k-1. Por exemplo, a posição alvo pode envolver o posicionamento da partícula de modo que ao menos uma porção da partícula seja disposta ao longo do plano focal F. Em alguns casos, a posição alvo pode envolver o posicionamento da partícula de modo que uma distância entre a partícula e o plano focal F não exceda um determinado limiar. Em alguns casos, a posição alvo envolve uma posição de partícula alvo que é relativa ao plano focal F no sítio de imageamento 432k-1. Em alguns casos, a posição alvo é igual ou menor que uma distância D a partir do plano focal F, em que a distância D corresponde a uma tolerância posicional. Um diferencial de viscosidade entre o fluido envoltório e o fluido de amostra pode ser selecionado a fim de alcançar um posicionamento desejado da corrente de amostra de fita dentro da célula de fluxo (por exemplo, em relação ao plano de trajetória de fluxo P e/ou plano focal F). Em alguns casos, o diferencial de viscosidade pode ser selecionado a fim de alcançar uma posição de partícula alvo que é igual ou menor que a tolerância posicional D.

[000185] Em alguns casos, o plano focal F tem uma espessura ou profundidade de campo conforme indicado na Figura 4K-2, e a partícula (RBC) tem um estado de imageamento alvo em relação à espessura de plano focal. Por exemplo, a posição alvo para a partícula pode ser dentro do plano focal F ou ao menos parcialmente dentro do plano focal F. Em alguns casos, um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou câmera pode ter uma profundidade de campo ou espessura de plano focal de cerca de 7 μm. Em alguns casos, a profundidade de campo ou espessura de plano focal tem um valor com uma faixa a partir de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a profundidade do campo da câmera é similar ou igual à espessura de fita de amostra no sítio de captura de imagem.

[000186] Em alguns casos, a orientação alvo pode envolver um alinhamento alvo em relação ao plano focal F no sítio de imageamento. Por exemplo, o alinhamento alvo pode indicar que um plano definido pela partícula é alinhado com o plano focal F, não para exceder um determinado ângulo α em relação ao plano focal F no sítio de captura de imagem 432k-3 conforme mostrado na Figura 4K-3. Em alguns casos, o estado de imageamento alvo pode envolver uma limitação sobre o número ou porcentagem de partículas desalinhadas em uma amostra. Por exemplo, uma diferença em viscosidade entre o fluido envoltório e o fluido de amostra R pode ser eficaz para limitar o desalinhamento de orientação de imageamento de glóbulos vermelhos na amostra de urina para menos que cerca de 10%. Isto é, 90 ou mais glóbulos vermelhos de 100 glóbulos vermelhos em uma amostra podem ser alinhados de modo que suas superfícies maiores fiquem voltadas para o dispositivo de imageamento (conforme representado nas Figuras 4K-1 e 4K-2) ou de modo que o alinhamento daqueles 90 ou mais RBCs esteja dentro de 20 graus de um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo (por exemplo, ângulo de alinhamento de RBC α é de 20 graus ou menos). Conforme discutido em outro lugar no presente documento, em alguns casos, ao menos 92% de partículas não esféricas, tais como RBCs, podem ser alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em alguns casos, ao menos entre 75% e 95% de partículas não esféricas, tais como RBCs, podem ser substancialmente alinhadas, ou seja, dentro de 20 graus de um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo (por exemplo, ângulo de alinhamento α é de 20 graus ou menos). De acordo com algumas modalidades, 90% ou mais de determinadas partículas (por exemplo, glóbulos vermelhos e/ou plaquetas) podem ser orientadas transversal ao eixo geométrico de imageamento do dispositivo de imageamento.

[000187] Em alguns casos, as modalidades da presente invenção incluem composições para o uso com um sistema de urinálise, conforme descrito na presente invenção, tal como uma partícula ou fluido envoltório e líquido de alinhamento de organela intracelular (PIOAL). Tais fluidos envoltórios ou PIOALs são adequados ao uso em um analisador visual de hidro-focalização geométrica e de viscosidade combinada. O PIOAL pode operar para direcionar ou facilitar o fluxo de um fluido de amostra de urina de uma determinada viscosidade através de uma zona de transição de célula de fluxo de estreitamento do analisador visual. O PIOAL pode incluir um fluido que tem uma viscosidade maior que a viscosidade da amostra. Um efeito de hidro- focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associado à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidro-focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido de PIOAL e o fluido de amostra associado à zona de transição de célula de fluxo de estreitamento, pode ser eficaz para fornecer um estado de imageamento alvo em pelo menos parte da pluralidade de partículas em um sítio de imageamento do analisador visual, enquanto que se retém a viabilidade de células no fluido de amostra de urina.

[000188] A Figura 4M representa um neutrófilo exemplificador 400 m (um tipo de glóbulo branco) que tem organelas internas, tais como lóbulos 410m. Como resultado do diferencial de viscosidade entre o fluido de amostra e o fluido envoltório, as organelas internas podem se alinhar dentro da célula, conforme indicado pela Figura 4N. Por conseguinte, as organelas intracelulares podem ser imageadas de modo eficaz com um dispositivo de captura de imagem 430m, sem que as organelas sobreponham umas às outras. Isto é, em vez dos lóbulos serem empilhados um sobre o outro, conforme representado na Figura 4M, quando vistos a partir do eixo geométrico óptico ou de imageamento do dispositivo de captura de imagem, os lóbulos são alinhados e assentados lado a lado, conforme representado na Figura 4N. Por conseguinte, os lóbulos podem ser visualizados na imagem capturada de modo mais eficaz. O alinhamento de organela interna é um resultado surpreendente e inesperado do diferencial de viscosidade entre os fluidos de amostra e envoltório.

[000189] Conforme observado em outro lugar no presente documento, e com referência às Figuras 4M e 4N, à medida que o fluido envoltório e o fluido de amostra R fluem através de uma redução em tamanho de trajetória de fluxo ou zona de transição de uma célula de fluxo, e em direção a um sítio de imageamento de um dispositivo de captura de imagem 430m ou 430n, um efeito de hidro-focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido envoltório e o fluido de amostra R associado a uma diferença de viscosidade entre a viscosidade de fluido envoltório e a viscosidade de fluido de amostra, em combinação com um efeito de hidro-focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido envoltório e o fluido de amostra R associado à redução em tamanho de trajetória de fluxo ou zona de transição, fornece um estado de imageamento alvo em pelo menos parte da pluralidade de partículas no sítio de imageamento. De acordo com algumas modalidades, o estado de imageamento alvo pode corresponder a uma distribuição de estados de imageamento.

[000190] Em alguns casos, o estado de imageamento alvo pode envolver uma orientação de estrutura intrapartícula alvo (por exemplo, alinhamento e/ou posição) em relação a um plano focal no sítio de imageamento. Por exemplo, conforme representado na A Figura 4N, as estruturas internas 410m (por exemplo, estrutura intracelular, organela, lóbulo, ou similares) podem ser orientadas em relação ao plano focal F. Em alguns casos, o alinhamento alvo envolve um alinhamento de estrutura intrapartícula alvo em relação a um plano focal F no sítio de imageamento, similar à relação de alinhamento de partícula representada na Figura 4K-3. Em alguns casos, a posição alvo envolve uma posição de estrutura intrapartícula alvo em relação a um plano focal no sítio de imageamento, similar à relação de posição de partícula representada na Figura 4K-1. Em alguns casos, a orientação alvo da estrutura intrapartícula pode incluir tanto um alinhamento alvo em relação ao plano focal como também uma posição alvo em relação ao plano focal. Em alguns casos, o estado de imageamento alvo pode envolver uma deformação alvo no sítio de imageamento. Por exemplo, conforme representado na Figura 4N, a partícula 400m tem um formato comprimido em comparação com o formato de partícula representado na Figura 4M. Por conseguinte, pode ser visto que a operação da célula de fluxo pode produzir um efeito de compressão lateral sobre os formatos de partícula. De modo correspondente, os traços intrapartícula podem ser orientados de maneira posicional ou direcional (por exemplo, alinhados em relação ao plano focal F e/ou plano de fluxo de fita), à medida que a própria partícula é comprimida em formato. De acordo com algumas modalidades, uma diferença de velocidade entre os fluidos de amostra e envoltório pode produzir atrito dentro da corrente, e uma diferença de viscosidade entre os fluidos de amostra e envoltório pode amplificar esse atrito hidrodinâmico.

Exemplos

[000191] Qualquer uma dentre uma variedade de técnicas de urinálise ou análise de partículas de urina pode ser realizada com o uso de imagens de fluido de amostra que flui através da célula de fluxo. Muitas vezes, a análise de imagem pode envolver determinar determinados parâmetros de célula ou partícula, ou medir, detectar ou avaliar determinados traços de célula ou partícula. Por exemplo, a análise de imagem pode envolver avaliar o tamanho de célula ou partícula, traços de núcleo de célula, traços de citoplasma de célula, traços de organela intracelular e similares. De modo correspondente, as técnicas de análise podem abranger determinados métodos de contagem ou classificação ou testes de diagnóstico. De modo correspondente, com referência à Figura 4, o processador 440 pode incluir ou ficar em associação operacional a um meio de armazenamento que tem um aplicativo de computador que, quando executado pelo processador, é configurado para fazer com que o sistema 400 diferencie tipos diferentes de células ou partículas com base em imagens obtidas a partir do dispositivo de captura de imagem. Por exemplo, as técnicas de diagnóstico ou teste podem ser usadas para diferenciar diversas partículas presentes na urina (por exemplo, glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, células epiteliais escamosas, cálculos, cristais e leveduras).

[000192] Os exemplos fornecidos no presente documento são para o propósito de ilustração apenas, e a invenção não se limita a esses Exemplos, mas, de preferência, abrange todas as variações que são evidentes como resultado da instrução fornecida no presente documento.

[000193] Antes dos experimentos aqui descritos, não houve protocolo publicado que permitisse o desenvolvimento e os métodos de uso que compreendem PIOAL para alinhar partículas em urina e reposicionar o teor intracelular, conforme aqui revelado. Isso é útil para análise à base de imagem e categorização e subcategorização diferencial de partículas em amostras de fluido corpóreo (por exemplo, urina). Os métodos e composições reveladas no presente documento podem, opcionalmente, colorir e/ou submeter à lise as partículas de uma maneira adequada para alcançar coloração de glóbulo branco, células epiteliais, coloração de bactérias, que acentuam a visualização diferencial na lâmina para microscópio. De modo correspondente, antes dos experimentos descritos no presente documento, não houve protocolo publicado que permitisse o desenvolvimento e os métodos de uso que compreendem PIOAL para análise à base de imagem e para realizar a categorização e subcategorização diferencial de partícula/celular em amostras de urina e os métodos para usar tais composições, enquanto que se mantém células viáveis ou substancialmente intactas, com a opção de etapas de coloração e permeabilização que ocorrem durante fluxo, para se alcançar a coloração de glóbulo branco, células epiteliais, bactérias, que acentuam a visualização diferencial em lâmina para microscópio.

[000194] As composições exemplificadoras descritas no presente documento permitem que a coloração ocorra em uma diluição de sangue para reagente relativamente baixa e a coloração pode ocorrer rapidamente (por exemplo, dentro de 30 segundos). Se for desejado, o método exemplificador pode empregar o uso de um tensoativo em combinação com calor para alcançar a lise de glóbulo vermelho. As formulações exemplificadoras podem ser modificadas para manter a integridade de RBC e ainda alcançar a eficácia de coloração de WBC, reticulócito e plaqueta.

[000195] Os aspectos e modalidades da presente revelação têm por base a descoberta surpreendente e inesperada que determinadas composições de PIOAL têm propriedades inesperadas que alinham células e reposicionam estruturas intracelulares quando usadas para realizar a análise de partículas/células à base de imagem.

[000196] A título de exemplo, várias formulações de PIOAL exemplificadoras e métodos de uso das mesmas foram desenvolvidos. A seguir estão alguns exemplos de formulações de PIOAL com as propriedades desejadas.

[000197] As composições exemplificadoras descritas no presente documento permitem que a coloração ocorra em uma razão entre urina e reagente relativamente alta e a coloração pode ocorrer rapidamente (por exemplo, dentro de 30 segundos). Se for desejado, o método exemplificador pode empregar o uso de um tensoativo em combinação com calor para alcançar a permeabilização de membrana para manter a integridade de RBC e ainda alcançar a eficácia de coloração de WBC, células epiteliais e bactérias na resolução desejada.

[000198] As Figuras 4O e 4P mostram imagens que demonstram a comparação entre as imagens obtidas com o uso de um PIOAL (Figura 4P) versus um fluido envoltório convencional (Figura 4O). A amostra contendo uma versão concentrada do controle de urina positivo iQ200 foi analisada depois que os instrumentos foram focalizados com o uso do protocolo de focalização (em um padrão de foco automático exemplificador). A amostra foi injetada na célula de fluxo através de uma cânula, gerando uma corrente de amostra em formato de fita de aproximadamente 2,5 mícrons de espessura entre duas camadas de PIOAL ou envoltório convencional (em controles). O analisador visual, então, gera imagens focalizadas das partículas na corrente de amostra em formato de fita (por exemplo, em cerca de 60 quadros por segundo) a serem usadas para a análise. Conforme pode ser visto a partir das Figuras 4O e 4P, o PIOAL aumenta significativamente a porcentagem de partículas alinhadas na amostra de urina concentrada.

[000199] A título de exemplo, a Figura 4Q mostra as imagens resultantes obtidas com o uso da composição e métodos exemplificadores da revelação, as quais demonstraram a eficácia na categorização e/ou subcategorização das seguintes partículas: glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, células epiteliais escamosas, cálculos, cristais e leveduras. As imagens revelaram diversos componentes celulares e que lóbulos nucleares e estruturas granulares são claramente distinguíveis para cada tipo de célula. A amostra de urina foi coletada com o uso do seguinte protocolo: A amostra foi colocada em contato com uma composição de agente de contraste de partícula, conforme apresentado abaixo. Os seguintes líquidos foram misturados em conjunto para obter a composição de agente de contraste de partículas exemplificadora: 0,150 ml de 1 mg/ml de cristal violeta dissolvido em uma solução lítica (CDS 5PD-Lytic) e 0,150 ml de PBS, pH 7,2. A amostra exemplificadora foi preparada inicialmente pipetando-se 300 ul da composição de agente de contraste de partículas exemplificadora em um tubo de teste e misturando-se a mesma com 1,7 ml de amostra de urina. A mistura foi aquecida durante 30 segundos em um banho de água a 60 °C. A amostra foi analisada em um analisador exemplificador (por exemplo, conforme representado na Figura 1) com o uso das seguintes condições: taxa de fluxo de amostra de 0,56 ul/s e taxa de fluxo de fluido envoltório de 46 ul/s. Os resultados são mostrados na Figura 4Q. Por conseguinte, pode ser visto que as técnicas de processamento de amostra reveladas no presente documento podem fornecer resultados de imageamento favoráveis, de tal modo que o conteúdo e estrutura de partícula seja conservado, e o alinhamento acentuado em relação a um eixo geométrico de imageamento é alcançado.

[000200] Também foi observado que a implementação de PIOAL resulta no alinhamento aperfeiçoado com base no uso de níveis crescentes de glicerol (gly) em células de fluxo simétricas e assimétricas.

[000201] Esses resultados fornecem evidência para a descoberta surpreendente e inesperada que determinadas composições de PIOAL têm propriedades inesperadas que alinham células e reposicionam estruturas intracelulares quando usadas para realizar a análise de partículas/célula à base de imagem.

[000202] A título de exemplo, várias formulações de PIOAL exemplificadoras e métodos de uso das mesmas foram desenvolvidos. A seguir estão alguns exemplos de formulações de PIOAL com as propriedades desejadas. O PIOAL compreende um diluente e ao menos um agente de modificação de viscosidade.

[000203] A formulação de PIOAL exemplificadora A inclui uma solução de glicerol a 30% (em volume) que tem 300 ml de glicerol e q.s. (quantidade suficiente ou para levar o volume final até) até 1 l com diluente contendo 9,84 g de sulfato de sódio, 4,07 g de cloreto de sódio, 0,11 g de procaína HCl, 0,68 g de fosfato de potássio monobásico, 0,71 g de fosfato de sódio dibásico e 1,86 g de EDTA dissódico. A mistura inicial foi seguida de q.s. até 1 l com água desionizada, enquanto que se ajustava o pH para 7,2 com hidróxido de sódio.

[000204] A formulação de PIOAL exemplificadora B inclui uma solução de glicerol a 6,5% (em volume) que tem 65 ml de glicerol e q.s. até 1 l com diluente exemplificador adequado contendo 9,84 g de sulfato de sódio, 4,07 g de cloreto de sódio, 0,11 g de procaína HCl, 0,68 g de fosfato de potássio monobásico, 0,71 g de fosfato de sódio dibásico e 1,86 g de EDTA dissódico. A mistura inicial foi seguida de q.s. até 1 l com água desionizada, enquanto que se ajustava o pH para 7,2 com hidróxido de sódio.

[000205] A formulação de PIOAL exemplificadora C inclui uma solução de glicerol a 5% (em volume) com 1% de PVP (peso por volume) em tampão que tem 50 ml de glicerol, 10 g de PVP (PM: 360.000), 1 pacote de pó de STF Sigma, em pH 7,4 (0,01 M de solução salina tamponada com fosfato; 0,138 M de cloreto de sódio; 0,0027 M de cloreto de potássio), e q.s. até 1 l com água desionizada.

[000206] A formulação de PIOAL exemplificadora D inclui uma solução de PVP a 1,6% (peso por volume) que tem 16 g de PVP (PM: 360.000) e 1 pacote de pó de STF Sigma, em pH 7,4 (0,01 M de solução salina tamponada com fosfato; 0,138 M de cloreto de sódio; 0,0027 M de cloreto de potássio), e q.s. até 1 l com água desionizada.

Taxa de rendimento

[000207] A Figura 5 representa um cronograma 500 que corresponde à injeção de um ou mais fluidos de amostra em uma célula de fluxo. Conforme mostrado aqui, a injeção de um primeiro fluido de amostra pode ser iniciada em uma célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 510. Consequentemente, as partículas a partir do primeiro fluido de amostra podem ser imageadas na célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 515. O primeiro fluido de amostra pode ter um volume de cerca de 900 μl. Em alguns casos, o fluxo é de 0,232 μl/segundo (ou dentro de uma faixa a partir de 0,2 μl/segundo a 0,35 μl/segundo) na área de imageamento. A injeção do primeiro fluido de amostra pode ser terminada, conforme indicado pela etapa 520, e a injeção de um segundo fluido de amostra pode ser iniciada na célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 530. Os transientes de fluido de amostra podem ser iniciados, conforme indicado pela etapa 535, como resultado da terminação da primeira injeção de fluido de amostra e iniciação da segunda injeção de fluido de amostra. Subsequentemente, os transientes de fluido de amostra na célula de fluxo podem se dissipar, conforme indicado pela etapa 445. As partículas a partir do segundo fluido de amostra podem ser imageadas na célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 550. A injeção do segundo fluido de amostra pode ser terminada, conforme indicado pela etapa 560. Em alguns casos, os procedimentos de injeção e fluxo são realizados em temperaturas dentro de uma faixa a partir de cerca de 18 °C a cerca de 40 °C.

[000208] Tipicamente, a corrente do fluido envoltório permanece fluindo dentro da célula de fluxo à medida que a amostra é injetada, e à medida que a injeção é terminada. Por conseguinte, de acordo com algumas modalidades, um fluxo contínuo de fluido envoltório é mantido enquanto que as injeções de fluido de amostra são pulsadas no envoltório circulante. O fluxo contínuo do fluido envoltório pode contribuir para a conservação de um formato de fita no fluido de amostra à medida que o fluido de amostra flui ao longo da célula de fluxo.

[000209] De acordo com algumas modalidades, a captura de imagem associada à etapa 550 pode ser realizada dentro de quatro segundos da captura de imagem associada à etapa 515. De acordo com algumas modalidades, o tempo entre a primeira e a segunda injeções de fluido de amostra (por exemplo, entre as etapas 510 e 530) é de cerca de 30 segundos. De modo correspondente, de acordo com algumas modalidades, o tempo entre a iniciação do imageamento do primeiro e segundo fluidos de amostra (por exemplo, entre a iniciação da etapa 515 e a iniciação da etapa 550) é de cerca de 30 segundos. Dessa forma, é possível processar 120 fluidos de amostra por hora. Em alguns casos, um dispositivo de captura de imagem opera em uma taxa de quadro de 180 quadros por segundo (FPS), produzindo, desse modo, múltiplas imagens ou quadros consecutivos únicos em uma taxa ou frequência alta. Conforme mostrado aqui, a duração de uma etapa de imageamento (por exemplo, 515 ou 550) pode ser de 15 segundos, produzindo, assim, 2.700 imagens por fluido de amostra.

[000210] Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado dentro de cerca de 1 a 3 segundos após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido de amostra a partir do tubo de injeção de fluido de amostra no fluido envoltório circulante. Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado dentro de menos que 1 segundo após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido de amostra a partir do tubo de injeção de fluido de amostra no fluido envoltório circulante. A injeção da amostra na célula de fluxo pode ser um processo de duas etapas. De acordo com essa modalidade, uma primeira etapa é um impulso de velocidade alta que limpa todo o diluente da cânula, e depois do impulso inicial, a taxa de fluxo da amostra é reduzida significativamente. O tempo de transição pode ser definido como o tempo que a amostra (por exemplo, uma célula) leva para se mover a partir da saída da cânula até a área de imageamento sob as condições de fluxo de imageamento (taxa de fluxo de amostra menor). Em alguns casos, o primeiro fluido de amostra alcança um estado estabilizado dentro de cerca de 1,8 segundos após a injeção (por exemplo, etapa 510) do primeiro fluido de amostra a partir do tubo de injeção de fluido de amostra no fluido envoltório circulante. Em alguns casos, o fluido de amostra tem um tempo de trânsito através da célula de fluxo (por exemplo, a partir de uma porta de saída de cânula a um sítio de captura de imagem) dentro de uma faixa a partir de cerca de 2 a 4 segundos.

[000211] De acordo com algumas modalidades, leva cerca de 5 segundos para que o fluxo se estabilize ou para se mover a partir de uma porta de saída distal da cânula até a área de imageamento. Em alguns casos, um período de duração de captura de imagem pode ser de cerca de 20 segundos.

[000212] Um sistema de urinálise de acordo com as modalidades da presente invenção pode processar uma amostra de urina que tem um volume de cerca de 900 μl. De acordo com algumas modalidades, a cânula ou tubo de injeção tem um volume interno de menos que cerca de 30 ul. De acordo com algumas modalidades, a cânula ou tubo de injeção tem um volume interno maior que cerca de 30 ul. O volume de amostra de urina é eficaz para nivelar a cânula antes de iniciar a coleta de imagem e, desse modo, pode evitar extensos períodos de tempo em que o fluxo de amostra não é estável. Por exemplo, o uso de uma cânula que tem um volume interno de cerca de 13 ul pode corresponder a um período de instabilidade de fluxo de amostra de cerca de 2 a 3 segundos. De acordo com algumas modalidades, o volume interno da cânula pode não afetar a estabilidade de fluxo da amostra. De acordo com algumas modalidades, o volume interno da cânula pode afetar a estabilidade de concentração de célula na própria fita de amostra se o impulso de amostra de alta velocidade inicial for insuficiente para substituir todo o diluente dentro da cânula. De modo correspondente, a cânula pode ser limpa entre as amostras em uma curta quantidade de tempo com o uso de uma pequena quantidade de diluente. Dessa forma, é possível alcançar um fluxo de amostra estável que facilita a captura de uma imagem de alta qualidade e, ao mesmo tempo, alcançar uma alta taxa de rendimento, com um baixa persistência de resíduos. De acordo com algumas modalidades, uma cânula com alto volume interno pode exigir um impulso de alta velocidade inicial e alto volume de amostra para limpar todo o diluente nas linhas e cânula.

[000213] De acordo com algumas modalidades, os sistemas de urinálise podem ser configurados para limitar transientes e a contaminação cruzada de amostra sequencial, a fim de acelerar a captura de imagem a partir de amostras de urina.

Métodos

[000214] A Figura 6 representa aspectos de um método exemplificador 600 para o imageamento de uma pluralidade de partículas com o uso de um sistema de análise de partículas configurado para a hidro-focalização geométrica e de viscosidade combinada, de acordo com as modalidades da presente invenção. As partículas podem ser incluídas em uma amostra de fluido de urina 610 que tem uma viscosidade de fluido de amostra. Conforme mostrado aqui, a amostra de urina 610 inclui partículas e pode ser dividida em porções em um ou mais fluidos de amostra, tais como um primeiro fluido de amostra 612 contendo partículas e um segundo fluido de amostra 614 contendo partículas.

[000215] O método pode incluir fazer fluir um fluido envoltório 620 ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 630. O fluido envoltório 620 pode ter uma viscosidade de fluido envoltório que difere da viscosidade de fluido de amostra em uma diferença de viscosidade em uma faixa de diferença de viscosidade predeterminada. O método pode também incluir injetar a amostra de fluido de urina 610 (primeiro fluido de amostra 612) a partir de um tubo de injeção de fluido de amostra no fluido envoltório circulante dentro da célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 630, a fim de fornecer uma corrente de fluido de amostra envelopada pelo fluido envoltório.

[000216] A trajetória de fluxo da célula de fluxo pode ter uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo, de tal modo que uma espessura da corrente de fluido de amostra e do fluido envoltório através de uma redução em tamanho de trajetória de fluxo em direção a um sítio de imageamento diminua a partir da espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um sítio de captura de imagem. O método 600 podem incluir, também, o imageamento de uma primeira pluralidade das partículas a partir do primeiro fluido de amostra no sítio de captura de imagem da célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 640. À medida que a corrente de amostra e os fluidos envoltórios passam através da redução em tamanho de trajetória de fluxo ou zona de transição de estreitamento, um efeito de hidro-focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido envoltório e a corrente de fluido de amostra associado à diferença de viscosidade (conforme representado na etapa 650), em combinação com um efeito de hidro-focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido envoltório e a corrente de fluido de amostra associado à redução em tamanho de trajetória de fluxo (conforme representado na etapa 660), é eficaz para fornecer um estado de imageamento alvo em ao menos algumas dentre pluralidade de partículas no sítio de imageamento, enquanto que um agente de viscosidade no fluido envoltório retém a viabilidade de células na estrutura de saída de corrente de fluido de amostra e o teor das células intactas quando as células se estendem a partir da corrente de fluido de amostra no fluido envoltório circulante, conforme representado pela etapa 670. Os métodos podem também incluir o imageamento da pluralidade de partículas no sítio de imageamento, conforme representado pela etapa 680.

[000217] O método 600 pode também incluir a iniciação de transientes de fluido de amostra. Por exemplo, os transientes de fluidos de amostra podem ser iniciados terminando-se a injeção do primeiro fluido de amostra no fluido envoltório circulante, e injetando-se o segundo fluido de amostra no fluido envoltório circulante, conforme indicado pela etapa 650. Adicionalmente, o método 600 pode incluir o imageamento de uma segunda pluralidade das partículas a partir do segundo fluido de amostra no sítio de captura de imagem da célula de fluxo, conforme indicado pela etapa 660. De acordo com algumas modalidades, o imageamento da segunda pluralidade de partículas pode ser realizado substancialmente depois dos transientes de fluido de amostra e dentro de 4 segundos do imageamento da primeira pluralidade das partículas.

[000218] As Figuras 6A e 6B representam características de corrente exemplificadoras relacionadas à força de cisalhamento, compressão lateral, orientação, viscosidade diferencial, movimento relativo entre os fluidos de amostra e envoltório e similares.

Taxa de esforço de cisalhamento

[000219] As Figuras 7 e 8 representam aspectos de valores de taxa de esforço de cisalhamento para determinadas condições de fluxo em uma célula de fluxo de acordo com as modalidades da presente invenção. Em cada um desses desenhos, um fluido envoltório de glicerol a 30% é usado. Em alguns casos, a viscosidade pode ter um valor de 2,45 x 10-3. Um valor de tensão de cisalhamento pode ser igual ao produto obtido pela multiplicação de um valor de viscosidade com um valor de taxa de esforço. Em relação à Figura 7, a amostra pode ter uma taxa de fluxo de 0,3 μl/segundo e o fluido envoltório pode ter uma taxa de fluxo de 21 μl/segundo. Em relação à Figura 8, a amostra pode ter uma taxa de fluxo de 1 μl/segundo e o fluido envoltório pode ter uma taxa de fluxo de 70 μl/segundo. Em cada uma dessas figuras, pode ser visto que o fluxo apresenta um valor de esforço menor em direção ao centro (C) e um valor de esforço maior em direção à periferia (P). Tais valores de esforço podem corresponder a uma configuração de célula de fluxo assimétrica, em algumas modalidades.

[000220] Conforme representado na Figura 7, de acordo com algumas modalidades, a taxa de esforço menor em direção à porção de centro (C) da corrente pode ter um valor de cerca de 500 (1/s) ou menor e a taxa de esforço maior em direção à periferia (P) da corrente pode ter um valor de cerca de 3.000 (1/s) ou maior. Conforme representado na Figura 8, de acordo com algumas modalidades, a taxa de esforço menor em direção à porção de centro (C) da corrente pode ter um valor de cerca de 1.000 (1/s) ou menor e a taxa de esforço maior em direção à periferia (P) da corrente pode ter um valor de cerca de 9.000 (1/s) ou maior.

[000221] Por conseguinte, pode ser visto que as taxas menores de fluido de amostra e fluido envoltório (por exemplo, Figura 7) correspondem a taxas de esforço menores e as taxas maiores de fluido de amostra e fluido envoltório (por exemplo, Figura 8) correspondem a taxas de esforço maiores. Compreende-se que as modalidades da presente invenção abrangem o uso de fluido de amostra e/ou fluido envoltório que corresponde a diversos valores de viscosidade, diversos valores de taxa de esforço e/ou diversos valores de taxa de tensão de cisalhamento.

[000222] O PIOAL tem uma viscosidade e densidade adequada, e as taxas de fluxo no ponto de introdução à célula de fluxo da amostra são de tal modo que o fluido de amostra aplane em uma fita delgada. A corrente de amostra em formato de fita é carregada junto com o PIOAL, para passar em frente de uma porta de visualização em que uma lente objetiva e uma fonte de luz são dispostas para permitir a visualização da corrente de amostra em formato de fita. O fluido de amostra é introduzido, por exemplo, injetado em ponto em que a trajetória de fluxo do PIOAL se estreita simetricamente. Como resultado, a corrente de fluido de amostra é aplanada e estendida em uma fita delgada. Um PIOAL desta revelação pode ser usado como o fluido envoltório com qualquer analisador visual desta revelação. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser introduzido em uma extremidade da célula de fluxo para arrastar o fluido de amostra em direção à descarga.

