JP2006039315A - 自動焦点装置及びそれを用いた顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 合焦点位置を短い時間で正確に求めることが可能な自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置を提供する。
【解決手段】 試料Ｓの画像を取得するＣＣＤカメラ３０と、試料Ｓの光像をカメラ３０へと導く導光光学系２０と、カメラ３０及び光学系２０を駆動して試料Ｓでの焦点位置をｚ軸方向について変更する光学系駆動部２５と、焦点制御部５１を含む制御装置５０とを備えて顕微鏡装置１Ａを構成する。また、焦点制御部５１は、焦点位置を一方向に連続的に変更しつつ実行される第１の焦点計測で取得された複数の画像から第１の焦点計測値を算出し、焦点位置を第１の焦点計測とは逆方向に連続的に変更しつつ実行される第２の焦点計測で取得された複数の画像から第２の焦点計測値を算出するとともに、第１、第２の焦点計測値の平均値によって合焦点位置を求める。
【選択図】 図１

Description

本発明は、試料の画像を取得する際の焦点を制御するための自動焦点装置、及び自動焦点装置を用いた顕微鏡装置に関するものである。

顕微鏡を用いて試料の画像を取得する場合、装置内の光学系、機構系の傾き、あるいは試料自体の傾き、凹凸形状などによる焦点ずれが問題となる。これに対して、従来、顕微鏡装置において、ＣＣＤカメラなどの撮像装置による撮像の焦点を自動的に制御する自動焦点（オートフォーカス）が行われている。このような自動焦点を行う装置としては、例えば、特許文献１に記載された装置がある。
特開平５−２８８９８１号公報

上記した文献１には、顕微鏡の対物レンズと、顕微鏡による観察対象となる試料との間での焦点位置を連続的に変更しながら一定の変更間隔毎に試料の画像を取得し、得られた複数の画像から合焦点位置を求める方法が開示されている。しかしながら、このような方法では、顕微鏡の各部を駆動して焦点位置を変更するのにステッピングモータやピエゾアクチュエータなどの機器が用いられるため、焦点位置を連続的に変更していく際にその機器特有の遅れが発生する。したがって、上記した方法での焦点計測によって合焦点位置を求めた場合、焦点位置の変更の遅れに起因する誤差が生じるという問題がある。

一方、このような焦点位置の変更の遅れの影響を解消する方法として、焦点位置を変更していく際に一定の変更間隔毎に機器を停止させ、焦点位置が安定してから試料の画像を取得することを繰り返す方法を用いることができる。しかしながら、この方法では、合焦点位置を求めるのに必要な複数の画像を取得する際に、１回の画像取得毎に焦点位置の安定を待たなければならない。したがって、合焦点位置を求めるのに必要な時間が非常に長くなるという問題がある。

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、合焦点位置を短い時間で正確に求めることが可能な自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置を提供することを目的とする。

このような目的を達成するために、本発明による自動焦点装置は、（１）観察対象となる試料の光像による画像を取得する撮像手段と、（２）試料からの光が入射する対物レンズを含み、試料の光像を撮像手段へと導く導光光学系と、（３）撮像手段及び導光光学系に対する試料における焦点位置を光軸方向について変更する焦点変更手段と、（４）撮像手段及び焦点変更手段を用いて、試料の画像を取得する際の焦点情報を取得する焦点制御手段とを備え、（５）焦点制御手段は、焦点変更手段によって焦点位置を一方向に連続的に変更しつつ実行される第１の焦点計測で取得された複数の試料の画像から第１の焦点計測値を算出し、焦点位置を第１の焦点計測とは逆方向に連続的に変更しつつ実行される第２の焦点計測で取得された複数の試料の画像から第２の焦点計測値を算出するとともに、第１の焦点計測値及び第２の焦点計測値に基づいて試料における合焦点位置を求めることを特徴とする。

上記した自動焦点装置においては、一定の変更間隔毎に焦点位置の変更を停止するのではなく、焦点位置を連続的に変更しつつ複数の試料の画像を取得する焦点計測方法を用いて合焦点位置を求めている。これにより、試料の観察位置に対する焦点情報を短い時間で取得することが可能となる。さらに、合焦点位置を求めるための焦点計測について、焦点位置の変更方向を変えて２回の焦点計測を行い、そのそれぞれで算出された焦点計測値を参照して合焦点位置を求めている。このとき、２回の焦点計測では、焦点位置の変更の遅れの影響が逆になる。したがって、２回の焦点計測においてそれぞれ複数の画像から算出される焦点計測値を用いることにより、最終的な合焦点位置を正確に求めることが可能となる。