[000223] A dimensão da corrente de amostra em formato de fita na zona de visualização é afetada pelo adelgaçamento geométrico da trajetória de fluxo de PIOAL e velocidade linear diferencial do fluido de amostra e PIOAL resultando em adelgaçamento e estiramento da corrente de amostra em formato de fita. A velocidade linear diferencial inicial da amostra para PIOAL pode variar de 0,5:1 a 5:1. A seção transversal de trajetória de fluxo de PIOAL pode ser adelgaçada reduzindo-se a profundidade por um fator de cerca de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 ou 200:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é de 40:1. Em uma modalidade, o adelgaçamento geométrico é de 30:1. Os fatores levados em conta são tempo de trânsito através da célula de fluxo, taxa desejada de rendimento de amostra, obtenção de uma espessura de corrente de amostra em formato de fita comparável com o tamanho de partícula, obtenção de alinhamento de partículas e organelas, obtenção de foco em conteúdo de partículas, equilíbrio de pressão, fluxo e viscosidade dentro de limites operacionais, otimização de espessura de corrente de amostra em formato de fita, obtenção de uma velocidade linear desejada, considerações de facilidade de fabricação e volumes de amostra e PIOAL exigidos.

[000224] O comprimento e volume da cânula e o aplanamento da seção transversal podem ser selecionados para reduzir o período de instabilidade de fluxo de amostra, aumentando assim a taxa de rendimento. Em algumas modalidades, o período de instabilidade de fluxo pode ser menor que cerca de 3, 2,75, 2,5, 2,25, 2, 1,75, 1,5, 1,25, ou menor que cerca de 1 segundo. Um volume de cânula menor podem também reduzir o tempo e volume de diluente necessário para limpar a cânula entre procedimentos de amostra. Em algumas modalidades o tempo de trânsito através da célula de fluxo é de 1, 2, 3 ou 4 segundos, ou qualquer faixa entre quaisquer dois desses tempos. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito pode ser menor que 4, 3 ou 2 segundos.

[000225] As viscosidades e as taxas de fluxo do fluido de amostra e do PIOAL e o contorno da célula de fluxo são dispostos de tal modo que o fluxo de PIOAL aplane e estenda o fluxo de amostra em uma fita plana de maneira consistente através da zona de visualização em um local confiável que corresponde a um sítio de captura de imagem. A corrente de fluido de amostra pode ser comprimida a aproximadamente 2 a 3 μm em espessura de fluxo de fluido. Diversos tipos de célula sanguínea têm diâmetros maiores que a espessura de corrente. As forças de cisalhamento na direção paralela à direção de fluxo causam um aumento de uma projeção de imagem das partículas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e/ou fazem com que as estruturas intrapartícula, por exemplo, estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos, sejam posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para ficarem substancialmente paralelas à direção de fluxo. A profundidade de campo do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é de até 7 μm, por exemplo, 1 a 4 μm.

[000226] A seção transversal de fluxo do PIOAL, com a corrente de amostra em formato de fita arrastada, é constante através de uma zona de visualização em frente de uma porta de visualização através da qual a lente objetiva é direcionada. A lente objetiva pode ser o componente objetivo de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital. A corrente de amostra em formato de fita segue uma trajetória através da zona de visualização em uma posição conhecida e repetível dentro da célula de fluxo, por exemplo, a uma distância conhecida e repetível de duas paredes da célula de fluxo, sendo descarregada a jusante.

[000227] Em algumas modalidades, as imagens obtidas em qualquer uma das composições e/ou métodos dessa invenção pode ser imagens digitalizadas. Em algumas modalidades, as imagens obtidas são imagens microscópicas. Em certas modalidades, as imagens podem ser obtidas manualmente. Em outras modalidades, ao menos parte do procedimento para obter as imagens é automatizada. Em algumas modalidades, as imagens podem ser obtidas com o uso de um analisador visual que compreende uma célula de fluxo, um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital, opcionalmente com um recurso de foco automático.

[000228] As informações ópticas a partir das partículas na amostra são detectadas por uma seção de detecção no analisador, quando a corrente de amostra em formato de fita é carregada através da zona de visualização na frente da porta de visualização, gerando assim dados a partir das partículas/células contidas na amostra. O uso desse analisador permite a captura, processamento, categorização e subcategorização e contagem de células e/ou partículas contidas em amostras. O líquido PIOAL pode ser preparado mediante a adição de agente de modificação de viscosidade, agente de tampão, agente de ajuste de pH, agente antimicrobiano, modificador de força iônica, tensoativo e/ou um agente quelante. Os componentes funcionais exemplificadores e/ou recursos do analisador na presente revelação podem incluir, por exemplo, a capacidade de adquirir e/ou processar dados a partir da análise de imagem, processamento de coloração de amostra, processamento de imagem e/ou identificação de imagem de partícula, contagem e/ou categorização e subcategorização.

[000229] Em uma modalidade, esta revelação tem por base a descoberta surpreendente e inesperada que a adição de uma quantidade adequada de um agente de viscosidade no PIOAL aperfeiçoa significativamente o alinhamento de partícula/célula em uma célula de fluxo, levando a uma porcentagem mais alta de células em foco, ou componentes celulares, e imagens de qualidade maior de células e/ou partículas em fluxo. Um diferencial de viscosidade em combinação com um efeito de focalização geométrica de uma zona de transição de estreitamento pode alcançar resultados acentuados de alinhamento e foco. A adição do agente de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento sobre as células como RBCs, o qual aperfeiçoa o alinhamento das células em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, o qual resulta na otimização da imagem. Isso também resulta no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas intrapartícula, tais como estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos substancialmente paralelos à direção de fluxo, o que resulta na otimização da imagem. O agente de viscosidade também reduz o desalinhamento de células, em geral, mas não se limitando a células que são menores em diâmetro que a corrente de fluxo.

[000230] O alinhamento de células que são menores em diâmetro do que a corrente de fluxo, por exemplo, glóbulos vermelhos, pode ser obtido, por exemplo, aumentando-se a viscosidade do PIOAL, ou mediante o aumento da razão de velocidade de fluxo. Isso resulta no alinhamento dos RBCs paralelos à direção de fluxo. Em algumas modalidades, uma redução em desalinhamento de RBC e/ou aumento em alinhamento de RBC é alcançado mediante o aumento da viscosidade do PIOAL.

[000231] A seção transversal de fluxo do PIOAL, com a corrente de amostra em formato de fita arrastada, é constante através de uma zona de visualização em frente de uma porta de visualização através da qual o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é direcionado. A corrente de amostra em formato de fita segue uma trajetória através da zona de visualização em uma distância conhecida e repetível de cada uma dentre as paredes traseira e frontal da célula de fluxo sendo descarregada a jusante da mesma.

[000232] A presente revelação fornece uma técnica para alcançar automaticamente uma posição de trabalho correta do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para focalizar na corrente de amostra em formato de fita. A estrutura de célula de fluxo é configurada de tal modo que a corrente de amostra em formato de fita tenha um local fixo e repetível entre as paredes da célula de fluxo que definem a trajetória de fluxo do fluido de amostra, em uma fita delgada entre camadas de PIOAL, passando através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Nas modalidades de célula de fluxo reveladas, por exemplo, na Figura 1-4G, a seção transversal da trajetória de fluxo para o PIOAL pode se estreitar simetricamente em uma zona de transição, e uma amostra pode ser inserida através de um orifício aplanado, tal como um tubo com um lúmen retangular no orifício. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área de seção transversal por uma razão entre 20:1 e 40:1) e também devido a uma velocidade linear opcionalmente maior do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, coopera para aplanar a seção transversal da amostra por uma razão entre cerca de 20:1 a 70:1. De acordo com algumas modalidades, a razão pode se situar dentro de uma faixa a partir de 10:1 a 100:1, dentro de uma faixa a partir de 50:1 a 100:1, dentro de uma faixa a partir de 70:1 a 80:1. De acordo com algumas modalidades, a razão é de 75:1. Efetivamente, devido à combinação de taxa de fluxo, viscosidade e geometria, a amostra é formada em uma fita delgada. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área em seção transversal por uma razão de 40:1, ou por uma razão entre 20:1 a 70:1) e uma diferença em velocidade linear do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para comprimir a seção transversal da amostra por uma razão entre cerca de 20:1 a 70:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura em seção transversal pode ser de 40:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura em seção transversal pode ser de 30:1.

[000233] Como resultado, as variações do processo, tais como as velocidades lineares específicas da amostra e do PIOAL, não tendem a deslocar a corrente de amostra em formato de fita a partir de seu local no fluxo. Em relação à estrutura da célula de fluxo, o local da corrente de amostra em formato de fita é estável e repetível.

[000234] Em um outro aspecto, essa invenção se refere a um kit que compreende as composições de agente de contraste de partículas dessa invenção. O kit pode conter, também, instruções sobre o uso da composição de agente de contraste de partículas de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente documento. O kit pode também incluir um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL). O kit pode conter, também, um meio de armazenamento programável e software relacionado para identificação à base de imagem de partículas, tais como neutrófilo, linfócitos, monócito, eosinófilos, basófilos, plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleados, blastos, promielócitos, mielócitos, metamielócitos, bactérias, fungos, protistas, protozoários ou parasitas. O kit pode compreender também um ou mais tampões, os quais podem incluir diluentes e/ou tampões isotônicos. O kit e/ou tampão pode compreender adicionalmente um tensoativo, um agente de ajuste de pH e/ou um agente antimicrobiano. Em outras modalidades, o kit pode compreender também uma solução de limpeza ou enxágue. O kit pode compreender também padrões para controles positivo e negativo. Em algumas modalidades, o padrão pode compreender um reagente de célula corada padrão. O kit pode compreender também descartáveis, tais como micropipetas, pontas ou tubos descartáveis para transferir os componentes do kit. O kit pode conter qualquer um ou qualquer combinação de dois ou mais desses componentes do kit.

[000235] A discriminação de células sanguíneas ou outros partículas em uma amostra de urina é uma aplicação exemplificadora para qual as modalidades da presente invenção são particularmente bem adequadas. A amostra é preparada por técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica como uma corrente de amostra em formato de fita delgada a ser imageada periodicamente, enquanto que a corrente de amostra em formato de fita flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (tais como células sanguíneas) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas e contadas, com o uso de técnicas de processamento programado de dados de imagem de pixel, de maneira exclusivamente automática ou com assistência humana limitada, para identificar e contar células ou partículas. Adicionalmente às imagens de célula, as quais podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de traços críticos ou incomuns de partículas, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria particular de célula ou partícula distinguida nas imagens de amostra registradas.

[000236] As contagens das diferentes partículas encontradas em cada imagem podem ser processadas adicionalmente, por exemplo, usadas para acumular razões exatas e estatisticamente significativas de células de cada categoria e/ou subcategoria distinguida na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual pode ser diluída, mas as proporções de células em cada categoria e/ou subcategoria são representadas na amostra diluída, particularmente após uma série de imagens ter sido processada.

[000237] O aparelho, composições e métodos revelados no presente documento são úteis na discriminação e quantificação de células em amostras com base nas distinções visuais. A amostra pode ser uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de fluido corpóreo que compreende glóbulos brancos, incluindo sem limitação, sangue, soro, medula óssea, fluido de lavagem, efusões, exsudatos, líquido cefalorraquidiano, fluido pleural, fluido peritoneal e fluido amniótico. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de tecido sólido, por exemplo, uma amostra de biópsia que tem sido tratada para produzir uma suspensão de células. A amostra pode também ser uma suspensão obtida a partir do tratamento de uma amostra fecal. Uma amostra pode também ser uma amostra de linha de produção ou laboratório que compreende partículas, tais como uma amostra de cultura celular. O termo amostra pode ser usado para se referir a uma amostra obtida a partir de um paciente ou laboratório ou qualquer fração, porção ou alíquota da mesma. A amostra pode ser diluída, dividida em porções ou corada em alguns processos.

[000238] Em um aspecto, os sistemas, composições e métodos desta revelação fornecem surpreendentemente imagens de alta qualidade de células em um fluxo. Em um aspecto, o analisador visual pode ser usado em métodos desta revelação para fornecer contagem diferencial de WBC à base de imagem automatizada. Em certas modalidades, os métodos desta revelação se referem à identificação automatizada de distinções visuais, incluindo traços morfológicos e/ou anormalidades para determinar, diagnosticar, prognosticar, predizer e/ou suportar um diagnóstico de se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade e/ou infecção e/ou é responsivo ou não responsivo ao tratamento. O sistema pode compreender adicionalmente um contador de partícula em algumas modalidades. As aplicações incluem categorizar e/ou subcategorizar e contar células em uma amostra de fluido, tal como uma amostra de urina. Outros usos similares para a contagem de tipos adicionais de partículas e/ou partículas em outras amostras de fluido também são contemplados. O sistema, composições e métodos dessa invenção podem ser usados para a categorização e subcategorização e visualização em tempo real de imagens com o uso de qualquer algoritmo de reconhecimento de partícula automatizado adequado. As imagens capturadas para cada amostra podem ser armazenadas para serem visualizadas posteriormente.

[000239] Em um outro aspecto, o aparelho, composições e métodos dessa invenção fornecem sinalização, categorização e subcategorização de célula à base de imagem surpreendentemente mais precisa, o que reduz a taxa de análise manual em comparação com a taxa de análise manual quando se usa analisadores automatizados atuais. Os sistemas, composições e métodos reduzem a taxa de análise manual e permitem que a análise manual seja realizada sobre o instrumento. Além disso, os sistemas, composições e métodos desta revelação também reduzem a porcentagem de amostras sinalizadas durante a análise automatizada, conforme análise manual exigida.

[000240] Consequentemente, em algumas modalidades, a presente revelação apresenta um aparelho e um método para analisar uma amostra contendo partículas, por exemplo, células sanguíneas. De acordo com esta revelação, é fornecido um analisador visual para obtenção de imagens de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido. Em algumas modalidades, o analisador visual compreende uma célula de fluxo e um componente de foco automático, no qual uma amostra líquida contendo partículas de interesse é induzida a fluir através de uma célula de fluxo que tem a porta de visualização através da qual uma câmera acoplada a uma lente objetiva captura imagens digitais de partículas. As técnicas de foco automático exemplificadoras que podem ser implantadas com o uso de modalidades da presente invenção são reveladas no pedido de patente copendente US n° , cujo conteúdo é aqui incorporado, a título dereferência. A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido de amostra, tal como uma amostra de urina diluída e/ou tratado ou outra amostra de fluido corpóreo, conforme descrito no presente documento, e a uma fonte de um fluido envoltório límpido, ou líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL).

[000241] Em uma modalidade, o aparelho também compreende um contador de partícula que tem ao menos uma faixa de detecção, assim como um analisador, e um processador. O analisador e o processador são configurados para fornecer informações adicionais para corrigir erros de contagem, categorização e subcategorização associados ao contador de partículas, e adicionalmente determinar a concentração ou contagem de partículas precisa de diferentes categorias e/ou subcategorias de partículas na amostra.

[000242] Em outras modalidades, esta revelação se refere a um PIOAL que pode ser usado em uma análise à base de imagem de partículas, conforme descrito no presente documento. A contagem de categoria e/ou subcategoria de célula em amostras de urina é usada nesta revelação como exemplos não limitadores da classe de amostras que pode ser analisada. Em algumas modalidades, as células presentes em amostras podem também incluir células bacterianas ou fúngicas, assim como glóbulos brancos e/ou glóbulos vermelhos.

[000243] De acordo com algumas modalidades, as particularidades do aparelho de preparação de amostra e métodos para diluição de amostra, permeabilização e coloração histológica, geralmente são realizadas com o uso de válvulas e bombas de precisão operadas por um ou mais controles programáveis, e não são cruciais para esta revelação. Os exemplos podem ser encontrados em patentes atribuídas a International Remote Imaging Systems, Inc., tais como o documento US 7.319.907, relacionado a controles programáveis. De modo semelhante, as técnicas para distinguir entre determinadas categorias e/ou subcategorias de célula por seus atributos, tais como tamanho relativo e cor, podem ser encontradas no documento US 5.436.978 em conjunto com glóbulos brancos. As revelações dessas patentes estão aqui incorporadas, por referência. De acordo com algumas modalidades, as técnicas de preparação de amostra podem incluir coloração, lise, permeabilização e outras modalidades de processamento, tais como aquelas descritas no pedido de patente copendente US n°. , cujo conteúdo é aqui incorporado, por referência.

[000244] O termo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode incluir dispositivos que têm capacidade para obter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para diferenciar traços e/ou alterações morfológicas. Os dispositivos de imageamento de alta resolução óptica exemplificador podem incluir dispositivos com uma resolução óptica de 1 μm ou menor, incluindo, por exemplo, 0,4 a 0,5 μm, tal como, por exemplo, 0,46 μm.

[000245] Em algumas modalidades, as imagens obtidas em qualquer uma das composições e/ou métodos dessa invenção podem ser imagens digitalizadas. Em algumas modalidades, as imagens obtidas são imagens microscópicas. Em certas modalidades, as imagens podem ser obtidas manualmente. Em outras modalidades, ao menos parte do procedimento para obter as imagens é automatizada. Em algumas modalidades, as imagens podem ser obtidas com o uso de um analisador visual que compreende uma célula de fluxo, um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital, opcionalmente com um recurso de foco automático.

[000246] Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas aos componentes citosólicos, de núcleo celular e/ou nucleares da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas ao componente granulado e/ou outros traços morfológicos da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas aos componentes citosólicos, nucleares e/ou granulares da célula. As imagens e/ou traços granulares e/ou nucleares são determinantes para a categorização e subcategorização de célula tanto de maneira independente como em combinação uns com os outros.

Alvo de foco automático

[000247] Novamente com referência à Figura 1, os sistemas de imageamento de partículas podem incluir um alvo ou padrão de foco automático 44 que é fixo em relação à célula de fluxo 22. O alvo de foco automático 44 pode ser usado para alcançar imagens focalizadas de partículas de fluido de urina que fluem através da célula de fluxo.

[000248] A Figura 9A representa um alvo de foco automático exemplificador 900, de acordo com as modalidades da presente invenção. Conforme mostrado aqui, o alvo 900 inclui uma faixa anular opaca 910 e uma abertura ou centro transparente 920. Em operação, o dispositivo de imageamento focaliza na faixa 910 e captura a imagem através da abertura. Conforme discutido em outro lugar no presente documento, e no pedido de patente copendente US n° , um processo de captura de imagem pode envolver primeiramente focalizar (ou focalizar automaticamente) na faixa 910 e, então, ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a corrente de fluido de amostra antes de obter a imagem através da abertura 920. Consequentemente, a faixa 910 pode apresentar um alvo sob o qual um sistema de foco automático do dispositivo de captura de imagem pode detectar e focalizar, e determinadas porções do alvo (por exemplo, bordas ou segmentos) podem ser incluídas na imagem. Em alguns casos, o alvo pode ser fornecido como um disco de cromo que tem uma abertura central. Um alvo exemplificador pode ser dotado de um orifício central, que tem um diâmetro de cerca de 0,5 mm, que é colado ou fixado à célula de fluxo. O tamanho da abertura ou orifício central 920 pode ser selecionado de modo que somente quatro porções de borda 930 da faixa anular opaca 910 sejam visíveis na imagem capturada 940, conforme ilustrado na Figura 9B. Por conseguinte, a faixa anular 910 não interfere com a captura de imagens de célula (por exemplo, a luz pode passar através da abertura 920 a fim de iluminar as partículas da amostra, e o campo de visão é substancialmente livre da faixa anular). Dessa forma, a faixa 910 mostra-se somente nos cantos da imagem.

[000249] A Figura 10 representa um alvo de foco automatic exemplificador 1000, de acordo com as modalidades da presente invenção. O alvo 1000 inclui uma faixa ou margem 1010 e uma abertura central 1020. A Figura 11 mostra outro alvo de foco automático exemplificador 1100, de acordo com as modalidades da presente invenção. O alvo 1100 inclui uma faixa ou margem 1110 e uma abertura central 1120. De acordo com algumas modalidades, o alvo de foco automático 1100 fornece uma imagem com 50 pixels de preto no topo e no fundo. Em alguns casos, o alvo de foco automático 1100 fornece uma compensação de foco de célula de fluxo (FCFO) de cerca de 65,3 μm.

[000250] A Figura 12A representa um alvo de foco automático exemplificador 1200, de acordo com as modalidades da presente invenção. O alvo 1200 é apresentado como um projeto de caixa de correio e inclui uma primeira margem ou margem superior 1210 e uma segunda margem ou margem inferior 1220. O alvo 1200 inclui também uma abertura ou passagem transparente 1230 entre a primeira e a segunda margens. De acordo com algumas modalidades, o alvo tem um diâmetro de cerca de 4 mm, e a altura da caixa de correio é de 265 μm. Em alguns casos, as margens superior e inferior podem estar presentes como meio-círculos e podem ser produzidas com um metal depositado, tal como óxido de cromo ou algum outro material opaco.

[000251] Em um outro aspecto dos métodos dessa invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou imageadas são células anormais, tais como células infectadas com malária, linfócitos atípicos. Em alguns aspectos dessa invenção, as células são células anormais que podem ser usadas para identificar, prever, diagnosticar, prognosticar ou suportar um diagnóstico de uma condição, doença, infecção e/ou síndrome.

[000252] A Figura 12B mostra uma vista aproximada da porção central do alvo de foco automático 1200. Conforme mostrado aqui, a primeira margem 1210 inclui uma escala numérica negativa/positiva, com um valor zero centralizado. A segunda margem 1220 inclui uma escala similar. Em alguns casos, os incrementos de escala são de 100 μm. De acordo com algumas modalidades, as escalas podem ser usadas para facilitar o posicionamento da célula de fluxo de modo que o campo de visão do dispositivo de imageamento ou câmera possa ser centralizado sobre a corrente de amostra. Conforme mostrado aqui, a corrente de amostra 1240 flui em uma direção perpendicular às escalas da primeira e segunda margens. Como parte de um protocolo de focalização, o dispositivo de captura de imagem pode operar para focalizar os números ou outros caracteres ou objetos que podem ser vistos presentes nas margens 1210, 1220.

[000253] As modalidades da presente invenção abrangem técnicas para tratar do desvio térmico associado ao uso do sistema de análise de partículas, através do qual tais efeitos térmicos podem de outro modo comprometer a qualidade de imagens obtidas com o dispositivo de imageamento. A Figura 13A representa uma vista lateral parcial de uma célula de fluxo 1320 que tem um sensor térmico 1370, um refletor 1380, e um alvo de foco automático 1344. Durante a operação de um sistema de análise de partículas, os efeitos térmicos podem fazer com que a corrente de amostra se desvie lentamente do foco do dispositivo de imageamento. Por exemplo, os efeitos térmicos podem ser causados pela expansão térmica da célula de fluxo através do calor irradiado que procede da lâmpada. Adicionalmente, os efeitos térmicos podem ser causados pela expansão térmica da montagem de célula de fluxo e montagem de bancada óptica (OBA) através do aquecimento condutivo e radiativo. Em algumas modalidades, determinados componentes da OBA podem expandir, o qual pode contribuir para erros de focalização. Por exemplo, tais componentes podem incluir placas de metal que retêm a câmera 24 em conjunto, uma placa de metal que retém ou está conectada à célula de fluxo, ou uma placa de metal que retém tanto a célula de fluxo como a câmera 24 em conjunto. A Figura 13B representa uma vista em perspectiva parcial da célula de fluxo 1320 que tem um sensor térmico 1370 e alvo de foco automático 1344. Adicionalmente, a Figura 13C representa outra vista em perspectiva de célula de fluxo 1320 que tem um sensor térmico 1370, refletor 1380 e alvo de foco automático 1344.

[000254] A Figura 13C representa outra vista em perspectiva de célula de fluxo 1320 que tem um sensor térmico 1370, refletor 1380 e alvo de imageamento ou foco automático 1344. O refletor 1380 pode operar para reduzir ou limitar a quantidade de calor absorvido pela célula de fluxo 1320. Por exemplo, o refletor 1380 pode bloquear o calor irradiado por uma lâmpada de flash 1342, conforme indicado na Figura 13A. Por conseguinte, o refletor 1380 pode minimizar o impacto térmico da lâmpada. O refletor 1342 pode também reduzir o ofuscamento e dispersão de luz gerados pela lâmpada, resultando, assim, em qualidade de imagem aprimorada. O sensor térmico 1370 é posicionado próximo ao canal de fluxo de fluido e adjacente ao sítio de captura de imagem, de modo que leituras de temperatura precisas possam ser obtidas. As informações a partir do sensor de temperatura podem ser usadas para focalizar o dispositivo de captura de imagem sobre a corrente de fita de fluido de amostra. As técnicas de focalização automática exemplificadoras reveladas no presente documento podem ter por base as flutuações de temperatura que ocorrem dentro de determinados elementos do analisador.

[000255] Conforme representado na Figura 13D, uma célula de fluxo 1300d pode incluir uma trajetória de fluxo 1322d que tem uma porta ou respiro 1301d através do qual bolhas 1302d podem ser liberadas ou removidas. Conforme descrito aqui, um tubo 1303d, através do qual o vácuo pode ser aplicado, pode ser colocado em contato com a porta 1301d a fim de retirar bolhas 1302d da corrente. Tal mecanismo de remoção de bolha é adequado para remover bolhas do fluido circulante dentro da célula de fluxo, e pode operar para evitar que bolhas ou microbolhas fiquem alojadas ou presas dentro da célula de fluxo. A corrente de fluxo é representada em uma direção para cima na Figura 13D. Deve-se compreender que, em algumas modalidades, a corrente pode se mover através da célula de fluxo em uma direção para baixo. As bolhas mostradas aqui flutuam em direção ao topo do fluido dentro da célula de fluxo.

[000256] De acordo com algumas modalidades, um método para imageamento de partículas em uma amostra de urina pode incluir fazer fluir um fluido envoltório ao longo de uma trajetória de fluxo de uma célula de fluxo, e injetar a amostra de urina no fluido envoltório circulante dentro da célula de fluxo, de modo que a amostra de urina flua em uma corrente de amostra com uma largura de corrente maior que uma espessura de corrente, de tal modo que a célula de fluxo tenha uma temperatura associada. Adicionalmente, o método pode incluir focalizar um dispositivo de captura de imagem, ao longo de um eixo geométrico de imageamento, sobre a corrente para um primeiro estado focal, enquanto que a temperatura associada à célula de fluxo está em uma primeira temperatura, e adquirir uma primeira imagem focalizada de um primeiro subconjunto das partículas dentro da corrente com o dispositivo de captura de imagem no primeiro estado focal. Além disso, o método pode incluir determinar que a temperatura associada à célula de fluxo tem se submetido a uma mudança a partir da primeira temperatura a uma segunda temperatura, e ajustar automaticamente o foco do dispositivo de captura de imagem a partir do primeiro estado focal a um segundo estado focal em resposta à mudança em temperatura e uma relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado. Ainda adicionalmente, o método pode incluir adquirir uma segunda imagem focalizada de um segundo subconjunto das partículas dentro da corrente com o dispositivo de captura de imagem no segundo estado focal.

[000257] Em alguns casos, o processo de ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem inclui ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem e a célula de fluxo com o uso da mudança em temperatura e da relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado. Em alguns casos, o processo de ajustar o foco do dispositivo de captura de imagem inclui ajustar uma distância focal do dispositivo de captura de imagem com o uso da mudança em temperatura e da relação conhecida entre a temperatura de célula de fluxo e o foco desejado.

Imagens focalizadas

[000258] A Figura 14A e 14Bfornecem vistas laterais em seção transversal que ilustram sistemas e métodos de imageamento, de acordo com as modalidades da presente invenção. Com referência à Figura 14A, um sistema de análise de partículas 1400a, tal como um analisador de amostra de urina, pode ser configurado para a hidro-focalização geométrica e/ou de viscosidade, por exemplo, com o uso de técnicas de célula de fluxo e fluido envoltório viscoso, tais como aquelas descritas no presente documento. Um método exemplificador para o imageamento de partículas em uma amostra de urina com o uso do sistema de análise de partículas pode incluir fazer fluir um fluido envoltório 1410a ao longo de uma trajetória de fluxo 1420a de uma célula de fluxo 1430a do sistema de análise de partículas. A trajetória de fluxo 1420a pode ser definida ao menos em parte por paredes de célula de fluxo opostas 1422a, 1424a da célula de fluxo. O fluido envoltório 1410a pode ter uma viscosidade que é diferente de uma viscosidade da amostra de urina. O método de imageamento pode incluir adicionalmente injetar a amostra de urina no fluido envoltório circulante 1410a dentro da célula de fluxo 1430a de modo que o fluido de amostra de urina flua em uma corrente de amostra 1440a. A corrente de amostra 1440a pode ter uma largura de corrente maior que uma espessura de corrente. A corrente de amostra 1440a pode também fluir através de uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo e atravessar um eixo geométrico de imageamento 1450a. Na ilustração da Figura 14A, a direção de fluxo é a partir da esquerda para a direita.

[000259] Adicionalmente, o método de imageamento pode incluir focalizar um dispositivo de captura de imagem 1460a mediante o imageamento de um alvo de imageamento 1470a que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo 1430a. Por exemplo, conforme representado aqui, o alvo de imageamento 1470a pode ter uma posição fixa em relação a uma janela de iluminação 1480a da célula de fluxo. Em alguns casos, o alvo de imageamento 1470a pode ser embutido dentro de ou fixado sob a janela 1480a. Os métodos podem também incluir adquirir uma imagem focalizada das partículas do fluido de amostra (por exemplo, partícula 1490a, disposta ao menos parcialmente dentro da corrente 1440a) com o dispositivo de captura de imagem 1460a. A imagem focalizada é adequada para a caracterização e contagem de partículas.

[000260] O dispositivo de captura de imagem 1460a pode ser focalizado na corrente de amostra 1440a com o uso de uma distância de deslocamento. Por exemplo, a distância de deslocamento pode corresponder a uma distância D entre a corrente de amostra 1440a e o alvo de imageamento 1470a. A diferença de viscosidade entre o fluido envoltório 1410a e a amostra de urina, em combinação com a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo, é eficaz para a hidro- focalização do fluido de amostra na corrente de amostra 1440a no eixo geométrico de imageamento 1450a, enquanto que retém a viabilidade de células na amostra de urina. Por exemplo, um efeito de hidro- focalização de viscosidade induzido por uma interação entre o fluido envoltório 1410a e a corrente de fluido de amostra 1440a associado à diferença de viscosidade, em combinação com um efeito de hidro- focalização geométrica induzido por uma interação entre o fluido envoltório 1410a e a corrente de fluido de amostra 1440a associada à redução em tamanho da trajetória de fluxo, é eficaz para fornecer um estado de imageamento alvo em pelo menos parte da pluralidade de partículas de amostra de fluido no eixo geométrico de imageamento 1450a, enquanto que um agente de viscosidade no fluido envoltório 1410a retém a viabilidade de células na estrutura de saída de corrente de fluido de amostra 1440a e o teor das células intactas quando as células se estendem a partir da corrente de fluido de amostra 1440a no fluido envoltório circulante 1410a.

[000261] À medida que o dispositivo de captura de imagem 1460a é focalizado na corrente de amostra 1440a com o uso da distância de deslocamento, o dispositivo de captura de imagem 1460a pode obter imagens de partículas ou células dentro da corrente de amostra 1440a no eixo geométrico de imageamento 1450a, ou em um sítio de captura de imagem associado ao eixo geométrico de imageamento 1450a. Em alguns casos, as partículas podem ser iluminadas com uma lâmpada ou fonte de iluminação 1426a. As imagens da corrente de amostra 1440a podem ser obtidas à medida que as partículas se aproximam do eixo geométrico de imageamento 1450a, à medida que as partículas atravessam o eixo geométrico de imageamento 1450a e/ou à medida que as partículas fluem para longe do eixo geométrico de imageamento 1450a.

[000262] A Figura 14B representa aspectos de uma configuração de célula de fluxo alternativa, em que o alvo de imageamento 1470b tem uma posição fixa em relação a uma janela de visualização 1482b da célula de fluxo 1430b. Por exemplo, o alvo de imageamento 1470b pode ser embutido dentro de ou fixado sob a janela 1482b. Conforme mostrado aqui, o método de imageamento pode incluir focalizar um dispositivo de captura de imagem 1460b mediante o imageamento de um alvo de imageamento 1470b que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo 1430b. Adicionalmente, o dispositivo de captura de imagem 1460b pode ser focalizado na corrente de amostra 1440b com o uso de uma distância de deslocamento. Por exemplo, a distância de deslocamento pode corresponder a uma distância D entre a corrente de amostra 1440b e o alvo de imageamento 1470b.

[000263] A Figura 14C representa uma vista de extremidade em seção transversal de uma célula de fluxo 1430c, que ilustra diversos locais de colocação alternativos para um alvo de imageamento ou foco automático. Por exemplo, um alvo de imageamento 1472c pode estar localizado em uma janela de visualização 1482c da célula de fluxo 1430c. Opcionalmente, um alvo de imageamento 1474c pode estar localizado em uma janela de iluminação 1480c da célula de fluxo 1430c. Ainda opcionalmente, um alvo de imageamento 1476c pode estar localizado em uma parede de célula de fluxo lateral (por exemplo, 1432c e/ou 1434c). O dispositivo de captura de imagem 1460c pode ser focalizado em uma corrente de amostra 1440c, a qual é envelopada dentro de um fluido envoltório 1410c, com o uso da distância de deslocamento. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D1 ao longo do eixo geométrico de imageamento 1450c entre a corrente de amostra 1440c (ou um plano central 1441c definido pela corrente 1440c) e o alvo de imageamento da janela de visualização 1472c. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D2 ao longo do eixo geométrico de imageamento entre a corrente de amostra 1440a (ou um plano central 1441c) e o alvo de imageamento da janela de iluminação 1476c. Em algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a ou ser definida por uma distância D3 ao longo do eixo geométrico de imageamento entre a corrente de amostra 1440a (ou o plano central 1441c) e o alvo de imageamento da parede lateral da célula de fluxo 1474c. Em alguns casos, a distância D3 tem um valor maior que zero. Em alguns casos, a distância D3 tem um valor de zero; ou seja, em que a corrente de amostra 1440a (ou o plano central 1441c) é coplanar com o alvo de imageamento 1474c. Em alguns casos, é possível definir uma distância de deslocamento que não é calculada com base na distância D1, distância D2 ou distância D3. Por exemplo, uma distância de deslocamento pode ser um valor ou número predeterminado que é fornecido por um fabricante de analisador de hematologia ou célula de fluxo.

[000264] De acordo com algumas modalidades, a corrente de amostra 1440c pode ter uma espessura T1 no eixo geométrico de imageamento dentro de uma faixa a partir de cerca de 2 μm a cerca de 10 μm. Em alguns casos, a trajetória de fluxo ou o fluido envoltório 1410c pode ter uma espessura T2 de cerca de 150 μm no eixo geométrico de imageamento. Conforme mostrado aqui, um alvo de imageamento 1472c pode estar localizado em uma janela de visualização 1482c disposta entre a corrente de amostra 1440c e o dispositivo de captura de imagem 1460c. Em alguns casos, um alvo de imageamento (por exemplo, 1474c) pode estar localizado entre uma janela de iluminação 1480c e uma janela de visualização 1482c. Conforme discutido em outro lugar no presente documento, o processo de adquirir uma imagem focalizada pode incluir ajustar uma distância entre o dispositivo de captura de imagem 1460c e a célula de fluxo 1430c com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, conforme discutido em outro lugar no presente documento, o processo de adquirir uma imagem focalizada pode incluir ajustar uma distância focal entre o dispositivo de captura de imagem 1460c com o uso da distância de deslocamento. Em alguns casos, o processo de adquirir uma imagem focalizada pode incluir ajustar a distância entre o dispositivo de captura de imagem 1460c e a célula de fluxo 1430c, e o processo de ajustar a distância inclui mover a célula de fluxo 1430c, por exemplo, para uma posição mais próxima ao dispositivo de captura de imagem 1460c, ou para uma posição mais distante do dispositivo de captura de imagem 1460c.

[000265] Conforme representado na Figura 14D, uma primeira distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460d pode corresponder a uma distância D1 (por exemplo, ao longo do eixo geométrico de imageamento 1450d) entre o dispositivo de captura de imagem 1460d e o alvo de imageamento 1470d, e uma segunda distância focal do dispositivo de captura de imagem 1460d pode corresponder a uma distância D2 (por exemplo, ao longo do eixo geométrico de imageamento 1450d) entre o dispositivo de captura de imagem 1460d e a corrente de amostra 1440d (ou um plano central definido pela corrente de amostra). Em alguns casos, o alvo de imageamento pode estar localizado em outro local na célula de fluxo, por exemplo, conforme representado na Figura 14C. De acordo com algumas modalidades, a distância de deslocamento pode corresponder a uma diferença de distância entre a primeira distância focal (ou distância D1) e a segunda distância focal (ou distância D2). O dispositivo de captura de imagem 1460d pode ser focalizado sobre a corrente de amostra 1440d com o uso dessa distância de deslocamento (por exemplo, diferença entre D1 e D2).

[000266] A Figura 15 representa uma vista em elevação que mostra modalidades de um padrão de foco automático (ou alvo de imageamento), o qual, por exemplo, pode estar localizado na janela ou orifícios de iluminação, em uma janela ou entrada de visualização ou em outro local de célula de fluxo. O alvo pode enfraquecer à medida que na distância ou posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é movida em relação à corrente de amostra em formato de fita. Conforme representado nas Figuras 9 a 12B, um alvo de foco ou imageamento (padrão de foco automático) pode se encontrar na periferia da área de visão na qual a amostra deve aparecer. Com referência novamente à Figura 15, pode ser visto que também é possível que o alvo de foco possa ser definido por formatos opostos que se encontram no campo de visão.

[000267] Quando o dispositivo de imageamento está em foco no padrão de foco automático (alvo) (painel B na Figura 15), os formatos conforme imageado pelo dispositivo são bem definidos e podem ser usados para a focalização automática, conforme descrito no presente documento, ou seja, para buscar a distância entre o alvo e o dispositivo de imageamento na qual os formatos produzem o contraste maior em amplitude entre pixels adjacentes localizados ao longo de linhas que cruzam os formatos, tais como as linhas mostradas como pontas de flecha. A configuração de foco representada no painel B corresponde a uma configuração de foco análoga representada na Figura 16A. Conforme ilustrado na Figura 16A, o plano focal do dispositivo de captura de imagem é alinhado com o alvo de foco automático, e, por conseguinte, o dispositivo de captura de imagem está em uma posição para obter imagens nítidas do alvo de foco automático.

[000268] Com referência novamente à Figura 15, quando o local de trabalho (por exemplo, plano focal do dispositivo de imageamento) é movido para longe do padrão de foco automático (mostrado nos painéis A e C, mostrados à esquerda e à direita do padrão de foco automático na Figura 15), por exemplo, ajustando-se a distância de trabalho da objetiva ou a distância entre a objetiva e seu plano focal, os formatos do alvo de foco agora saem de foco e na posição em que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é focalizado na corrente de amostra em formato de fita, os formatos de alvo de foco não são mais de maneira alguma discerníveis (consulte painel D na Figura 15). A configuração de foco representada no painel D pode corresponder a uma configuração de foco análoga representada na Figura 16B. Conforme ilustrado na Figura 16B, o plano focal do dispositivo de captura de imagem é alinhado com a corrente de fluido de amostra e, por conseguinte, o dispositivo de captura de imagem está em uma posição para obter imagens nítidas de partículas na corrente de amostra. O plano focal da Figura 16A é separado do plano focal da Figura 16B por uma distância D. Conforme mostrado na Figura 16B, mediante o movimento do dispositivo de captura de imagem a uma distância D, é possível mover também o plano focal a uma distância D e, por conseguinte, mover o plano focal a partir do alvo de foco automático para a corrente de amostra. Em alguns casos, o plano focal pode ser movido a partir do alvo de foco automático para a corrente de amostra ajustando-se internamente a distância focal do dispositivo de captura de imagem, enquanto que se mantém o dispositivo de captura de imagem em uma posição fixa em relação à célula de fluxo. Em alguns casos, o plano focal pode ser movido partir do alvo de foco automático para a corrente de amostra ajustando-se internamente a distância focal do dispositivo de captura de imagem, em combinação com o ajuste da posição do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo. Os formatos de foco automático podem ser fornecidos em qualquer local que está dentro da visão e é fixado em relação à célula de fluxo, tal como na janela ou abertura de iluminação, ou na frente ou atrás da janela ou porta de visualização, através da qual o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é direcionado, o em um acessório fixado à fotocélula para reter um alvo na posição a ser imageada.

[000269] De acordo com algumas modalidades, quando o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é movido sobre a distância de deslocamento e o padrão de foco automático sai do foco, os traços que aparecem em foco são as células sanguíneas em oposição ao padrão de foco automático. Na modalidade da Figura 15, o padrão de foco automático é definido por formatos no campo de visão. Os formatos são formas discretas relativamente finas de um tamanho limitado e, portanto, após o movimento pela distância de deslocamento, as formas se tornam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizada sobre a corrente de amostra em formato de fita. Uma distância de deslocamento típica pode ser, por exemplo, de 50 a 100 μm em uma célula de fluxo dimensionada para aplicações de imageamento de urinálise Em algumas modalidades, o recurso de foco automático mantém o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica dentro de 1 μm da distância de foco ideal.

[000270] Consequentemente, os recursos descritos na Figura 15 fornecem uma técnica exemplificadora para determinar uma distância de deslocamento. Por exemplo, um método para determinar uma distância de deslocamento pode incluir um processo de focalização automática que envolve injetar uma amostra de fluido de teste em um fluido envoltório para formar uma corrente de amostra de teste dentro de uma célula de fluxo, e obter uma primeira imagem focalizada do alvo de imageamento com o uso de um dispositivo de captura de imagem. A primeira imagem focalizada pode corresponder ao painel B na Figura 15, em que o alvo de imageamento focalizado e o dispositivo de captura de imagem definem uma primeira distância focal. Conforme representado aqui, o plano focal ou distância/local de trabalho do dispositivo de captura de imagem é posicionado no alvo de imageamento. O processo de focalização automática pode também incluir obter uma segunda imagem focalizada da corrente de amostra de teste com o uso do dispositivo de captura de imagem. A segunda imagem focalizada pode corresponder ao painel D na Figura 15, em que a corrente de amostra de teste focalizada e o dispositivo de captura de imagem definem uma segunda distância focal. Conforme representado aqui, o plano focal ou distância/local de trabalho do dispositivo de captura de imagem é posicionado no alvo de imageamento. O processo de focalização automática pode incluir, também, obter a distância de deslocamento calculando-se uma diferença entre a primeira distância focal e a segunda distância focal. Em alguns casos, a amostra de fluido de teste é igual à amostra de urina e a corrente de amostra de teste é igual à corrente de amostra. Em alguns casos, o processo de focalização automática estabelece um plano focal associado ao dispositivo de captura de imagem, e o plano focal permanece estacionário em relação ao dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, o processo de focalização automática do dispositivo de captura de imagem inclui determinar uma posição de foco ideal dentre uma pluralidade de posições de foco.

[000271] De acordo com algumas modalidades, o dispositivo de captura de imagem pode ser focalizado na corrente de amostra sem o uso de dados de temperatura. Por exemplo, um processo de focalizar o dispositivo de captura de imagem na corrente de amostra pode ser realizado independentemente de uma temperatura do dispositivo de captura de imagem. Em alguns casos, um alvo de imageamento pode incluir uma escala (por exemplo, conforme representado na Figura 12B) para o uso no posicionamento do eixo geométrico de imageamento do dispositivo de captura de imagem em relação à corrente de amostra. Em alguns casos, o alvo de imageamento pode incluir uma íris alinhada em relação ao eixo geométrico de imageamento, de tal modo que as partículas imageadas sejam dispostas dentro de uma abertura definida pela íris, e uma ou mais porções de borda da íris são imageadas durante a focalização automática.

[000272] Em modalidades exemplificadoras, as técnicas de focalização automática podem posicionar a célula de fluxo para dentro de ±1 μm a partir de uma posição focal ideal da corrente de amostra. Em alguns casos, as modalidades abrangem técnicas de foco automático que podem focalizar automaticamente o sistema de imageamento sem a necessidade de uma solução ou líquido de focalização separado ou qualquer intervenção do usuário. As técnicas de focalização automática exemplificadoras podem também ser responsáveis pelas causas mecânicas do desempenho de focalização subótimo, tal como desvio ou expansão térmica que pode causar flutuações na distância entre a objetiva do dispositivo de imageamento e a célula de fluxo. Em alguns casos, foi observado que o local do fluxo de amostra dentro da célula de fluxo pode ser muito estável e independente de temperatura. Por conseguinte, as técnicas de imageamento exemplificadoras podem envolver focalizar em um alvo de imageamento na célula de fluxo, e usar um deslocamento fixo para alcançar o foco ideal na corrente de amostra.

[000273] De acordo com algumas modalidades, a objetiva do microscópio que é usada em um sistema de imageamento tem uma abertura numérica de 0,75, resultando em uma profundidade de campo teórica (DOF) de ±0,5 μm. Em determinados testes experimentais, foi observado que a boa qualidade de imagem poderia ser obtida em ±1,25 μm a partir de um ponto focal ideal. Também foi observado que uma profundidade de campo prática ou experimental poderia ser diferente da profundidade de campo teórica. Por exemplo, em determinados testes experimentais, foi observado que uma profundidade de campo foi em torno de 2,5 a 3 μm. Com base em determinados estudos experimentais, foi constatado que o desempenho de foco automático para o posicionamento da célula de fluxo dentro de ±1,25 μm poderia assegurar a boa qualidade de imagem. Em algumas modalidades, um sistema de foco automático pode operar para posicionar a célula de fluxo dentro de ±1 μm a partir de uma posição de foco ideal da corrente de amostra. Em determinados testes experimentais, foi observado que as técnicas de foco automático, conforme revelado no presente documento, podem localizar repetidamente um alvo em uma célula de fluxo com um desvio padrão menor que 0,3 μm. Em alguns casos, os procedimentos do sistema de foco automático de teste demonstraram excelente repetitividade (desvio padrão < 0,23 μm) e tiveram capacidade para determinar a posição de foco da corrente de amostra para dentro de <0,6 μm a partir de uma posição métrica otimizada que está dentro de uma tolerância posicional de ±1 μm. Os procedimentos de teste de foco automático adicionais em uma variedade de condições de temperatura também exibiram excelente desempenho de posicionamento (por exemplo, posicionamento de célula de fluxo dentro de uma tolerância de ±1 μm exigida de uma posição de foco ideal). Esse grau de exatidão e um sistema analisador automatizado é bem adequado para se obter de maneira consistente e confiável imagens de alta qualidade de partículas a partir de uma amostra de urina que flui em uma corrente de fita delgada, conforme revelado em outro lugar no presente documento, em relação a uma faixa de temperatura operacional que corresponde às condições normais de laboratório.

[000274] Exceto onde expressamente indicado em contrário, as referências a "partícula" ou "partículas" feitas nesta revelação serão entendidas como abrangendo qualquer objeto formado ou discreto disperso em um fluido. Para uso na presente invenção, "partícula" pode incluir todos os componentes mensuráveis e detectáveis (por exemplo, por imagem e/ou outros parâmetros mensuráveis) em fluidos biológicos. As partículas são de qualquer material, qualquer formato e qualquer tamanho. Em certas modalidades, as partículas podem compreender células. Os exemplos de partículas incluem, mas não se limitam a, células, incluindo células sanguíneas, células fetais, epiteliais, células-tronco, células de tumor, ou bactérias, parasitas, ou fragmentos de qualquer um dos mencionados anteriormente ou outros fragmentos em um fluido biológico. As células sanguíneas podem ser qualquer célula sanguínea, incluindo quaisquer células normais ou anormais, maduras ou imaturas que existem potencialmente em um fluido biológico, por exemplo, glóbulos vermelhos (RBCs), glóbulos brancos (WBCs), plaquetas (PLTs) e outras células. Os membros também incluem células imaturas ou anormais. Os WBCs imaturos podem incluir metamielócitos, mielócitos, promielócitos e blastos. Adicionalmente ao RBCs maduros, os membros de RBCs podem incluir RBCs nucleados (NRBCs), RBCs normais ou anormais, e reticulócitos. PLTs podem incluir PLTs "gigantes" e nódulos de PLT. As células sanguíneas e elementos formados são adicionalmente descritos em outro lugar nesta revelação.

[000275] As partículas exemplificadoras podem incluir elementos formados em amostras de fluido biológico, incluindo, por exemplo, partículas esféricas e não esféricas. Em certas modalidades, as partículas podem compreender componentes não esféricos. A projeção de imagem de componentes não esféricos pode ser maximizada no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em certas modalidades, as partículas não esféricas são alinhadas no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica (alinhado em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo). Em algumas modalidades, plaquetas, reticulócitos, RBCs nucleados e WBCs são contados e analisados como partículas. Para uso na presente invenção, os glóbulos brancos (WBC) exemplificadores podem incluir, por exemplo, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, granulócitos imaturos incluindo meta-mielócitos, mielócitos, promielócitos e blastos, e glóbulos brancos anormais.

[000276] Para uso na presente invenção, os parâmetros de partículas mensuráveis e detectáveis podem incluir, por exemplo, índices visuais e/ou à base de não imagem de tamanho, formato, simetria, contorno e/ou outras características.

[000277] Em uma outra modalidade, esta revelação se refere a um método para imageamento de partículas com o uso, por exemplo, dos kits dessa invenção, em métodos que compreendem, por exemplo: 1) iluminar as partículas com luz em um analisador visual; 2) obter uma imagem digitalizada de partículas da amostra envelopadas em um PIOAL; e 3) analisar as amostras contendo partícula com base nas informações de imagem. Em outras modalidades, o método pode compreender, adicionalmente, colocar a amostra contendo partículas em contato com uma composição de agente de contraste de partículas antes de iluminar a amostra tratada.

[000278] Em uma modalidade, as partículas analisadas compreendem ao menos um dentre uma partícula esférica, uma partícula não esférica, ou ambas. Em uma outra modalidade, as partículas compreendem ao menos uma partícula esférica. Em mais uma outra modalidade, as partículas compreendem ao menos uma partícula não esférica. Em outra modalidade, uma projeção de imagem de partículas não esféricas ou partículas que têm componentes não esféricos é maximizada em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. As partículas podem ser, por exemplo, WBCs, RBCs e/ou plaquetas. Em uma modalidade, ao menos 50% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em um outro aspecto, o uso dos PIOALs dessa invenção em uma célula de fluxo permite que ao menos 90% das partículas não esféricas sejam alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo.

[000279] Em uma modalidade, as partículas não esféricas compreendem glóbulos vermelhos. Em um outro aspecto dessa invenção, as partículas esféricas compreendem glóbulos brancos ou glóbulos vermelhos nucleados.

[000280] O fluxo das células menores que a espessura da corrente de amostra em formato de fita envelopada em PIOAL, resulta no alinhamento daquelas células paralelas à direção de fluxo. Em uma modalidade desta revelação, ao menos 92% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em ainda outra modalidade, ao menos 90% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em uma outra modalidade, ao menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou ao menos 95% das partículas são substancialmente alinhadas, ou seja, dentro de 20 graus a partir de um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em uma outra modalidade, a porcentagem de partículas não esféricas e/ou esféricas que são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo pode se situar em qualquer faixa entre quaisquer duas das porcentagens referidas, por exemplo, ao menos 75 a 85%, 75 a 80%, e outras faixas, tais como 75 a 92%.

[000281] As forças de cisalhamento na direção paralela à direção de fluxo como resultado do fluxo de células maiores na amostra envelopada no PIOAL, tais como WBCs, resulta no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos ou outros componentes ou estruturas intracelulares mais próximos a um plano paralelo à direção de fluxo.

[000282] Em uma modalidade desta revelação, a seção transversal da imagem compreende ao menos um dentre estrutura nuclear diferencialmente corada, estrutura citosólica diferencialmente corada ou grânulos diferencialmente corados em um WBC, incluindo um neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo, ou WBC imaturo incluindo um blasto, promielócito, mielócito ou metamielócito. Em uma outra modalidade, ao menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou ao menos 95% das partículas esféricas e/ou não esféricas têm estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos no plano focal ou profundidade de campo do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica.

[000283] Em algumas modalidades dos métodos dessa invenção, as informações de imagem são a seção transversal de imagem de uma partícula. Em alguns aspectos, a seção transversal da imagem compreende ao menos um dentre uma estrutura nuclear diferencialmente corada, uma estrutura citosólica diferencialmente corada ou grânulos diferencialmente corados em um WBC, incluindo um neutrófilo, linfócito, monócito, eosinófilo, basófilo, ou WBC imaturo incluindo um blasto, promielócito, mielócito ou metamielócito.

[000284] Em uma modalidade, os métodos dessa invenção fornecem imagens de qualidade surpreendentemente alta de células com uma alta porcentagem de partículas e conteúdo de partícula em foco no fluxo, os quais são úteis na obtenção automatizada de diferenciais de WBC à base de imagem, assim como identificação automatizada de anormalidades morfológicas úteis na determinação, diagnóstico, prognóstico, predição ou suporte de um diagnóstico de se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade ou infecção e/ou é responsivo ou não responsivo ao tratamento.

[000285] Em um outro aspecto, as composições e métodos dessa invenção fornecem sinalização, categorização e subcategorização de célula à base de imagem mais precisa, o qual reduz muito a taxa de análise manual em comparação com os analisadores atuais.

[000286] Para uso na presente invenção, o agente de viscosidade pode incluir agentes de viscosidade ou modificadores de viscosidade. Um agente/modificador de viscosidade exemplificador tem uma viscosidade característica que é diferente da viscosidade da amostra, de tal modo que, quando o PIOAL e o agente de viscosidade são misturados, a viscosidade do PIOAL é alterada e/ou aumentada a fim de maximizar o alinhamento de partículas. Em certas modalidades, a diferença de viscosidade e/ou uma diferença de velocidade entre a corrente de amostra em formato de fita e o PIOAL pode introduzir forças de cisalhamento para agir sobre as partículas, enquanto que em fluxo, reduzindo, assim, o desalinhamento e/ou fazendo com que as partículas se alinhem.

[000287] Para uso na presente invenção, as composições de agente de contraste de partículas podem ser adaptadas para o uso em combinação com um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) em um analisador visual para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo. O PIOAL exemplificador é útil, por exemplo, nos métodos para o reconhecimento automatizado de diferentes tipos de partículas em uma amostra de um indivíduo.

[000288] Em um outro aspecto, as células podem ser envelopadas em PIOAL quando as imagens são obtidas. Os líquidos de alinhamento de organela intracelular exemplificadores e adequados são descritos no presente documento.

[000289] Em uma modalidade, esta revelação se refere a um PIOAL para o uso em um analisador visual. Em certas modalidades, o PIOAL pode compreender ao menos em dentre um tampão; um agente de ajuste de pH; um tampão; um agente/modificador de viscosidade; modificador de força iônica, um tensoativo, um agente quelante e/ou um agente antimicrobiano.

[000290] Em um aspecto, o PIOAL pode compreender dois ou mais agentes/modificadores de viscosidades.Em um aspecto, o PIOAL dessa invenção pode ter uma viscosidade entre cerca de 1 a cerca de 10 centipoise. Em uma modalidade, o PIOAL dessa invenção pode compreender um agente/modificador de viscosidade. Em uma modalidade, o PIOAL compreende até 100% de um agente de viscosidade.

[000291] Para uso na presente invenção, o agente de viscosidade e/ou modificador de viscosidade pode incluir qualquer substância adequada para alcançar uma viscosidade de cerca de 1 a cerca de 10 centipoise, com características ópticas, incluindo claridade óptica, adequadas para o uso em um sistema de imageamento. Em geral, o agente ou modificador de viscosidade é não tóxico, biocompatível e deixa a estrutura e conteúdos celulares substancialmente intactos. O agente de viscosidade e/ou modificador de viscosidade pode compreender ao menos um dentre glicerol; derivado de glicerol; etileno glicol; propileno glicol (diidroxipropano); polietileno glicol; polímero e/ou dextrano solúvel em água. Em um aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser glicerol. Como um exemplo, em um aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser um derivado de glicerol. Como um exemplo, em um aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser um polivinil pirrolidona (PVP). Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser etileno glicol. Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser propileno glicol (diidroxipropano). Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser polietileno glicol. Como outro exemplo, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser polímero ou dextrano solúvel em água. Em outros aspectos, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode compreender dois ou mais dentre glicerol, derivado de glicerol; etileno glicol; propileno glicol (diidroxipropano); polivinil pirrolidona (PVP); polietileno glicol; polímero ou dextrano solúvel em água. O agente/agentes de modificação de viscosidade pode incluir qualquer agente adequado para fornecer uma viscosidade de cerca de 1 a cerca de 10 centipoise, com características ópticas, incluindo claridade óptica, adequadas para o uso em um sistema de imageamento.

[000292] Para uso na presente invenção, outros agentes/modificadores de viscosidade podem incluir, por exemplo, hidrocoloides naturais (e derivados), tais como acácia, tragacanto, ácido algínico, carragenina, goma de alfarrobeira, goma guar, goma de xantana, goma arábica, goma guar, gelatina, celulose, alginatos, amidos, açúcares, dextranos; gelatina; açúcares (e derivados), tais como dextrose, frutose; polidextrose; dextranos; polidextranos; sacarídeos; e polissacarídeos; hidrocoloides semissintéticos (e derivados), tais como glicerol, metilcelulose, hidróxi etil amido (hetastarch), carbóxi metil celulose de sódio, hidróxi etil celulose, hidróxi-propil-metil celulose, polivinil pirrolidona (PVP); hidrocoloides sintéticos (e derivados), tais como álcool polivinílico (PVA) e/ou Carbopol®. Outros agentes/modificadores de viscosidade compatíveis à célula também são considerados úteis para esse propósito.

[000293] Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser glicerol presente a uma concentração de cerca de 1 a cerca de 50 % (em volume) do PIOAL. Como um exemplo, Em uma modalidade, o agente/modificador de viscosidade pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 5,0% a cerca de 8,0 % (em volume). Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade pode estar presente a uma concentração de cerca de 6,5 % (em volume). Em uma modalidade, o agente/modificador de viscosidade é glicerol presente a uma concentração de cerca de 6,5 % (em volume).

[000294] Em ainda outra modalidade, o PIOAL pode compreender um agente/modificador de viscosidade de glicerol presente a uma concentração de cerca de 30% (em volume).

[000295] Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser PVP presente a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 2,5% (em peso por volume). Como um exemplo, em uma modalidade, o agente/modificador de viscosidade de PVP pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 1,0 a cerca de 1,6% (em peso por volume). Em uma modalidade, o PVP está presente a uma concentração de cerca de 1,0 % (peso por volume).Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser PVP e glicerol. Como um exemplo, em uma modalidade, o glicerol pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 5% (em volume) em combinação com cerca de 1% (peso por volume) de PVP.

[000296] Em uma modalidade, o PIOAL dessa invenção pode ser usado em um analisador visual para imagear partículas. Em um aspecto, o analisador visual compreende uma célula de fluxo com uma trajetória de fluxo simétrica e um componente de foco automático.

[000297] Um agente de viscosidade e/ou agentes de ajuste/modificação de viscosidade, tais como glicerol, pode ser incluído no PIOAL. O agente de viscosidade, ou agente de modificação de viscosidade, quando introduzido, pode ajustar adequadamente a viscosidade do PIOAL para a faixa desejada. Qualquer agente de viscosidade adequado pode ser usado, o qual aumenta de maneira suficiente a viscosidade do PIOAL, que tem características ópticas adequadas para permitir o imageamento de alta qualidade de células em fluxo. O PIOAL terá uma viscosidade adequada para alinhar células e/ou estruturas celulares em um único plano que é substancialmente paralelo à direção de fluxo, aumentando, assim, em parte, os conteúdos em foco das partículas.

[000298] O PIOAL pode ser usado com qualquer analisador desta revelação.

[000299] Para uso na presente invenção, o termo "gliceróis" abrange glicerol e um derivado de glicerol (deste ponto em diante no presente documento referido como derivado de glicerol). Os exemplos de um derivado de glicerol incluem tioglicerol, poliglicerol e similares. Os exemplos usáveis de poliglicerol podem incluir diglicerol, POLIGLICERINA n°. 310 (Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), POLIGLICERINA n°. 750 (Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), POLIGLICERINA n°. 500 (Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) e similares.