ここで、焦点制御手段は、第１の焦点計測値及び第２の焦点計測値の平均値によって合焦点位置を求めることが好ましい。この場合、焦点位置の変更の遅れの影響が打ち消された状態の合焦点位置を確実に求めることができる。あるいは、合焦点位置を求める方法については、具体的な焦点計測方法に応じて他の方法を用いても良い。

また、焦点制御手段は、第１の焦点計測及び第２の焦点計測において、複数の試料の画像の取得を、被写界深度以下に設定された焦点位置の変更間隔毎に行うことが好ましい。この場合、試料の観察位置に対する合焦点位置を充分に高い精度で求めることができる。

また、自動焦点装置は、撮像手段及び導光光学系に対する試料における観察位置を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段を備え、焦点制御手段は、試料の観察対象領域を複数の焦点計測領域に区分し、複数の焦点計測領域のそれぞれについて求められた合焦点位置によって観察対象領域に対する合焦点位置のマッピングを行うこととしても良い。

あるいは、自動焦点装置は、撮像手段及び導光光学系に対する試料における観察位置を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段を備え、焦点制御手段は、試料の観察対象領域内で３点以上の焦点計測位置を設定し、３点以上の焦点計測位置のそれぞれについて求められた合焦点位置を用いて観察対象領域内での各観察位置に対する合焦点位置を求めることとしても良い。

これらの構成によれば、観察対象の試料に対して複数の観察位置で画像の取得を行う場合に、複数の観察位置を含む観察対象領域に対する合焦点位置などの焦点情報を効率的に取得することができる。

本発明による顕微鏡装置は、上記した自動焦点装置と、試料の観察位置に対して焦点制御手段によって求められた合焦点位置を含む焦点情報に基づいて、試料の画像の取得を制御する画像取得制御手段とを備えることを特徴とする。

上記した顕微鏡装置においては、焦点位置の変更方向を変えて２回の焦点計測を行い、そのそれぞれで算出された焦点計測値を参照して試料の観察位置に対する合焦点位置を求める上記した自動焦点装置を用いて顕微鏡装置を構成している。これにより、試料の画像を取得する際の合焦点位置を短い時間で正確に求めて、高い精度で効率良く試料の観察を実行することが可能となる。

本発明の自動焦点装置及びそれを用いた顕微鏡装置によれば、合焦点位置を求めるための焦点計測について、焦点位置を連続的に変更しつつ複数の試料の画像を取得するとともに、焦点位置の変更方向を変えて２回の焦点計測を行い、そのそれぞれで算出された焦点計測値を参照して合焦点位置を求めることにより、試料の観察位置に対する合焦点位置を短い時間で正確に求めることが可能となる。

以下、図面とともに本発明による自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明による自動焦点装置を用いた顕微鏡装置の一実施形態の構成を示すブロック図である。この顕微鏡装置１Ａは、試料Ｓの画像の取得に用いられるものである。ここで、顕微鏡装置１Ａでの光軸方向となる垂直方向をｚ軸方向、光軸に垂直な方向である水平方向をｘ軸方向、ｙ軸方向とする。また、本顕微鏡装置１Ａによる観察対象となる試料Ｓは、例えば生体サンプルであり、試料ステージ１０上に載置されている。

試料ステージ１０は、ｘ方向及びｙ方向（水平方向）に可動なＸＹステージからなり、このＸＹステージ１０をｘｙ面内で駆動することにより、試料Ｓに対する顕微鏡装置１Ａでの観察位置が設定または変更される。また、試料ステージ１０は、ＸＹステージ駆動部１５によって駆動制御されている。この構成において、ＸＹステージ駆動部１５は、顕微鏡装置１Ａに対する試料Ｓにおける観察位置を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段として機能する。

試料ステージ１０上の試料Ｓに対し、ステージ１０の上方に、試料Ｓの光像を導光するための導光光学系２０が設けられている。この導光光学系２０は、試料Ｓからの光が入射する対物レンズ２１、及び試料Ｓの光像の導光、集束に必要な光学要素を含んで構成されている。また、試料Ｓの光像が導光光学系２０によって導かれる光路上の所定位置には、撮像装置であるＣＣＤカメラ３０が設置されている。このＣＣＤカメラ３０は、試料Ｓの光像による画像を取得する撮像手段である。これらの導光光学系２０、及びＣＣＤカメラ３０は、その光軸及び光学系２０−カメラ３０間の距離等が調整された状態で、一体に固定されている。