[000300] Em uma outra modalidade, o PIOAL desta revelação compreende, adicionalmente, um agente de ajuste de pH. Em um aspecto, o pH final do PIOAL e/ou da amostra é entre cerca de 6,0 a cerca de 8,0. Em outro aspecto, o pH final do PIOAL e/ou da amostra é entre cerca de 6,6 a cerca de 7,4. Em um aspecto, o pH final do PIOAL pode ser igual ao pH da amostra preparada 12A (com referência à Figura 1C).

[000301] Os agentes de ajuste de pH exemplificadores podem incluir, por exemplo, ácidos (exemplos incluem ácidos orgânicos e ácidos minerais), bases (exemplos incluem bases orgânicas e hidróxidos de metais alcalinos e metais alcalinoterrosos). Os ácidos orgânicos exemplificadores podem incluir ácido acético, lático, fórmico, cítrico, oxálico e úrico. Os ácidos minerais exemplificadores podem incluir, por exemplo, ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bórico, fluorídrico, bromídrico e perclórico. As bases orgânicas exemplificadoras podem incluir, por exemplo, piridina, metilamina, imidazol, benzimidazol, histidina, fosfazeno e hidróxidos de cátions. Os hidróxidos exemplificadores de metal alcalino e metais alcalinoterrosos podem incluir, por exemplo, hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de bário (Ba(OH)2), hidróxido de césio (CsOH), hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de estrôncio (Sr(OH)2), hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), hidróxido de lítio (LiOH) e hidróxido de rubídio (RbOH).Em algumas modalidades, com o uso de um tampão, o pH de PIOAL é, de preferência, mantido a partir de cerca de 6,0 a cerca de 8,5, com mais preferência a partir de cerca de 7,0 a cerca de 8,0. Em algumas modalidades, é preferencial adicionar um agente de tampão ao PIOAL a fim de ajustar o pH do PIOAL. Qualquer agente ou agente de tampão adequado pode ser usado, contanto que o agente ou agentes ajustem o pH do PIOAL para a faixa adequada. Os exemplos de tal agente de tampão incluem STF, tampões de Good (especificamente, tampão tris, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, tricina, bicina, TAPS e similares), hidrogenofosfato dissódico, diidrogênio fosfato de sódio, fosfato de potássio monobásico, HCl de sódio veronal, HCl de colidina, ácido tris(hidróxi metil)aminometano-maleico, tris(hidróxi metil)aminometano-HCl, os quais podem ser usados por si sós ou em combinações;.

[000302] Em outra modalidade, o PIOAL dessa invenção compreende um modificador de força iônica para ajustar a força iônica da formulação resultante. Os modificadores de força iônica exemplificadores podem incluir Li+, Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, Br-, HCO-3, sulfatos, pirossulfatos,fosfatos, pirofosfatos (por exemplo, pirofosfato de potássio), citratos, cacodilatos, ou outros sais adequados. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser isotônico.

[000303] Tensoativos podem ser adicionados ao PIOAL. Os tipos de tensoativos não são particularmente limitados, contanto que sejam compatíveis com outros componentes do PIOAL, e compatíveis com a corrente de amostra em formato de fita e as partículas na amostra. Os tensoativos podem incluir, por exemplo, tensoativos catiônicos, aniônicos, não iônicos e anfolíticos. Os tensoativos exemplificadores podem incluir tensoativos do tipo éster alquílico de polioxietileno, tensoativos do tipo polioxietileno alquil fenil éter, (por exemplo, NISSAN NONION NS-240 (NOF CORPORATION, marca registrada)), tensoativos do tipo éster alquílico de polioxietileno sorbitano (por exemplo, RHEODOL TW-0120 (Kao Corporation, marca registrada)), copolímeros de poliol (por exemplo, PLURONIC F-127, F-123, F-109, F-87, F-86, F- 68, T-1107, T-1102 (BASF Corporation, marca registrada)), MEGA-8, monocaprato de sacarose, desoxi-BIGCHAP, n-octil-β-D-tioglicosideo, n- nonil-β-D-tiomaltosideo, n-heptil-β-D-tioglicosideo, n-octil-β-D-tioglicosídeo, CHAPS, CHAPSO e similares, podem ser usados. Outros tensoativos podem incluir Triton-X-100 e Tween 20 em concentrações compatíveis com a amostra e corrente de amostra em formato de fita.

[000304] A concentração do tensoativo no PIOAL é, de preferência, o nível de concentração no qual as partículas, tais como células, na amostra não são afetadas e/ou permanecem substancialmente intactas. Especificamente, a concentração é, de preferência, a partir de 5 a 5.000 mg/l, com mais preferência a partir de 100 a 3.000 mg/l.

[000305] Quando as partículas contidas na amostra são analisadas com o analisador, sais amorfos, tais como fosfato de amônio, fosfato de magnésio, carbonato de cálcio, podem precipitar na amostra. Agentes quelantes podem ser adicionados ao PIOAL a fim de dissolver esses sais amorfos. A adição de agentes quelantes possibilita não somente a dissolução de sais amorfos, mas também a inibição da oxidação de PIOAL. Os exemplos usáveis de um agente quelante incluem sais de EDTA, CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, metil-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EDDPO e similares. A concentração do agente quelante no PIOAL se situa, de preferência, na faixa de 0,05 a 5 g/l.

[000306] Em outra modalidade, o PIOAL pode compreender, adicionalmente, um ou mais agentes antimicrobianos. Em alguns aspectos, o agente antimicrobiano pode ser, por exemplo, substâncias que têm atividade fungicida (agentes fungicidas) e/ou substâncias que têm atividade bactericida (agentes bactericidas). Em certas modalidades, os agentes antimicrobianos adequados podem incluir, por exemplo, parabenos, isotiazolinona, fenólicos, conservantes ácidos, compostos halogenados, quatérnio e álcool. Os parabenos exemplificadores podem incluir parabenos e sais de parabeno. As isotiazolinonas exemplificadoras podem incluir metil cloro isotiazolinona, metil isotiazolinona, benzisotiazolinona ProClin 150, ProClin 200, ProClin 300 e ProClin 950. Os tipos fenólicos exemplificadores podem incluir fenóxi etanol, álcool benzílico e álcool fenetílico. Os conservantes ácidos exemplificadores podem incluir ácido deidro acético, ácido benzoico, ácido ascórbico, ácido salicílico, ácido fórmico, ácido propiônico. Os compostos halogenados exemplificadores podem incluir 2-bromo-2-nitropropano-1, 3-diol, cloroacetamida, clorobutanol, cloroxilenol, clorfenesina, álcool diclorobenzílico, butilcarbamato de iodopropinila, metildibromo glutaronitrila. Os quatérnios exemplificadores podem incluir cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, clorexidina, diisetionato de hexamidina e poliaminopropil biguanido. Os álcoois exemplificadores podem incluir álcool etílico e álcool isopropílico. Os exemplos dos mesmos incluem agentes antimicrobianos de triazina, agentes bactericidas de tiazol (por exemplo, benzisotiazolona, etc.), piritiona, agentes bactericidas de piridina (por exemplo, 1-hidróxi piridina-2- tiossódio etc.), 2-fenóxi etanol e similares. Especificamente, Proxel GXL (Avecia), TOMICIDE S (API Corporation) e similares, podem ser usados. Os agentes bactericidas e/ou fungicidas ajudam a aperfeiçoar a estabilidade do PIOAL.

[000307] Em uma modalidade, a concentração do agente antimicrobiano pode ser de 0,01% a 0,5% (peso por volume). A concentração pode ser de 0,03 a 0,05% (peso por volume).

[000308] A amostra que é submetida à análise com o uso do analisador com o PIOAL na modalidade não é particularmente limitada. As amostras obtidas a partir do organismo vivo (amostras biológicas) são normalmente usadas. Alternativamente, aquelas amostras podem ser diluídas, purificadas, colocadas em contato com um agente de contraste, ou similares, para o uso. Especificamente, os exemplos de tal amostra podem incluir sangue, sêmen, líquido cefalorraquidiano e similares. As amostras podem também incluir suspensões de partícula derivadas de amostras de tecido. O PIOAL na modalidade é adequadamente usado quando as partículas (glóbulo vermelho, glóbulo branco, bactérias, etc.) são analisadas.

[000309] O PIOAL dessa invenção pode ser usado em um analisador visual que submete ao imageamento as partículas. Em um aspecto, o analisador visual compreende uma célula de fluxo capaz de manter o fluxo de uma corrente de amostra em formato de fita com características dimensionais predeterminadas, tais como uma espessura vantajosa de corrente de amostra em formato de fita. Em algumas modalidades, a célula de fluxo pode ter uma trajetória de fluxo simétrica e pode ser usada em combinação com um componente de foco automático.

[000310] Esta revelação se refere a um método para o imageamento de uma partícula que compreende: 1) colocar a amostra em contato com uma composição de agente de contraste de partículas; 2) iluminar a partícula preparada; 3) obter uma imagem digitalizada da partícula em uma corrente de amostra em formato de fita envelopada em um PIOAL; e; 4) analisar as informações de imagem para categorizar ou subcategorizar as partículas. Em algumas modalidades, a partícula pode ser ao menos uma dentre qualquer partícula revelada no presente documento e pode ser contada e analisada com base nas informações de imagem de partícula.

[000311] Em algumas modalidades o analisador visual compreende uma célula de fluxo com uma trajetória de fluxo simétrica ou assimétrica, e um componente de foco automático.

[000312] Em um aspecto geral, o PIOAL exemplificador e métodos de uso do mesmo são úteis quando empregados em combinação com um analisador automatizado encontrado em laboratórios de pesquisa e/ou médicos. Os analisadores automatizados exemplificadores são instrumentos projetados para medir diferentes elementos formados e/ou outras características em uma série de amostras biológicas, rapidamente, incluindo, por exemplo, amostras de fluido corpóreo humano, com assistência humana mínima. Os analisadores automatizados exemplificadores podem incluir, por exemplo, analisadores de urinálise. Os analisadores exemplificadores podem processar amostras individualmente, em lotes ou continuamente.

[000313] Em um aspecto, o analisador/sistema exemplificador compreende um contador de partícula automatizado configurado para detectar uma pluralidade de partículas que atendem um ou mais critérios de seleção, e para fornecer uma contagem de partículas das mesmas, em que os critérios de seleção abrangem membros de ao menos duas categorias dentro das ditas partículas. Um analisador, o qual pode compreender um processador, que pode incluir componentes do contador, é programado para distinguir as partículas das ao menos duas categorias. Uma distribuição de cada uma das partículas é determinada com o uso do analisador. O processador usa a distribuição para corrigir a contagem de partículas para os membros de ao menos uma dentre as ao menos duas categorias e/ou subcategorias. Em algumas modalidades, o contador de partícula compreende ao menos um canal configurado para fornecer a contagem de partículas da ao menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas com base em uma faixa predeterminada à base de volume, tamanho, formato e/ou outro critério. Por exemplo, os membros da ao menos uma categoria e/ou subcategoria compreendem ao menos um tipo de partícula selecionado a partir de um grupo que consiste em subcategorias de glóbulos brancos (WBCs), glóbulos vermelhos (RBCs), plaquetas gigantes (PLTs) e glóbulos vermelhos nucleados (NRBCs). Em um contador de partícula, devido ao tamanho similar ou outra característica medida, as células, tais como PLTs gigantes e NRBCs, podem ser contadas como WBCs. Mediante a operação do aparelho, conforme descrito no presente documento, a concentração ou contagem de partículas de PLTs gigantes e NRBCs podem ser medidas com exatidão.

[000314] Em um aspecto, os sistemas, composições e métodos desta revelação fornecem surpreendentemente imagens de alta qualidade de células em um fluxo. Em um aspecto, o analisador visual pode ser usado em métodos desta revelação para fornecer contagem de partículas de sedimento urinário à base de imagem automatizada. Em certas modalidades, os métodos desta revelação se referem à identificação automatizada de distinções visuais, incluindo anormalidades morfológicas para determinar, diagnosticar, prognosticar, predizer e/ou suportar um diagnóstico de se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade ou infecção e/ou para monitorar se um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento. As aplicações incluem categorizar, subcategorizar e contar células em uma amostra de fluido, tal como uma amostra de urina, especificamente de acordo com a categoria ou subcategoria. Outros usos similares para a contagem de tipos adicionais de partículas e/ou partículas em outras amostras de fluido também são contemplados. O sistema, composições e métodos dessa invenção podem ser usados para a categorização e subcategorização e visualização em tempo real de imagens com o uso de qualquer algoritmo de reconhecimento de partícula automatizado adequado. As imagens capturadas para cada amostra podem ser armazenadas para serem visualizadas posteriormente.

[000315] Em um outro aspecto, o analisador, composições e métodos dessa invenção fornecem sinalização, categorização e subcategorização de célula à base de imagem surpreendentemente mais precisa, o qual reduz a taxa de análise manual em comparação com a taxa de análise manual quando se usa analisadores à base de imagem automatizados. Os sistemas, composições e métodos reduzem a taxa de análise manual inicial e permitem que a análise manual inicial seja realizada sobre o instrumento. Além disso, os sistemas, composições e métodos desta revelação também reduzem a porcentagem de amostras sinalizadas durante a análise automatizada, conforme análise manual exigida.

[000316] Consequentemente, em algumas modalidades, a presente revelação apresenta um analisador e um método para analisar uma amostra contendo partículas, por exemplo, partículas em urina. De acordo com esta revelação, é fornecido um analisador visual para obtenção de imagens de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido. Em algumas modalidades, o analisador visual compreende uma célula de fluxo e um componente de foco automático, no qual uma amostra líquida contendo partículas de interesse é induzida a fluir através de uma célula de fluxo que tem a porta de visualização através da qual uma câmera acoplada a uma lente objetiva captura imagens digitais de partículas. A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido de amostra, tal como uma amostra de urina diluída e/ou não diluída, ou similares, e a uma fonte de um fluido envoltório límpido, ou líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL).

[000317] Em uma modalidade, o analisador também compreende um contador de partículas que tem ao menos uma faixa de detecção, assim como um analisador, e um processador. O analisador e o processador são configurados para fornecer informações para categorizar, subcategorizar e determinar a concentração e/ou contagem de partículas precisa na amostra.

[000318] Em outras modalidades, esta revelação se refere a um PIOAL que pode ser usado em uma análise à base de imagem de partículas, conforme descrito no presente documento. A contagem de categoria e/ou subcategoria de partículas em amostras de urina é usada nesta revelação como exemplos não limitadores da classe de amostras que pode ser analisada. Em algumas modalidades, as células presentes em amostras podem também incluir células bacterianas ou fúngicas, assim como glóbulos brancos ou glóbulos vermelhos. Em algumas modalidades, as suspensões de partículas obtidas a partir de tecidos ou aspirados podem ser analisadas.

[000319] A discriminação de partículas de sedimento urinário em uma amostra de urina é uma aplicação exemplificadora para qual o assunto é particularmente bem adequado. A amostra é preparada por técnicas automatizadas e apresentada a um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica como uma corrente de amostra em formato de fita a ser imageada periodicamente, enquanto que a amostra flui através de um campo de visão. As imagens das partículas (tais como em partículas de sedimento urinário) podem ser distinguidas umas das outras, categorizadas, subcategorizadas e contadas, com o uso de técnicas de processamento programado de dados de imagens de pixel, de maneira exclusivamente automática ou com assistência humana limitada, para identificar e contar células ou partículas. Adicionalmente às imagens de partículas, as quais podem ser armazenadas e disponibilizadas no caso de traços críticos ou incomuns, os dados de saída incluem uma contagem das ocorrências de cada categoria e/ou subcategoria particular de célula ou partícula distinguida nas imagens de amostra registradas. As contagens das diferentes partículas encontradas em cada imagem podem ser processadas adicionalmente, por exemplo, usadas para acumular razões proporcionadas exatas e estatisticamente significativas, ou funções das mesmas de partículas de cada categoria e/ou subcategoria distinguida na amostra como um todo. A amostra usada para a discriminação visual pode também ser altamente diluída, mas as proporções de células em cada categoria e/ou subcategoria são representadas na distribuição para a amostra diluída, particularmente após uma série de imagens ter sido processada. Para uso na presente invenção, o uso de informações à base de imagem (por exemplo, visuais) para a identificação de partículas/células abrange a faixa espectral para luz ultravioleta, visível ou infravermelha a partir de 200 nm a 10 mm.

[000320] Em alguns aspectos, as amostras são apresentadas, imageadas e analisadas de uma maneira automatizada. No caso de amostras de urina, a amostra pode ser substancialmente diluída em água ou solução salina, o qual reduz a extensão a qual a visão de algumas células e/ou partículas poderia ser encoberta por outras células e/ou partículas em uma amostra não diluída ou menos diluída. As células podem ser tratadas com agentes que acentuam o contraste de alguns aspectos de célula, por exemplo, com o uso de agentes permeabilizantes para tornar as membranas celulares permeáveis, e colorações histológicas para aderir e revelar traços, tais como citoplasma na célula. Em algumas modalidades, pode ser desejável corar uma alíquota da amostra para contagem e caracterização de partículas e contagem de subpopulação, caracterização e análise de partículas que incluem glóbulos brancos, células epiteliais e/ou bactérias.

[000321] As particularidades do analisador de preparação de amostra e métodos para diluição de amostra, coloração histológica, geralmente são realizadas com o uso de válvulas e bombas de precisão operadas por um ou mais controles programáveis, e não são cruciais para esta revelação. Os exemplos podem ser encontrados em patentes atribuídas a International Remote Imaging Systems, Inc., tais como o documento US 7.319.907, relacionado a controles programáveis. De modo semelhante, as técnicas para distinguir entre determinadas células por seus atributos, tais como cor quando coloridas com B021, podem ser encontradas no documento US 5.436.978. As revelações dessas patentes estão aqui incorporadas, por referência.

[000322] Para facilitar a capacidade, velocidade e eficácia por meio das quais as partículas, tais como células, são categorizadas e subcategorizadas, é vantajoso fornecer imagens de alta qualidade límpidas das partículas de urina para a análise automatizada pelo sistema de processamento de dados. De acordo com a presente revelação, uma corrente de amostra preparada é disposta em uma fita delgada que tem uma posição estável entre as paredes opostas de uma célula de fluxo. O posicionamento da corrente de amostra e seu aplanamento em uma corrente de amostra em formato de fita podem ser alcançados pelo fluxo entre camadas de um PIOAL introduzido na célula de fluxo que se difere em viscosidade do fluido de amostra e flui através de um canal de fluxo simétrico.

[000323] O PIOAL e a amostra têm taxas de fluxo e viscosidades coordenadas no ponto de introdução à célula de fluxo da amostra de tal modo que o fluido de amostra aplane em um formato de fita delgada. A corrente de amostra em formato de fita é carregada junto com o PIOAL, para passar em frente de uma porta de visualização em que uma lente objetiva e uma fonte de luz são dispostas para permitir a visualização da corrente de amostra em formato de fita. O fluido de amostra é introduzido, por exemplo, injetado em ponto em que a trajetória de fluxo do PIOAL se estreita simetricamente. Como resultado, a corrente de fluido de amostra é aplanada e estendida em uma fita delgada. Um PIOAL desta revelação pode ser usado como o fluido envoltório com qualquer analisador visual desta revelação. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser introduzido em uma extremidade da célula de fluxo para arrastar o fluido de amostra em direção à descarga.

[000324] A dimensão da corrente de amostra em formato de fita na zona de visualização é afetada pelo adelgaçamento geométrico da trajetória de fluxo de PIOAL e velocidade linear diferencial do fluido de amostra e PIOAL resultando em adelgaçamento e estiramento da corrente de amostra em formato de fita. As razões de velocidade linear inicial entre a amostra e o PIOAL podem variar de 0,5 a 5,0. A seção transversal da trajetória de fluxo de PIOAL pode ser adelgaçada mediante a redução da profundidade para alcançar uma redução da área de seção transversal da trajetória de fluxo por um fator de cerca de 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 ou 200:1. Em uma modalidade, esse adelgaçamento geométrico é de 40:1. Os fatores levados em conta são tempo de trânsito através da célula de fluxo, taxa desejada de rendimento de amostra, obtenção de uma espessura de corrente de amostra em formato de fita comparável com o tamanho de partícula, obtenção de alinhamento de partículas e organelas, obtenção de foco em conteúdo de partículas, equilíbrio de pressão, fluxo e viscosidade dentro de limites operacionais, otimização de espessura de corrente de amostra em formato de fita, obtenção de uma velocidade linear desejada, considerações de facilidade de fabricação e volumes de amostra e PIOAL exigidos.

[000325] O comprimento e volume da cânula e o aplanamento da seção transversal podem ser selecionados para reduzir o período de instabilidade de fluxo de amostra, aumentando assim a taxa de rendimento. Em algumas modalidades, o período de instabilidade de fluxo pode ser menor que cerca de 3, 2,75, 2,5, 2,25, 2, 1,75, 1,5, 1,25, ou menor que cerca de 1 segundo. Um volume de cânula menor podem também reduzir o tempo e volume de diluente necessário para limpar a cânula entre procedimentos de amostra. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito através da célula de fluxo é de 1, 2, 3 ou 4 segundos, ou qualquer faixa entre quaisquer dois desses tempos. Em algumas modalidades, o tempo de trânsito pode ser menor que 4, 3 ou 2 segundos.

[000326] As viscosidades e as taxas de fluxo do fluido de amostra e do PIOAL e o contorno da célula de fluxo são dispostos de tal modo que o fluxo de PIOAL aplane e estenda o fluxo de amostra em uma fita plana de maneira consistente através da zona de visualização em um local confiável. A corrente de fluido de amostra pode ser comprimida a aproximadamente 2 a 3 μm em espessura de fluxo de fluido. Diversos tipos de célula na urina têm diâmetros maiores que a espessura de corrente. As forças de cisalhamento na direção paralela à direção de fluxo causam um aumento de uma projeção de imagem das partículas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e/ou fazem com que as estruturas intracelulares, por exemplo, organelas ou lóbulos, sejam posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para ficarem substancialmente paralelas à direção de fluxo. A profundidade de campo do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é de até 7 μm, por exemplo, 1 a 4 μm.

[000327] A espessura de fluxo do PIOAL, com a corrente de amostra em formato de fita arrastada, é constante através de uma zona de visualização em frente de uma porta de visualização através da qual a lente objetiva é direcionada. A lente objetiva pode ser o componente objetivo de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital. A corrente de amostra em formato de fita segue uma trajetória através da zona de visualização em uma posição conhecida e repetível dentro da célula de fluxo, por exemplo, a uma distância conhecida e repetível de duas paredes da célula de fluxo, sendo descarregada a jusante.

[000328] As informações ópticas a partir das partículas na amostra são detectadas por uma seção de detecção no analisador, quando a corrente de amostra em formato de fita é carregada através da zona de visualização na frente da porta de visualização, gerando assim dados a partir das partículas/células contidas na amostra. O uso desse analisador permite a captura, processamento, categorização e subcategorização e contagem de células e/ou partículas contidas em amostras. O líquido PIOAL pode ser preparado mediante a adição de agente de modificação de viscosidade, agente de tampão, agente de ajuste de pH, agente antimicrobiano, modificador de força iônica, tensoativo e/ou um agente quelante. Os componentes funcionais e/ou recursos exemplificadores do analisador na presente revelação podem incluir, por exemplo, a capacidade de adquirir e/ou processar dados a partir da análise de imagem, processamento de coloração de amostra, processamento de imagem e/ou identificação, contagem e/ou categorização e subcategorização de imagem de partícula.

[000329] Em uma modalidade, esta revelação teve por base a descoberta surpreendente e inesperada que a adição de uma quantidade adequada de um agente de viscosidade no PIOAL aperfeiçoa significativamente o alinhamento de partícula/célula em uma célula de fluxo, levando a uma porcentagem mais alta de células em foco, ou componentes celulares, e imagens de qualidade maior de células e/ou partículas em fluxo. A adição do agente de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento sobre as células como RBCs, o qual aperfeiçoa o alinhamento das células em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, o qual resulta na otimização da imagem. Isso também resulta no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas intrapartícula, tais como estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos substancialmente paralelas à direção de fluxo, o qual resulta na otimização da imagem. O agente de viscosidade também reduz o desalinhamento de células, em geral, mas não se limitando a células que são menores em diâmetro que a corrente de fluxo.

[000330] O alinhamento de células que são menores em diâmetro que a corrente de fluxo, por exemplo, glóbulos vermelhos e/ou hastes de bactérias, pode ser obtido, por exemplo, aumentando-se a viscosidade do PIOAL e/ou aumentando-se a razão de velocidade linear de fluxo. Isso resulta no alinhamento dos RBCs ou hastes de bactérias paralelo à direção de fluxo. Em algumas modalidades, uma redução em desalinhamento de RBC ou hastes de bactérias e/ou um aumento em alinhamento de RBC ou hastes de bactérias é alcançado aumentando- se a viscosidade do PIOAL.

[000331] Em um aspecto, esta revelação se refere a um método para diferencialmente classificar partículas e/ou contar partículas com o uso de categorização, subcategorização e contagem de partículas à base de imagem. Os métodos exemplificadores podem incluir colocar uma amostra contendo as partículas ou células em contato com uma composição de agente de contraste de partículas em uma quantidade eficaz para gerar distinções visuais para categorizar e/ou subcategorizar as partículas, aplicar a amostra a ao menos uma célula de fluxo, introduzir com a primeira porção colocada em contato da amostra, na ao menos uma célula de fluxo, uma partícula e líquido de alinhamento de organela intracelular (PIOAL) que tem uma viscosidade diferente da viscosidade da amostra tratada, e eficaz para sustentar o fluxo da amostra, alinhar partículas e aumentar o conteúdo em foco de partículas e organelas de células que fluem na trajetória de fluxo, analisar as células com o uso de um aparelho que compreende um analisador visual, e um processador, realizar a categorização e subcategorização de partícula mediante a determinação de uma ou mais distinções visuais, e contagem das partículas nas categorias e subcategorias com base nas distinções visuais.

[000332] Nesse e em qualquer um dentre os outros métodos desta revelação, as partículas podem ser qualquer categoria e/ou subcategoria de células presentes na amostra, e podem incluir partículas selecionadas a partir de eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e fragmentos de célula.

[000333] A presente revelação fornece uma técnica para alcançar automaticamente uma posição de trabalho correta do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para focalizar na corrente de amostra em formato de fita. A estrutura de célula de fluxo é configurada de tal modo que a corrente de amostra em formato de fita tenha um local fixo e repetível entre as paredes da célula de fluxo que definem a trajetória de fluxo do fluido de amostra, em uma fita delgada entre camadas de PIOAL, passando através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Nas modalidades de célula de fluxo reveladas, esquematicamente na Figura 1 e na modalidade prática nas Figuras 6 e 7, a seção transversal da trajetória de fluxo para o PIOAL se estreita simetricamente no ponto em que a amostra é inserida através de um orifício aplanado, tal como um tubo com um lúmen retangular no orifício. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área de seção transversal por uma razão de 20: 1 a 40:1) e também devido a uma velocidade linear maior do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para aplanar e espalhar a seção transversal da amostra por uma razão de cerca de 20:1 a 70:1. Efetivamente, devido à combinação de taxa de fluxo, viscosidade e espessura de corrente, a amostra é formada em uma fita delgada. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área em seção transversal por uma razão de 40:1, ou por uma razão entre 20:1 a 70:1) e uma diferença em velocidade linear do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para adelgaçar a seção transversal da amostra por uma razão entre cerca de 20:1 a 70:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura em seção transversal pode ser de 40:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura em seção transversal pode ser de 30:1.

[000334] Como resultado, as variações do processo, tais como as velocidades lineares específicas da amostra e do PIOAL, não tendem a deslocar a corrente de amostra em formato de fita a partir de seu local central no fluxo. Em relação à estrutura da célula de fluxo, o local da corrente de amostra em formato de fita é estável e repetível.

[000335] A alta resolução óptica e a óptica do dispositivo de imageamento têm uma determinada distância focal, e a óptica é primeiramente posicionada com exatidão em relação à célula de fluxo, ou seja, mediante a focalização do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica em um padrão de foco automático. A distância de deslocamento entre o padrão de foco automático e o corrente de amostra é conhecida precisamente, de preferência, como resultado de etapas de calibração iniciais. Após a focalização automática no padrão de foco automático, a célula de fluxo e o dispositivo de captura de imagem de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital são deslocados relativamente um para o outro em relação à distância de deslocamento. Como resultado, o dispositivo de captura de imagem de alta resolução óptica é focalizado precisamente na corrente de amostra.

[000336] Dessa forma, pode não ser necessário focalizar automaticamente ou depender de um aspecto de conteúdo de imagem que é variável entre diferentes imagens, ou é menos altamente definido como contraste, ou poderia estar localizado em algum lugar em uma faixa de posições, como a base para determinar um local de distância para referência. Tendo encontrado o local de foco ideal para o padrão de foco automático, as posições relativas do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e da célula de fluxo são deslocadas para mover a posição do foco ideal a partir do local do padrão de foco automático para o local da corrente de amostra em formato de fita.

[000337] Em uma modalidade, esta revelação se refere a uma composição de agente de contraste de partículas que pode ser usada para corar células. As composições de agente de contraste de partículas e métodos dessa invenção podem ser usados em uma modalidade, por exemplo, para categorizar, contar e caracterizar qualquer uma das partículas reveladas no presente documento, assim como subcategorizar, contar, caracterizar e analisar. Em uma modalidade, as composições de agente de contraste de partículas são adequadas ao uso com analisadores parcialmente automatizados ou automatizados à base de imagem.

[000338] Em algumas modalidades, a composição de agente de contraste de partículas é usada para acentuar os traços celulares e/ou subcelulares sob condições em que um ou mais tipos de célula permanecem vitais ou viáveis e/ou células e/ou traços celulares e/ou subcelulares permanecem substancialmente intactos. As composições de agente de contraste de partículas podem ser usadas para gerar distinções visuais para a categorização e subcategorização de partícula. Em algumas modalidades, as composições de agente de contraste de partículas podem ser usadas para corar glóbulos brancos. Em algumas modalidades, a composição de agente de contraste de partículas podem também otimizar traços visualizáveis de, por exemplo, células epiteliais, bactérias e/ou inclusões em cálculos patológicos adicionalmente aos glóbulos brancos. Em outras modalidades, as composições de agente de contraste de partículas podem corar glóbulos brancos, assim como células epiteliais, bactérias e/ou inclusões em cálculos patológicos.