また、導光光学系２０及びＣＣＤカメラ３０に対して、光学系駆動部２５が設置されている。光学系駆動部２５は、例えばステッピングモータやピエゾアクチュエータなどを用いて構成され、光学系２０及び光学系２０に対して固定されたカメラ３０を光軸方向であるｚ軸方向に移動させる。この構成において、光学系駆動部２５は、ＣＣＤカメラ３０及び導光光学系２０に対する試料Ｓにおける焦点位置を光軸方向について変更する焦点変更手段として機能する。この光学系駆動部２５は、試料Ｓの画像取得における焦点の制御に用いられる。

これらの試料ステージ１０、導光光学系２０、及びＣＣＤカメラ３０に対し、焦点制御部５１及び画像取得制御部５２を有する制御装置５０が設置されている。焦点制御部５１は、ＣＣＤカメラ３０、及び光学系駆動部２５を用いて、試料Ｓの画像取得における合焦点位置を含む焦点情報を取得する。

図１に示す顕微鏡装置１Ａでは、上記した試料ステージ１０、導光光学系２０、撮像手段であるＣＣＤカメラ３０、観察位置変更手段であるステージ駆動部１５、及び焦点変更手段である光学系駆動部２５と、制御装置５０の焦点制御部５１とによって、試料Ｓの画像を取得する際に用いられる焦点情報を取得するための自動焦点装置が構成されている。また、焦点制御部５１で取得された焦点情報は、焦点情報記憶部５５に記憶される。

画像取得制御部５２は、ＣＣＤカメラ３０を用いて実際に試料Ｓの画像の取得を実行する場合に、試料Ｓの観察位置に対して焦点制御部５１によって求められた合焦点位置を含む焦点情報に基づいて、試料Ｓの画像の取得を制御する。図１に示した構成においては、画像取得制御部５２は、焦点情報記憶部５５から読み出した合焦点位置を含む焦点情報を参照し、ＣＣＤカメラ３０による試料Ｓの画像取得動作、光学系駆動部２５による焦点変更動作、及びステージ駆動部１５による観察位置変更動作を制御して、所望の観察条件で試料Ｓの観察及び画像の取得を実行する。

焦点制御部５１及び画像取得制御部５２を有する制御装置５０は、例えば、ＣＰＵ及び必要なメモリ、ハードデイスクなどの記憶装置を含むコンピュータによって構成される。また、この制御装置５０に対して、入力装置５８及び表示装置５９が接続されている。入力装置５８は、例えばコンピュータに接続されたキーボードやマウス等から構成され、本顕微鏡装置１Ａにおける焦点制御部５１による焦点情報取得動作、あるいは画像取得制御部５２による画像取得動作の実行に必要な情報、指示の入力等に用いられる。また、表示装置５９は、例えばコンピュータに接続されたＣＲＴディスプレイや液晶ディスプレイ等から構成され、本顕微鏡装置１Ａにおける焦点情報取得及び画像取得に関する必要な情報の表示等に用いられる。

次に、図１に示した自動焦点装置及び顕微鏡装置１Ａにおける焦点情報の取得方法について説明する。

本実施形態の顕微鏡装置１Ａにおいては、試料Ｓの画像取得における合焦点位置を含む焦点情報の取得は、上記したように制御装置５０の焦点制御部５１によって行われる。焦点制御部５１は、撮像手段であるＣＣＤカメラ３０、焦点変更手段である光学系駆動部２５、あるいはさらに必要に応じて観察位置変更手段であるステージ駆動部１５を用いて、試料Ｓの画像取得のための焦点情報取得を実行する。

焦点制御部５１は、光学系駆動部２５によってＣＣＤカメラ３０及び導光光学系２０を光軸方向であるｚ軸方向に駆動し、試料Ｓにおける焦点位置をｚ軸方向に沿って一方向に連続的に変更する。そして、この焦点位置の連続的な変更の間に、所定の変更間隔毎に試料Ｓの画像を取得する焦点計測を行うとともに、得られた複数の画像に対して解析を行って、ＣＣＤカメラ３０及び導光光学系２０による画像取得の焦点が合う合焦点位置を示す焦点計測値を算出する。