[000339] Os aspectos e modalidades da presente revelação se originam da descoberta que determinadas formulações de corante que compreendem esses componentes têm eficácia e propriedades surpreendentes e inesperadas quando usadas como agentes de contraste para a intensificação da análise à base de imagem, tal como categorização, subcategorização e contagem. Em uma modalidade, esta revelação se refere a uma composição de agente de contraste de partículas que pode ser usada para tratar e/ou corar células. As composições de agente de contraste de partículas e métodos dessa invenção podem ser usados em uma modalidade, por exemplo, para a contagem e caracterização de glóbulos brancos e caracterização e análise de diferencial de glóbulo branco, e para contagem de partículas, caracterização e análise de partículas em fluidos biológicos. Em uma modalidade, as composições de agente de contraste de partículas são adequadas ao uso com analisadores que são parcialmente automatizados ou automatizados. Em alguns aspectos dessa invenção, são fornecidos métodos e composições para conduzir a análise de sedimento urinário à base de imagem. Em uma modalidade, as composições e métodos relacionados permitem que os usuários visualizem células e seu conteúdo celular que poderiam facilitar a identificação de células anormais com base em contraste e/ou morfologia.

[000340] Em outras modalidades, as composições de agente de contraste de partículas podem acentuar e/ou corar estruturas subcelulares de WBCs, assim como células epiteliais, bactérias, inclusões em cálculos patológicos, ou fragmentos de célula.

[000341] Os aspectos e modalidades da presente revelação têm por base a descoberta surpreendente e inesperada que determinadas composições de corante e/ou combinações das mesmas, têm eficácia e propriedades inesperadas quando usadas para realizar a análise de amostra de sedimento urinário. As composições de corante exemplificadoras e/ou combinações das mesmas são discutidas no pedido de patente copendente US n° , cujo conteúdo é aquiincorporado, a título de referência.

[000342] Em um outro aspecto, essa invenção se refere a um kit que compreende as composições de agente de contraste de partículas dessa invenção. O kit pode conter, também, instruções sobre o uso da composição de agente de contraste de partículas de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente documento. O kit pode também incluir um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL). O kit pode conter, também, um meio de armazenamento programável e software relacionado para identificação à base de imagem de partículas, tais como eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula, e fragmentos de célula. O kit pode compreender também um ou mais tampões, os quais podem incluir diluentes e/ou tampões isotônicos. O kit e/ou tampão pode compreender adicionalmente um tensoativo, um agente de ajuste de pH e/ou um agente antimicrobiano. Em outras modalidades, o kit pode compreender também uma solução de limpeza ou enxágue. O kit pode compreender também padrões para controles positivo e negativo. Em algumas modalidades, o padrão pode compreender um reagente de célula corada padrão. O kit pode compreender também descartáveis, tais como micropipetas, pontas ou tubos descartáveis para transferir os componentes do kit. O kit pode conter qualquer um ou qualquer combinação de dois ou mais desses componentes do kit.

[000343] Em uma outra modalidade, esta revelação se refere a métodos para realizar a categorização e subcategorização de célula à base de imagem que compreende: a) colocar as amostras contendo partículas em contato com uma composição de agente de contraste de partículas de acordo com qualquer dos métodos descritos no presente documento; b) obter imagens das partículas incluindo estruturas intrapartícula; c) determinar uma ou mais traços das células; e d) realizar a categorização e subcategorização à base de imagem e/ou análise das partículas.

[000344] Para uso na presente invenção, os componentes funcionais e/ou recursos exemplificadores de um analisador na presente revelação podem incluir, por exemplo, um analisador visual capaz de adquirir e/ou processar imagens e/ou identificação, contagem, categorização e subcategorização de imagem de partícula. O analisador pode ser usado nos métodos dessa invenção para analisar amostras de urina ou outras amostras para categorizar e/ou subcategorizar e/ou contar células presentes na amostra, ou para identificar células presentes na amostra com base na análise de traços de partícula.

[000345] Em certas modalidades, a imagem é obtida por um analisador exemplificador. Um analisador pode incluir uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um líquido de alinhamento e organela, por exemplo, um PIOAL, em que a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna, sendo que a célula de fluxo é configurada para direcionar um fluxo da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Um analisador pode também incluir um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica digital com uma objetiva em um eixo geométrico óptico que cruza a corrente de amostra em formato de fita, sendo que uma distância relativa entre a objetiva e a célula de fluxo é variável por operação de um acionamento de motor, para separar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor. Adicionalmente, um analisador pode incluir um padrão de foco automático e/ou padrões de foco automático que têm uma posição fixa em relação à célula de fluxo, sendo que o padrão de foco automático é localizado a uma distância predeterminada do plano da corrente de amostra em formato de fita. Além disso, um analisador pode incluir uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático, e ao menos um processador digital acoplado para operar o acionamento de motor e para analisar a imagem digitalizada. O processador pode ser configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar relativamente a objetiva e a célula de fluxo em relação à distância predeterminada a partir da posição focalizada, para focalizar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na corrente de amostra em formato de fita.

[000346] O termo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode incluir dispositivos que têm capacidade para obter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para diferenciar traços e/ou alterações morfológicas. Os dispositivos de imageamento de alta resolução óptica exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução de 1 um ou menor, incluindo, por exemplo, 0,6 a 0,8 um, tal como, por exemplo, 0,7 um. Em outro exemplo, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode ter uma resolução de 0,3 a 0,4 um, tal como, por exemplo, 0,35 um. Em outro exemplo, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode ter uma resolução de 0,4 a 0,5 um, tal como, por exemplo, 0,43 um.

[000347] Em algumas modalidades, as imagens obtidas em qualquer uma das composições e/ou métodos dessa invenção pode ser imagens digitalizadas. Em algumas modalidades, as imagens obtidas são imagens microscópicas. Em certas modalidades, as imagens podem ser obtidas manualmente. Em outras modalidades, ao menos parte do procedimento para obter as imagens é automatizada. Em algumas modalidades, as imagens podem ser obtidas com o uso de um analisador que compreende uma célula de fluxo, um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital, opcionalmente com um recurso de foco automático.

[000348] Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas aos componentes citosólicos, de núcleo celular e/ou nucleares da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas ao componente granulado e/ou outros traços morfológicos da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas aos componentes citosólicos, nucleares e/ou granulares da célula. As imagens e/ou traços granulares e/ou nucleares são determinantes para a categorização e subcategorização celular, tanto de maneira independente como em combinação uns com os outros.

[000349] Em um aspecto dos métodos dessa invenção, as células que são colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas podem compreender glóbulos brancos, células epiteliais e/ou bactérias. Em um outro aspecto, o métodos dessa invenção pode compreender, adicionalmente, categorização e subcategorização de glóbulo branco.

[000350] Em um aspecto dos métodos dessa invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou imageadas são glóbulos vermelhos. Em ainda um outro aspecto, os métodos dessa invenção se referem a um método para realizar a categorização e subcategorização de partícula de urina à base de imagem que compreende: a) imagear uma porção das partículas de células; e b) determinar a morfologia das partículas imageadas. Em uma modalidade, as partículas na urina podem ser glóbulos vermelhos. Para uso na presente invenção, os glóbulos vermelhos (RBC) podem incluir, por exemplo, glóbulos vermelhos normais e/ou glóbulos vermelhos dismórficos. Em algumas modalidades, o imageamento é realizado com o uso do analisador desta revelação, tal como um analisador que compreende um analisador visual e um processador

[000351] Para uso na presente invenção, uma análise de sedimento urinário completa exemplificadora pode incluir um painel de teste tipicamente solicitado por um médico ou outro profissional médico que fornece informações sobre os elementos formados (por exemplo, células e/ou outras partículas) presentes em uma amostra de urina do paciente. Os elementos formados exemplificadores encontrados em urina podem geralmente incluir, mas não se limitam a, qualquer partícula revelada no presente documento.

[000352] Para uso na presente invenção, altas contagens de anormalidade podem indicar a presença de doença, distúrbio e/ou condição. Dessa forma, uma análise de sedimento urinário completa é um dos testes de urina comumente realizados em medicamento, à medida que pode fornecer uma visão geral de um estado de saúde geral do paciente. Consequentemente, uma análise de sedimento urinário é realizada habitualmente durante os exames físicos anuais.

[000353] Para uso na presente invenção, tipicamente o indivíduo coleta uma amostra de urina, geralmente em um copo. A amostra é, então, transportada para um laboratório. Em um método tradicional, a amostra de urina é primeiramente submetida à separação centrífuga e enriquecida, os sedimentos assim obtidos são, em alguns casos, corados e, então, carregados em uma lâmina de microscopia (por exemplo, uma lâmina de contagem especializada ou exame a fresco) e são submetidos à determinação e contagem manual sob o microscópio. Em uma outra modalidade, a amostra é processada com um analisador automatizado em que as partículas são categorizadas, subcategorizadas e contadas, enquanto que as partículas são envelopadas em um fluido envoltório.

[000354] Para uso na presente invenção, em geral, os analisadores de urina podem aspirar uma quantidade muito pequena da espécime através de tubagem estreita. Os sensores podem detectar a contagem e/ou o número de células que passam através da tubagem, e podem identificar o tipo de célula. Os sensores exemplificadores podem incluir detectores de luz (por exemplo, visível, UV ou IV) e/ou impedância elétrica. Os parâmetros de detecção exemplificadores podem incluir tamanho, volume e/ou características celulares. Em certas modalidades, os sensores podem detectar luz visível e não visível em um espectro do comprimento de onda na faixa de cerca de 200 nm a cerca de 1,0 mm. Em certas modalidades, os sensores podem detectar um comprimento de onda entre cerca de 380 nm e cerca de 760 nm.

[000355] Em um outro aspecto dos métodos dessa invenção, as partículas colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou partículas imageadas, tais como células sanguíneas, células epiteliais escamosas e não escamosas, cálculos, tricossomas, ou bactérias. Em alguns aspectos dessa invenção, a presença anormal dessas partículas pode ser usada para identificar, prever, diagnosticar, prognosticar ou suportar um diagnóstico de uma condição, doença, infecção e/ou síndrome e/ou monitorar se um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento.

[000356] Para uso na presente invenção, os parâmetros de partículas mensuráveis e detectáveis podem incluir, por exemplo, imagens visuais e/ou índices à base de não imagem de tamanho, formato, simetria, contorno e/ou outras características.

[000357] Para uso na presente invenção, a amostra de urina pode ser diluída, dividida em porções ou tratada com um agente de contraste de partículas em alguns processos.

[000358] Os métodos revelados no presente documento são aplicáveis a amostras a partir de uma ampla gama de organismos, incluindo mamíferos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), cavalos, vacas ou outro gado, cães, gatos ou outros mamíferos criados como animais de estimação, ratos, camundongos, ou outros animais de laboratório; pássaros, por exemplo, galinhas; répteis, por exemplo, jacarés; peixe, por exemplo, salmão e outras espécies cultivadas; e anfíbios.

[000359] As amostras podem ser obtidas por meio de qualquer método convencional, por exemplo, excreção, extração, coleta, aspiração ou uma biópsia. A amostra pode ser de um indivíduo considerado saudável, por exemplo, uma amostra coletada como parte de um exame físico de rotina. A amostra pode também ser de um indivíduo que tem, que está em risco ou que é suspeito de ter um distúrbio. O distúrbio pode ser o resultado de uma doença, uma anormalidade genética, uma infecção, uma lesão ou causas desconhecidas. Alternativa ou adicionalmente, os métodos podem ser úteis para monitorar um indivíduo durante o curso do tratamento para um distúrbio. Onde existem sinais de capacidade nula de resposta ao tratamento e/ou terapia, um clínico pode escolher um agente alternativo ou adjuntivo. Dependendo da condição do indivíduo e do distúrbio particular, se houver, as amostras podem ser coletadas quando (ou duas vezes, três vezes, etc.) diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente.

[000360] As partículas podem variar dependendo da amostra de urina. As partículas podem ser células encontradas em urina, por exemplo, células sanguíneas, células fetais, células-tronco, células de tumor ou fragmentos dos mesmos. Em algumas modalidades, as partículas podem ser um agente infeccioso, por exemplo, vírus, bactéria, protista, protozoário, fungo ou parasita.

[000361] A referência a um "elemento formado" será entendida como abrangendo elementos não fluidos presentes em amostras de fluido biológico. Os elementos formados incluem, por exemplo, classes de células sanguíneas com base em classificação científica ou função fisiológica incluindo eritrócitos (RBCs), leucócitos (WBCs), nódulos de WBC, subclasses de leucócitos, que incluem leucócitos maduros, tais como monócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos. Os "elementos formados", para uso na presente invenção, também irão incluir partículas, tais como cálculos, células epiteliais, leveduras, cristais, bactérias, muco, micro-organismos, bactérias, fungos, protista, protozoários, parasitas, cistos, incluindo cistos parasíticos, ou fragmentos dos mesmos ou outros fragmentos de célula.

[000362] Exceto onde expressamente indicado em contrário, a referência a uma "categoria" de partículas feita nesta revelação será entendida como abrangendo um grupo de partículas detectadas com o uso de ao menos um critério de detecção medido, detectado ou derivado, tal como tamanho, formato, textura ou cor. Em algumas modalidades, os membros de ao menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas contadas pelo analisador desta revelação serão o mesmo tipo de elemento formado. A referência a uma "categoria" de partículas feita nesta revelação será entendida como abrangendo um agrupamento de partículas que corresponde aos critérios medidos, detectados ou derivados, tais como tamanho, formato, textura ou cor. Em algumas modalidades, os membros de ao menos uma categoria e/ou subcategoria de partículas contadas pelo analisador desta revelação serão o mesmo tipo de elemento formado.

[000363] A referência a um "membro" ou "membros" de uma categoria e/ou subcategoria de partículas feita nesta revelação será entendida como abrangendo partículas individuais dentro de uma categoria ou subcategoria de partículas.

[000364] Para uso na presente invenção, o termo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode incluir dispositivos que têm capacidade para obter imagens de partículas com distinções visuais suficientes para diferenciar traços e/ou alterações morfológicas. Os dispositivos de imageamento de alta resolução óptica exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução de 1 um ou menor, incluindo, por exemplo, 0,7 a 0,9 um, tal como, por exemplo, 0,8 um. Outro dispositivo de imageamento de alta resolução óptica exemplificador tem uma resolução de 0,4 a 0,5 um, tal como, por exemplo, 0,43 um. Os dispositivos de imageamento de alta resolução óptica exemplificadores podem incluir dispositivos com uma resolução óptica de 1 μm ou menor, incluindo, por exemplo, 0,46 μm.

[000365] Para uso na presente invenção, as composições de agente de contraste de partículas podem ser adaptadas para o uso em combinação com um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) em um analisador visual para analisar partículas em uma amostra de um indivíduo. O PIOAL exemplificador é útil, por exemplo, nos métodos para o reconhecimento automatizado de diferentes tipos de partículas em uma amostra de um indivíduo.

[000366] Em um outro aspecto, as células podem ser envelopadas em PIOAL quando as imagens são obtidas. O PIOAL exemplificador adequado é descrito no presente documento.

[000367] Para uso na presente invenção, "alinhamento" pode ser caracterizado em parte pelo alinhamento de partículas esféricas e/ou não esféricas. Por exemplo, as partículas, tais como partículas não esféricas, podem ser alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo. Em certas modalidades, o alinhamento das partículas não esféricas é caracterizado pela orientação das partículas que aumentam uma projeção de imagem das partículas não esféricas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. As partículas, tais como partículas esféricas, podem ter um aumento na quantidade dos conteúdos intrapartícula em foco das partículas e células. As estruturas intrapartícula de partículas, tais como partículas esféricas, podem ser posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para ficarem substancialmente paralelas à direção de fluxo. Por exemplo, as estruturas intracelulares, organelas ou lóbulos podem também ser posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para ficarem substancialmente paralelas à direção de fluxo.

[000368] A referência a uma "classe" de partículas feita nesta revelação será entendida como abrangendo um grupo de partículas com base na classificação científica. Por exemplo, as maiores classes de elementos formados em uma amostra de urina incluem, mas não se limitam a, eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula, e fragmentos de célula.

[000369] A referência a um "membro" ou "membros" de partículas feita nesta revelação será entendida como abrangendo uma subcategoria de partículas em uma categoria de partículas. Por exemplo, cada classe de sedimentos de urina pode ser adicionalmente dividida em subcategorias ou subcategorias. As maiores subcategorias de WBCs incluem, mas não se limitam a, neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. Adicionalmente a RBCs maduros, os membros de RBCs podem incluir RBCs com formato anormal.

[000370] A referência a células ou partículas "anormais" será entendida como abrangendo aquelas associadas a uma determinada doença ou condição, ou irregularidades que podem, em alguns casos, estar associadas a determinadas doenças ou condições. As variações em tamanho, formato, cor, quantidade de partículas e/ou estruturas intracelulares podem estar associadas a determinadas doenças ou condições ou falta das mesmas.

[000371] A referência a "contagem" de partículas ou "contagem de partículas" feita nesta revelação será entendida como abrangendo os números de partículas obtidas acumulando-se o número de todas as partículas detectadas e categorizadas ou subcategorizadas pelo analisador visual. A referência a "concentração" de uma classe, categoria ou uma subclasse ou subcategoria de partículas feita nesta revelação será entendida como se referindo aos números das partículas por volume de unidade (por exemplo, por litro) ou por amostra de um volume conhecido. Por exemplo, um analisador visual pode fornecer contagens, concentrações, razões ou outros parâmetros à base de concentração para cada categoria ou subcategoria de partículas.

[000372] A presente revelação fornece uma técnica para alcançar automaticamente uma posição de trabalho correta do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para focalizar na corrente de amostra em formato de fita. A estrutura de célula de fluxo é configurada de tal modo que a corrente de amostra em formato de fita tenha um local fixo e confiável dentro da célula de fluxo que define a trajetória de fluxo de fluido de amostra, em uma fita delgada entre camadas de PIOAL, passando através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Nas modalidades de célula de fluxo reveladas, esquematicamente na Figura 1 e na modalidade prática nas Figuras 6 e 7, a seção transversal da trajetória de fluxo para o PIOAL se estreita simetricamente no ponto em que a amostra é inserida através de um orifício aplanado, tal como um tubo com um lúmen retangular no orifício, ou cânula. A trajetória de fluxo de estreitamento (por exemplo, que se estreita geometricamente na área em seção transversal por uma razão de 20:1, ou por uma razão entre 20:1 a 70:1) e uma diferença em velocidade linear do PIOAL em comparação com o fluxo da amostra, cooperam para comprimir a seção transversal da amostra por uma razão de cerca de 20:1 a 70:1. Em algumas modalidades, a razão de espessura em seção transversal pode ser de 40:1.

[000373] Em um aspecto, a natureza simétrica da célula de fluxo e a maneira de injeção do fluido de amostra e PIOAL fornecem uma posição repetível dentro da célula de fluxo para a corrente de amostra em formato de fita entre as duas camadas do PIOAL. Como resultado, as variações do processo, tais como as velocidades lineares específicas da amostra e do PIOAL, não tendem a deslocar a corrente de amostra em formato de fita a partir de seu local central no fluxo. Em relação à estrutura da célula de fluxo, o local da corrente de amostra em formato de fita é estável e repetível.

[000374] Entretanto, as posições relativas da célula de fluxo e do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica do sistema óptico podem ser submetidas à mudança e exigir ajustes de posição ocasionais para manter a distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita, fornecendo, assim, uma imagem de foco de qualidade das partículas envelopadas na corrente de amostra em formato de fita. Há uma distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita para obter imagens focalizadas das partículas envelopadas. A óptica é primeiramente posicionada com exatidão em relação à célula de fluxo, esquematicamente na Figura 1, ou seja, por técnicas de foco automático para localizar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na distância ideal a partir de um padrão de foco automático com uma posição fixa em relação à célula de fluxo. A distância de deslocamento entre o padrão de foco automático e a corrente de amostra em formato de fita é conhecida precisamente, de preferência, como resultado de etapas de calibração iniciais. Após a focalização automática no padrão de foco automático, a célula de fluxo e/ou dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é, então, deslocado para fornecer a distância de deslocamento conhecida entre a célula de fluxo e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou o dispositivo de captura de imagem digital e a corrente de amostra em formato de fita. Como resultado, a lente objetiva do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é focalizada de maneira precisa sobre a corrente de amostra em formato de fita que contém as partículas envelopadas.

[000375] Em sistemas fotográficos com aspectos de foco automático, é usualmente o caso em que os processos de foco automático tentam aumentar o contraste do objeto que aparece na imagem. Entretanto, de acordo com a presente técnica, a focalização automática é simplificada pela focalização automática no padrão de foco automático, o qual, em alguns casos, é uma figura de alto contraste que define um local conhecido ao longo de uma linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ou do dispositivo de captura de imagem digital. O padrão de foco automático tem um deslocamento ou distância conhecida em relação ao local da corrente de amostra em formato de fita. Um algoritmo de medição de contraste pode ser empregado especificamente nos traços do padrão de foco automático. Em um exemplo, a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é variada ao longo de um linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para encontrar a profundidade ou distância na qual uma ou mais amplitudes diferenciais máximas são encontradas entre os valores de luminância de pixel que ocorrem ao longo de uma linha de pixels na imagem que é conhecida por cruzar uma borda da figura de contraste. O padrão de foco automático vantajosamente não tem variação ao longo da linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica, a qual também é a linha ao longo da qual um controle motorizado opera para ajustar a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para fornecer a distância de deslocamento registrada.

[000376] O método compreende, adicionalmente, formar a corrente de amostra em formato de fita em um formato de fita. O formato de fita é apresentado de tal modo que o eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica seja substancialmente perpendicular à corrente de amostra em formato de fita, ou seja, ortogonal ao plano da corrente em formato de fita.

[000377] O analisador visual 17 pode também compreender ao menos um membro de contato 26 configurado para fornecer ao menos um produto químico que compreende ao menos um dentre um diluente, um agente permeabilizante, um agente de contraste eficaz para gerar distinções visuais para categorização e subcategorização de partícula. Por exemplo, conforme mostrado na Figura 1 e em outro lugar, a amostra colocada em contato é introduzida na célula de fluxo através do injetor de amostra 29, e um reagente de alinhamento de organela intracelular ou envoltório é introduzido a partir do injetor 27.

[000378] Um diluente pode ser usado para diluir a amostra a uma concentração adequada. Um agente de contraste e/ou agente permeabilizante é usado para gerar distinções visuais para categorizar e/ou subcategorizar partículas. O PIOAL é usado para alinhar determinado tipo de células ou estruturas celulares em uma direção para melhor imageamento. Em algumas modalidades, o ao menos um produto químico pode ser aplicado para entrar em contato com uma amostra primeiro e, então, a amostra tratada é fornecida no analisador visual 17.

[000379] O tratamento da amostra com a ao menos adição de ao menos um produto químico pode ser realizado à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, tal tratamento pode ser realizado em uma temperatura, tal como 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 °C. O tratamento em uma temperatura selecionada pode ser conduzido em um incubador que é separado do analisador visual 17, ou em um analisador visual 17 que tem temperatura controlada.

[000380] Em algumas modalidades, o analisador visual pode ter uma câmara de contato para colocar a amostra em contato com um agente de contraste e/ou agente permeabilizante ou tensoativo. Em outras modalidades, a amostra pode ser colocada em contato com o agente de contraste e/ou agente permeabilizante antes da injeção no analisador visual. Em outras modalidades, o analisador visual que contém um elemento de aquecimento para aquecer a amostra enquanto em contato com o agente de contraste e/ou agente permeabilizante, em uma temperatura controlada durante um tempo controlado. O analisador visual podem também ter um elemento de resfriamento para resfriar a mistura de amostra após a etapa de aquecimento.

[000381] Adicionalmente ao fornecimento de resultados exatos, o analisador visual 17 oferece vantagens significantes no aperfeiçoamento da velocidade de análise. Na Figura 1C, os resultados exatos da contagem de diferentes sedimentos de urina podem ser fornecidos através da tela 63. Durante um processo de análise, um operador pode interagir com o processador 18 através de um terminal 65. O operador pode precisar fazer slides para identificar ou verificar classes ou membros de classes de células ou outras partículas em uma amostra, e inserir a informações no processador 18. Anteriormente, até cerca de 25% a 30% de resultados foram analisados manualmente produzindo-se lâminas para microscópio (por exemplo, lâminas de contagem especializadas ou de exame a fresco) com as quais foram examinadas sob um microscópio por um operador. Mediante a operação do analisador conforme descrito nesta revelação, as imagens podem ser analisadas no analisador visual e as amostras exigirão análise manual menos frequente.

[000382] As seguintes categorias de aplicações são descritas com o propósito de ilustração do analisador nesta revelação. As aplicações não se limitam àquelas descritas a seguir.

[000383] A presente revelação apresenta composições inovadoras e métodos de uso das mesmas para conduzir a análise de partículas. Em particular, a presente revelação se refere a um líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) usado em um analisador para analisar partículas em uma amostra. Os termos fluido envoltório e PIOAL podem ser usados de forma intercambiável por toda esta revelação. A presente revelação fornece adicionalmente métodos para produzir o PIOAL e métodos para usar o PIOAL para analisar partículas. O PIOAL dessa invenção é útil, por exemplo, em métodos para categorização e subcategorização automatizada de partículas em uma amostra.

[000384] O PIOAL pode compreender um ou mais agentes de viscosidade ou modificadores de viscosidade. Para uso na presente invenção, o PIOAL é um composto ou composição que tem uma viscosidade característica que é diferente da viscosidade da amostra. Em algumas modalidades, a viscosidade do PIOAL é aumentada ou diminuída a fim de maximizar o alinhamento de partículas, enquanto que em fluxo, e surpreendentemente também aumentar os conteúdos em foco das partículas e/ou organelas intracelulares de partículas quando apresentadas para o imageamento. Por exemplo, a partículas e/ou as células podem ser orientadas para aumentar uma projeção de imagem das partículas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. As estruturas intrapartícula, tais como estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares, podem também ser posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas para ficarem substancialmente paralelas à direção de fluxo. Em algumas modalidades, um ou mais agentes de viscosidade compreendem a porção líquida inteira do PIOAL, a qual pode conter sais adicionais ou outros componentes. Em outras modalidades, a viscosidade da amostra é aumentada ou diminuída para maximizar a diferença relativa na viscosidade da amostra e na viscosidade do PIOAL, a fim de maximizar o alinhamento de partículas, enquanto que em fluxo, e aumentar os conteúdos em foco das partículas e/ou organelas intracelulares de partículas quando apresentadas para imageamento.

[000385] Em certas modalidades, a diferença de viscosidade e/ou diferença de velocidade entre a corrente de amostra em formato de fita e o PIOAL e/ou a espessura da corrente de amostra em formato de fita pode introduzir forças de cisalhamento a agir sobre as partículas, enquanto que em fluxo, fazendo, assim, com que as partículas se alinhem e permaneçam em alinhamento por todo o processo de imageamento no analisador visual. Em algumas modalidades, a amostra terá contraste acentuado. Em algumas modalidades, o PIOAL pode compreender até 100% de um agente de viscosidade.

[000386] Em outras modalidades, esta revelação se refere a um PIOAL que pode ser usado em análise à base de imagem de partículas em amostras de urina ou outras amostras de fluido biológico, tais como líquido cefalorraquidiano e/ou efusões associadas a condições particulares. As contagens de categoria e/ou subcategoria de partícula, conforme descrito, para o uso em amostras de urina nesta revelação, são exemplos não limitadores da classe de amostras que podem ser analisadas. Em algumas modalidades, as células presentes em amostras podem também incluir células bacterianas ou fúngicas, assim como glóbulos brancos ou glóbulos vermelhos. Em algumas modalidades, as suspensões de partícula obtidas a partir de tecidos ou aspirados podem ser analisadas.

[000387] Em algumas modalidades, uma corrente de fluido de amostra pode ser injetada através de uma cânula com uma abertura aplanada para estabelecer uma trajetória de fluxo com uma largura considerável. O PIOAL pode ser introduzido na célula de fluxo e carrega o fluido de amostra ao longo da área de imageamento, então, em direção a uma descarga. O PIOAL tem uma viscosidade diferente, por exemplo, relativamente maior que o fluido de amostra e, opcionalmente, uma taxa de fluxo diferente no ponto de injeção à corrente de amostra em formato de fita resulta no aplanamento do fluido de amostra em um formato de fita delgada. A fita delgada de fluido de amostra é carregada junto com o PIOAL, para passar na frente de uma porta de visualização em que um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e uma fonte de luz estão dispostos para visualizar a corrente de amostra em formato de fita.

[000388] Em uma modalidade, a viscosidade do PIOAL pode ser maior que a viscosidade da amostra. A viscosidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a taxa de fluxo do PIOAL e a taxa de fluxo do material de amostra são coordenadas para manter o fluxo em uma corrente de amostra em formato de fita com características dimensionais predeterminadas, tais como uma espessura de corrente de amostra em formato de fita vantajosa. A manutenção de uma espessura vantajosa de corrente de amostra em formato de fita fornece, por exemplo, uma alta porcentagem de partículas em foco, tais como células e/ou componentes celulares em foco.

[000389] A revelação tem por base a descoberta que a adição de uma quantidade adequada de um agente de viscosidade no PIOAL aperfeiçoa significativamente o alinhamento de partícula/célula em uma célula de fluxo, e aumenta os conteúdos intracelulares de células em foco, resultando em imagens de qualidade superior de células em fluxo em comparação com o uso de um fluido envoltório convencional não modificado em viscosidade. A adição do agente de viscosidade aumenta as forças de cisalhamento em células como RBCs, o qual, então, alinha as células em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, o qual resulta na otimização da imagem. Para células como WBCs, isso também resulta no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares substancialmente paralelas à direção de fluxo.

[000390] O alinhamento de partículas que são menores em diâmetro que a corrente de fluxo, pode ser obtido mediante o aumento da viscosidade do PIOAL. Isso resulta no alinhamento aperfeiçoado daquelas partículas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo.

[000391] Uma modalidade de PIOAL exemplificadora é usada em uma célula de fluxo para análise de partículas. Uma amostra é envelopada na corrente do PIOAL e passada através da célula de fluxo do dispositivo analisador. Então, as informações da amostra quando passa através da área de detecção são coletadas, possibilitando que se analise partículas/células contidas na amostra. O uso do PIOAL em tal analisador permite a categorização e subcategorização e contagem exata de partículas, tais como células e outras partículas contidas em amostras.

[000392] Para uso na presente invenção, o PIOAL é útil na obtenção de informações relacionadas às seguintes células e/ou partículas reveladas no presente documento.

[000393] Para uso na presente invenção, o agente de viscosidade e/ou modificador de viscosidade pode incluir qualquer substância adequada para alcançar um valor absoluto de uma diferença entre a viscosidade do PIOAL e a viscosidade da amostra entre 0,1 a 10 centipoise, com características ópticas, incluindo claridade óptica, adequada para o uso em um sistema de imageamento. O agente de viscosidade/agentes modificadores de viscosidade podem incluir qualquer substância adequada para alcançar um valor absoluto de uma diferença entre a viscosidade do PIOAL e a viscosidade da amostra entre 0,1 a 10 centipoise (cP), com características ópticas, incluindo claridade óptica, adequada para o uso em um sistema de imageamento.

[000394] Os tampões adequados adicionais podem incluir, por exemplo, tampões de pH que agem em uma faixa fisiológica de pH 6 a 8, incluindo 2-Amino-2-metil-1,3-propanodiol BioXtra, pH 10,0 a 12,0 (20 °C, 0,5 M em H2O); ACES; ADA; BES; bicina; BIS-TRIS; DIPSO; EPPS; Gly-Gly; HEPBS; HEPES; MES; MOBS; MOPS; MOPSO; fosfatos; PIPES; POPSO; carbonato de sódio; bicarbonato de sódio; TAPS; TAPSO; TES; tricina; cloridrato de trietanol amina; e Tris; Trizma.

[000395] Em um aspecto, o analisador/sistema exemplificador compreende um componente analisador visual automatizado em que uma amostra líquida contendo partículas de interesse é induzida a fluir através de uma célula de fluxo que tem uma porta de visualização através da qual um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura uma imagem digital. A célula de fluxo é acoplada a uma fonte de fluido de amostra, e a uma fonte de PIOAL. A amostra pode ser tratada com uma ou mais dentre as composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras descritas no presente documento antes da análise de imageamento. A amostra de urina pode ser diluída, dividida em porções, corada em alguns processos, e induzida a fluir através de uma célula de fluxo que tem uma janela ou porta transparente através da qual a imagem de dados de pixel é capturada com o uso de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica que compreende uma câmera digital. A imagem de dados de pixel pode ser exibida em um monitor e analisada automaticamente e/ou interativamente para discernir traços visíveis de partículas de interesse. Os traços permitem que as partículas sejam distinguidas, categorizadas, subcategorizadas e contadas, tais como elementos formados em amostras de urina.

[000396] As amostras podem ser obtidas por meio de qualquer método convencional, por exemplo, uma coleta de amostra de urina. A amostra pode ser de um indivíduo considerado saudável, por exemplo, uma amostra coletada como parte de um exame físico de rotina. A amostra pode também ser de um indivíduo que tem, que está em risco ou que é suspeito de ter um distúrbio. O distúrbio pode ser o resultado de uma doença, uma anormalidade genética, uma infecção, uma lesão ou causas desconhecidas. Alternativa ou adicionalmente, os métodos podem ser úteis para monitorar um indivíduo durante o curso do tratamento. Onde existem sinais de capacidade de resposta, o clínico pode ajustar a dose ou tratamento em conformidade. Onde existem sinais de capacidade nula de resposta ao tratamento, um clínico pode ajustar a dose ou escolher um agente alternativo ou adjuntivo. Dependendo da condição do indivíduo e do distúrbio particular, se houver, as amostras podem ser coletadas quando (ou duas vezes, três vezes, etc.) diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente.

[000397] O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a fonte de luz podem ser colocados em lados opostos da célula de fluxo, para obter imagens iluminadas por trás das partículas. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura uma imagem de dados de pixel da amostra através de uma porta de visualização na célula de fluxo. Por exemplo, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura imagens em uma frequência de repetição consistente com a taxa de fluxo de tal modo que as seções da corrente de amostra em formato de fita sejam imageadas sem lacunas ou sobreposição substancial.

[000398] Há uma série de desafios estruturais e funcionais no projeto e operação de um sistema para coletar imagens de alta resolução de uma corrente de amostra em formato de fita em avanço através de uma célula de fluxo. Uma necessidade é obter uma imagem nitidamente focalizada das partículas, suficientemente límpida para revelar os diferentes traços dos diversos tipos de partícula que permitem que os tipos de partícula sejam distinguidos uns dos outros.

[000399] Com a finalidade de manter o foco, a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita precisa ser ajustada de tal modo que a corrente de amostra em formato de fita fique na distância correta do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ao longo do eixo geométrico óptico. A lente objetiva do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica separa uma imagem focalizada em uma matriz de fotossensor, tal como uma matriz de dispositivo de acoplamento de carga bidimensional, a partir da qual os dados de pixel são digitalizados. As dimensões da área da amostra que é imageada e a profundidade de campo que está em foco na amostra são determinadas pela configuração óptica. Os ajustes de abertura e ajustes de zoom podem ser possíveis, mas para propósitos de simplicidade, os exemplos nesta revelação são de tal modo que a focalização do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica nas partículas na corrente de amostra em formato de fita exija simplesmente o posicionamento do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica a uma distância correta predeterminada da corrente de amostra em formato de fita na célula de fluxo, ou seja, a distância que resulta em uma imagem de partícula focalizada na matriz de fotossensor.

[000400] Em um aspecto, os analisadores visuais, ou analisadores de imagem, para o uso com as composições dessa invenção, podem capturar imagens confiavelmente focalizadas da amostra ajustando-se com exatidão a distância entre a corrente de amostra em formato de fita e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica do sistema óptico. Em algumas modalidades, os analisadores visuais podem ser usados em combinação com as composições dessa invenção e algoritmos para estabelecer a dita distância.

[000401] É desejável imagear uma camada delgada de amostra preparada. A amostra é disposta na célula de fluxo e iluminada para possibilitar a visualização através de uma porta de visualização. As partículas individuais aparecem claramente na imagem de dados de pixel capturada, com contraste de traço suficiente, por exemplo, para revelar atributos que são, então, comparados e correlacionados com os parâmetros conhecidos para distinguir categorias e subcategorias de partículas umas das outras.

[000402] É um objetivo empregar uma célula de fluxo em combinação com composições de agente de contraste de partículas adequados, e um PIOAL exemplificador para permitir que o analisador colete imagens otimizadas para o reconhecimento de partícula. Além disso, o PIOAL e a célula de fluxo fornecem uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra em formato de fita injetada em um fluxo de PIOAL, em combinação com um mecanismo de foco automático que mantém a distância ideal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para a corrente de amostra em formato de fita, fornecendo, assim, uma imagem focalizada de qualidade.

[000403] É de conhecimento o uso de processos de foco automatizados em fotografia digital, em geral, e em microscopia de imagem digital em particular, para focalizar em um indivíduo em uma posição de profundidade incerta. Entretanto, um processador programado não tem uma percepção do conteúdo de imagem. Tipicamente, a qualidade de foco é avaliada encontrando-se a distância na qual a imagem do indivíduo tem o maior contraste total, conforme determinado por um algoritmo numérico aplicado aos dados de pixel na imagem. Por exemplo, uma soma das diferenças em amplitude de luminância para cada pixel na imagem versus seus pixels adjacentes pode ser calculada como um contraste total medido. Em igualdade de circunstâncias, a soma maior encontrada nas imagens em distâncias ligeiramente diferentes corresponde ao contraste maior. Entretanto, o conteúdo da imagem afeta o resultado de tais medições numéricas, e o conteúdo de imagem pode se diferir em distâncias diferentes. Dessa forma, é desejável, como um procedimento manual, imagear uma camada delgada de amostra corada diluída, por exemplo, de uma espessura comparável com a espessura das células ou partículas, quando se usa uma célula de fluxo em vez de amostras montadas em lâminas de vidro. A amostra precisa ser disposta na célula de fluxo para possibilitar a visualização através de uma porta de visualização e iluminada.

[000404] Portanto, é vantajoso ter processos de foco automatizados de modo que as partículas individuais apareçam claramente na imagem de dados de pixel capturada, com contraste de traço suficiente para revelar atributos visíveis que são, então, comparados e correlacionados com os parâmetros conhecidos para distinguir categorias e subcategorias de partículas umas das outras.

[000405] É um objetivo empregar uma célula de fluxo em combinação com PIOAL exemplificador revelado no presente documento que fornece uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra injetada em uma fluxo de PIOAL, em combinação com um aparelho de foco automático de imageamento de alta resolução óptica que mantém o plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica sobre a corrente de amostra em formato de fita, substancialmente paralelo à direção de fluxo, fornecendo, assim, uma imagem focalizada de qualidade das partículas na amostra, mas o qual não exige repetição constante ou mesmo frequente do processo de foco automático. A imagem é focalizada em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo do analisador visual.

[000406] Como um exemplo, uma primeira etapa é para determinar uma posição relativa precisa do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica em relação à célula de fluxo que carrega o PIOAL exemplificador e a corrente de amostra em formato de fita. Vantajosamente, a célula de fluxo e/ou dispositivo de imageamento de alta resolução óptica são movidos um em relação ao outro em um processo de focalização automática usando como um objeto um padrão de foco automático com bordas nitidamente contrastantes com o ponto de referência. A corrente de amostra em formato de fita é fixa em posição em relação àquele ponto de referência.

[000407] A trajetória de fluxo de PIOAL pode ser disposta simetricamente de tal modo que os fluxos de PIOAL iguais se espalhem e localizem a corrente de amostra como uma fita delgada a uma distância fixa do padrão de foco automático ao longo da linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em uma modalidade, o padrão de foco automático compreende uma margem opaca em torno de uma abertura que admite luz a partir de uma fonte de iluminação traseira e a distância do padrão de foco automático é prontamente e sem ambiguidade concentrada pelos controles de foco automático. Então, a corrente de amostra em formato de fita é colocada em foco deslocando-se o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica a partir da posição de padrão de foco automático para a posição da corrente de amostra em formato de fita, a qual é uma distância de deslocamento fixa, sem a necessidade de focalização automática no conteúdo de imagem da amostra, embora a focalização automática adicional seja concebível.

[000408] Um acionamento de motor é fornecido e controlado por um processador que avalia uma medição de qualidade de foco, por exemplo, uma medição de contraste, e opera o acionamento de motor para a focalização automática. Em operação normal, o processador opera o acionamento de motor para focalizar automaticamente no padrão de foco automático e, então, ajusta a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo pela distância de deslocamento registrada a partir do padrão de foco automático à corrente de amostra em formato de fita. Contanto que o dispositivo continue a mover a corrente de amostra em formato de fita da mesma forma, e a expansão térmica ou fatores de confusão similares não surjam, a imagem da corrente de amostra em formato de fita irá permanecer em foco.

[000409] Um processo de calibração ou configuração preliminar pode ser usado para determinar e registrar a distância de deslocamento entre o padrão de foco automático e o local de uma corrente de amostra em formato de fita na célula de fluxo. A distância de deslocamento exata, a qual pode se diferir para células de fluxo diferentes, é estabelecida por teste preliminar, tal como pela focalização automática alternativamente no padrão de foco automático e em uma corrente de amostra em formato de fita de teste várias vezes, e registrando-se o resultado médio como uma constante associada à célula de fluxo.

[000410] As partículas na amostra de urina são imageadas pelo dispositivo de imageamento de alta resolução óptica que coleta imagens digitais que são analisadas por processos de análise de imagem ao menos parcialmente automatizados. Um processo de foco automático é realizado em um padrão de foco automático ou alvo de focalização similar, de preferência, um alvo plano com pouca ou nenhuma variação de distância na direção do eixo geométrico óptico, e não na presente corrente de amostra em formato de fita. O padrão de foco automático tem um deslocamento de distância conhecido em relação à distância da corrente de amostra em formato de fita. Uma configuração de focalização automatizada inclui um acionamento de motor que ajusta a posição relativa da célula de fluxo e um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ao longo do eixo geométrico óptico, responsivo aos sinais de controle a partir de um processador que coleta uma ou mais medições de qualidade de foco sobre uma faixa de distâncias e procura uma distância ideal. O foco automático é aplicado para fixar o ponto de foco do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na profundidade do padrão de alvo localizado a uma distância de deslocamento da corrente de amostra em formato de fita plana paralela à corrente de fluxo.

[000411] Tendo focalizado no padrão de foco automático, o processador opera o acionamento de motor sobre a distância de deslocamento fixa, colocando, assim, a corrente de amostra em formato de fita em foco na imagem digital. O padrão de foco automático pode ter um alto grau de contraste visual e, em algumas modalidades, pode ajudar em um alinhamento plano, isto é, dispondo a célula de fluxo em um plano ortogonal ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica.

[000412] Em uma aspecto, os métodos dessa invenção fornecem imagens de qualidade surpreendentemente alta de partículas em fluxo que permitem a contagem de sedimento urinário à base de imagem automatizada, assim como a identificação automatizada de anormalidades morfológicas úteis na determinação, diagnóstico, prognóstico, predição e/ou suporte de um diagnóstico de se um indivíduo tem uma doença, condição, anormalidade ou infecção e/ou monitoramento de se um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento. Em um outro aspecto, as composições e métodos dessa invenção fornecem sinalização, categorização e subcategorização de célula mais precisa, o qual reduz a taxa de análise manual em comparação com os analisadores automatizados atuais.

[000413] Em algumas modalidades, essa invenção se refere adicionalmente a um kit que compreende o PIOAL dessa invenção. Em uma outra modalidade, essa invenção se refere a um kit que compreende o PIOAL dessa invenção e ao menos um agente de contraste de partícula. Em alguns aspectos, o kit pode conter dois agentes de contraste de partículas adicionalmente ao PIOAL. Em algumas modalidades, o agente de contraste de partículas é uma composição que compreende novo azul de metileno, cristal violeta, safranina O, eosina Y e/ou verde de metila.

[000414] Em uma modalidade, as partículas não esféricas compreendem glóbulos vermelhos, células epiteliais, cálculos, nódulos de glóbulos brancos e/ou leveduras de hifas ou de germinação. Em um outro aspecto dessa invenção, as partículas esféricas compreendem glóbulos brancos, corpos de gordura, tricomonas.

[000415] As partículas em amostras de urina a serem analisadas incluem sedimentos característicos ou elementos formados. Os elementos formados podem incluir as partículas exemplificadoras reveladas no presente documento.

[000416] Os cálculos exemplificadores podem incluir cálculos de pigmento acelulares, cálculo não classificado (por exemplo, cálculos granulares). Os cálculos acelulares exemplificadores podem incluir, por exemplo, cálculos cerosos, cálculos amplos, cálculos graxos e cálculos cristais. Os cálculos celulares exemplificadores podem incluir, por exemplo, cálculos de RBC, cálculos de WBC e cálculos celulares.

[000417] Os cristais exemplificadores podem incluir, por exemplo, oxalato de cálcio, fosfato triplo, fosfato de cálcio, ácido úrico, carbonato de cálcio, leucina, cistina, tirosina e cristais amorfos.

[000418] As células epiteliais não escamosas exemplificadoras podem incluir, por exemplo, células epiteliais renais e células epiteliais transicionais.

[000419] A levedura exemplificadora pode incluir, por exemplo, levedura de germinação e levedura com pseudo-hifas.

[000420] Os patógenos bacterianos exemplificadores podem incluir, por exemplo, Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens Francisella tularensis, espécie Brucella, Salmonella spp., incluindo Salmonella enteriditis, Escherichia coli incluindo E. coli O157:H7, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia spp., Coxiella burnetii, Rickettsia prowazekii, Vibrio spp., Shigella spp. Listeria monocytogenes, Mycobacteria tuberculosis, M. leprae, Borrelia burgdorferi, Actinobacillus pleuropneumoniae, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis, Porphyromonas gingivalis e Campylobacter jejuni. Os patógenos fúngicos podem incluir, sem limitação, membros dos gêneros Aspergillus, Penecillium, Stachybotrys, Trichoderma, micoplasma, Histoplasma capsulatum, Cryptococcus neoformans, Chlamydia trachomatis e Candida albicans. Os protozoários patogênicos podem incluir, por exemplo, membros dos gêneros criptosporídio, por exemplo, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Microsporidia e Toxoplasma, por exemplo, Toxoplasma brucei, Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, Leishmania major e Cyclospora cayatanensis.

[000421] A partícula de sedimento urinário exemplificadora pode também incluir nódulos de RBC, gordura, corpos de gordura ovais e tricomonas.

[000422] As condições associadas à hemoglobina em urina incluem, por exemplo, cristais de bilirrubina ou depósitos amorfos vistos em hiperbilirrubinemia severa; cristais de cistina, vistos em cistinose hemossiderina, vista em sobrecarga de ferro; e eritrócitos, vistos em hemoglobinuria paroxística ao frio.

[000423] Em algumas modalidades, os resultados obtidos podem ser comparados com uma referência.

[000424] Os níveis de referência padrão tipicamente representam os números de célula derivados a partir de uma grande população de referência. A população de referência pode incluir indivíduos de idade, tamanho corporal; antecedente étnico ou saúde geral similar ao indivíduo em questão.

[000425] Em um aspecto, as composições de coloração exemplificadoras reveladas no presente documento são úteis para categorizar, subcategorizar e contar partículas reveladas no presente documento.

[000426] Para uso na presente invenção, a composição de agente de contraste de partículas pode ser usada em combinação com um PIOAL em um analisador visual para gerar imagens que contêm um número maior de conteúdos de célula em foco (por exemplo, lóbulos, núcleo, conteúdos nucleares, citoplasma e grânulos).

[000427] O uso do PIOAL reduz a corrente de amostra, ajudando a direcionar o fluxo para uma fita plana e delgada. Em algumas modalidades, o uso do PIOAL exemplificador resulta em mais conteúdos de célula em foco, os quais podem incluir lóbulos, citoplasma e componentes granulares da célula. Além disso, em algumas modalidades, o projeto de célula de fluxo tem uma trajetória de fluxo simétrica que rende desalinhamento de célula menor que uma célula de fluxo com uma trajetória de fluxo assimétrica.

[000428] Para uso na presente invenção, os agentes de contraste são usados para corar uma variedade de tipos de célula, incluindo, por exemplo, glóbulos brancos, células epiteliais e/ou bactérias.

[000429] Em algumas modalidades, os traços de células imageadas coradas pelas composições de agente de contraste de partículas desta revelação são mostrados na Tabela 1.

[000430] Em certas modalidades, a composição de agente de contraste de partículas é formulada para estabilidade, facilidade de armazenamento, eliminação e/ou toxicidade limitada.

[000431] Em algumas modalidades, os métodos e analisador revelados no presente documento podem ser usados para monitorar a morfologia celular. As alterações em morfologia celular estão associadas a muitos tipos de distúrbios. Tais alterações podem variar dependendo do distúrbio e tipo de célula específico, mas geralmente incluem irregularidades em tamanho, formato, cor e estruturas intracelulares ou qualquer combinação de irregularidades em tamanho, formato, cor e estruturas intracelulares. Por exemplo, as alterações em formato de RBC podem ser um indicador de doença renal/dos rins.

[000432] Em algumas modalidades, os valores obtidos podem ser comparados com um nível de referência. Os níveis de referência padrão tipicamente representam os números de partícula derivados a partir de uma grande população de indivíduos. A população de referência pode incluir indivíduos de idade, tamanho corporal; antecedente étnico ou saúde geral similar ao indivíduo em questão.

[000433] As células podem ser células decoy ou células de tumor.

[000434] Em outras modalidades, esta revelação inclui kits que contêm um ou mais reagentes para o uso nos métodos revelados no presente documento. Em uma modalidade, o kit pode compreender uma ou mais unidades de PIOAL. Em outras modalidades, o kit pode compreender, adicionalmente, uma ou mais composições de agente de contraste de partícula. O kit pode compreender também um ou mais tampões, os quais podem ser isotônicos e/ou um diluente. O kit e/ou tampão pode compreender adicionalmente um tensoativo, um agente de ajuste de pH, um modificador de força iônica, agente quelante, açúcar, álcool de açúcar, estabilizante de proteína, agente antimicrobiano e/ou reagente de hemoglobina. Em outras modalidades, o kit pode compreender também uma solução de limpeza ou enxágue. O kit pode compreender também padrões para controles positivo e negativo. Em algumas modalidades, o padrão pode compreender um reagente de partícula corada padrão (calibradores ou controles). O kit pode também incluir concentrados de qualquer um dentre os mencionados anteriormente. O kit pode compreender também descartáveis, tais como micropipetas, pontas ou tubos descartáveis para transferir os componentes do kit, conectores, limpadores (solução), ou manual de instruções, manual de operação, certificado de análise, MSDS, etc., e embalagem que associa tais elementos como uma unidade.

[000435] Os agentes de contraste de partículas usados para acentuar os traços em partículas, células ou estruturas celulares, incluindo estruturas em glóbulos brancos, células epiteliais, cálculos patológicos e/ou bactérias, são descritos adicionalmente no pedido de patente copendente US n° 14/216.562, depositado no dia 17 de março de 2014, cujo conteúdo é aqui incorporado, a título de referência.

[000436] O analisador e métodos revelados no presente documento podem ser usados para avaliar qualquer amostra que compreende partículas em urina. Os métodos são aplicáveis a amostras a partir de uma ampla gama de indivíduos, incluindo mamíferos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos), cavalos, vacas ou outro gado, cães, gatos ou outros mamíferos criados como animais de estimação, ratos, camundongos, ou outros animais de laboratório; pássaros, por exemplo, galinhas; répteis, por exemplo, jacarés; peixe, por exemplo, salmão e outras espécies cultivadas; e anfíbios.

[000437] Em algumas modalidades, os métodos e composições revelados no presente documento podem ser usados para monitorar contagens de célula, traços/morfologia de célula e/ou alterações em traços/morfologia de célula. Tais alterações podem ser associadas a distúrbios e podem variar dependendo do distúrbio e tipo de célula específico, mas geralmente incluem irregularidades em tamanho, formato, cor e traços/estruturas intracelulares ou qualquer combinação de irregularidades em tamanho, formato, cor e traços/estruturas intracelulares. Por exemplo, as alterações em formato de RBC podem ser indicativas de doença renal/dos rins.

[000438] A presente revelação também fornece composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras e métodos de uso na análise de partículas. As composições de agente de contraste de partículas podem ser usadas em qualquer analisador adequado para detectar e/ou analisar uma amostra contendo partículas, incluindo o analisador descrito no presente documento. Em um aspecto geral, as composições de contraste de partículas exemplificadoras e métodos de uso das mesmas são úteis quando empregados em combinação com um analisador automatizado encontrado em laboratórios de pesquisa e/ou médicos. Os analisadores automatizados exemplificadores são instrumentos projetados para detectar traços e/ou outras características diferentes em uma série de amostras biológicas, rapidamente, incluindo, por exemplo, amostras de fluido corpóreo humano, com assistência humana mínima. Os analisadores automatizados exemplificadores incluem, por exemplo, analisadores automáticos de sedimento urinário. Os analisadores exemplificadores podem processar amostras individualmente, em lotes ou continuamente. Em uma modalidade, as composições de contraste de partículas exemplificadoras descritas no presente documento podem também ser usadas em aplicações de microscopia convencionais sem exigir o uso de um contador de partícula automático e/ou analisador visual.

[000439] A amostra pode ser diluída, dividida em porções ou concentradas. Em alguns aspectos, antes da análise de imagem, a amostra pode ser colocada em contato, sobre ou fora do analisador, com uma composição de agente de contraste de partículas exemplificadora descrita no presente documento. O tratamento com a composição de agente de contraste de partículas exemplificadora pode também ser realizado em linha no analisador. Em certas modalidades, a amostra contendo a partícula é colocada em contato com a composição de agente de contraste de partículas e a amostra preparada é transportada através da célula de fluxo, enquanto que envelopada em um PIOAL exemplificador. Em alguns aspectos, a amostra preparada pode ser direcionada a fluir através de uma célula de fluxo que tem uma janela ou porta transparente através da qual uma imagem de dados de pixel é capturada de maneira periódica ou contínua com o uso de um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. A imagem de dados de pixel pode ser exibida em um monitor e/ou analisada automaticamente e/ou de maneira ao menos parcialmente interativa para discernir traços visíveis de interesse. Os traços visualmente distinguíveis de um objeto típico são usados para categorizar, subcategorizar e/ou classificar ou subclassificar e contar partículas, tais como elementos formados em amostras de urina.

[000440] Em um aspecto, esta revelação se refere a um analisador visual para o imageamento de uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido, no qual o analisador visual inclui uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL, em que a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna, sendo que a célula de fluxo é configurada para direcionar um fluxo da corrente de amostra em formato de fita envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo. Uma lente objetiva associada a um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica é localizada de tal modo que o eixo geométrico óptico da objetiva cruze a corrente de amostra em formato de fita na célula de fluxo. A distância relativa entre a lente objetiva e a célula de fluxo é variável por operação de um acionamento de motor acoplado a um controlador, para separar e coletar uma imagem digitalizada focalizada em uma matriz de fotossensor. Um padrão de foco automático (por exemplo, visível nas imagens digitalizadas) está situado em uma posição fixa em relação à célula de fluxo, sendo que o padrão de foco automático é localizado a uma distância predeterminada do plano da corrente de amostra em formato de fita. Uma fonte de luz ilumina a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático. Ao menos um processador digital está associado ao controlador acoplado para operar o acionamento de motor. O processador também é disposto para analisar a imagem digitalizada. O processador determina uma posição de foco do padrão de foco automático e desloca relativamente a objetiva e a célula de fluxo em relação à distância predeterminada (por exemplo, a "distância de deslocamento") a partir da posição focalizada, para focalizar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica na corrente de amostra em formato de fita.

[000441] Em um outro aspecto, um analisador visual pode compreender um processador para facilitar a análise automatizada das imagens. Em um aspecto, o analisador visual pode ser usado em métodos desta revelação para fornecer contagens de elementos formados de urina à base de imagem. Em determinados aspectos, os métodos desta revelação se referem à identificação automatizada de anormalidades morfológicas para determinar, diagnosticar, prognosticar, predizer e/ou suportar um diagnóstico de se um indivíduo está saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade e/ou infecção e/ou monitorar de um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento.

[000442] Em uma modalidade, o PIOAL é introduzido na célula de fluxo e carrega o fluido de amostra através da área de imageamento, então, em direção à descarga. A corrente de fluido de amostra pode ser injetada através de uma cânula com uma abertura aplanada para estabelecer uma trajetória de fluxo com uma largura considerável. Em algumas modalidades, o fluido de amostra injetado tem sido preparado por meio do tratamento com uma composição de agente de contraste de partículas antes da injeção. Em um outro aspecto dessa invenção, a amostra pode ser injetada na célula de fluxo operando-se uma sequência de válvulas e bombas. Em um aspecto, os fluxos de fluido de amostra e PIOAL são introduzidos na célula de fluxo em taxas de fluxo selecionadas por bombas de fluido de precisão.

[000443] As viscosidades e as taxas de fluxo do fluido de amostra e do PIOAL e o contorno e dimensões da célula de fluxo podem ser selecionados de tal modo que o fluxo de PIOAL aplane e estenda o fluxo de amostra em uma fita plana de maneira consistente através da zona de visualização em um local confiável. Por exemplo, o PIOAL pode fluir ao longo de uma trajetória de fluxo com uma seção transversal simetricamente aplanada, a qual tende a manter uma amostra injetada em posição em um nível constante no fluxo. Em algumas modalidades, o PIOAL tem uma viscosidade relativamente maior que o fluido de amostra, e as taxas de fluxo lineares de amostra e PIOAL relativas no ponto de injeção da amostra são de tal modo que o fluido de amostra aplane em uma corrente de amostra em formato de fita delgada.

[000444] A corrente de amostra em formato de fita delgada é carregada junto com o PIOAL, para passar na frente de uma porta de visualização em que um dispositivo de imageamento de alta resolução e uma fonte de luz (por exemplo, UV, visível, IV) sejam dispostos para visualizar as partículas na corrente de amostra em formato de fita. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a fonte de luz podem ser colocados em lados opostos da célula de fluxo, para obter imagens iluminadas a contraluz das partículas. O dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura imagens de dados de pixel das partículas de amostra através de uma porta de visualização na célula de fluxo. Por exemplo, o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica captura imagens em uma frequência de repetição consistente com a velocidade de fluxo de amostra de tal modo que as seções da corrente de amostra em formato de fita sejam imageadas sem lacunas ou sobreposição substancial.

[000445] As modalidades da presente invenção fornecem uma série de recursos funcionais e estruturais exclusivos implantados no projeto e operação de um sistema para coletar imagens de uma corrente de amostra em formato de fita que flui através de uma célula de fluxo. As modalidades exemplificadoras são configuradas para obter imagens suficientemente focalizadas das partículas, com clareza e resolução suficientes para revelar os diferentes traços das diversas partículas, tais como células sanguíneas, que permitem que os tipos de partícula e/ou célula sejam distinguidos uns dos outros.

[000446] Em um aspecto, a natureza simétrica da célula de fluxo e a maneira de injeção do fluido de amostra e PIOAL fornecem uma posição repetível dentro da célula de fluxo para a corrente de amostra em formato de fita no PIOAL. Entretanto, as posições relativas da célula de fluxo e do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica são submetidas à mudança e exigem ajustes de posição ocasionais para manter a distância ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita, fornecendo, assim, uma imagem de foco de qualidade das partículas.

[000447] As modalidades da presente invenção abrangem sistemas e métodos de analisador visual automatizado para urina e/ou outros fluidos biológicos que incorporam um dispositivo/aparelho de foco automático para fornecer imagens confiavelmente focalizadas da amostra ajustando-se com exatidão a distância entre a corrente de amostra em formato de fita e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em um aspecto, as modalidades do sistema de foco automático reveladas no presente documento podem ajustar com exatidão a distância entre a corrente de amostra em formato de fita e o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e capturar imagens confiavelmente focalizadas da amostra. Em algumas modalidades, algoritmos são usados para estabelecer a distância que alcança bons resultados de foco.

[000448] É um objetivo empregar uma célula de fluxo que fornece uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra em formato de fita envelopada em um fluxo de PIOAL, em combinação com um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e dispositivo/analisador de foco automático que mantém a distância focal ideal entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a corrente de amostra em formato de fita, fornecendo, assim, uma imagem focalizada de qualidade.

[000449] Tal aparelho e métodos são revelados e reivindicados no presente documento. Uma célula de fluxo simétrica é fornecida, a qual mostrou produzir uma distância de corrente de amostra em formato de fita repetível dentro da célula de fluxo. A focalização envolve ajustar uma posição relativa precisamente correta do dispositivo de imagem de alta resolução óptica em relação à corrente de amostra em formato de fita, a fim de manter o foco na corrente de amostra em formato de fita.