焦点計測を実行する焦点位置の変更範囲については、合焦点位置が変更範囲内に含まれるように適宜設定される。また、設定された焦点位置の変更範囲にわたってＣＣＤカメラ３０によって取得された複数の画像を用いた焦点計測値の算出については、例えば、複数の画像の間でのコントラストの高低、明るさの高低などの画像特性の変化を評価し、その評価結果に基づいて最も画像取得の焦点が合っている位置を焦点計測値として算出する方法が用いられる。

図２は、一方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである。このグラフにおいて、横軸は試料Ｓにおける焦点位置ｚを連続的に変更しつつ実行される焦点計測での計測時間ｔを示し、縦軸は焦点位置ｚを示している。また、図２中において、グラフＡ１は焦点制御部５１が光学系駆動部２５に対して指示する焦点位置を示し、グラフＡ２は光学系駆動部２５によって設定される実際の焦点位置を示している。

このグラフからわかるように、ステッピングモータやピエゾアクチュエータなどの機器を用いた光学系駆動部２５によって焦点位置を連続的に変更すると、グラフＡ２に示す実際の焦点位置の変化では、グラフＡ１に示す指示された焦点位置の変化からみて矢印Ａ６で示した変更の遅れが発生する。したがって、上記した焦点計測で取得された複数の画像から焦点計測値を算出した場合、算出された焦点計測値において、焦点位置の変更の遅れに起因する誤差が生じる。

図１に示した自動焦点装置及び顕微鏡装置１Ａにおいては、このような焦点計測値の誤差を低減するため、双方向の焦点計測を実行して合焦点位置を求める。図３は、双方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである。図３中において、グラフＢ１は焦点制御部５１が光学系駆動部２５に対して指示する焦点位置を示し、グラフＢ２は光学系駆動部２５によって設定される実際の焦点位置を示している。

具体的には、焦点制御部５１は、試料Ｓにおける焦点位置をｚ軸方向に沿って一方向に連続的に変更しつつ第１の焦点計測を実行する。そして、その間に所定の変更間隔毎に取得された試料Ｓの画像から第１の焦点計測値を算出する。このとき、得られる第１の焦点計測値は、図３中に矢印Ｂ６で示したように、焦点位置の変更の遅れに起因した誤差を有している。

焦点制御部５１は、さらに、試料Ｓにおける焦点位置をｚ軸方向に沿って第１の焦点計測とは逆方向に連続的に変更しつつ第２の焦点計測を実行する。そして、その間に所定の変更間隔毎に取得された試料Ｓの画像から第２の焦点計測値を算出する。このとき、得られる第２の焦点計測値は、図３中に矢印Ｂ７で示したように、焦点位置の変更の遅れに起因した第１の焦点計測値とは逆方向の誤差を有している。焦点制御部５１では、図３中に破線Ｂ０によって示すように、これらの第１の焦点計測値及び第２の焦点計測値の平均値によって試料Ｓにおける合焦点位置を求める。

上記実施形態による自動焦点装置及び顕微鏡装置の効果について説明する。

図１に示した自動焦点装置においては、一定の変更間隔毎に試料Ｓにおける焦点位置の変更を停止するのではなく、光学系駆動部２５によって焦点位置を連続的に変更しつつＣＣＤカメラ３０によって複数の試料Ｓの画像を取得する焦点計測方法を用いて合焦点位置を求めている。これにより、試料Ｓの観察位置に対する焦点情報を短い時間で取得することが可能となる。

さらに、上記したように焦点位置を連続的に変更しつつ実行される焦点計測について、光軸方向についての焦点位置の変更方向を変えて２回の焦点計測を行い、そのそれぞれで算出された焦点計測値を参照して合焦点位置を求めている。このとき、２回の焦点計測では、図３中に矢印Ｂ６、Ｂ７で示したように、焦点位置の変更の遅れの影響による焦点計測値の誤差が逆方向となる。したがって、第１、第２の焦点計測のそれぞれで複数の画像から算出された第１、第２の焦点計測値を用いることにより、最終的な合焦点位置を正確に求めることが可能となる。また、このような自動焦点装置を用いた顕微鏡装置１Ａによれば、試料Ｓの画像を取得する際の合焦点位置を短い時間で正確に求めて、高い精度で効率良く試料Ｓの観察を実行することが可能となる。

自動焦点装置及び顕微鏡装置１Ａの効果について詳述する。光学系駆動部２５にピエゾ素子等を用いた場合、それによる焦点位置の変更動作の遅れは大きいものでは数１０ｍｓ〜１００ｍｓ（ミリ秒）程度になる。これに対してＣＣＤカメラ３０での画像を取り込むフレームレートを３０Ｈｚとし、連続的に焦点位置を変更しながら試料Ｓの画像の取得を行うと、変更動作の遅れが１００ｍｓの場合、焦点制御部５１によって指示された焦点位置と、光学系駆動部２５によって設定された実際の焦点位置とは、画像数でいえば３画像分ずれていることとなる。このような画像のずれは、フレームレートが高い撮像装置を用いればさらに大きくなる。上記した装置構成及び焦点情報の取得方法によれば、双方向で焦点計測を行うことにより、このような画像のずれの影響が解消される。

また、このような焦点情報の取得方法を用いることにより、焦点情報の取得を高速に行うことができる。例えば、一定の変更間隔毎に試料Ｓにおける焦点位置の変更を停止して焦点計測を行うことを考える。この場合、変更動作の遅れを１００ｍｓ、変更された焦点位置が安定するまでの時間を遅れの３倍の３００ｍｓ、画像取得のフレームレートを３０Ｈｚ（画像取得時間１／３０ｓ）、焦点計測に用いられる画像の取得枚数を３０枚とすると、焦点計測に要する時間は（画像取得時間＋焦点位置の安定時間）×画像の取得枚数＝（１／３０＋０．３）×３０＝１０秒となる。

一方、焦点位置を連続的に変更しつつ双方向で焦点計測を行う上記方法では、同様に画像取得のフレームレートを３０Ｈｚ、焦点計測に用いられる画像の取得枚数を一方向について３０枚とすると、双方向での焦点計測に要する時間は２秒となる。このように、上記構成の自動焦点装置及び顕微鏡装置によれば、焦点情報の取得に要する時間を大幅に短縮することが可能である。

なお、焦点計測における焦点位置の変更の遅れ、及びその影響による焦点計測値の誤差は、焦点位置の変更速度によって大きさが変化する。図４は、焦点計測における焦点位置の変更の遅れについて示すグラフである。図４中において、グラフＣ１は所定の変更速度となるように焦点制御部５１が指示する焦点位置を示し、グラフＣ２は光学系駆動部２５によって設定される実際の焦点位置を示している。また、グラフＤ１はグラフＣ１での変更速度よりも遅い変更速度となるように焦点制御部５１が指示する焦点位置を示し、グラフＤ２は光学系駆動部２５によって設定される実際の焦点位置を示している。

このグラフからわかるように、変更速度を遅く設定した場合のグラフＤ１、Ｄ２での焦点位置の変更の遅れは、変更速度を速く設定した場合のグラフＣ１、Ｃ２での変更の遅れよりも小さくなる。すなわち、焦点計測における焦点位置の変更の遅れ、及び焦点計測値に生じる誤差は、焦点位置の変更速度などの焦点計測の具体的な条件によって異なるものとなる。また、このような誤差の違いは、例えば光学系駆動部２５に用いられる機器の種類、個々の特性、あるいは装置特性の経時変化等によっても発生する。これに対して、上記した焦点情報の取得方法では、２回の焦点計測を実行して焦点位置の変更の遅れの影響を打ち消す方法を用いているため、そのような誤差の不確定性にかかわらず、確実に合焦点位置を求めることが可能である。

ここで、２回の焦点計測については、焦点位置の変更方向以外の条件、例えば焦点位置の変更範囲、変更間隔等については、同一の条件として焦点計測を実行することが好ましい。あるいは、焦点位置の変更方向以外の条件も異なる条件に設定しても良い。また、第１の焦点計測及び第２の焦点計測における試料Ｓでの焦点位置の変更間隔については、被写界深度以下に設定された焦点位置の変更間隔毎に試料Ｓの画像の取得を行って、焦点計測値の算出に用いられる複数の画像を取得することが好ましい。

このように焦点位置の変更間隔を設定して焦点計測を行うことにより、試料Ｓの観察位置に対する合焦点位置を充分に高い精度で求めることができる。なお、顕微鏡装置１Ａにおける被写界深度は、導光光学系２０において用いられる対物レンズ２１の開口数ＮＡによって異なるが、例えば、ＮＡ＝０．４の場合で１．５μｍ程度、ＮＡ＝０．７で０．５μｍ程度である。また、具体的な焦点位置の変更間隔の設定については、例えば被写界深度の半分の分解能で変更間隔を設定する方法を用いることができる。あるいは、必要とされる焦点位置の精度等に応じて、焦点位置の変更間隔を被写界深度よりも大きく設定しても良い。