[000450] Vantajosamente, a célula de fluxo e/ou o dispositivo de imagem de alta resolução óptica podem ser movidos um em relação ao outro em um processo de focalização automática com o uso de um padrão de foco automático, tal como padrão de alto contraste ou alvo de focalização similar, de preferência, um padrão plano com traços nitidamente contrastantes, tais como bordas, sendo que o padrão de foco automático é fixo em posição em relação à célula de fluxo e usado como um objeto de focalização no lugar da própria amostra. A corrente de amostra em formato de fita é uma fita delgada a uma distância fixa do padrão de foco automático ao longo de uma linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. A distância de deslocamento entre o padrão de foco automático e a posição de corrente de amostra em formato de fita é uma distância constante, a qual é determinada inicialmente e programada no dispositivo/analisador de foco automático. A técnica exemplificadora, consequentemente, é focalizar automaticamente no padrão de foco automático, então, deslocar o dispositivo de imagem de alta resolução óptica e/ou célula de fluxo um em relação ao outro pela distância predeterminada, em que a distância entre o dispositivo de imagem de alta resolução óptica e o local da corrente de amostra em formato de fita é a distância ideal para fornecer uma imagem focalizada de qualidade da corrente de amostra em formato de fita. Por exemplo, primeiramente, um algoritmo de foco automático focaliza a posição do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica no padrão de foco automático localizado a uma distância fixa da corrente de amostra em formato de fita. Tendo focalizado no padrão de foco automático, o processador opera o acionamento de motor sobre o deslocamento predeterminado, colocando, assim, a corrente de amostra em formato de fita em foco do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica.

[000451] Um dispositivo de imagem de alta resolução óptica exemplificador compreende uma lente objetiva e sensor de imagem de pixel associado, capaz de capturar uma imagem que revela as partículas em ampliação e resolução suficiente para fornecer detalhes suficientes para separar traços de imagem (por exemplo, visual) das partículas.

[000452] A trajetória de fluxo de PIOAL pode ser disposta simetricamente de tal modo que quantidades iguais de PIOAL fluem acima e abaixo da corrente de amostra, o qual estende e localiza a corrente de amostra como uma fita delgada a uma distância fixa do padrão de foco automático ao longo da linha paralela ao eixo geométrico óptico do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em uma modalidade, o padrão de foco automático compreende uma margem opaca em torno de uma abertura que admite luz a partir de uma fonte de iluminação traseira e a distância do padrão de foco automático é prontamente e sem ambiguidade concentrada pelos controles de foco automático. Não há necessidade de focalização automática diretamente no conteúdo de imagem da amostra, embora a focalização automática adicional seja concebível.

[000453] Uma configuração de focalização automatizada inclui um acionamento de motor que ajusta a posição relativa da célula de fluxo e um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica ao longo do eixo geométrico óptico, responsivo aos sinais de controle a partir de um processador que avalia uma ou mais medições de qualidade de foco sobre uma faixa de distâncias e procura uma distância ideal. Por exemplo, o processador pode avaliar uma medição de contraste e operar o acionamento de motor para focalização automática. Em operação normal, o processador opera o acionamento de motor para focalizar automaticamente no padrão de foco automático e, então, ajusta a distância entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo pela distância de deslocamento registrada a partir do padrão de foco automático para colocar a corrente de amostra em formato de fita em foco. Contanto que o dispositivo continue a mover a corrente de amostra em formato de fita da mesma forma, e a expansão térmica ou fatores de confusão similares não surjam, a imagem da corrente de amostra em formato de fita permanecerá em foco.

[000454] Um processo de calibração ou configuração preliminar pode ser usado para determinar e registrar a distância de deslocamento entre o padrão de foco automático e a posição da corrente de amostra em formato de fita na célula de fluxo. A distância de deslocamento exata, a qual pode se diferir ligeiramente para células de fluxo diferentes, é estabelecida por teste preliminar, tal como pela focalização automática alternativamente no padrão de foco automático e em uma corrente de amostra de teste várias vezes, e registrando-se o resultado médio como uma constante associada à célula de fluxo.

[000455] Consequentemente, uma amostra a ser imageada, tal como uma amostra de urina preparada, é direcionada ao longo de uma trajetória de fluxo definida através de uma zona de visualização em uma célula de fluxo. A trajetória de fluxo de PIOAL é, de preferência, simétrica e a amostra é injetada no centro do fluxo de PIOAL, com o qual a amostra é envelopada. As taxas de fluxo e características de viscosidade e densidade da amostra e do PIOAL, em conjunto com o contorno da célula de fluxo, cooperam para formar a amostra em uma fita plana que flui de maneira consistente através da zona de visualização em uma posição repetível.

[000456] A amostra pode ser imageada por um componente de câmera do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e imagens digitais coletadas a serem analisadas por processos de análise de imagem ao menos parcialmente automatizados, incluindo um processo de foco automático conforme descrito no presente documento.

[000457] Um objetivo é distinguir, categorizar, subcategorizar e/ou contar partículas em uma amostra de urina, tal como células sanguíneas, descrita no presente documento, o qual pode ser associado às condições particulares. Em um aspecto, as composições de agente de contraste de partículas desta revelação podem ser combinadas com um analisador, tal como o analisador descrito no presente documento em um método para fornecer surpreendentemente imagens de alta qualidade de partículas em fluxo. As imagens de partículas de alta qualidade podem ser automaticamente capturadas e processadas.

[000458] As imagens permitem a contagem de elementos formados de urina à base de imagem automatizada, assim como a identificação automatizada de anormalidades morfológicas úteis na determinação, diagnóstico, prognóstico, predição e/ou suporte de um diagnóstico de se um indivíduo é saudável ou tem uma doença, condição, anormalidade e/ou infecção e/ou monitoramento de se um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento. A contagem de categoria e/ou subcategoria de célula em amostras de urina é usada nesta revelação como exemplos não limitadores da classe de fluidos que pode ser analisada.

[000459] É um objetivo empregar uma célula de fluxo em combinação com as composições de agente de contraste exemplificadoras descritas no presente documento, e um PIOAL exemplificador, que fornece imagens de qualidade ideal e detalhes para o reconhecimento de partícula. Além disso, o PIOAL e o aparelho fornecem uma posição estável e altamente repetível para uma corrente de amostra em formato de fita envelopada em um fluxo de PIOAL. Isso, em combinação com um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e o dispositivo/aparelho de foco automático que mantém a distância ideal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica para a corrente de amostra em formato de fita, fornece uma imagem focalizada de qualidade.

[000460] Em comparação, outros analisadores, por exemplo, discriminadores à base de imagem, tais como analisadores visuais, têm capacidade para discriminar entre células e/ou partículas exemplificadoras de categorias e subcategorias diferentes, com base na aparência das células ou células agregadas e/ou partículas ou partículas agregadas. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas ao componente nuclear ou núcleo celular da célula. Em uma modalidade, as imagens das partículas tratadas com as composições de agente de contraste de partículas desta revelação fornecem informações relacionadas aos traços e/ou composição granular da célula. Em uma modalidade, as imagens fornecem informações relacionadas aos componentes citoplasmáticos nucleares e componentes granulares da célula. Os traços granulares, citoplasmáticos e/ou nucleares são imageados com base em distinções (por exemplo, visuais) que podem ser, ao menos em parte, determinantes da categorização e subcategorização celular tanto de maneira independente como em combinação uma com a outra.

[000461] Mediante a seleção das composições de agente de contraste de partículas desta revelação para fornecer contraste ideal para o reconhecimento de partícula por software em um dispositivo automatizado, as composições desta revelação são úteis em métodos de categorização e subcategorização de partícula, tal como categorização e subcategorização de partículas de sedimento urinário.

[000462] Em um aspecto dos métodos dessa invenção, as células que são colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e imageadas podem ser glóbulos brancos. Em um outro aspecto, os métodos dessa invenção podem compreender, adicionalmente, categorização e subcategorização de glóbulo branco.

[000463] Em um outro aspecto dos métodos dessa invenção, as células colocadas em contato com uma composição de agente de contraste de partículas e imageadas são partículas anormais, tais como células infectadas por malária, células de câncer, bactérias ou parasitas.

[000464] Os fluidos envoltórios convencionais usados em sistemas de imageamento de partícula substancialmente não alinham as partículas ou aumentam o conteúdo de partícula em foco. Existe uma necessidade por métodos e composições úteis para o líquido de alinhamento de organela intracelular e/ou partícula (PIOAL) para realizar categorização e subcategorização de partícula automatizada. Também fornecidos em alguns aspectos desta revelação, os PIOALs são usados nas células de fluxo dos sistemas desta revelação.

[000465] A presente revelação apresenta composições inovadoras e métodos de uso das mesmas para conduzir a análise de partículas. Em particular, a presente revelação se refere a um PIOAL usado em um analisador para analisar partículas em uma amostra. A presente revelação fornece adicionalmente métodos para produzir o PIOAL e métodos para usar o PIOAL para analisar partículas. O PIOAL dessa invenção é útil, por exemplo, em métodos para categorização e subcategorização automatizada de partículas em uma amostra.

[000466] Um aspecto da invenção desta revelação tem por base a observação inesperada que a inclusão de ao menos um agente de viscosidade e/ou agente de modificação de viscosidade no PIOAL aperfeiçoa significativamente o alinhamento de partículas, células e os conteúdos em foco de estruturas intrapartícula, tais como estruturas intracelulares de células que fluem através de uma célula de fluxo. O PIOAL aperfeiçoa o alinhamento das células em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, maximizando uma projeção de imagem de partículas não esféricas no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica, o qual resulta na otimização de imagem e um aumento no número de partículas em foco. Isso também resulta no posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas intrapartícula, tais como estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares, substancialmente paralelas à direção de fluxo. Consequentemente, em alguns aspectos, as composições e métodos dessa invenção resultam em conteúdo de célula em foco aumentado, tal como lóbulos, citoplasma e/ou grânulos em foco. As composições e métodos dessa invenção fornecem adicionalmente a categorização e/ou subcategorização e contagem mais precisa de partículas e permitem contagens de partícula diferencial.

[000467] Essa invenção se refere a um PIOAL adequado para o uso em um analisador. Em um aspecto, a presente revelação fornece um PIOAL para o uso em um analisador configurado para direcionar o fluxo de uma amostra de urina de uma determinada viscosidade em uma trajetória de fluxo, em que o PIOAL compreende: um fluido que tem uma viscosidade diferente da viscosidade da amostra, em que o PIOAL é eficaz para sustentar o fluxo da amostra e para alinhar partículas e/ou para aperfeiçoar o alinhamento e um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo e para aumentar o conteúdo em foco de partículas e células que fluem na trajetória de fluxo, de modo que as partículas e organelas intracelulares de células alinhadas possam ser imageadas. Em uma modalidade, o PIOAL compreende, adicionalmente, ao menos um dentre: um tampão; um agente de ajuste de pH; um agenteantimicrobiano; um modificador de força iônica; um tensoativo, e um agente quelante. Em algumas modalidades, o PIOAL pode conter componentes compatíveis adicionais.

[000468] Em um aspecto, o agente/modificador de viscosidade está presente no PIOAL em uma concentração suficiente para alcançar de maneira eficaz um valor absoluto de uma diferença entre a viscosidade do PIOAL e a viscosidade da amostra entre cerca de 0,1 a cerca de 10 centipoise (cP), cerca de 1,0 a cerca de 9,0 centipoise, 3,0 a 7,0 centipoise, ou cerca de 5,0 centipoise sob condições de operação. Em um aspecto, o PIOAL pode ser usado com uma amostra com uma viscosidade menor. Em um outro aspecto, o PIOAL pode ser usado com uma amostra que tem uma viscosidade maior. Em um aspecto, o PIOAL compreende até 100% de agente de viscosidade.

[000469] Em um outro aspecto, o PIOAL dessa invenção compreende, adicionalmente, um agente de ajuste de pH. Em uma modalidade, o pH do PIOAL é entre cerca de 6,0 a cerca de 8,0 sob condições de operação antes de sua introdução na amostra. Em uma modalidade, o pH do PIOAL é entre cerca de 6,5 a cerca de 7,5 sob condições de operação. Em uma modalidade, o pH é entre cerca de 6,8 a cerca de 7,2 sob condições de operação.

[000470] Em um aspecto, o PIOAL dessa invenção pode compreender, adicionalmente, um ou mais agentes antimicrobianos. Em alguns aspectos, o agente antimicrobiano pode ser, por exemplo, uma substância que tem atividade fungicida (agentes fungicidas) e/ou substâncias que têm atividade bactericida (agentes bactericidas).

[000471] Em certas modalidades, o PIOAL pode conter componentes compatíveis adicionais, tais como HCl de procaína.

[000472] Em certas modalidades, o PIOAL pode compreender, adicionalmente, marcadores inertes detectáveis adequados para identificação por lote ou batelada. Em um aspecto, a revelação fornece um PIOAL para o uso em um analisador visual/analisador configurado para direcionar o fluxo de uma amostra de uma determinada viscosidade em uma trajetória de fluxo, em que o líquido compreende um fluido que tem uma viscosidade diferente da viscosidade da amostra, por exemplo, um PIOAL tem viscosidade maior que a amostra, em que o PIOAL é eficaz para alinhar e aumentar o conteúdo em foco de partículas e organelas intracelulares de células que fluem na trajetória de fluxo e para permitir o imageamento de alta qualidade de partículas e células em fluxo.

[000473] Em outra modalidade, o PIOAL desta revelação compreende um modificador de força iônica para ajustar a força iônica. Os modificadores de força iônica exemplificadores podem incluir Li+, Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, Br-, HCO3-, sulfatos, pirossulfatos, fosfatos, pirofosfatos, citratos, cacodilatos ou outros sais adequados. Em uma modalidade, o PIOAL pode ser isotônico. Em uma modalidade, o PIOAL é isotônico e/ou compreende uma solução aquosa que é isotônica. Em uma modalidade, o PIOAL compreende cloreto de sódio. Em uma modalidade, o dito cloreto de sódio está presente a uma concentração de cerca de 0,9%. Em um aspecto, o PIOAL tem a mesma osmolalidade que a urina. Em uma modalidade, o cloreto de sódio no PIOAL dessa invenção pode estar presente em uma concentração entre cerca de 0,1 e cerca de 10% (peso por volume). A concentração de cloreto de sódio no PIOAL pode ser, por exemplo, de cerca de 0,9 grama de cloreto de sódio em 100 mililitros.

[000474] Em um aspecto, o PIOAL tem uma viscosidade alvo entre cerca de 1 a 10 centipoise sob condições e temperaturas de operação. Em uma modalidade, uma solução de estoque de PIOAL concentrado é fornecida, em que a dita solução de estoque concentrada pode ser diluída para alcançar a viscosidade de PIOAL. Em uma modalidade, a concentração da solução de estoque está presente ao menos cerca de 1,1x a ao menos cerca de 100x a concentração do PIOAL sob condições de operação. Para uso na presente invenção, a temperatura de operação pode se situar na faixa a partir de cerca de 10 a 40 °C, incluindo cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 30 °C. Tipicamente, as medições de viscosidade são relatadas à temperatura ambiente, ou a cerca de 25 °C.

[000475] Em um aspecto, a revelação fornece uma solução de estoque de líquido de alinhamento de organela intracelular e partícula concentrado, em que a solução de estoque pode ser diluída para alcançar uma viscosidade entre cerca de 1 a 10 centipoise sob condições de operação.

[000476] O agente de viscosidade é qualquer composto capaz de alinhar as células em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo e/ou para o posicionamento, reposicionamento e/ou melhor posicionamento de estruturas intrapartícula, tais como estruturas, organelas ou lóbulos intracelulares substancialmente paralelos à direção de fluxo. Em uma modalidade, o PIOAL compreende ao menos um agente de viscosidade selecionado a partir de ao menos um dentre glicerol, derivado de glicerol, etileno glicol, propileno glicol (diidroxipropano), polietileno glicol, polivinil pirrolidona (PVP), carboximetilcelulose (CMC), dextrano e polímero solúvel em água. Em uma modalidade, o agente de viscosidade é glicerol. Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende glicerol e polivinil pirrolidona (PVP). Em uma modalidade, o agente de viscosidadecompreende PVP. Em uma modalidade, o agente de viscosidadecompreende propileno glicol (diidroxipropano). Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende polietileno glicol. Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende dextrano solúvel em água. Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende glicerol e carboximetilcelulose (CMC). Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende glicerol e dextrano, por exemplo, sulfato de dextrano. Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende um derivado de glicerol. Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende etileno glicol. Em uma modalidade, o agente de viscosidade compreende propileno glicol (diidroxipropano). O agente de viscosidade pode compreender também lactose, sacarose, sucralose, maltodextrina, dextrose, manitol, sorbitol, celulose, amido de milho maís, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanta, metil celulose, hidróxi propil metil-celulose, um carbóxi metil celulose (CMC), carbóxi metil celulose de sódio (NaCMC), etila celulose (EC), hidróxi propil metil-celulose(HPMC), carbóxi metil celulose de sódio (CMC), polivinil pirrolidona (PVP: povidona), hidróxi propil metil celulose (HPMC) e combinações dos mesmos. Ademais, os agentes adicionais para modificar a viscosidade têm sido descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences; junho de 1990, Mack Publishing Co. Esses agentes podem ser selecionados de acordo com a tonicidade e viscosidade final desejada. Os agentes de modificação de viscosidade podem incluir qualquer agente adequado para fornecer uma viscosidade de cerca de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 a cerca de 10 centipoise em PIOAL, com características ópticas, incluindo claridade óptica, adequada para o uso em um analisador visual.

[000477] Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode estar presente a uma concentração de cerca de 1 a cerca de 50% (em volume) sob condições de operação. Por exemplo, o agente/modificador de viscosidade pode também estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 3 a cerca de 30% (em volume) sob condições de operação. Como um exemplo, Em uma modalidade, o agente/modificador de viscosidade de glicerol pode estar presente no PIOAL a uma concentração final de cerca de 5,0% a cerca de 8,0% (em volume) sob condições de operação. Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade de glicerol pode estar presente a uma concentração final de cerca de 6,5% (em volume) sob condições de operação. Em mais outra modalidade, o agente/modificador de viscosidade de glicerol é glicerol presente a uma concentração de cerca de 5% (em volume) sob condições de operação. Em mais outra modalidade, o agente/modificador de viscosidade de glicerol é glicerol presente a uma concentração de cerca de 30% (em volume) sob condições de operação.

[000478] Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser PVP presente a uma concentração de cerca de 1 a cerca de 50% (em volume) do PIOAL sob condições de operação. Como um exemplo, o agente/modificador de viscosidade PVP pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 1,0 a cerca de 1,6% (em peso por volume). Em uma modalidade, o PVP está presente a uma concentração no PIOAL de cerca de 1,0% (peso por volume).

[000479] Em um outro aspecto, o agente/modificador de viscosidade no PIOAL pode ser uma combinação de glicerol e PVP com glicerol presente a uma concentração de cerca de 1 a cerca de 10% (em volume) do PIOAL com PVP presente a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 2,5% (peso por volume). Como um exemplo, em uma modalidade, o glicerol pode estar presente no PIOAL a uma concentração de cerca de 5% (em volume) em combinação com cerca de 1% (peso por volume) de PVP.

[000480] Em uma modalidade, o PIOAL desta revelação pode ser usado com qualquer analisador desta revelação, por exemplo, um analisador que compreende um analisador visual, e um processador. Em uma modalidade, o analisador visual compreende uma célula de fluxo com uma trajetória de fluxo simétrica e um componente de foco automático. Em uma modalidade, o analisador pode compreender um contador de partícula.

[000481] Em um aspecto, a revelação fornece um método de imageamento de partículas com o uso do PIOAL exemplificador mediante o fornecimento de um analisador visual/analisador para uma amostra que compreende partículas em um líquido. O analisador visual tem uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL, em que a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna, em que a célula de fluxo direciona um fluxo da corrente de amostra em formato de fita envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo. O analisador pode compreender um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica desta revelação.

[000482] Um fluxo laminar é estabelecido, incluindo a corrente de amostra em formato de fita envelopada por ou entre ao menos duas camadas de PIOAL. A corrente de amostra em formato de fita e o PIOAL podem ter diferentes viscosidades. Em uma modalidade, a viscosidade da amostra é menor que a do PIOAL. Em uma outra modalidade, a viscosidade do PIOAL é menor que a da amostra.

[000483] Em uma modalidade, as partículas analisadas compreendem ao menos uma dentre uma partícula esférica que pode incluir uma partícula esférica, uma partícula não esférica, ou ambas. Nas respectivas modalidades, as partículas podem compreender eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e fragmentos de célula. Em uma modalidade, as partículas compreendem ao menos uma partícula esférica. Em uma modalidade, as partículas esféricas são glóbulos brancos ou micro-organismos. Em uma modalidade, as partículas compreendem ao menos uma partícula não esférica. Em uma modalidade, uma projeção de imagem de partículas não esféricas sob condições de imageamento é aumentada no plano focal do analisador. Em uma modalidade, as partículas não esféricas são glóbulos vermelhos, células epiteliais, cálculos, nódulos de glóbulos brancos e/ou leveduras de hifas ou de germinação.

[000484] Em um aspecto, a revelação fornece um método para categorizar e/ou subcategorizar de maneira diferencial uma partícula que compreende: a) colocar a partícula em uma amostra em contato com a composição de agente de contraste de partículas; b) iluminar a partícula na amostra preparada com luz em um analisador visual; c) obter uma imagem digitalizada da partícula envelopada no PIOAL; d) analisar a partícula na amostra com base nos traços de imagem (por exemplo, visuais); e e) categorizar e/ou subcategorizar a partícula de acordo com os traços visuais característicos de cada categoria e/ou subcategoria de partículas.

[000485] Em uma modalidade, as informações de imagem incluem o conteúdo em foco de uma partícula/célula, incluindo partículas esféricas. Em uma modalidade, a dita partícula, célula ou porção da mesma pode ser selecionada a partir de ao menos um dentre eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco. Matéria particulada, nódulos de célula ou componentes ou fragmentos celulares. Em uma modalidade, o dito conteúdo em foco de uma partícula compreende ao menos um dentre estrutura nuclear diferencialmente corada, estrutura citosólica diferencialmente corada ou elementos diferencialmente corados.

[000486] Em uma modalidade, ao menos 50% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo, por exemplo, paralelo à direção de fluxo, ou têm projeções de imagem maximizadas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em um outro aspecto, o uso do PIOAL dessa invenção em uma célula de fluxo permite que ao menos 90% das partículas não esféricas sejam alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, ou tenham projeções de imagem maximizadas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em um aspecto dessa invenção, ao menos 92% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, ou têm projeções de imagem maximizadas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em outra modalidade, ao menos 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo e/ou têm projeções de imagem maximizadas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em uma outra modalidade, a porcentagem de partículas não esféricas alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo ou que têm projeções de imagem maximizadas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode se situar em qualquer faixa entre quaisquer duas das porcentagens referidas, por exemplo, ao menos 75 a 85%, 75 a 80%, 75% a 92%, 92% a 95% ou outras faixas.

[000487] Em uma modalidade, as partículas esféricas têm organelas, estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos melhor posicionados, reposicionados e/ou melhor posicionadossubstancialmente paralelos à direção de fluxo, e ao menos 50% das estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos são substancialmente paralelos à direção de fluxo no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em uma modalidade, as partículas esféricas têm ao menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% ou ao menos 92% de estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos que são substancialmente paralelos à direção de fluxo no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica, ou alinhados em um plano substancialmente paralelo, por exemplo, paralelo, à direção de fluxo. Em outra modalidade, a porcentagem de estruturas de partícula esférica substancialmente paralelas à direção de fluxo no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica pode se situar na faixa entre quaisquer duas das porcentagens referidas. Em uma modalidade, ao menos 75% do conteúdo de partículas não esféricas são substancialmente paralelos à direção de fluxo no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em um outro aspecto, o uso do PIOAL dessa invenção em uma célula de fluxo permite que ao menos 90% ou 92% do conteúdo de partículas não esféricas sejam substancialmente paralelos à direção de fluxo no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica.

[000488] Em algumas modalidades dos métodos dessa invenção, as informações de imagem são a imagem dos conteúdos de partícula. Em alguns aspectos, o conteúdo de partícula compreende ao menos um dentre estrutura nuclear diferencialmente corada, estrutura citosólica diferencialmente corada ou elementos diferencialmente corados em uma partícula. Os exemplos de partículas sensíveis à coloração são WBCs e células epiteliais.

[000489] Em um aspecto, os métodos dessa invenção fornecem imagens de qualidade surpreendentemente alta de células em fluxo úteis na obtenção de análise de elementos formados de urina à base de imagem, assim como a identificação automatizada de anormalidades morfológicas úteis na determinação, diagnóstico, prognóstico, predição e/ou suporte de um diagnóstico de se um indivíduo tem uma doença, condição, anormalidade ou infecção e/ou monitoramento de se um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento.

[000490] Em um aspecto, a presente revelação se refere a uma composição de agente de contraste de partículas que pode ser usada para corar as partículas em fluidos biológicos, tais como urina. As composições e métodos dessa invenção podem ser usados, em um aspecto, por exemplo, para acentuar os traços de partícula para a contagem e caracterização de partículas, tais como eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula, e fragmentos de célula, assim como para a contagem diferencial de glóbulo branco e categorização, subcategorização, caracterização e análise de glóbulo branco. Em alguns aspectos nos métodos desta revelação, uma amostra pode ser tratada com uma composição de agente de contraste de partículas em linha no analisador. Em outros aspectos, uma amostra pode ser tratada com uma composição de agente de contraste de partículas antes da introdução ao analisador visual.

[000491] Em um aspecto, a composição de agente de contraste de partículas é usada para acentuar os traços de partícula e/ou células sob condições em que um ou mais tipos de célula permanecem substancialmente intactos. Em outros aspectos, a composição de agente de contraste de partículas é usada para tratar fragmentos de célula ou outras partículas. Em alguns aspectos, as composições de agente de contraste de partículas podem ser usadas para corar e/ou acentuar traços celulares de glóbulos brancos e/ou células epiteliais e/ou bactérias.

[000492] Os aspectos e modalidades da presente invenção têm por base a descoberta surpreendente e inesperada que determinadas composições de agente de contraste de partícula, incluindo, por exemplo, composições de coloração/corante, e/ou combinações das mesmas, têm propriedades e eficácia inesperadas quando usadas para realizar a análise de amostra de urina automatizada à base de imagem. Em um aspecto, essa invenção se refere a uma composição de agente de contraste de partículas que compreende ao menos um dentre cristal violeta, safranina O, eosina Y, novo azul de metileno e/ou verde de metila. A coloração/corantes pode estar presente em uma quantidade eficaz para corar células viáveis e/ou substancialmente intactas e gerar distinções visuais para a categorização e subcategorização à base de imagem. Em certas modalidades, as partículas de interesse podem compreender partículas de célula que compreendem, adicionalmente, membranas celulares. Em certas modalidades, a permeabilidade da membrana celular pode ser alterada ou modulada pelo uso de agentes permeabilizantes e/ou fixadores para aumentar a acessibilidade dos agentes de contraste aos conteúdos intracelulares nessas partículas de célula, acentuando, assim, os traços dos conteúdos de célula quando visualizados ou imageados. Em uma modalidade, o agente permeabilizante compreende um sal de amônio quaternário.

[000493] Em determinados aspectos, diversos componentes da composição de agente de contraste de partículas estão presentes em uma quantidade para permitir de maneira eficaz um procedimento de coloração de partícula de uma etapa e rápido.

[000494] Em alguns aspectos, são fornecidos métodos para purificar agentes de contraste de partículas. A purificação de uma o mais colorações/corantes usados nas composições e métodos dessa invenção reduz o teor de precipitados formados sob o contato com uma amostra, reduzindo, assim, o fundo, e aperfeiçoando os resultados a partir da análise de amostra de urina à base de imagem com uma necessidade reduzida de análise adicional de imagens ou microscopia manualmente preparada.

[000495] Em um aspecto, uma composição de agente de contraste de partículas é usada para colocar em contato partículas que podem ser células ou outras partículas, para gerar distinções visuais para categorizar e subcategorizar partículas, por exemplo, acentuando-se os traços celulares sob condições em que as células permanecem substancialmente intactas. A composição de agente de contraste de partículas exemplificadora pode ser usada nos métodos desta revelação para obter imagens coradas de células vitais e/ou substancialmente intactas com o uso de agentes de contraste em sistema de solvente com base diferente de álcool. Em um outro aspecto, a composição de agente de contraste de partículas pode também incluir um agente permeabilizante de partícula para permeabilizar membranas celulares e/ou paredes celulares. Em alguns aspectos, descobriu-se surpreendentemente que as composições de agente de contraste de partículas dessa invenção, as quais compreendem um agente permeabilizante, têm capacidade para permeabilizar a membrana de células permitindo que o agente de contraste penetre dentro das células, enquanto que as células permanecem substancialmente intactas.

[000496] Em alguns aspectos, as composições de agente de contraste de partículas podem ser usadas para tratar glóbulos brancos, células epiteliais e/ou bactérias. Como um exemplo, em alguns aspectos, as composições de agente de contraste de partículas podem ser usadas para tratar ao menos um dentre glóbulos brancos, células epiteliais, bactérias e/ou para analisar as morfologias das células. Em um outro aspecto, o métodos dessa invenção pode compreender, adicionalmente, categorização e subcategorização de glóbulo branco.

[000497] Em um aspecto dos métodos dessa invenção, as células colocadas em contato com a composição de agente de contraste de partículas e/ou imageadas são, por exemplo, bactérias, parasitas ou tricomonas. Em alguns aspectos dessa invenção, as células são células anormais que podem ser usadas para identificar, prever, diagnosticar, prognosticar e/ou suportar um diagnóstico de uma condição, doença, infecção e/ou síndrome e/ou monitorar se um indivíduo é responsivo ou não responsivo ao tratamento. As composições de agente de contraste exemplificadoras e métodos para seu uso e fabricação são reveladas no pedido de patente copendente número US , cujo conteúdo é aqui incorporado, a título de referência.