また、第１の焦点計測値及び第２の焦点計測値を用いた合焦点位置の導出については、上記したように、第１、第２の焦点計測値の平均値によって合焦点位置を求めることが好ましい。焦点位置の変更方向が逆の第１、第２の焦点計測では、通常、焦点位置の変更の遅れは方向が逆、大きさは略等しくなる。したがって、上記のように第１、第２の焦点計測値の平均値を合焦点位置とすることで、焦点位置の変更の遅れの影響が打ち消された状態の合焦点位置を容易かつ確実に求めることができる。また、このような合焦点位置の導出方法については、具体的な焦点計測方法や、焦点位置の変更に用いる機器の特性等に応じて、平均値を合焦点位置とする方法以外の方法を用いても良い。

また、試料Ｓの画像を取得する撮像手段については、図１に示した構成では焦点制御部５１による焦点情報の取得、及び画像取得制御部５２による試料Ｓの画像の取得に同一のＣＣＤカメラ３０を用いているが、それぞれ別の撮像装置を用いる構成としても良い。この場合には、導光光学系２０において焦点制御用光路及び画像取得用光路の２つの光路を設定し、それぞれの光路上に焦点制御用の撮像装置及び画像取得用の撮像装置を設置する構成を用いることができる。あるいは、単一の光路上において焦点制御用の撮像装置及び画像取得用の撮像装置を切換えて設置する構成としても良い。

一般には、焦点制御用の撮像装置としては、試料Ｓの２次元の画像を取得可能なＣＣＤカメラなどのイメージセンサを用いることが好ましい。また、画像取得用の撮像装置としては、試料Ｓの１次元の画像を取得可能なリニアセンサ、または２次元の画像を取得可能なイメージセンサを用いることができる。例えば、試料Ｓに対してある程度の範囲の観察対象領域をスキャンしつつ画像を取得するような場合には、画像取得用の撮像装置としてはリニアセンサ（ラインセンサ）、またはＴＤＩ動作が可能な２次元のイメージセンサなどを用いることが好ましい。また、図１に示した構成では、ＣＣＤカメラ３０として、通常の２次元画像の取得動作と、ＴＤＩラインセンサ動作との両方の動作が可能なＣＣＤカメラを用いても良い。

図１に示した自動焦点装置及び顕微鏡装置１Ａにおける焦点情報の取得方法についてさらに説明する。

図１の顕微鏡装置１Ａでは、試料ステージ１０としてｘｙ面内で可動なＸＹステージを用いるとともに、このステージ１０に対してＸＹステージ駆動部１５を設けている。このような試料ステージ１０及びＸＹステージ駆動部１５を用いれば、試料Ｓに対する観察位置をｘｙ面内で調整することができる。あるいは、試料Ｓに対して、ある程度の広さの観察対象領域について画像の取得を行う場合には、ＸＹステージ駆動部１５により、試料Ｓにおける観察位置をｘｙ面内で光軸に垂直な方向について変更することが可能である。

このように一定の観察対象領域に対して試料Ｓの画像の取得を行う場合、観察対象領域の全体に対する焦点情報を取得する方法としては、焦点制御部５１が、試料Ｓの観察対象領域を複数の焦点計測領域に区分し、複数の焦点計測領域のそれぞれについて合焦点位置を求めて、それらの合焦点位置によって観察対象領域に対する合焦点位置のマッピングを行う方法を用いることが好ましい。

図５は、試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の一例を示す模式図である。顕微鏡装置１Ａを用いて試料Ｓを広い範囲でスキャンして画像データを取得する場合、試料ステージ１０の傾きや試料Ｓの形状などによる観察対象領域内での焦点位置の変化が問題となる。観察対象領域が狭い場合には、複数の観察位置で試料Ｓの画像取得を行う場合でも焦点位置の変化は問題とはならないが、例えば２０ｍｍ×２０ｍｍの範囲を観察対象領域とする例のように、広い範囲で試料Ｓの画像取得を行う場合には、観察位置による焦点位置の変化を考慮する必要がある。

これに対して、図５に示した焦点情報の取得方法では、上記したように、観察対象領域Ｒを複数の焦点計測領域に区分する。図５の例では、矩形状の観察対象領域Ｒを横方向１０、縦方向１０に区切って、１０×１０個の焦点計測領域ＲＦを設定している。そして、１００個の焦点計測領域ＲＦのそれぞれについて上記した方法で焦点計測を行って合焦点位置を求めることにより、観察対象領域Ｒの全体に対する合焦点位置のマッピングデータを作成することができる。このような方法によれば、複数の観察位置を含む観察対象領域Ｒに対する合焦点位置などの焦点情報を効率的に取得することが可能である。

ここで、観察対象領域Ｒの焦点計測領域ＲＦへの区分数などの区分条件については、具体的な観察対象領域Ｒの広さや必要とされる焦点情報の精度などに応じて適宜設定すれば良い。また、各焦点計測領域ＲＦでの焦点計測及び合焦点位置の導出については、例えば図５に示すように焦点計測領域ＲＦの中心点を代表点ＲＣとし、この代表点ＲＣを計測位置として焦点計測及び合焦点位置の導出を行うことが好ましい。

このような方法で取得された焦点情報を用いて実際に試料Ｓの画像を取得する際には、画像取得制御部５２は、焦点情報記憶部５５に記憶された焦点情報のマッピングデータを読み出し、そのデータを参照しながら観察対象領域Ｒ内をスキャンして試料Ｓの画像を取得すれば良い。

図５には、このような観察対象領域Ｒ内での試料Ｓの画像の取得方法の一例を合わせて示している。この例では、観察対象領域Ｒ内で図中の上側から下側への画像スキャン（実線矢印）を左側から右側へ向けて繰り返して行って（破線矢印）、領域Ｒの全体に対して試料Ｓの画像を取得する。この場合、焦点情報のマッピングデータを参照し、観察対象領域Ｒ内での画像スキャンに追従するように焦点位置を調整しながら画像を取得することにより、領域Ｒの全体で焦点が合った良好な画像を取得することができる。

あるいは、試料Ｓの観察対象領域の全体に対する焦点情報を取得する方法としては、焦点制御部５１が、試料Ｓの観察対象領域内で３点以上の焦点計測位置を設定し、３点以上の焦点計測位置のそれぞれについて合焦点位置を求めて、それらの合焦点位置を用いて観察対象領域内での各観察位置に対する合焦点位置を求める方法を用いることが好ましい。

図６は、試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の他の例を示す模式図である。図６に示した焦点情報の取得方法では、上記したように、観察対象領域Ｒに対して３点の焦点計測位置ＰＦを設定している。そして、３点の焦点計測位置ＰＦのそれぞれについて上記した方法で焦点計測を行って合焦点位置を求めている。このとき、３点の焦点計測位置ＰＦで求められた合焦点位置から、直線補完によって観察対象領域Ｒ内の任意の観察位置に対する合焦点位置を求めることができる。このような方法によっても、観察対象領域Ｒに対する合焦点位置などの焦点情報を効率的に取得することが可能である。

このような方法は、例えば、試料ステージ１０が充分に平面状で、観察対象領域Ｒ内での焦点位置の変化がステージ１０の傾きのみによる場合など、焦点位置の変化が平面的である場合に特に有効である。ただし、図６に示したように３点の焦点計測位置ＰＦを用いる場合、３点が一直線上にないことが必要である。また、観察対象領域Ｒ内で４点以上の焦点計測位置を設定し、最小二乗法によって観察対象領域Ｒ内の任意の観察位置に対する合焦点位置を求めることとすれば、さらに精度良く焦点位置を制御することができる。

また、図５及び図６に示した例のように、観察対象領域Ｒに対して焦点情報の取得を行う場合には、試料ステージ１０の真直度についても同時に補正を行うことが好ましい。一般に、ＸＹステージの真直度では、ステージの移動に用いられるボールネジの偏芯等、ガイド自体の真直度（例えばステージが移動するレールの反り）、ガイドを取り付けるベース部分の平面度、ガイド取付のネジ固定による波打ち、ガイドがボール循環式の場合の転動体の通過に伴う振動、などの影響を受け、ステージが直線動作をしない場合がある。

図７及び図８は、それぞれステージ送り位置に対する真直度誤差の変化を示すグラフである。図７のグラフは、広い送り位置範囲についての真直度誤差の変化を示している。これは、主にステージが移動するレールの反りによる誤差パターンに対応している。また、図８のグラフは、狭い送り位置範囲についての真直度誤差の変化を示している。これは、主に送り用のネジによる誤差パターンに対応している。これに対して、上記した自動焦点装置及び顕微鏡装置１Ａによれば、このようなステージの真直度についても、焦点計測による焦点情報の取得によって同時に補正することが可能である。