[000498] Em um outro aspecto, a revelação fornece um kit. Em um aspecto, o kit compreende uma ou mais unidades de um PIOAL, conforme descrito no presente documento. Em um outro aspecto, essa invenção se refere a um kit que compreende as composições de agente de contraste de partículas dessa invenção ou componentes e/ou concentrados das mesmas que podem ser combinados para formar as composições de agente de contraste de partículas dessa invenção, e qualquer uma das composições descritas no presente documento podem ser incluídas no kit. O kit pode conter, também, instruções sobre o uso da composição de agente de contraste de partículas de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente documento e/ou instruções para o uso de qualquer outro componente do kit. O kit pode compreender também um ou mais tampões e/ou diluentes. O kit e/ou tampão pode compreender, adicionalmente, ao menos um dentre um agente de ajuste de pH; modificador de força iônica, um tensoativo, um agente quelante, açúcar, álcool de açúcar, estabilizantes de proteína e/ou um agente antimicrobiano. Em outras modalidades, o kit pode compreender também uma solução de limpeza ou enxágue. O kit pode compreender também padrões para controles positivos e negativos, calibradores ou controles. Em algumas modalidades, o padrão pode compreender um padrão que contém calibradores e/ou controles. O kit pode compreender também descartáveis, tais como micropipetas, pontas ou tubos descartáveis para transferir os componentes do kit.

[000499] Em um outro aspecto, essa invenção se refere a um kit que compreende o PIOAL dessa invenção e ao menos um agente de contraste de partícula. Em alguns aspectos, o kit pode conter dois agentes de contraste de partículas adicionalmente ao PIOAL. Em uma modalidade, o kit compreende ao menos um agente permeabilizante e ao menos um dentre cristal violeta, novo azul de metileno, eosina Y, safranina O e verde de metila em uma quantidade eficaz para corar células viáveis e/ou substancialmente intactas para categorização e subcategorização.

[000500] O kit pode ser usado nos métodos revelados no presente documento e pode ser útil para a identificação de elementos formados de urina, tais como eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e/ou fragmentos de célula. O kit pode conter também software para a identificação de elementos formados de urina, tais como eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e/ou fragmentos de célula.

[000501] Em um outro aspecto, a revelação fornece um método para realizar a categorização e subcategorização de partícula/célula diferencial com o uso dos kits de reagente exemplificadores.

[000502] Em um aspecto, esse método refere-se a um método para categorizar, subcategorizar e/ou contar partículas com o uso, por exemplo, dos kits de reagente dessa invenção, em que o método compreende: 1) colocar a amostra contendo as partículas em contato com uma composição de agente de contraste de partícula, 2) introduzir a amostra tratada resultante em um analisador visual; 3) iluminar as partículas de amostra tratadas com luz no analisador visual; 4) obter imagens digitalizadas das partículas de amostra tratadas envelopadas em um PIOAL; e 5) categorizar, subcategorizar e contar partículas com base nas informações de imagens. Em uma modalidade, o método compreende coloração em linha automática. Em uma outra modalidade, a amostra pode ser introduzida no analisador visual antes do contato com a composição de agente de contraste de partícula.

[000503] Em um outro aspecto, a revelação fornece um método para produzir a composição líquida de PIOAL descrita no presente documento.

[000504] Em um outro aspecto, a revelação fornece um método para categorizar e/ou subcategorizar de maneira diferencial partículas/célula com o uso de categorização e subcategorização de partícula à base de imagem que compreende: a) colocar uma amostra de partículas em contato com uma composição de agente de contraste de partículas, conforme descrito no presente documento, em uma quantidade eficaz para gerar distinções visuais para categorizar e subcategorizar partículas, por exemplo, acentuando-se traços de conteúdo intracelular de partículas em uma amostra quando apresentada para o imageamento; b) obter imagens das partículas e seus detalhes internos; e c) realizar categorização e subcategorização à base de imagem das partículas com base nas distinções visuais. Em alguns aspectos, o agente de contraste de partículas compreende ao menos um agente permeabilizante, ao menos um fixador, e ao menos um dentre cristal violeta, novo azul de metileno, safranina O, eosina Y, e verde de metila em uma quantidade eficaz para gerar distinções visuais para categorização e subcategorização de partícula. Em uma modalidade, o contato da amostra contendo partículas com a composição de agente de contraste de partículas é realizado em uma temperatura elevada.

[000505] Em alguns aspectos, a categorização, subcategorização e contagem podem compreender a) colocar a amostra contendo as partículas em contato com uma composição de agente de contraste de partícula, b) envelopar a corrente de amostra em formato de fita contendo as partículas tratadas em um PIOAL; c) iluminar as partículas de amostra tratadas com luz em um analisador visual; d) obter imagens digitalizadas das partículas de amostra tratadas envelopadas em um PIOAL ou imagear as partículas com o uso de um analisador visual; e e) categorizar e/ou subcategorizar e contar as partículas com base nas características de imagem, em que as partículas podem ser qualquer uma das partículas reveladas no presente documento. Em alguns aspectos, o PIOAL pode compreender qualquer um dos agentes de viscosidade revelados no presente documento. O analisador pode ser qualquer analisador revelado no presente documento.

[000506] Em um outro aspecto, a revelação fornece uma composição fluida para PIOAL em um analisador configurado para suportar um fluxo de uma amostra que carrega ao menos uma das partículas e/ou células. A composição fluida pode incluir um fluido de amostra contendo partículas, e o fluido de amostra pode ter uma determinada viscosidade. Adicionalmente, a composição fluida pode incluir um PIOAL que está em contiguidade ao fluido de amostra ao longo de uma superfície de interface, sendo que um PIOAL é substancialmente transparente, que tem uma viscosidade maior ou menor que a viscosidade do fluido de amostra, de tal modo que as partículas e as células sejam alinhadas. As partículas podem ser alinhadas ou posicionadas conforme revelado no presente documento.

[000507] Em uma modalidade, o PIOAL e o fluido de amostra têm diferentes velocidades lineares médias em um ponto de contato inicial entre o fluido de amostra e o PIOAL. Em uma modalidade, o fluido de amostra é disposto entre duas camadas do PIOAL, definindo, assim, duas ditas superfícies de interface nas quais o PIOAL fica em contiguidade ao fluido de amostra, sendo que as superfícies de interface são espaçadas por uma distância. Em uma modalidade, a distância de espaçamento das camadas de interface é menor que ou igual à dimensão mais ampla da dita ao menos uma dentre as partículas e células. Em uma modalidade, a distância de espaçamento das camadas de interface se estreita ao longo de uma direção de fluxo de ao menos um dentre o PIOAL e o fluido de amostra. Em uma modalidade, a distância de espaçamento das camadas de interface se estreita em uma zona de transição na direção de fluxo a uma distância que é menor que ou igual à dimensão mais ampla de ao menos uma das partículas. Em uma modalidade, o alinhamento da dimensão mais ampla de ao menos uma das partículas e as posições relativas de organelas intracelulares ou porções das organelas das células em uma direção paralela à direção de fluxo é aumentado na zona de transição. Em uma modalidade, uma diferença na viscosidade do PIOAL para a viscosidade do fluido de amostra é de cerca de 0,1 centipoise a cerca de 10 centipoise. As diferenças em viscosidades possibilitam a geração de forças de cisalhamento favoráveis/adequadas a agirem sobre a corrente de amostra em formato de fita.

[000508] A presente revelação apresenta composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras e métodos de uso das mesmas em um analisador adequado para análise de uma amostra contendo partículas. Em um aspecto geral, as composições exemplificador e métodos de uso das mesmas são úteis quando empregadas em combinação com um analisador automatizado encontrado em laboratórios de pesquisa e/ou médicos. Os analisadores automatizados exemplificadores são instrumentos projetados para medir parâmetros diferentes de partículas e componentes bioquímicos em uma série de amostras biológicas, incluindo, por exemplo, urina, com assistência humana mínima, e uma alta taxa de rendimento. Os analisadores automatizados exemplificadores podem incluir, por exemplo, analisadores de microscopia de urina automatizados e/ou contadores de célula, os quais podem realizar, por exemplo, contagem de elementos formados de urina completa. Em alguns aspectos, os analisadores podem processar amostras individualmente, em lotes ou continuamente.

[000509] Em alguns aspectos, a amostra pode ser tratada com as composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras descritas no presente documento antes da análise de imageamento. Em alguns aspectos, o tratamento com as composições de agente de contraste de partículas exemplificadoras pode também ser realizado em linha no analisador ou antes de fornecer a amostra para o analisador. Em algumas modalidades, a amostra pode ser aquecida durante parte ou todo o processo de coloração de partícula. A amostra pode também ser resfriada após o aquecimento.

[000510] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método para analisar uma amostra de urina, sendo que o método compreende: a) introduzir a amostra em ao menos uma célula de fluxo configurada para direcionar o fluxo da amostra ao longo de uma trajetória de fluxo; b) introduzir na célula de fluxo junto com a amostra, um PIOAL que tem uma viscosidade diferente de uma viscosidade da amostra, em que o PIOAL é eficaz para suportar o fluxo da amostra em uma fita plana; c) imagear a partícula em um analisador que compreende um analisador visual; d) detectar e contar partículas que têm uma ou mais distinções visuais, em que as partículas incluem ao menos um dentre eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e fragmentos de célula.

[000511] Em um outro aspecto, a presente revelação também fornece um método para focalizar um analisador visual para análise de urina que compreende: a) um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica em um padrão de foco automático fixo em relação a uma célula de fluxo, b) o padrão de foco automático que é localizado a uma distância de deslocamento de uma corrente de amostra em formato de fita de urina que é predeterminada, c) o dispositivo de imagem de alta resolução óptica com uma objetiva em um eixo geométrico óptico que cruza a corrente de amostra em formato de fita, d) uma distância relativa entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo que é variável por operação de um acionamento de motor, e) o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica configurado para separar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor; e operar o acionamento de motor sobre a distância de deslocamento para focalizar o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica sobre a corrente de amostra em formato de fita. Em uma modalidade, o método compreende, adicionalmente, formar a corrente de amostra em formato de fita em um formato de fita. Em outra modalidade, o eixo geométrico óptico é substancialmente perpendicular à corrente de amostra em formato de fita. Em outra modalidade, o padrão de foco automático inclui formas com tamanho limitado e a distância de deslocamento é suficiente para que as formas sejam substancialmente invisíveis na imagem digitalizada quando focalizado na corrente de amostra em formato de fita. Em ainda outra modalidade, o método compreende: a) detectar um sinal de reiniciação de foco automático; b) refocalizar no padrão de foco automático; c) operar o acionamento de motor sobre a distância de deslocamento (a distância predeterminada entre o padrão de foco automático e a corrente de amostra em formato de fita); de modo que o dispositivo de imageamento de alta resolução fique focalizado na corrente de amostra em formato de fita. Em uma modalidade, o sinal de reiniciação de foco automático inclui ao menos um dentre uma mudança em temperatura, uma diminuição em qualidade de foco, tempo ou entrada de usuário.

[000512] Em uma modalidade, a trajetória de fluxo interna forma uma corrente de amostra em formato de fita. Em uma modalidade, a fonte da amostra é configurada para fornecer a amostra em uma taxa de fluxo de amostra controlável. Em uma modalidade, a fonte do PIOAL é configurada para fornecer o PIOAL em uma taxa de fluxo de PIOAL controlável. Em uma modalidade, o PIOAL tem uma viscosidade predeterminada. Em uma modalidade, o PIOAL tem uma viscosidade diferente da amostra. Em uma modalidade, a viscosidade do PIOAL, a viscosidade do material de amostra, a velocidade linear do PIOAL e a velocidade linear do material de amostra são coordenados para manter a corrente de amostra em formato de fita na distância de deslocamento a partir do padrão de foco automático. Em uma modalidade, o PIOAL tem uma velocidade linear maior que a corrente de amostra em formato de fita sob o contato inicial com a corrente de amostra em formato de fita. Em uma modalidade, o padrão de foco automático é localizado em uma borda de um campo de visão do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica.

[000513] Em uma modalidade, o ao menos um dito processador digital é adicionalmente configurado para realizar a categorização e subcategorização à base de imagem dos eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e fragmentos de célula. Em uma modalidade, o ao menos um dito processador digital é adicionalmente configurado para: detectar um sinal de reiniciação de foco automático; sendo que o sinal de reiniciação de foco automático é disparado por ao menos um dentre uma mudança em temperatura, uma diminuição em qualidade de foco, tempo ou entrada de usuário. Em uma modalidade, o analisador tem uma trajetória de fluxo interna do analisador se estreita para produzir a espessura de corrente de amostra em formato de fita de 2 a 4 μm. Em uma modalidade, a trajetória de fluxo interna resulta na corrente de amostra em formato de fita de 500 a 3.000 μm de largura. Em uma modalidade, a trajetória de fluxo interna resulta na corrente de amostra em formato de fita de 1.500 a 2.500 μm de largura. Em uma modalidade, o analisador é configurado para que uma velocidade linear das partículas na amostra seja de tal modo que as partículas não sejam substancialmente embaçada na imagem. Em uma modalidade, o analisador é configurado para que uma fonte de luz seja adicionalmente configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático.

[000514] Em um aspecto, a presente revelação fornece um método para imageamento de partículas em urina com o uso de um PIOAL, conforme descrito no presente documento, que compreende: fornecer um analisador visual para uma amostra que compreende partículas suspensas em um líquido; estabelecer um fluxo que tem seções laminares que são de viscosidade maior e menor no analisador, em que o analisador compreende, adicionalmente: uma célula de fluxo acoplada a uma fonte da amostra e a uma fonte de um PIOAL, em que a célula de fluxo define uma trajetória de fluxo interna, em que a célula de fluxo direciona um fluxo da amostra envelopada com o PIOAL através de uma zona de visualização na célula de fluxo; um dispositivo de imageamento de alta resolução óptica com uma objetiva em um eixo geométrico óptico que cruza a corrente de amostra em formato de fita, sendo que uma distância relativa entre o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo é variável por operação de um acionamento de motor, para separar e coletar uma imagem digitalizada em uma matriz de fotossensor; um padrão de foco automático que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, sendo que o padrão de foco automático é localizado a uma distância de deslocamento do plano da corrente de amostra em formato de fita; uma fonte de luz configurada para iluminar a corrente de amostra em formato de fita e o padrão de foco automático; e ao menos um processador digital acoplado para operar o acionamento de motor e para analisar a imagem digitalizada, em que o processador é configurado para determinar uma posição de foco do padrão de foco automático e para deslocar relativamente o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica e a célula de fluxo sobre a distância de deslocamento a partir da posição focalizada, de modo que o dispositivo de imageamento de alta resolução óptica fique focalizado na corrente de amostra em formato de fita. Em uma modalidade, as partículas compreendem ao menos uma partícula esférica. Em uma modalidade, as partículas compreendem ao menos uma partícula não esférica. Em uma modalidade, o método compreende um recurso em que uma projeção de imagem de partículas não esféricas sob condições de imageamento é aumentada no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica. Em uma modalidade, as partículas compreendem ao menos um dentre eritrócitos (RBCs), eritrócitos dismórficos, leucócitos (WBCs), neutrófilos, linfócitos, células fagocíticas, eosinófilos, basófilos, células epiteliais escamosas, células epiteliais transicionais, células decoy, células epiteliais tubulares renais, cálculos, cristais, bactérias, levedura, parasitas, corpos de gordura ovais, gotículas de gordura, espermatozoides, muco, tricomonas, nódulos de célula e fragmentos de célula.

[000515] Em uma modalidade, ao menos 50% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, de modo que a projeção de imagem de partículas não esféricas sob condições de imageamento no plano focal do dispositivo de imageamento de alta resolução óptica (HORID) seja aumentada ou maximizada. Em uma modalidade, ao menos 90% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, de modo que a projeção de imagem de partículas não esféricas sob condições de imageamento no plano focal do HORID seja aumentada ou maximizada. Em uma modalidade, ao menos 92% das partículas não esféricas são alinhadas em um plano substancialmente paralelo à direção de fluxo, de modo que a projeção de imagem de partículas não esféricas sob condições de imageamento no plano focal do HORID seja aumentada ou maximizada.

[000516] Em uma modalidade, ao menos 50% das partículas esféricas são alinhadas, isto é, estruturas intrapartícula das partículas esféricas são posicionadas, reposicionadas e/ou melhor posicionadas substancialmente paralelas à direção de fluxo. Por exemplo, as células esféricas têm ao menos 50% de organelas, estruturas nucleares, estruturas citosólicas ou grânulos no plano focal do analisador. Em uma modalidade, ao menos 90% das estruturas intrapartícula de partículas esféricas, como células, são posicionadas reposicionadas e/ou melhor posicionadas substancialmente paralelas à direção de fluxo. Em uma modalidade, ao menos 92% das estruturas intrapartícula de partículas esféricas, como células, são posicionadas reposicionadas e/ou melhor posicionadas substancialmente paralelas à direção de fluxo.

[000517] Em uma modalidade, a categorização, subcategorização e contagem de partículas têm por base as distinções visuais selecionadas a partir de ao menos um dentre tamanho, formato, simetria e contorno. Em uma modalidade, o imageamento é imageamento digitalizado. Em uma modalidade, o imageamento é realizado por microscopia. Em uma modalidade, o imageamento é realizado manualmente com o uso de microscopia convencional. Em uma modalidade, o imageamento é automatizado. Em uma modalidade, a partícula pode incluir qualquer uma das partículas reveladas no presente documento. Em uma modalidade, o imageamento é realizado com o uso de um analisador em qualquer uma das modalidades reveladas no presente documento.

[000518] Cada dos cálculos ou operações aqui descritos pode ser feito com o uso de um computador ou outro processador que tenha hardware, software e/ou firmware. As várias etapas do método podem ser realizadas por módulos, e os módulos podem compreender qualquer uma dentre uma ampla variedade de hardware e/ou software de processamento de dados digitais e/ou analógicos dispostos para executar as etapas do método aqui descritas. Os módulos compreendem opcionalmente hardware de processamento de dados adaptado para executar uma ou mais dessas etapas tendo código de programação de máquina adequado associado ao mesmo, os módulos de duas ou mais etapas (ou porções de duas ou mais etapas) sendo integrados a uma única placa de processador ou separados em diferentes placas de processador em qualquer uma dentre uma ampla variedade de arquiteturas de processamento integrado e/ou distribuído. Esses métodos e sistemas com frequência usarão um meio tangível incluindo código legível por máquina com instruções para executar as etapas do método descrito acima. Os meios tangíveis adequados podem compreender uma memória (incluindo uma memória volátil e/ou uma memória não volátil), um meio de armazenamento (como uma gravação magnética em um disquete, um disco rígido, uma fita, ou similares; em uma memória óptica, como um CD, um CD-R/W, um CD- ROM, um DVD ou similares; ou qualquer outro meio de armazenamento digital ou analógico), ou similares.

[000519] Todas as patentes, publicações, artigos científicos, sites da web e outros documentos e materiais referidos ou mencionados no presente documento são indicativos dos níveis de habilidade daqueles elementos versados na técnica a qual a invenção pertence, e cada tal documento e material referido está aqui incorporado, por referência, com a mesma abrangência como se o mesmo tivesse sido aqui incorporado a título de referência, em sua totalidade individualmente ou apresentado no presente documento em sua totalidade. Os requerentes se reservam ao direito de incorporar fisicamente nesse relatório descritivo todo e qualquer material e informação a partir de tais patentes, publicações, artigos científicos, sites da web, informações eletronicamente disponíveis, e outros materiais ou documentos referidos.

[000520] Os métodos e composições específicas descritos no presente documento são representativos de modalidades preferenciais e são exemplificadores e não destinados a limitar o escopo da invenção. Outros objetivos, aspectos e modalidades irão ocorrer para aqueles elementos versados na técnica sob a consideração desse relatório descritivo, e são abrangidos pelo espírito da invenção, conforme definido pelo escopo das reivindicações. Será prontamente evidente para um elemento versado na técnica que substituições e modificações variadas podem ser feitas na invenção revelada no presente documento, sem que se desvie do escopo e espírito da invenção. A invenção ilustrativamente descrita no presente documento pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, ou limitação ou limitações, que não é especificamente revelado no presente documento como essencial. Dessa forma, por exemplo, em cada caso no presente documento, em modalidades ou exemplos da presente invenção, qualquer um dos termos "compreender", "consistir essencialmente em" e "consistir em" pode ser substituído por qualquer um dentre os outros dois termos no relatório descritivo. Além disso, os termos "compreender", "incluir", "conter", etc. devem ser lidos de maneira expansiva e sem limitação. Os métodos e processos ilustrativamente descritos no presente documento podem ser adequadamente praticados em ordens diferentes de etapas, e que os mesmos não são necessariamente restritos às ordens de etapas indicadas no presente documento ou nas reivindicações. Ademais, para uso na presente invenção e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um" e "o" incluem a referência do plural, exceto onde o contexto determina claramente em contrário. Sob nenhuma circunstância a patente pode ser interpretada como limitada aos exemplos, modalidades ou métodos específicos especificamente revelados no presente documento. Sob nenhuma circunstância, a patente pode ser interpretada como limitada por qualquer declaração feita por qualquer examinador ou qualquer outro oficial ou funcionário do escritório de marcas e patentes, exceto onde tal declaração é especificamente e sem qualificação ou reserva expressamente adotada em uma escrita responsiva por requerentes.

[000521] Os termos e expressões que têm sido empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões para excluir qualquer equivalente dos recursos mostrados e descritos ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que diversas modificações são possíveis dentro do escopo da invenção, conforme reivindicado. Dessa forma, será compreendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente revelada por modalidades preferenciais e recursos opcionais, a modificação e variação dos conceitos aqui revelados podem ser utilizadas por aqueles elementos versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas abrangidas pelo escopo dessa invenção, conforme definido pelas reivindicações em anexo.

[000522] A invenção foi descrita de maneira ampla e genérica no presente documento. Cada uma das espécies mais limitadas e agrupamentos subgenéricos que se incluem na revelação genérica também formam parte da invenção. Isso inclui a descrição genérica da invenção com uma ressalva ou limitação negativa que remove qualquer assunto do gênero, independentemente de se o material eliminado estiver ou não especificamente referido no presente documento.

[000523] Outras modalidades são abrangidas pelas reivindicações a seguir. Além disso, onde os recursos ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, os versados na técnica reconhecerão que a invenção também é assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

[000524] Diferentes disposições dos componentes representadas nos desenhos ou descritas acima, assim como os componentes e etapas não mostrados ou descritos, são possíveis. De modo similar, alguns traços e subcombinações são úteis e podem ser empregados sem referência a outros traços e subcombinações. As modalidades da invenção foram descritas para propósitos ilustrativos e não restritivos, e modalidades alternativas ficarão aparentes aos leitores desta patente. Em certos casos, as etapas do método ou operações podem ser realizadas ou executadas em diferentes ordens, ou as operações poderão ser incluídas, deletadas ou modificadas. Pode ser entendido que, em determinados aspectos da invenção, um único componente pode ser substituído por múltiplos componentes, e múltiplos componentes podem ser substituídos por um único componente, para fornecer um elemento ou estrutura ou para executar uma determinada função ou funções. Exceto onde essa substituição não é operacional para praticar certas modalidades da invenção, essa substituição é considerada dentro do escopo da invenção. Consequentemente, a presente invenção não se limita às modalidades descritas acima ou mostradas nos desenhos, e várias modalidades e modificações podem ser feitas sem que se afaste do escopo das reivindicações abaixo.

Claims

1. Método para o imageamento de partículas com o uso de um sistema de análise de partículas configurado para a hidro- focalização geométrica, as partículas incluídas dentro de uma amostra de fluido corpóreo (25), o método caracterizado pelo fato de que compreende: injetar um fluido envoltório (426) ao longo de uma trajetória de fluxo (422) de uma célula de fluxo (22, 420) do analisador de partículas; injetar a amostra de fluido corpóreo a partir de um tubo de injeção de fluido de amostra (29, 412, 400d) em uma taxa de fluxo no fluido envoltório circulante (426) dentro da célula de fluxo (22, 420), a fim de fornecer uma corrente de amostra (32, 428) que tem uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção (29, 412, 400d), em que a trajetória de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 420) tem uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo (21, 419) de tal modo que a espessura da corrente de amostra (32, 428) diminua a partir da espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um sítio de captura de imagem (432); focalizar um dispositivo de captura de imagem (430) por meio do imageamento de um alvo de imageamento (44, 1344, 1470, 1472c, 1476c) que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo, em que o alvo de imageamento e a corrente de amostra (32, 428) definem uma distância de deslocamento predeterminada (52) ao longo do eixo geométrico de imageamento (1450a); e adquirir uma imagem focalizada de uma primeira pluralidade das partículas a partir da primeira amostra (25) ao longo do eixo geométrico de imageamento (1450a) no sítio de captura de imagem (432) da célula de fluxo (22, 420), adequado para a caracterização e contagem de partículas, dentro da corrente com o dispositivo de captura de imagem (430), em que: o dispositivo de captura de imagem (430) é focalizado na corrente de amostra (32, 428) com o uso da etapa de focalização e da distância de deslocamento predeterminada (52), a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo (21, 419) é definida por uma porção de trajetória de fluxo proximal (21a) que tem uma espessura proximal e uma porção de trajetória de fluxo distal (21b) que tem uma espessura distal menor que a espessura proximal, uma extremidade a jusante (427a) do tubo de injeção de fluido de amostra (29, 412, 400d) é posicionada distal à porção de trajetória de fluxo proximal (21a), o fluido envoltório (426) tem uma primeira velocidade na extremidade a jusante (427a) do tubo de injeção de fluido (29, 412, 400d), a amostra de fluido corpóreo (25) tem uma segunda velocidade na extremidade a jusante (427a) do tubo de injeção de fluido (29, 412, 400d), e a primeira velocidade é maior que a segunda velocidade, e a diferença de velocidade entre o envoltório (426) e as amostras de fluido corpóreo (25), em combinação com a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo e na taxa de fluxo da amostra, é eficaz para liberar células na amostra (25) a partir do tubo de injeção de fluido de amostra (29, 412, 400d) ao sítio de captura de imagem (432) em quatro segundos ou menos, e em que a amostra de fluido corpóreo (25) tem uma viscosidade da amostra e o fluido envoltório (426) tem uma viscosidade do fluido envoltório que é diferente da viscosidade da amostra.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido corpóreo (25) é uma amostra de fluido de urina.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fluido de amostra (25) se move a partir de uma porta de saída (P, 331, 431) do tubo de injeção de fluido de amostra (29, 412, 400d) para o eixo geométrico de imageamento (1450a) no sítio de captura de imagem (432) em cerca de 1,5 segundo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo é definida pelas paredes opostas (412a, 423a) da angulação de trajetória de fluxo (422) radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo (422) geralmente simétrica sobre um plano transversal (451a) que bisecciona a primeira e a segunda espessuras da corrente de fluido de amostra.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula de fluxo (22, 420) é configurada para receber o fluido envoltório (426) a partir de uma fonte de fluido envoltório na trajetória de fluxo (422) em uma primeira direção de fluxo que é perpendicular à segunda direção de fluxo do fluido envoltório ao longo da trajetória de fluxo no sítio de imageamento (432).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o alvo de imageamento (44, 1344, 1470, 1472c, 1476c) é fixo na célula de fluxo (22, 420).

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a corrente de amostra (32, 428) tem uma terceira velocidade de 20 a 200 mm/s no sítio de captura de imagem.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fração da segunda velocidade para a primeira velocidade está na faixa de 0,5 a menos de 1.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreende ainda a produção de uma corrente de amostra em formato de fita (32, 428) com uma largura na faixa de 500 a 3.000 μm.

10. Sistema de análise de partículas que realiza a hidro- focalização geométrica para o imageamento de partículas em uma amostra de fluido corpóreo, o sistema caracterizado pelo fato de que compreende: uma célula de fluxo (22, 420) que tem uma trajetória de fluxo (422) configurada para transmitir um fluxo de fluido envoltório (426); um sistema de injeção de fluido de amostra em comunicação fluida com a trajetória de fluxo (422) e configurado para injetar a amostra no fluido envoltório circulante (426) dentro da célula de fluxo (22, 420), a fim de fornecer uma corrente de fluido de amostra (32, 426) que tem uma primeira espessura adjacente ao tubo de injeção (29, 412, 400d), em que a trajetória de fluxo (422) da célula de fluxo (22, 420) tem uma diminuição em tamanho de trajetória de fluxo (21, 419), de modo que a espessura da corrente de fluido de amostra diminua a partir da espessura inicial para uma segunda espessura adjacente a um sítio de captura de imagem (432); um dispositivo de captura de imagem (430) alinhado ao sítio de captura de imagem (432) a fim de imagear uma pluralidade das partículas a partir do primeiro fluido de amostra (426) no sítio de captura de imagem (432) da célula de fluxo (22, 420); um mecanismo de focalização configurado para ajustar um estado focal do dispositivo de captura de imagem em relação à célula de fluxo; um alvo de imageamento (44, 1344, 1470, 1472c, 1476c) que tem uma posição fixa em relação à célula de fluxo (22, 420), em que o alvo de imageamento (44, 1344, 1470, 1472c, 1476c) e a corrente de amostra (32, 426) definem uma distância de deslocamento (52) ao longo do eixo geométrico de imageamento (1450a); um processador (440); e um módulo de focalização que compreende um meio tangível que incorpora código legível por máquina executado no processador (440) para operar o mecanismo de focalização para ajustar o estado focal do dispositivo de captura de imagem (430), adequado para a caracterização e contagem de partículas, com o uso da distância de deslocamento (52), em que o sistema de injeção de fluido de amostra é configurado para liberar o fluido de amostra (25) de tal modo que o fluido de amostra tenha um tempo de trânsito através da célula de fluxo dentro de uma faixa a partir de cerca de 2 a 4 segundos, e em que o sistema de injeção de fluido de amostra é configurado de modo que o fluido envoltório (426) tenha uma primeira velocidade na extremidade a jusante do tubo de injeção de fluido (9, 412, 400d), a amostra de fluido corpóreo (25) tem uma segunda velocidade na extremidade a jusante (427a) do tubo de injeção de fluido (29, 412, 400d) e a primeira velocidade é maior que a segunda velocidade, e em que a amostra de fluido corpóreo (25) tem uma viscosidade da amostra e o fluido envoltório (426) tem uma viscosidade do fluido envoltório que é diferente da viscosidade da amostra.

11. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido corpóreo (25) é uma amostra de fluido de urina.

12. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a diminuição em tamanho de trajetória de fluxo (21, 419) é definida pelas paredes opostas (412a, 423a) da angulação de trajetória de fluxo (422) radialmente para dentro ao longo da trajetória de fluxo geralmente simétrica sobre um plano transversal (451a) que bisecciona a primeira e segunda espessura da corrente de fluido de amostra.

13. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula de fluxo (22, 420) é configurada para receber o fluido envoltório (426) a partir de uma fonte de fluido envoltório (426) na trajetória de fluxo (422) em uma primeira direção de fluxo que é perpendicular à segunda direção de fluxo do fluido envoltório (426) ao longo da trajetória de fluxo no sítio de imageamento (432).