本発明による自動焦点装置及び顕微鏡装置は、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、撮像手段及び導光光学系に対する試料Ｓにおける焦点位置を光軸方向について変更する焦点変更手段については、図１に示した構成ではＣＣＤカメラ３０及び導光光学系２０をｚ軸方向に駆動する光学系駆動部２５を用いているが、例えば試料Ｓが載置された試料ステージ１０をｚ軸方向に駆動する構成など、他の構成を用いても良い。

また、試料Ｓにおける観察位置（撮像位置）を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段については、図１に示した構成では試料ステージ１０をｘｙ面内で駆動するＸＹステージ駆動部１５を用いているが、例えばＣＣＤカメラ３０及び導光光学系２０をｘｙ面内で駆動する構成など、他の構成を用いても良い。あるいは、このような観察位置変更手段については、試料Ｓに対して１つの観察位置のみで画像取得を行う場合など、不要であれば設けない構成としても良い。

本発明による自動焦点装置及び顕微鏡装置は、合焦点位置を短い時間で正確に求めることが可能な自動焦点装置、及びそれを用いた顕微鏡装置として利用可能である。

自動焦点装置を用いた顕微鏡装置の一実施形態の構成を示すブロック図である。 一方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである。 双方向の焦点計測で求められる合焦点位置について示すグラフである。 焦点計測における焦点位置の変更の遅れについて示すグラフである。 試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の一例を示す模式図である。 試料の観察対象領域の全体に対する焦点情報の取得方法の他の例を示す模式図である。 ステージ送り位置に対する真直度誤差の変化を示すグラフである。 ステージ送り位置に対する真直度誤差の変化を示すグラフである。

符号の説明

１Ａ…顕微鏡装置、１０…試料ステージ、１５…ステージ駆動部、２０…導光光学系、２１…対物レンズ、２５…光学系駆動部、３０…ＣＣＤカメラ（撮像装置）、５０…制御装置、５１…焦点制御部、５２…画像取得制御部、５５…焦点情報記憶部、５８…入力装置、５９…表示装置。

Claims (6)

1. 観察対象となる試料の光像による画像を取得する撮像手段と、
   前記試料からの光が入射する対物レンズを含み、前記試料の光像を前記撮像手段へと導く導光光学系と、
   前記撮像手段及び前記導光光学系に対する前記試料における焦点位置を光軸方向について変更する焦点変更手段と、
   前記撮像手段及び前記焦点変更手段を用いて、前記試料の画像を取得する際の焦点情報を取得する焦点制御手段とを備え、
   前記焦点制御手段は、前記焦点変更手段によって前記焦点位置を一方向に連続的に変更しつつ実行される第１の焦点計測で取得された複数の前記試料の画像から第１の焦点計測値を算出し、前記焦点位置を前記第１の焦点計測とは逆方向に連続的に変更しつつ実行される第２の焦点計測で取得された複数の前記試料の画像から第２の焦点計測値を算出するとともに、前記第１の焦点計測値及び前記第２の焦点計測値に基づいて前記試料における合焦点位置を求めることを特徴とする自動焦点装置。
2. 前記焦点制御手段は、前記第１の焦点計測値及び前記第２の焦点計測値の平均値によって前記合焦点位置を求めることを特徴とする請求項１記載の自動焦点装置。
3. 前記焦点制御手段は、前記第１の焦点計測及び前記第２の焦点計測において、複数の前記試料の画像の取得を、被写界深度以下に設定された前記焦点位置の変更間隔毎に行うことを特徴とする請求項１または２記載の自動焦点装置。
4. 前記撮像手段及び前記導光光学系に対する前記試料における観察位置を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段を備え、
   前記焦点制御手段は、前記試料の観察対象領域を複数の焦点計測領域に区分し、前記複数の焦点計測領域のそれぞれについて求められた前記合焦点位置によって前記観察対象領域に対する合焦点位置のマッピングを行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の自動焦点装置。
5. 前記撮像手段及び前記導光光学系に対する前記試料における観察位置を光軸に垂直な方向について変更する観察位置変更手段を備え、
   前記焦点制御手段は、前記試料の観察対象領域内で３点以上の焦点計測位置を設定し、前記３点以上の焦点計測位置のそれぞれについて求められた前記合焦点位置を用いて前記観察対象領域内での各観察位置に対する前記合焦点位置を求めることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の自動焦点装置。
6. 請求項１〜５のいずれか一項記載の自動焦点装置と、
   前記試料の観察位置に対して前記焦点制御手段によって求められた前記合焦点位置を含む前記焦点情報に基づいて、前記試料の画像の取得を制御する画像取得制御手段と
   を備えることを特徴とする顕微鏡装置。

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